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Orientadores: Sara Teresinha Olalla Saad, Mariana Lazarini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A reorganização do citoesqueleto mediada pela família de proteínas Rho GTPases é essencial durante a diferenciação do megacariócito e formação de plaquetas. As diferentes funções plaquetárias também dependem da intensa reorganização do citoesqueleto. As proteínas RhoGAP, como ARHGAP21, atuam como reguladores negativos de Rho GTPases, acelerando sua inativação. Nosso grupo de pesquisa reportou a participação da ARHGAP21 na regulação de funções de células-tronco e progenitores hematopoiéticos, incluindo seu comprometimento nas células progenitoras megacariocíticas. No presente estudo, investigamos o papel da ARHGAP21 na diferenciação megacariocítica e função plaquetária. Para tal, utilizamos dois modelos: 1) células de eritroleucemia humana (HEL) silenciadas para ARHGAP21 e submetidas à diferenciação megacariocítica in vitro e 2) camundongos heterozigotos nocautes para Arhgap21 (Arhgap21+/-). Proteínas do citoesqueleto foram investigadas por microscopia confocal e western blot em células HEL silenciadas para ARHGAP21 e submetidas à diferenciação megacariocítica. Marcadores de diferenciação e ploidia foram avaliados por citometria de fluxo. O modelo de camundongo Arhgap21+/- foi usado para avaliar a diferenciação megacariocítica de células progenitoras primárias. O tempo de oclusão do vaso e a formação de trombo foram detectados após lesão da artéria carótida de camundongo Arhgap21+/- com FeCl3. Agregação plaquetária e exposição à p-selectina da Arhgap21+/- foram avaliados em resposta à trombina com um agregômetro. A morfologia plaquetária foi avaliada por microscopia eletrônica. A expressão da ARHGAP21 foi aumentada durante a diferenciação megacariocítica na linhagem celular e células primárias de camundongo. No modelo de células HEL, a proteína ARHGAP21 foi detectada nas protrusões citoplasmáticas colocalizada e associada à tubulina ? e foi detectada principalmente na fração celular proteica contendo a tubulina polimerizada. O silenciamento da ARHGAP21 diminuiu a expressão da tubulina glu, sugerindo instabilidade dos microtúbulos e maior espalhamento com aumento de protrusões celulares. Ainda, em células HEL, o silenciamento da ARHGAP21 aumentou a atividade de CDC42, enquanto não foram observadas alterações na atividade de RHOA. Em modelo de camundongo Arhgap21+/-, observamos aumento de agregação plaquetária in vitro induzida por trombina e exposição à p-selectina. Houve maior atividade de RHOA e CDC42 em células primarias da medula óssea de Arhgap21+/- submetidas a diferenciação megacariocítica em comparação a células selvagens. Plaquetas Arhgap21+/- também apresentaram aumento no tamanho de grânulos ?. Estes resultados foram associados com o menor tempo de sangramento caudal e aceleração de formação de trombo após injuria da artéria carótida com FeCl3. Nossos resultados indicam que ARHGAP21 é uma proteína crítica na regulação da produção e função plaquetária por meio do controle do rearranjo do citoesqueleto Abstract: Cytoskeleton reorganization mediated by the Rho family of GTPases is an essential part of megakaryocyte differentiation and platelet formation. The different functions of platelets also depend on the intense reorganization of the cytoskeleton. RhoGAP proteins, such as ARHGAP21, are negative regulators of Rho GTPases and accelerate their inactivation. Our research group has reported the participation of ARHGAP21 in the regulation of the functions of hematopoietic stem progenitor cells, including its involvement in megakaryocytic lineage differentiation. In the present study, we investigated the role of ARHGAP21 in megakaryocytic differentiation and platelet function. To this end, two models were used: 1) the human erythroleukemia cell line (HEL) silenced for ARHGAP21 and subjected to megakaryocytic differentiation in vitro and 2) heterozygous knockout mice for the Arhgap21 gene (Arhgap21+/-). The HEL cell line model was used to assess cytoskeleton proteins by confocal microscopy and western blotting as well as differentiation markers and ploidy by flow cytometry. The Arhgap21+/- mouse model was used in different experiments to investigate megakaryocytic differentiation of primary progenitor cells. Vessel occlusion time and thrombus formation were detected after injury of carotid artery with FeCl3. Arhgap21+/-platelet aggregation and exposure to p-selectin in response to thrombin were obtained using an aggregometer and platelet morphology was evaluated by electron microscopy. ARHGAP21 expression was increased during megakaryocytic differentiation both in the HEL cell line and in mice primary cells. In the HEL cell line, ARHGAP21 was detected in cytoplasmic protrusions, where it colocalized and associated with ?-tubulin, and mainly detected in the protein cell fraction containing polymerized tubulin. In those cells, ARHGAP21 silencing decreased the expression of glu tubulin suggesting microtubule instability and greater spreading with increased cell protrusions. Furthermore, ARHGAP21 silencing increased CDC42 activity in the HEL cell line, whereas no change in RHOA activity was observed. Using Arhgap21+/- mouse model, we observed increased platelet aggregation in vitro induced by thrombin and higher p-selectin exposure. There was higher RHOA and CDC42 activity in Arhgap21+/- bone marrow primary cells when they were subjected to megakaryocytic differentiation in comparison with wild-type cells. Arhgap21+/- platelets showed an increase in the size of ? granules. These results were associated with shorter tail bleeding time and accelerated thrombus formation after injury of carotid artery with FeCl3. Our results indicate that ARHGAP21 may be a critical protein in regulating platelet production and function through the control of cytoskeleton rearrangement Doutorado Fisiopatologia Médica Doutora em Ciências FAPESP 2013/13022-2

Orientadores: Maria Marluce dos Santos Vilela, Marcelo Teocchi Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A imunodeficiência comum variável (ICV) é caracterizada por infecções recorrentes, hipogamaglobulinemia de IgA e IgG ou IgM e IgG, baixa resposta à antígenos vacinais, número normal ou baixo de linfócitos B, defeitos na produção de citocinas e desregulação imunológica, com maior risco para doença autoimune, doença intersticial pulmonar (ILD) e granulomatosa (GLID), esplenomegalia e linfadenopatia benigna e maligna. Nosso objetivo é identificar em uma coorte de 18 pacientes com fenótipo de linfoproliferação, autoimunidade e hipogamaglobulinemia, o diagnóstico genético molecular através do Sequenciamento Total do Exoma (STE). Objetivos específicos, nos pacientes com mutação no gene TNFRSF13B, posição p.C104R, analisar: os membros da família; a expressão da proteína CD267 nos linfócitos B; as células viáveis e em apoptose; a expressão gênica das vias intrínseca e extrínseca da apoptose e no plasma, avaliar IL-2, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10 e TGF-?. Sujeitos: Após aprovação pelo Comitê de Ética e Pesquisa- UNICAMP, foram selecionados seis indivíduos de três famílias não aparentadas com linfoproliferação, autoimunidade e hipogamaglobulinemia, sob acompanhamento na Divisão de Alergia-Imunologia Pediátrica da UNICAMP. DNA genômico do sangue foi extraído para o STE e a validação da variante foi realizada por sequenciamento Sanger. Para análise dos efeitos da variante TNFRSF13B na expressão dos genes envolvidos nas vias de sinalização da apoptose, foi realizado extração de RNA para RT-PCR, Array em placa e expressão gênica única. Para expressão da proteína de membrana CD267 (TACI) e o ensaio de apoptose foi utilizado a citometria de fluxo e para dosagem no plasma de IL-2, IL-5, IL-6, IL-8 e IL-10, a técnica de Multiplex. Resultados e discussão: Pacientes e suas mães assintomáticas apresentam a variante p.C104R no gene TNFRSF13B, sugerindo ampliar as investigações para entendimento da fisiopatologia da doença. Em relação aos controles, os probandos apresentaram menor número de CD19+CD27+, redução da expressão de CD267+ e maior número de células viáveis, mas sem diferenças estatisticamente significativas. TNFRSF13B codifica a proteína TACI, com funções na sobrevida, apoptose, diferenciação dos linfócitos B e por recombinação somática (CSR) atua na mudança de IgM para IgA e IgG. O STE mostrou ausência de variantes entre os genes investigados das vias de sinalização da apoptose no array. Contudo, o estudo da expressão gênica revelou hiperexpressão de genes próapoptóticos BCL2L11, BCL2L13, BNIP3L, TRADD e NOD2, e de genes antiapoptóticos BCL2L1, BCL2A1, BIRC3, BIRC5, BIRC6, BIRC8, NAIP e TNFRSF1B como também hipoexpressão de genes proapoptóticos APAF1, BCL10, BOK, CARD6, CASP3, CASP4, CASP5, CASP6, CASP8, FASL, TNFRSF21, DAPK1, DIABLO, NLRP1 e de genes antiapoptóticos BCL2A1, BCL2, BIRC3, BIRC6, BIRC8, CHUK, RIPK2 e XIAP. Esta desregulação predominou entre os genes próapoptóticos da via intrínseca mitocondrial. O probando com fenótipo mais grave de linfoproliferação recidivante apresentava menor número de genes desregulados e aquele com fenótipo leve, maior número de genes desregulados. Especulamos que a desregulação na expressão gênica seja um mecanismo compensatório positivo do organismo, na tentativa de controlar a doença. Nossos resultados e os da literatura sobre os efeitos da variante p.C104R, sugerem que além da sua haploinsuficiência e penetrância variável, ela pode ser deficiente na sinalização da via canônica NF-?B e exacerbar a sinalização da via não canônica, promovendo autoreatividade e linfoproliferação de linfócitos B naive através da hiperexpressão de genes antiapoptóticos BCL2L1, BCL2A1, BIRC3, BIRC5, BIRC6, BIRC8, NAIP e TNFRSF1B induzindo o organismo a usar mecanismos compensatórios na tentativa de alcançar uma regulação Abstract: Common variable immunodeficiency (CVI) is characterized by recurrent infections, hypogammaglobulinemia of IgA and IgG or IgM and IgG, low response to vaccine antigens, normal or low number of B lymphocytes, defects in cytokine production and immune dysregulation, with increased risk for autoimmune disease, interstitial lung disease (ILD) and granulomatous disease (GLID), splenomegaly, and benign and malignant lymphadenopathy. Our objective is to identify, in a cohort of 18 patients with lymphoproliferation, autoimmunity and hypogammaglobulinemia phenotype, the molecular genetic diagnosis through Total Exome Sequencing (STE). As specific objectives, in patients with a mutation in the TNFRSF13B gene, in position p.C104R, to analyze: family members; the expression of the CD267 protein on B lymphocytes; viable and apoptotic cells; gene expression of the intrinsic and extrinsic pathways of apoptosis and in plasma, evaluate IL-2, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10 and TGF-?. Subjects: After approval by the Ethics and Research Committee - UNICAMP, six individuals from three unrelated families were selected from a cohort of 18 patients with lymphoproliferation, autoimmunity and hypogammaglobulinemia, under follow-up at the Division of Pediatric Allergy-Immunology at UNICAMP. Blood genomic DNA was extracted for STE and variant validation was performed by Sanger sequencing. To analyze the effects of the TNFRSF13B variant on the expression of genes involved in apoptosis signaling pathways, RNA extraction for RT-PCR, plate array and single gene expression were performed. For expression of CD267 membrane protein (TACI) and the apoptosis assay, flow cytometry was used and for plasma dosage of IL-2, IL-5, IL-6, IL-8 and IL-10, the technique of Multiplex. Results and discussion: Patients and their asymptomatic mothers have the p.C104R variant in the TNFRSF13B gene, suggesting further investigations to understand the pathophysiology of the disease. Compared to controls, the probands had a lower number of CD19+CD27+, reduced expression of CD267+ and a higher number of viable cells, but without statistically significant differences. TNFRSF13B encodes the TACI protein, with functions in survival, apoptosis, differentiation of B lymphocytes and by somatic recombination (CSR) it acts in the change from IgM to IgA and IgG. STE showed absence of variants among the investigated genes of the apoptosis signaling pathways in the array. However, the study of gene expression revealed hyperexpression of proapoptotic genes BCL2L11, BCL2L13, BNIP3L, TRADD and NOD2, and antiapoptotic genes BCL2L1, BCL2A1, BIRC3, BIRC5, BIRC6, BIRC8, NAIP1, TNFRSF1B and hypoexpression of proapoptotic genes APAF1, BCL10, BOK, CARD6, CASP3, CASP4, CASP5, CASP6, CASP8, FASL, TNFRSF21, DAPK1, DIABLO, NLRP1 and anti-apoptotic genes BCL2A1, BCL2, BIRC3, BIRC6, BIRC8 CHUK, RIPK2 and XIAP. Dysregulation predominated among proapoptotic genes of the intrinsic mitochondrial pathway. The proband with the most severe phenotype of relapsing lymphoproliferation had a lower number of dysregulated genes, and the one with a mild phenotype, a higher number of dysregulated genes. We speculate that the dysregulation in gene expression is a positive compensatory mechanism of the organism, in an attempt to control the disease. Our results, and those in the literature on the effects of the p.C104R variant, suggest that, in addition to its haploinsufficiency and variable penetrance, it may be deficient in NF-?B canonical pathway signaling and exacerbate non-canonical pathway signaling, promoting lymphocyte autoreactivity and lymphoproliferation B naive through hyper-expression of anti-apoptotic genes BCL2L1, BCL2A1, BIRC3, BIRC5, BIRC6, BIRC8, NAIP and TNFRSF1B inducing the organism to use compensatory mechanisms in an attempt to achieve regulation Doutorado Saúde da Criança e do Adolescente Doutora em Ciências FAPESP 2016/25615-6

Orientador: Nicola Amanda Conran Zorzetto Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A Doença Falciforme (DF) é causada por uma mutação genética que resulta na substituição de um único aminoácido da cadeia da ?-globina, levando à formação de uma hemoglobina anômala conhecida como hemoglobina S. Em situações de baixas concentrações de oxigê-nio, a hemoglobina se polimeriza, levando as hemácias a assumirem um formato alongado, em um evento conhecido como falcização. A angiogênese é o processo pelo qual ocorre a formação de novos vasos a partir de vasos pré-existentes. Estudos mostraram que pacientes com DF, no geral, apresentam níveis elevados de fatores angiogênicos plasmáticos e que as plaquetas de pacientes com anemia falciforme (AF) podem circular em estado ativado na circulação sanguínea. Como já é conhecido que as plaquetas funcionam como reservatórios de fatores envolvidos na inflamação e na angiogênese, o objetivo deste projeto foi avaliar o papel das plaquetas de pacientes com DF nos principais mecanismos angiogênicos das célu-las endoteliais in vitro, utilizando células endoteliais humanas de cordão umbilical (HU-VEC). As células HUVEC foram co-cultivadas com plaquetas separadas do sangue perifé-rico de pacientes portadores de AF (HbSS) e DF (HbSC), e de indivíduos sadios (HbAA) por 24 horas. A quantificação das células HUVEC em proliferação se deu através de um kit comercial (BrdU). Para avaliação da formação de estruturas tipo capilares pelas células en-doteliais (CE) utilizou-se matriz GFR-Matrigel. Os ensaios de invasão e migração foram realizados em câmara dupla de Matrigel e por meio da técnica de Scratch. A análise do se-cretoma e da expressão de receptores na superfície de plaquetas foi feita através do ensaio de multiplex e citometria de fluxo. Os resultados do estudo indicam que as plaquetas de pacientes com DF (HbSS e HbSC) e controle podem estimular a formação de estruturas capilares, a invasão e a migração das CE, in vitro. Nossos achados também demonstram que o co-cultivo de CE com plaquetas de pacientes com AF, no mesmo poço, resulta no aumen-to da capacidade de invasão das CE. Em relação a análise da secretoma das plaquetas, ob-servamos que, em 24 horas, as plaquetas de pacientes com AF secretam concentrações ele-vadas dos fatores pró-angiogênicos ANG 1, angiogenina, e PDGF AA, e do fator anti-angiogênico, endostatina. Também, mostramos que as plaquetas de pacientes com AF do nosso grupo de pesquisa apresentam um aumento na expressão do receptor de trombina, PAR-1. Nosso trabalho reforça a hipótese de que as plaquetas participam do processo an-giogênico da AF e abre perspectivas para novos estudos. Considerando que pacientes com DF possuem contagens elevadas de plaquetas, destacamos as plaquetas como um alvo tera-pêutico no tratamento da DF Abstract: Sickle cell disease (SCD) is caused by a genetic mutation that results in the substitution of a single amino acid in the ?-globin chain, leading to the formation of an anomalous hemoglo-bin known as hemoglobin (HbS). At low blood oxygen concentrations, HbS polymerizes and red blood cells undergo sickling. Angiogenesis is the process by which the formation of new vessels occurs from pre-existing vessels. Previous studies have shown that patients with SCD have increased levels of plasma angiogenic factors, which indicates a proangio-genic state in these individuals, and that platelets from patients with sickle cell anemia (SCA) circulate in an activated state in the bloodstream. As platelets are known to serve as reservoirs for factors involved in inflammation and angiogenesis, the aim of this project was to evaluate the role of platelets from SCD patients in the major angiogenic mechanisms of endothelial cells in vitro, using Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC). HU-VEC cells were co-cultured with platelets isolated from the peripheral blood of patients with SCA (HbSS) and SCD (HbSC), and from healthy individuals (HbAA) for 24 hours. The quantification of proliferating cells was carried out using a commercial kit (BrdU), and HUVEC were cultured in the presence and absence of platelets on GFR-Matrigel matrix to assess the formation of capillary-like structures by endothelial cells. Invasion and migration assays were performed in dual chamber plates using Matrigel, and the Scratch technique, respectively. The secretome and the expression of receptors on the surface of platelets were analyzed using multiplex assays and flow cytometry. Our data indicate that SCD and con-trol platelets can stimulate the formation of capillary structures, and the invasion and migra-tion of endothelial cells (EC), in vitro. Our findings also show that the co-cultivation of EC with SCA platelets, in the same well, results in increased EC invasiveness. SCA platelets were found to secrete, during a 24-hour period, increased levels of the pro-angiogenic fac-tors, Ang 1, angiogenin and PDGF-AA, and the anti-angiogenic factor endostatin, and pre-sented an increased expression of the PAR-1 thrombin receptor. Our work reinforces the hypothesis that platelets participate in the angiogenic process of SCA and provides perspec-tives for further studies. Given the increased circulating platelet counts associated with SCD, data further highlight the platelets as a therapeutic target for the treatment of SCD Doutorado Fisiopatologia Médica Doutora em Ciências FAPESP 2017/11601-6 CAPES 001

Orientadores: Sara Teresinha Olalla Saad, Ilma Aparecida Paschoal Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Introdução: A doença falciforme (DF) é uma doença genética caracterizada por anemia hemolítica, lesões progressivas na maioria dos órgãos, crises vaso-oclusivas, e redução da expectativa de vida. As complicações pulmonares são importantes causas de morbidade e mortalidade na DF que, geralmente, resultam em dispneia e anormalidades na função pulmonar. Essas complicações, assim como outras inerentes à doença, também podem causar redução da tolerância ao exercício (TE). O treinamento muscular inspiratório (TMI) tem demonstrado uma série de resultados importantes, inclusive na melhora da TE em diversas doenças, porém, seus efeitos em pacientes com DF são relativamente desconhecidos. Objetivo: Avaliar a função pulmonar e os efeitos do TMI domiciliar em pacientes com doença falciforme, com ênfase sobre a ventilação pulmonar e TE. Métodos: Os participantes do estudo foram divididos em dois grupos aleatoriamente, sendo que um grupo realizou o treinamento com carga mínima (GM) e o outro realizou o treinamento com cargas maiores dentro de valores recomendados pela literatura, sendo denominado grupo de intervenção (GI). As avaliações inicial e final foram compostas de: capnografia volumétrica (VCap); espirometria; aplicação das escalas Modificada de Impacto da Fadiga (MFIS) e do Medical Research Council (MRC); avaliação das pressões inspiratória e expiratória máximas (PImáx e PEmáx); teste de caminhada de 6 minutos (TC6) com aplicação da escala de Borg (Borg) e; avaliação da concentração de lactato sanguíneo ([Lac]) pré e pós-TC6. O tempo total de TMI foi de 18 semanas. Resultados: Dos 25 participantes que concluíram o TMI, 12 constituíram o GM, com mediana de idade de 46 (30-64) anos e 13 foram alocados no GI, com mediana de idade de 40 (28-56) anos, sem diferença significativa entre os grupos. Na avaliação da espirometria, referente à primeira avaliação, do total de pacientes que finalizaram o estudo, 6 (24%) pacientes apresentaram resultado normal e 16 (64%) pacientes apresentaram restrição. Os resultados obtidos pela espirometria, MFIS, Borg e [Lac] não mostraram diferenças significativas pós-TMI em nenhum dos grupos. Na VCap houve melhora estatisticamente significativa (p

Orientador: Margareth Castro Ozelo Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Neoplasias mieloides (NM) são proliferações clonais de células mieloides que se manifestam como três doenças principais: as neoplasias mieloproliferativas (NMP), a leucemia mieloide aguda (LMA) e as síndromes mielodisplásicas (SMD). O avanço das técnicas de sequenciamento possibilitou a descoberta de no- vos mecanismos de evolução clonal, como a predisposição genética a NM, entre elas as mutações germinativas no gene RUNX1 e as mutações condutoras em NMP, en- volvendo os genes JAK2, CALR e MPL. A descrição destas mutações permitiu a identificação de um grupo de pa- cientes portadores de NMP negativos para estas, e a observação de um maior risco de eventos tromboembólicos nos pacientes portadores da mutação JAK2V617F. Não está claro, porém, se essa mutação é expressa em células endoteliais e qual impacto isso acarretaria. Assim, o presente trabalho teve o objetivo de: 1) avaliar os mecanismos clonais pelos quais pacientes portadores de mutações germinativas no gene RUNX1 apresentam transformação para NM; 2) avaliar a expressão da mutação JAK2V617F em células endoteliais formadoras de colônias (ECFCs) de pacientes com NMP JAK2V617F+ bem como seu comportamento in vitro, com relação à adesão a hemá- cias, migração e angiogênese e 3) avaliar a presença de mutações adicionais em pa- cientes com NMP triplo negativas. Com relação ao objetivo 1, 3 pacientes de 2 famílias com antecedente de LMA/SMD e DNA disponível ao diagnóstico foram submetidos ao sequenciamento de 48 genes relacionados a neoplasias mieloides. Um dos pacientes apresentou uma mutação no alelo previamente não mutado do RUNX1, além de uma mutação no gene NFE2. Os demais apresentaram mutações em outros genes. Uma revisão sistemática identificou a aquisição de uma mutação somática do RUNX1 ou aquisição de muta- ções em outros genes como os dois mecanismos para transformação para NM. Com relação ao objetivo 2, a pesquisa da mutação JAK2V617F nas ECFCs de 8/9 pacientes com isolamento bem-sucedido foi negativa. Na comparação com as ECFCs controle, ECFCs de pacientes com NMP JAK2V617F+ apresentaram maior adesão estática às hemácias, menor capacidade de migração e de angiogênese. Diante das diferenças funcionais não relacionadas à expressão da mutação JAK2V617F foi realizada avaliação da expressão gênica de ECFCs de indivíduos sa- dios e portadores de NMP JAK2V617F+ com um RT PCR array para 168 genes. Fo- ram observados aumento da expressão do gene ADAM17 e KDR e redução da ex- pressão do gene WNT5A. Para validar o achado do aumento de expressão de ADAM17 nas ECFCs foi realizada dosagem deste analito no plasma de 91 pacientes com NMP e 37 controles. As concentrações plasmáticas de ADAM17 foram maiores em indivíduos portadores de NMP em relação a controles (173,9 pg/ml vs. 71,44 pg/ml; P=0,01). Finalmente, com relação ao objetivo 3, 21 pacientes diagnosticados com trombocitemia essencial sem mutações nos genes JAK2; MPL; CALR no período entre 2007 e 2016 foram submetidos a sequenciamento de 48 genes relacionados a neo- plasias mieloides para identificação de mutações em genes adicionais. Desses, 3 não apresentavam qualidade adequada de DNA para sequenciamento. Dos 18 restantes, 4 (22%) apresentavam mutações em JAK2 (2); MPL (1) e CALR (1) Abstract: Myeloid neoplasms (MM) are clonal proliferations of myeloid cells present- ing as three main diseases: acute myeloid leukemia (AML); myeloproliferative neo- plasms (MNP) and myelodysplastic syndromes (MDS). The advances in DNA sequencing have led to the discovery of new mech- anisms of clonal evolution, such as the genetic predisposition to MM, among each germline mutations in RUNX1 and the driver mutations in MPNs in the JAK2, CALR and MPL genes. The identification of the abovementioned mutations has led to the identifi- cation of triple negative MPN patients, as well as a higher risk of thromboembolic events in patients with JAK2V617F+ MPN. These findings raised the question of whether this mutation is expressed in the endothelial cells and how this could impact their function. Accordingly, this thesis had the following objectives: 1) assess the mecha- nisms by which germline RUNX1 mutated patients progress to MM; 2) evaluate both the expression of the JAK2V617F mutation in endothelial colony forming cells (ECFCs) from patients with JAK2V617F+ MPN as well as the in vitro functional characteristics of these cells regarding static adhesion to red blood cells, migration and angiogenesis; 3) assess additional mutations in triple negative MPN. Regarding our first objective, 3 patients from 2 families with prior MDS/AML and available DNA at diagnosis were submitted to targeted sequencing with a 48 gene panel. One of the patients had an additional mutation in the wildtype RUNX1 allele and a mutation in NFE2. The remaining patients had mutations in other recurrently mutated genes. A systematic review identified the acquisition of a somatic RUNX1 mutation or an acquisition of mutation in other genes as the two mechanisms for transformation into MM. Regarding objective number 2, we did not detect the JAK2V617F mutation in ECFCs from 8/9 MPN patients with a successful isolation. ECFCs from JAK2V617F+ MPN patients had a higher static adhesion to red blood cells and a lower migration and angiogenesis capacity. To better explore these differences in their in vitro behavior, we assessed gene expression of ECFCs from both patients and healthy individuals with a PCR array for 168 genes. We found a higher expression of ADAM17 and KDR, and reduction of the expression of WNT5A. To validate our findings, we measured plasma levels of ADAM17 in an expansion cohort comprising 91 MPN patients (regardless of the JAK2V617F status) and 37 healthy individuals. Plasma levels of ADAM17 were greater in MPN patients vs. controls (173.9 pg/ml vs. 71.44 pg/ml, P=0.01). Finally, regarding objective 3, 21 patients diagnosed with essential throm- bocythemia without JAK2, MPL and CALR mutations diagnosed between 2007 and 2016 were submitted to targeted sequencing of 48 genes related to myeloid neoplasms for the identification of additional mutations. Three of these patients had insufficient DNA for sequencing. Of the remaining 18, 4 (22%) had mutations in the classical driver genes: JAK2 (2); MPL (1) and CALR (1) Doutorado Clínica Médica Doutor em Ciências CAPES FAPESP 2014/009843

Orientadores: Sara Teresinha Olalla Saad, Mariana Lazarini Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: As síndromes mielodisplásicas (SMD) são desordens resultantes de alterações em células-tronco hematopoéticas, caracterizadas por hematopoese ineficaz e pela probabilidade de progressão para leucemia mieloide aguda (LMA). A SMD e LMA são causadas por uma combinação de mutações e alterações epigenéticas que resultam na desregulação de funções proteicas, conferindo maior capacidade de proliferação, defeito na apoptose e na diferenciação celular. O estudo de novos genes envolvidos é importante para um melhor entendimento e para a identificação de possíveis alvos terapêuticos nestas neoplasias hematológicas. As Rho GTPases constituem uma família de 20 proteínas que participam de diversos processos celulares, como rearranjo do citoesqueleto, migração, adesão e polarização celular. As três proteínas Rho GTPases mais estudadas são RhoA, Rac1 e Cdc42 e estão relacionadas ao desenvolvimento do câncer, incluindo neoplasias hematológicas. Entretanto, poucos estudos foram realizados para investigar o papel dos outros membros desta família nestas doenças. O objetivo do presente estudo foi investigar a expressão de genes da família das Rho GTPases em SMD e LMA. A partir destes resultados, um gene promissor foi escolhido para que sua função fosse avaliada em células leucêmicas. A expressão gênica das Rho GTPases RhoC, RhoBTB2 e Rnd2 foram encontradas significativamente aumentadas em amostras de medula óssea de pacientes com LMA de novo, enquanto RhoQ foi encontrada diminuída em amostras de medula óssea de pacientes com LMA secundária à SMD em comparação a doadores sadios. Utilizamos o banco de dados do cBioPortal para analisar uma segunda coorte de pacientes e observamos aumento da expressão de RhoC em pacientes com LMA estratificados em risco citogenético desvaforável em comparação a pacientes em risco citogenético intermediário. Além disso, o aumento da expressão de RhoC foi um fator independente de menor sobrevida global em pacientes com LMA. RhoC foi então selecionada como a melhor candidata para as análises funcionais através do tratamento de linhagens mieloides com o fármaco Rhosin. As linhagens leucêmicas tratadas com Rhosin (inibidor dual de RhoA/RhoC) apresentaram redução da viabilidade celular, aumento na apoptose, aumento na autofagia, aumento na fase G1 do ciclo celular e redução de proliferação e proliferação clonal. Os achados aqui descritos sugerem a desregulação da expressão de Rho GTPases em LMA e indicam RhoC como uma molécula alvo promissora para a terapia desta doença. Estudos adicionais através da inibição específica de RhoC serão importantes para esclarecer a participação desta Rho GTPase na fisiopatologia da LMA Abstract: Myelodysplastic syndromes (MDS) are disorders resulting from changes in hematopoietic stem cells and characterized by ineffective hematopoiesis and probability of progression to acute myeloid leukemia (AML). MDS and AML are caused by a combination of mutations and epigenetic alterations that result in protein dysregulation, conferring greater proliferation capacity and defects in apoptosis and in cell differentiation. The study of new genes involved in these hematologic neoplasms is important for the identification of new therapeutic targets. Rho GTPases are a family of 20 proteins that participate in various cellular functions. RhoA, Rac1 and Cdc42 are the three most studied Rho GTPases and have been related to cancer development, including hematologic malignancies. However, few studies have been performed to investigate the role of the other members of the Rho GTPase family in these diseases. The aim of the present study was to investigate the gene expression of Rho GTPases in MDS and AML. Based on these results, the function of a promising gene was chosen so that its function could be evaluated in leukemia cells. RhoC, RhoBTB2 and Rnd2 gene expression was significantly increased in bone marrow samples from de novo AML patients, whereas RhoQ expression was decreased in secondary AML compared to healthy donors. Using the cBioPortal database, we analyzed a second cohort of AML patients and detected an increased RhoC expression in patients with unfavorable cytogenetic risk compared to patients with intermediate cytogenetic risk. In addition, the increased RhoC expression was an independent factor of poor overall survival in AML patients. RhoC was then selected as the best candidate for functional analyses, which were performed using Rhosin (a dual RhoA / RhoC inhibitor). Leukemia cells treated with Rhosin presented reduction in viability and proliferation and increase in apoptosis, autophagy and in the percentage of cells in the G1 phase of the cell cycle. The findings herein suggest a deregulation of Rho GTPases expression in AML and indicate RhoC as a promising molecule target for AML therapy. Further studies through specific inhibition of RhoC are important to clarify the participation of this Rho GTPase in AML pathophysiology Mestrado Fisiopatologia Médica Mestra em Ciências CAPES 001 FAPESP 2011/51959-0

Orientador: Kleber Yotsumoto Fertrin Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A aceruloplasminemia é uma doença hereditária autossômica recessiva causada por mutações no gene CP, que codifica a proteína ceruloplasmina. Ela está envolvida no metabolismo de ferro e alterações na sua função causam o acúmulo intracelular do metal em locais como cérebro, fígado e pâncreas. O diagnóstico é feito com a detecção da ausência de ceruloplasmina sérica associada a exames de neuroimagem sugestivos de sobrecarga de ferro. No Brasil, não se tem dados sobre sua prevalência e sobre quais mutações estão presentes na população. Este projeto teve como objetivo a caracterização das alterações moleculares que acarretam a aceruloplasminemia em pacientes brasileiros. Foram incluídos três pacientes e, quando possível, familiares em primeiro grau, além de um controle saudável e um controle negativo para proteínas ancoradas por GPI (hemoglobinúria paroxística noturna - HPN). Foram coletadas amostras de sangue periférico para a extração de DNA genômico a partir de leucócitos. Fragmentos de interesse no gene CP e no pseudogene CPP, que possui possível associação com a doença, foram amplificados através da reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciados. Foram avaliadas também as expressões de ferroportina e ceruloplasmina em monócitos de sangue periférico e em macrófagos diferenciados em cultura primária. Os dados dos familiares dos pacientes foram incluídos em uma revisão sistemática sobre os aspectos clínicos e moleculares de portadores de aceruloplasminemia em heterozigose. Duas novas mutações foram encontradas no gene CP: substituição de uma guanina por uma timina na posição 2879-1, mutação splice site (pacientes 1 e 2), e uma troca de timina por citosina na posição 2756 no éxon 16, levando à substituição de leucina por prolina no códon 919, mutação missense (paciente 3). Análise in silico das proteínas mostrou que ocorre mudança significativa na estrutura das proteínas das pacientes em decorrência das mutações. A imunofenotipagem revelou que as expressões observadas nos macrófagos foram similares àquelas vistas nos monócitos. No sangue periférico, houve detecção das proteínas nos monócitos e nos linfócitos B. As expressões encontradas nos linfócitos B foram similares entre os indivíduos, já a presença nos monócitos variou. A mutação CP c.2879-1 G>T apresentou níveis de detecção de ceruloplasmina-GPI e ferroportina semelhantes àqueles encontrados no controle saudável, enquanto que a mutação CP c.2756 T>C levou a redução considerável de ambas proteínas, perfil parecido àquele visto na HPN. Os resultados apoiam a ideia de que a ceruloplasmina-GPI estabiliza a ferroportina na membrana das células, e mostra que as diferentes isoformas da proteína são expressas de forma independente. Quanto aos parentes em primeiro grau, foram incluídos a irmã da paciente 1 e o filho da paciente 3, ambos heterozigotos para a mutação presente na família. Eles apresentavam nível de ceruloplasmina sérica baixo, mas ainda detectável. Através da revisão sistemática, constatou-se que, na literatura, todos os heterozigotos descritos apresentam ceruloplasmina reduzida, mas apenas parte deles manifestou sintomas neurológicos. Este trabalho é pioneiro na caracterização da aceruloplasminemia na população brasileira, sua variabilidade genética e heterogeneidade de expressão clínica, além de contribuir para o maior conhecimento sobre a expressão e importância da ceruloplasmina no nível celular Abstract: Aceruloplasminemia is an autosomal recessive hereditary disease caused by mutations in the CP gene, which encodes ceruloplasmin. This protein is involved in iron metabolism and abnormal function causes the intracellular accumulation of the metal in organs such as the brain, liver, and pancreas. The diagnosis is made upon the detection of absence of serum ceruloplasmin associated with neuroimaging tests suggestive of iron overload. In Brazil, there are no data on its prevalence or on which mutations are present in the population. This project aimed to characterize the molecular alterations that lead to aceruloplasminemia in Brazilian patients. Three patients and, when possible, first-degree relatives were included, as well as a healthy control and a negative control for glycosylphosphaditylinositol-anchored proteins (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria - PNH). Peripheral blood samples were collected for the extraction of genomic DNA from leukocytes. Fragments of interest in the CP gene and in the CPP pseudogene, which shows possible association with the disease, were amplified through polymerase chain reaction (PCR) and sequenced. We also evaluated the expression of ferroportin and ceruloplasmin in peripheral blood monocytes and monocyte-derived primary macrophage. Data from first degree relatives of the patients were included in a systematic review of the clinical and molecular aspects of heterozygous aceruloplasminemia. Two new mutations were found in the CP gene: a replacement of a guanine by a thymidine at position 2879-1, a splice site mutation (patients 1 and 2), and a switch of a thymidine by a cytosine at position 2756 in exon 16, leading to a leucine substitution by a proline at codon 919, a missense mutation (patient 3). In silico analysis of the proteins showed that there is significant change in the predicted tertiary structure of the proteins due to these mutations. Immunophenotyping revealed that the protein expressions observed in macrophages were like those seen in monocytes. Both proteins were detected in peripheral blood monocytes and in B lymphocytes. The expressions found in B lymphocytes were similar across all individuals studied, but the expression in monocytes varied. The CP c.2879-1 G>T mutation presented with ceruloplasmin-GPI and ferroportin expressions like those found in a healthy control, whereas the CP c.2756 T>C mutation led to a considerable reduction of both proteins, a profile similar to what was found in PNH. These results support that ceruloplasmin-GPI stabilizes ferroportin in the cell membrane and shows that the different isoforms of the protein are expressed independently across different cell lineages. As for first-degree relatives, patient 1's sister and patient 3's son were confirmed to be heterozygotes for the mutation present in the family. They had low but still detectable levels of serum ceruloplasmin. We performed a systematic review of the scientific literature that showed that all described heterozygotes present reduced ceruloplasmin, but only part of them manifested neurological symptoms. This work pioneers in the characterization of aceruloplasminemia in the Brazilian population, its genetic variability, and heterogeneity of its clinical expression, as well as it contributes to expand the knowledge on the expression and importance of ceruloplasmin at the cellular level Mestrado Clínica Médica Mestra em Ciências FAPESP 2016/08072-9

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A alga Chlorella é um alimento completo, contendo todos os ingredientes necessários para promover a saúde. É considerada um modificador da resposta biológica (adaptógeno), como demonstrado pela sua atividade moduladora frente a diferentes tipos de estresse, tanto em seres humanos como em animais de experimentação. Estudos pioneiros do nosso laboratório demonstraram que a capacidade da alga de prevenir a resistência à insulina em animais obesos é em parte devido à melhoria na via de sinalização da insulina no fígado, músculo esquelético e tecido adiposo, produzida através do aumento na fosforilação de proteínas, como IR, IRS-1 e AKT e redução na fosforilação do IRS-1ser307. Além disso, o tratamento com a alga nos animais obesos restaurou para os valores normais os níveis aumentados de citocinas pró-inflamatórias e os níveis reduzidos de citocinas anti-inflamatórias, assim como os níveis aumentados de triglicerídeos, colesterol total e frações, e ácidos graxos livres. Resistência à insulina é um importante mecanismo fisiopatológico que antecede a progressão para diabetes tipo 2 (DM2). Embora o tratamento farmacológico do DM2 tenha alguma eficácia em melhorar alguns parâmetros metabólicos, ele apresenta vários efeitos colaterais, que, em muitos casos, podem piorar as condições de saúde e a qualidade de vida. Nesse contexto, produtos de origem natural vêm sendo considerados de importância estratégica na pesquisa de novas substâncias seguras e eficazes no tratamento de doenças relacionadas à resistência à insulina. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do uso da Chlorella em pacientes com intolerância à glicose (IG) e DM2. Nossos resultados mostraram que o uso da alga melhorou significativamente a qualidade de vida relacionada à saúde (QVRS) dos grupos IG, DM2, assim como dos controles. Ao mesmo tempo, os níveis aumentados das citocinas pró-inflamatórias TNF-?, IL-6, MCP-1, IL-1?, IL-8 foram reduzidos e níveis reduzidos da citocina anti-inflamatória IL-10 foram aumentados nos grupos IG e DM2. Um aspecto importante foi a correlação entre a melhora na QVRS e a modulação pela alga nos níveis de citocinas pró- e anti-inflamatórias observados no grupo DM2. Redução nos níveis de leptina, resistina e glucagon, e aumento de adiponectina, GLP-1 e GIP também foram observados em ambos os grupos. Na microbiota intestinal, o uso da alga produziu redução significativa do filo Bacterioidetes, aumentado no DM2. Outro aspecto relevante avaliado neste trabalho diz respeito à falta de consenso quanto à dose clínica mínima adequada de Chlorella capaz de produzir os seus efeitos adaptogênicos, uma questão ainda aberta na literatura. Esta falta de consenso está em grande parte relacionada à quase ausência de efeitos colaterais observados com o uso da alga. Para isso, escolhemos as doses de 1,6g/dia e 3g/dia, as quais estão no patamar das doses mínimas utilizadas nos estudos clínicos da literatura. Quanto ao período de tratamento, considerando que a duração no uso da alga deve ser de médio a longo prazo, escolhemos o período de 12 meses para os nossos estudos, em contraste aos períodos relativamente curtos observados na maioria dos estudos clínicos da literatura. Os resultados descritos acima indicam que as doses utilizadas são suficientes para produzir a resposta adaptogênica, sendo que não houve diferença entre as respostas das duas doses. Estes achados corroboram estudos experimentais do nosso grupo nos quais, uma vez atingido os níveis de resposta equivalentes aos do grupo controle (homeostase), doses mais elevadas não levam a respostas mais ou menos pronunciadas, manifestando-se na forma de plateaux. Em conjunto, nossos resultados apontam alga Chlorella como alternativa terapêutica e/ou complementar promissora no tratamento da DM2 e suas complicações. Além disso, o fato bem reconhecido de que o papel do processo inflamatório é crucial não apenas nas doenças infecciosas, mas também em ampla gama de doenças crônicas não infecciosas, talvez até em todas elas, reforça o uso da Chlorella no tratamento de outras condições patológicas, incluindo cânceres, doenças auto-imunes e doenças infecciosas Abstract: The alga Chlorella is a complete food, containing all the ingredients necessary to promote health. It is considered a biological response modifier (adaptogen), as demonstrated by its modulating activity against different types of stress, both in humans and in experimental animals. Pioneer studies from our laboratory demonstrated that the ability of the algae to prevent insulin resistance in obese animals is partly due to the improvement in the insulin signaling pathway in the liver, skeletal muscle and adipose tissue, produced by increased phosphorylation of proteins, such as IR, IRS-1 and Akt and reduction in the phosphorylation of IRS-1ser307. In addition, treatment with the algae in obese animals restored to normal the increased levels of pro-inflammatory cytokines and the reduced levels of anti-inflammatory cytokines, as well as the increased levels of triglycerides, total cholesterol and fractions, and free fatty acids. Insulin resistance is an important pathophysiological mechanism that precedes the progression to type 2 diabetes (T2D). Although the pharmacological treatment of T2D has some efficacy in improving some metabolic parameters, it has several side effects, which, in many cases, can worsen health conditions and quality of life. In this context, products of natural origin have been considered of strategic importance in the research of new safe and effective substances in the treatment of diseases related to insulin resistance. Thus, the aim of this study was to investigate the effects of the use of Chlorella in patients with glucose intolerance (GI) and T2D. Our results showed that the use of the algae significantly improved the health-related quality of life (HRQoL) of the IG, T2D groups, as well as the controls. At the same time, increased levels of the proinflammatory cytokines TNF-?, IL-6, MCP-1, IL-1?, IL-8 were reduced and reduced levels of the anti-inflammatory cytokine IL-10 were increased in IG and T2D. Important aspect was the correlation between the improvement in HRQoL and the modulation in the levels of pro- and anti-inflammatory cytokines observed in the T2D group. Reduced levels of leptin, resistin and glucagon, and increased levels of adiponectin, GLP-1 and GIP were also observed in both groups. In the intestinal microbiota, the use of the alga produced a significant reduction of the phylum Bacterioidetes, increased in T2D. Another relevant aspect evaluated in this work was the lack of consensus regarding the adequate minimum clinical dose of Chlorella capable of producing its adaptogenic effects, an issue still open in the literature. This lack of consensus is largely related to the almost absence of side effects observed with the use of algae. For this, we have chosen the doses of 1.6 g/day and 3 g/day, which are at the level of the minimum doses used in clinical studies in the literature. Regarding the treatment period, considering that the duration of the use of the algae is of medium to long term, we selected the 12-months period for our studies, in contrast to the relatively short periods observed in most clinical studies in the literature. The results described above indicate that the doses used are sufficient to produce the adaptogenic response, and there was no difference between the responses of the two doses. These findings corroborate experimental studies from our group in which, once a response level equivalent to that of the control group (homeostasis) is reached, higher doses do not lead to more or less pronounced responses, and a plateau in the response is established. Together, our results indicate the algae Chlorella as a promising therapeutic and / or complementary alternative in the treatment of T2D and its complications. Moreover, the well-recognized fact that the role of inflammatory processes is crucial not only in infectious diseases but also in a wide range of chronic non-infectious diseases, perhaps even all of them, reinforces the use of Chlorella in the treatment of other pathological conditions, including cancers, autoimmune diseases and infectious diseases Doutorado Farmacologia Doutora em Farmacologia CAPES 01-P-3371/2017 FAPESP 2014/10634-0

Orientadores: Simone Cristina Olenscki Gilli, Sara Teresinha Olalla Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Células dendríticas (DCs) são as principais células apresentadoras de antígeno do sistema imune, capazes de estimular o linfócito T a iniciar resposta imune especifica. Vacinas de DCs vêm sendo utilizadas como forma de tratamento imunoterápico adjuvante para várias neoplasias. Protocolos para geração dessas células têm sido desenvolvidos e o método ideal de produção para uso clínico ainda necessita ser definido. É fundamental a definição de protocolos e reagentes que ofereçam, a partir de células mononucleares do sangue periférico, células dendríticas seguras e funcionais para uso clínico. A suplementação de meios de cultura com soro de origem animal e humano leva á riscos de xenosensibilização e transmissão de doenças. O uso do soro autólogo parece oferecer menos riscos ao paciente, porém a presença de fatores imunossupressores nesse soro poderia interferir na qualidade das DCs produzidas. Vários tipos de meios livres de soro, baseados nas boas práticas de produção - "good manufacture practice" (GMP), têm sido utilizados recentemente e parecem ser uma opção viável. O objetivo desse estudo foi avaliar os resultados da diferenciação, maturação e funcionalidade de DCs de pacientes com LMA, produzidas em meios livres de soro e em meio suplementado com soro autólogo. Concluímos que os meios de cultura livres de soro foram eficientes na produção de DCs para fins imunoterápicos em pacientes com LMA. Em contrapartida, o uso de soro autólogo parece interferir na capacidade funcional das DCs geradas Abstract: Dendritic cells (DCs) are the main antigen-presenting cells of the immune system, capable of stimulating T lymphocytes to initiate specific immune responses. Vaccines based on DCs have been used as a treatment adjuvant immunotherapy for various malignancies. Protocols for generating these cells have been developed and the optimal method of production for clinical use remains to be defined. There is a great interest in the definition of protocols and reagents providing from peripheral blood mononuclear cells, functional and safe dendritic cells for clinical use. Supplementation of culture media with serum from animal and human leads to reactions due the animal proteins and transmission of disease. The use of autologous serum seems to offer less risk to the patient, but the presence of immunosuppressive factors may affect the quality of the DCs produced. Several types of serum-free media, based on "good manufacture practice" (GMP), have been used recently and seem to be a viable option. The aim of this study was to evaluate the results of the differentiation, maturation and function of DCs from AML patients, generated in serum-free media and media supplemented with autologous serum. We concluded that the serum-free media were efficient in the production of DCs for immunotherapy in AML patients. However, the use of autologous serum appears to interfere with the functional capacity of generated DCs Mestrado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Mestra em Fisiopatologia Médica

Orientadores: Karin Spat Albino Barcellos Silveira, Sara Teresinha Olalla Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: VASP (Vasodilator-stimulated phosphoprotein) e Zyxin são proteínas reguladoras de actina que controlam a adesão célula-célula. Zyxin dirige a montagem da actina através da interação e recrutamento da VASP a sítios específicos da adesão. A fosforilação da VASP ou da Zyxin altera suas atividades nas junções aderentes. PKA fosforila VASP em serina 157, regulando, assim, importantes funções celulares de VASP. VASP interage com ABL e é substrato da oncoproteína BCR-ABL. A presença da proteína BCR-ABL promove a oncogênese em pacientes com leucemia mieloide crônica (LMC) devido à ativação constitutiva da atividade tirosina quinase. Apesar de já descrita alteração da expressão de VASP e Zyxin em diferentes tumores epiteliais, o papel de VASP e Zyxin na LMC, na via de sinalização BCR-ABL e a participação destas proteínas na hematopoiese são desconhecidos. Desta maneira, demonstramos aqui ausência de p-VASP ser157 em células de medula óssea de pacientes com LMC, em contraste com a presença de p-VASP ser157 em doadores saudáveis. Pacientes com LMC em remissão, responsivos a inibidores de tirosina quinase, apresentam p-VASP ser157, enquanto os pacientes resistentes não expressam p-VASP ser157. Utilizando células K562 inibidas para VASP ou Zyxin, observamos que VASP e Zyxin modulam as proteínas anti-apoptóticas BCL-2 e BCL-XL da via de sinalização do BCR-ABL. Em adição, células K562 silenciadas para a VASP apresentam diminuição na atividade de FAK y925 e demonstramos que VASP interage com FAK. A expressão de VASP e Zyxin e de suas formas ativas aumenta durante a diferenciação megacariocítica e a inibição de VASP implica em diminuição na expressão do marcador CD61. Identificamos no presente estudo a participação de VASP e Zyxin na via do BCR-ABL, regulando a expressão de proteínas efetoras anti-apoptóticas e, também, na diferenciação megacariocítica. Desta maneira, a expressão alterada da atividade de VASP nos pacientes com LMC pode contribuir para a patogênese da doença, seja afetando a diferenciação celular ou a adesão das células leucêmicas Abstract: VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein) and Zyxin are actin regulatory proteins that control cell-cell adhesion. Zyxin directs actin assembly by interacting and recruiting VASP to specific sites of adhesion. The phosphorylation of VASP and Zyxin modifies their activity in cell-cell junctions. PKA phosphorylates VASP at serine 157 regulating VASP cellular functions. VASP interacts with ABL and VASP is a substrate of BCR-ABL oncoprotein. The presence of BCR-ABL protein drives oncogenesis in patients with chronic myeloid leukemia (CML) due to a constitutive activation of tyrosine kinase activity. It has been described an altered expression of VASP and Zyxin in different types of tumor; however the function of VASP and Zyxin in CML, in BCR-ABL pathway and in hematopoiesis remains unknown. We describe here the absence of p-VASP ser157 in CML bone marrow cells, in contrast to p-VASP ser157 expression in healthy donors. Patients responsive to tyrosine kinase inhibitors present p-VASP ser157, while resistant patients do not have p-VASP ser157. In K562 cells we observed that VASP and Zyxin modulate anti-apoptotic proteins BCL-2 and BCL-XL. VASP depletion in K562 cells decreases FAK y925 activity and VASP interacts with FAK. Expression of VASP, p-VASP, Zyxin and p-Zyxin increases during megakaryocyte differentiation and VASP inhibition affects this differentiation through reduced CD61 expression in VASP depleted cells. We identify here the participation of VASP and Zyxin in BCR-ABL pathway affecting anti-apoptotic proteins and, also, in megakaryocyte differentiation. Then, the altered expression of VASP activity in CML patients may contribute to CML pathogenesis, affecting cellular differentiation or leukemic cell adhesion Mestrado Fisiopatologia Médica Mestra em Ciências

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A sílica cristalina, ou quartzo, é um mineral abundante na areia, rochas e solo, cuja exposição crônica predispõe a lesões pulmonares, proliferação de fibroblastos e produção excessiva de colágeno no pulmão causando silicose, uma forma de fibrose pulmonar. A exposição ocupacional à sílica cristalina também tem sido considerada um fator predisponente a doenças autoimunes como artrite reumatóide, esclerodermia e lúpus eritematoso sistêmico. Neste sentido, a sílica tem mostrado agir como adjuvante, aumentando os níveis de imunocomplexos e imunoglobulinas de forma inespecífica, podendo estar relacionado ao desenvolvimento de doença autoimune. Porém, a relação entre exposição à sílica e o desenvolvimento de autoimunidade não está clara devido à falta de conhecimento dos mecanismos envolvidos. Não se sabe se a silicose constitui apenas um marcador de exposição a altos níveis de sílica em pó ou se é uma patologia que pode predispor à doença autoimune. Assim, uma investigação mais acurada de indicadores de autoimunidade em indivíduos com silicose é necessária. Nossos resultados apresentam evidências de alterações compatíveis com autoimunidade nos indivíduos expostos à sílica comparado com a população controle ao demonstrar ativação da resposta imune humoral e celular, além de alterações funcionais nos linfócitos T (LT). Isto foi verificado pelos níveis elevados de fator anti-núcleo, fator reumatóide e anticorpos anti-células endoteliais; pelo aumento da resposta proliferativa de células mononucleares do sangue periférico, dos níveis séricos de Fas ligante solúvel, do número de células Natural Killer e alteração dos níveis das citocinas IFN-_, TNF-_, IL-1_, IL-2, IL-6, IL-10 e TGF-_ bem como alterações funcionais nos LT pela menor expressão das moléculas regulatórias CTLA-4 e PD-1. Além disso, nosso estudo sugeriu uma influência genética na expressão do receptor PD-1 pela menor expressão deste na superfície das células T CD4+ em indivíduos com o genótipo GG no estudo do polimorfismo PD1.3 e também demonstrou que a autoimunidade pode ocorrer anteriormente às manifestações clínicas de silicose Abstract: Crystalline silica, or quartz, is a mineral abundant in sand, rock and soil which chronic exposure is known to predispose to pulmonary lesions, fibroblasts proliferation and excessive collagen production in the lungs that leads to silicosis, a form of pulmonary fibrosis. Occupational exposure to crystalline silica dust has been examined as a possible risk factor with respect to several autoimmune diseases, such as rheumatoid arthritis, scleroderma and systemic lupus erythematosus. In this regard, silica has been known to have an adjuvant effect on immunocomplexes and immunoglobulins production in a nonspecific manner, thus reinforcing its relation with the appearance of autoimmunity. However, the relationship between silica exposure and the development of autoimmunity remains to be elucidated because the mechanisms underlying this association are unknown. It is unclear whether silicosis is only a marker for high-level silica dust exposure or whether it represents a pathologic process that may predispose some individuals to the development of autoimmune disease. Therefore, an accurate investigation of the autoimmunity indicators in silicotic individuals is required. Our results present evidences of alterations compatible with autoimmunity in silica-exposed individuals as compared to the control population by demonstrating an activation of humoral and cellular immune responses as well as functional alterations in T lymphocytes (LT). It was shown by the increased levels of antinuclear antibodies, rheumatoid factor and anti-endothelial cell antibodies, by the increased proliferative response of peripheral blood mononuclear cells, augmented levels of serum soluble Fas ligand, number of Natural Killer cells and alterations of IFN-_, TNF-_, IL-1_, IL-2, IL-6, IL-10 and TGF-_ cytokine levels as well as by functional LT alterations by thelower expression of CTLA-4 and PD-1 regulatory molecules. In addition, our study suggested a genetic influence in the expression of PD-1 receptor by its lower expression in the surface of T CD4+ cells in individuals carrying GG genotype in the study of PD1.3 polymorphism and also demonstrated that autoimmunity can occur before the clinical manifestations of silicosis Doutorado Farmacologia Doutor em Farmacologia

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: As síndromes mielodisplásicas (SMD) são um grupo heterogêneo de doenças hematopoiéticas caracterizadas pela hematopoiese ineficaz resultando em citopenia no sangue periférico; cerca de 30% das SMDs evolui para leucemia mielóide aguda secundária. Leucemias agudas (LA) são doenças malignas do sangue caracterizadas por acúmulo de blastos podendo ser classificadas em mielóide agudas (LMA), quando há envolvimento de mieloblastos, ou linfóides agudas (LLA), quando há envolvimento de linfoblastos. A sobrevida média dos pacientes com leucemia aguda ainda é muito baixa e muitos deles são resistentes ao tratamento ou apresentam recaída. O melhor entendimento sobre os mecanismos de progressão da mielodisplasia e da resposta ao tratamento em leucemias agudas poderia melhorar a taxa de resposta ao tratamento e aumentar a sobrevida dos pacientes. O metabolismo e o efluxo de drogas são mecanismos de defesa responsáveis pela proteção contra agentes tóxicos e estão envolvidos na biotransformação de diversos xenobióticos. O metabolismo de drogas pode ser divido em duas fases (Fase I: Oxidação; Fase II: Conjugação), sendo ambas mediadas por enzimas metabolizadoras de drogas. O efluxo de drogas é outro mecanismo de proteção contra tóxicos, similar ao metabolismo de drogas, porém mediado por proteínas de membrana. Essas proteínas são polimórficas e esses polimorfismos alteram a atividade enzimática, podendo modificar a resposta ao tratamento e a sua resistência. O gene CYP2B6 codifica uma enzima da fase I do metabolismo responsável pela ativação dos fármacos. Esse gene possui o polimorfismo G15631T onde há troca do aminoácido (Gln172His) resultando em perda da atividade enzimática. Os genes GSTM1, GSTT1 e NQO1 codificam enzimas da fase II do metabolismo, responsáveis pela conjugação com outras substâncias para facilitar a excreção. Os genes GSTM1 e GSTT1 possuem um polimorfismo que causa deleção homozigota do gene; e o gene NQO1 possui o polimorfismo C609T que resulta em troca do aminoácido codificado (Pro187Ser). Esses polimorfismos levam a perda da atividade enzimática. O gene MDR-1 codifica a P-glicoproteína que é uma proteína de membrana responsável pelo efluxo de drogas. Esse gene possui o polimorfismo C3435T que apesar de ser silencioso (Ile1142Ile) diminui a expressão de P-glicoproteína. Assim, o objetivo deste estudo foi identificar a influência dos polimorfismos CYP2B6 G15631T, GSTT1, GSTM1, NQO1 C609T e MDR-1 C3435T no risco de leucemias agudas e SMD, na progressão de SMD e resposta ao tratamento de leucemia aguda. Foram analisados 90 pacientes com leucemia aguda (66 LMA e 24 LLA), 68 pacientes com SMD e 100 controles normais utilizando os métodos de PCR-RFLP e Multiplex. Não houve diferença estatística na freqüência dos polimorfismos entre pacientes e grupo controle. Em SMD encontramos maior frequência de deleções de GST em pacientes que progrediram comparados aos pacientes que não progrediram: 50% e 21% (P=0,019). Também encontramos menor frequência do alelo polimórfico T do polimorfismo MDR-1 C3435T em pacientes que progrediram comparada a dos pacientes que não progrediram: 50% e 81% (P=0,012). Na resposta ao tratamento de leucemias agudas, encontramos uma tendência à maior frequência do polimorfismo NQO1 C609T em pacientes com falha de indução quando comparados a pacientes com remissão em leucemias agudas, em geral, (P=0,093) e pacientes somente com LMA (P=0,125); e quando comparamos falha de indução com o grupo controle em leucemias agudas, em geral, (P=0,101) e somente em LMA (P=0,08). Observamos a mesma tendência quando comparamos a frequência do polimorfismo NQO1 C609T em pacientes com óbito precoce versus a população normal (P=0,058). Em conclusão, estes resultados sugerem que os polimorfismos não estão relacionados ao risco de leucemia aguda e SMD, embora a amostra aqui analisada possa ter sido insuficiente; as deleções GST e o polimorfismo MDR-1 C3435T estão envolvidos na progressão de SMD e o polimorfismo NQO1 C609T tem uma tendência a estar relacionado à falha de indução e ao óbito precoce em pacientes com leucemias agudas, em geral, e somente LMA Abstract: Myelodysplastic syndromes (MDS) are a heterogeneous group of hematopoietic disorders characterized by ineffective hematopoiesis resulting in peripheral blood cytopenia, about 30% of MDS patients progresses to acute myeloid leukemia. Acute leukemia (AL) are malignant blood diseases characterized by accumulation of blasts and they can be classified into acute myeloid (AML), when there is myeloblasts involvement or acute lymphoid (ALL), when there is lymphoblasts involvement. The median survival of acute leukemia patients is very low and many of them are resistant to treatment or relapsed. The better understanding of the myelodysplasia progression mechanisms and the acute leukemia response to treatment could improve the treatment response rate and patients survival. The metabolism and drug efflux are defense mechanisms responsible for protection against toxic agents and are involved in the biotransformation of various xenobiotics. The drug metabolism can be divided into two phases (Phase I: Oxidation; Phase II: Conjugation), both being mediated by drug metabolizing enzymes. The drug efflux is a similar mechanism of protection but is mediated by membrane proteins. These enzymes are polymorphic and these polymorphisms alter the enzyme activity and may modify treatment response and resistance. The CYP2B6 gene encodes a phase I enzyme responsible for drug activation. This gene has the G15631T polymorphism where there is exchange of the amino acid (Gln172His) resulting in loss of enzyme activity. The GSTM1, GSTT1 and NQO1 genes encoding phase II metabolizing enzymes that are responsible for combining with other substances to facilitate drug excretion. GSTM1 and GSTT1 genes have a polymorphism that causes homozygous deletion of the gene; and the NQO1 gene has the C609T polymorphism that results in amino acid changes (Pro187Ser). These polymorphisms lead to loss of enzyme activity. The MDR-1 gene encodes P-glycoprotein (P-gp) which is a membrane protein responsible for drug efflux. This gene has the C3435T polymorphism that despite being silent (Ile1142Ile) leads to lower P-gp expression. The aim of this study was to identify the influence of CYP2B6 G15631T, GSTT1, GSTM1, NQO1 C609T and MDR-1 C3435T polymorphisms in acute leukemia and MDS risk, MDS progression and acute leukemia response to treatment. We analyzed 90 patients with acute leukemia (66 AML and 24 ALL), 68 MDS patients and 100 normal controls using the PCRRFLP and Multiplex methods. There was no statistical difference in the frequency of polymorphisms between patients and control group. In MDS we found higher frequency of GST deletions in patients who progressed compared to patients who did not progress: 50% and 21% (P = 0.019). We also found less frequently polymorphic allele T of MDR-1 C3435T polymorphism in patients who progressed compared to patients who did not progress: 50% and 81% (P = 0.012). In acute leukemia response to the treatment, we found a trend toward a higher frequency of NQO1 C609T polymorphism in patients with induction failure compared to patients in remission, with acute leukemia in general, (P = 0.093) and AML patients only (P = 0.125); and induction failure when compared with the control group in acute leukemia in general (P = 0.101) and only in AML patients (P = 0.08). We observed the same trend when comparing the frequency of NQO1 C609T polymorphism in patients with early death versus normal population (P = 0.058). In conclusion, these results suggest that theses polymorphisms are not related to acute leukemia and MDS risk, although the sample analyzed here may have been insufficient; GST deletions and MDR-1 C3435T polymorphism are involved in MDS progression and NQO1 C609T polymorphism has a tendency to be related to induction failure and early death in patients with acute leukemia, in general, and AML only Mestrado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientadores: Ângela Cristina Malheiros Luzo, Sara Teresinha Olalla Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Lesões cartilaginosas raramente curam-se espontaneamente. As atuais opções terapêuticas cirúrgicas e não são limitadas ao alívio dos sintomas, mando a necessidade de futura substituição total de joelho. Terapia baseada em células tronco adultas representa uma alternativa promissora para os procedimentos existentes. As células-tronco mesenquimais (MSC) apresentam alta plasticidade celular e podem ser obtidas de diversas fontes teciduais, opção que exige grande aporte celular expondo a necessidade de criopreservação, processo vantajoso. Contudo, protocolos convencionais estão diretamente associados a possíveis danos e mortalidade celular, sendo desencadeados por formação de cristais de gelo intracelular, toxicidade do crioprotetor adotado e desidratação celular. Este projeto tem como objetivo investigar a interferência da criopreservação com dimetilsufóxido (Me2SO-) (DMSO) na capacidade de MSCs em diferenciação em linhagens mesodermais e arranjo de fibras de colágeno produzidas na diferenciação condrogência. MSCs foram obtidas de tecido adiposo (ADSC). Em quarta passagem foram caracterizadas por citometria de fluxo e diferenciadas em linhagem mesodermais. Diferenciação comprovada por análise morfológica e expressão gênica por de RT-PCR. Genes escolhidos ADIPOQ, FABP4 e PPARG linhagem adipogênica, AGCAN, SOX9, COL1A1 e COL2A1 linhagem condrogênica e OC, OPN e COL1A1 linhagem osteogênica. Diferenciação condrogênica realizada pela técnica de micromassa. Arquitetura das fibras colágenas observada por microscopia de Geração de Segundo Harmônico (SHG) de MSCs e images analisadas pelos algoritmos Fast Fourier Transform (FFT) e Gray Level Co-occurrence Matrix (GLCM). ADSCs criopreservadas em taxa controlada de congelamente com solução criprotetora de soro fetal bovino e 10% de DMSO, mesmos ensaios realizados após descongelamento. Células descongeladas submetidas aos mesmos protocolos de caracterização. Características morfológicas obtidas por SHG expressão gênica das células frescas e criopreservadas analisadas estatisticamente. Amostras de ADSC, fresca e criopreservadas, foram capazes de se diferenciar em linhagens mesodermais. Perfil de expressão gênica da linhagem adipogênica foi semelhante ao esperado para tal processo de diferenciação, em ambas amostras, criopreservadas e frescas, estas últimas com maior expressão (p=ns). Na diferenciação para linhagem osteogênica também houve o perfil de expressão esperado para os genes estudas, sendo mais expresso no grupo criopreservado (p=ns). Apesar do fato da expressão do gene COL2A1 de linhagem condrogênica ter sido maior no grupo criopreservado, quando o perfil de expressão gênica do grupo fresco foi analisado, este mostrou-se mais consistente com o perfil esperado normal. Análise das imagens de SHG demonstraram que a arquitetura das fibras colágenas foi mais organizada (p=ns) e uniforme (p>0,0001) nas amostras frescas. O grupo criopreservado demonstrou maior entropia (p=ns) e contraste (p=0,0167), demonstrando haver maior tendência direcional das fibras de colágeno nas amostras frescas. Os resultados de expressão gênica sugerem que a criopreservação pode interferir de forma positiva na diferenciação osteogênica e negativamente nas linhagens adipogênica e condrogênica. A arquitetura da rede tridimensional de colágeno foi modulada negativamente pelo processo de criopreservação, dados esses confirmados por análise das imagens obtidas por SHG, o que poderia interferir com as propriedades físico/mecânicas características do tecido colagenoso, importante na manutenção da cartilagem articular baseada em terapia celular. O uso das imagens de SHG tornou-se uma importante ferramenta na melhor avaliação das fibras colágenas Abstract: Cartilage defects rarely heal spontaneously. Current surgical and non-surgical therapeutic interventions are limited to symptom relief and future total knee replacement continues to be necessary. Adult stem cell based therapy could represent a promising alternative to this procedure. Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have great capacity of differentiation and can easily be obtained from various sources. Cryopreservation offers many advantages for practitioners engaged in cell-based therapies. However, conventional slow freezing, despite using cryoprotectant solution, has always been associated with damage and mortality due to intracellular ice formation, cryoprotectant toxicity, and dehydration. The aim of this work is to investigate whether the Dimethyl Sulfoxide (Me2SO-) (DMSO) cryopreservation process interferes with the MSCs capacity of differentiation to mesodermal lineages and/or with collagen fiber network architecture, produced by chondrogenic cells, comparing fresh and thawed MSCs. MSCs were obtained from adipocyte tissue (ADSCs). At the fourth passage cells were characterized as ADSCs by flow cytometry analysis and differentiation to mesodermic lineages was confirmed by morphology (light optical microscopy) and gene expression analysis (RT-PCR). The following genes were chosen ADIPOQ, FABP4 and PPARG for adipogenic lineage, AGCAN, SOX9, COL2A1 and COL1A1 for chondrogenic and OC, OPN and COL1A1 for osteogenic lineage. Chondrogenic differentiation was carried out by micromass technique. Collagen fibers architecture was observed by Second Harmonic Generation (SHG) microscopy. Images were analyzed by Fast Fourier Transform (FFT) and Gray Level Cooccurrence Matrix (GLCM) algorithms. ADSCs were cryopreserved in a controlledrate freezing device with bovine serum fetal and 10% DMSO as cryoprotectant solution. Thawed cells were submitted to the same characterization protocols. SGH morphologic features and gene expression results from thawed and fresh cells were statistically analyzed. Both, thawed and fresh ADSCs were able to differentiate into mesodermal lineages. Gene expression profile of adipogenic lineage was similar to that expected for the differentiation process in both, thawed and fresh cells, with greater expression in fresh ones (p=ns). Osteogenic lineage also demonstrated the expected gene expression profile, being more expressed in the thawed group (p=ns). Despite the fact that COL2A1 gene expression in chondrogenic lineage was greater in the thawed group, when the gene expression profile was analyzed the fresh group was more consistent with the expected normal profile. SHG images results demonstrated that collagen fibers architecture was more organized (p=ns) and uniform (p

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: As síndromes mielodisplásicas (SMDs) constituem um grupo heterogêneo de desordens hematopoéticas, caracterizadas por exibirem hematopoese ineficaz com evidências de displasia da medula óssea resultando em citopenias no sangue periférico. Tecnologia de microarranjo tem permitido o refinado mapeamento da atividade transcricional do genoma humano. RNAs não codificadores (ncRNAs) transcritos de regiões intrônicas de genes conhecidos estão envolvidos em vários processos relacionados com controle transcricional e pós-transcricional da expressão gênica, interações com cromatinas, modificação de histonas e também estão se tornando evidentes em vários tipos de cânceres. Caracterização de ncRNAs em células progenitoras e células estromais de pacientes com SMD representa uma estratégia aparentemente importante para o entendimento da regulação gênica nesta doença. Neste estudo, o perfil de expressão gênica de células CD34+ e estromais de pacientes com SMD do subgrupo anemia refratária com sideroblastos em anel (ARSA) foi comparado com o de indivíduos saudáveis, usando oligoarranjos de 44 kilobases contendo íntrons e éxons, o qual incluiu sequências para genes codificadores, RNAs sense e antisense totalmente e parcialmente intrônicos. Em células CD34+ de pacientes com SMD-ARSA, 216 genes foram diferencialmente expressos (q-value ? 0,01) em comparação com indivíduos saudáveis, dos quais 65 (30%) eram transcritos não codificadores. O gene DMT1, um transportador de ferro, foi encontrado hiperexpresso em células CD34+ de SMD-ARSA. Em medula óssea total de 34 pacientes, a expressão foi mais evidente no subgrupo de pacientes com SMD de baixo risco/INT-1. Ensaios de imuno-histoquímica corroboram os dados encontrados na análise de expressão gênica e demonstram que DMT1 se encontra mais expresso nas células eritroblásticas. A hiperexpressão de DMT1 pode estar relacionada com o homeostase do ferro anormal nas SMDs. Em células estromais de SMD-ARSA, 12 genes foram diferencialmente expressos (q-value ? 0,05) em comparação com indivíduos saudáveis, dos quais 3 (25%) eram transcritos não codificadores. O gene SEMA3A, um membro secretado da família das semaforinas, foi encontrado hiperexpresso em células estromais de SMD-ARSA e na medula óssea total de 34 pacientes; sua hiperexpressão foi mais evidente em pacientes com SMD de alto risco/INT-2 e em pacientes com leucemia mieloide aguda (n=19). Ensaios funcionais demonstraram que SEMA3A está envolvido com aumento da adesão, diminuição da diferenciação e apoptose de células leucêmicas cocultivadas com células estromais HS27 hiperexpressando SEMA3A e age de maneira parácrina sobre as células precursoras. Pela primeira vez, o perfil diferencial de ncRNA em células CD34+ e células estromais entre SMD-ARSA e indivíduos saudáveis foi demonstrado, sugerindo que ncRNA pode ter um importante papel durante o desenvolvimento das síndromes mielodisplásicas Abstract: Myelodysplastic syndromes (MDS) are a group heterogeneous of hematological disorders characterized by ineffective hematopoiesis with morphological evidence of marrow cell dysplasia resulting in peripheral blood cytopenia. Microarray technology has permitted a refined high-throughput mapping of the transcriptional activity in the human genome. Noncoding-RNAs (ncRNAs) transcribed from intronic regions of genes are involved in a number of processes related to post-transcriptional control of gene expression, and chromatins interaction, and histone modification and they are becoming evident in several cancers. Characterization of ncRNAs in progenitor cells and stromal cells of MDS patients could be strategic for understanding gene expression regulation in this disease. In this study, gene expression profiles of CD34+ and stromal cells of MDS patients with refractory anemia with ringed sideroblasts (RARS) subgroup were compared those of healthy individuals, using 44 kilobases combined introns and exons oligoarrays, which included probes for protein-coding genes, for sense and antisense strands of totally and partially intronic noncoding RNAs. In CD34+ cells of MDS-RARS patients, 216 genes were significantly differentially expressed (q-value ? 0.01) in comparison to healthy individuals, of which 65 (30%) were noncoding transcripts. The DMT1 gene, an iron-transporter, was found up-regulated in CD34+ cells of MDS-RARS. In the total bone marrow of 34 patients, the expression of DMT1 was more evident in the subgroup of low risk/INT-1 MDS patients. The immunohistochemistry assay confirms the data obtained in the gene expression assay and show that DMT1 is more expressed in erythroid cells. The higher expression of DMT1 can be related with abnormal iron homeostasis in MDS. In stromal cells of MDS-RARS, 12 genes were significantly differentially expressed (q-value ? 0.05) in comparison to healthy individuals, of which 3 (25%) were noncoding transcripts. The SEMA3A gene, a secreted member of the semaphorins family, was found up-regulated in stromal cells of MDS-RARS and in the total bone marrow of 34 patients; further, the higher expression was more evident in high risk/ INT-2 subgroup of MDS patients and acute myeloid leukemia patients (n = 19). Functional assays demonstrated that SEMA3A is related to adhesion increase, differentiation decrease, and apoptosis of leukemia cells cocultivated with HS27 stromal cells higher expressing SEMA3A, also acting in a paracrine fashion in the precursors cells. These results demonstrated, for the first time, in CD34+ cells and stromal cells the differential ncRNA expression profile between MDSRARS and healthy individuals, suggesting that ncRNAs may play an important role during the development of myelodysplastic syndromes Doutorado Medicina Experimental Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Joyce Maria Anichino-Baizzacchi Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: As células endoteliais participam da hemostasia com efeitos pró e antitrombóticos, que podem ser estimulados por uma lesão endotelial. A presença de células endoteliais na circulação pode ser considerada um novo marcador de integridade vascular, como já descrito em várias patologias tais como: doenças cardiovasculares, doenças infecciosas, doenças imunes, transplantes, anemia falciforme. Os objetivos do nosso estudo foram: padronizar a identificação e quantificação das células endoteliais circulantes (CECs) e das células endoteliais progenitoras (CEPs) em um grupo de pacientes com trombose venosa profunda (TVP) ao diagnóstico (aguda, 1ª coleta) e após no mínimo 6 meses (2ª coleta), em um grupo de TVP crônica e em um grupo controle; padronizar um modelo animal de TVP induzida por lesão endotelial para avaliar as CECs e CEPs no sangue periférico e no trombo venoso. O grupo de TVP aguda foi composto por 9 pacientes [F: 7; M: 2; 45 anos (26 - 54 anos)], sendo recrutados 6 indivíduos para uma 2ª coleta [F: 5; M: 1; 47,5 anos (27 - 55 anos)], no grupo de TVP crônica foram incluídos 10 pacientes [F: 6; M: 4; 44,5 anos (28 - 56 anos)] e no grupo controle 11 voluntários [F: 9; M: 2; 29 anos (21 - 52 anos)]. A identificação das CECs e CEPs no sangue periférico foi realizada por citometria de fluxo. No modelo animal, a TVP foi induzida por lesão endotelial com uma solução de FeCl3 a 15%. Após a indução da TVP as CECs e CEPs foram avaliadas no sangue periférico nos tempos: 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 24 horas, 48 horas e 72 horas. O trombo venoso formado na veia cava inferior (VCI) foi avaliado pela coloração de Verhoff van Gienson e a presença de CECs e CEPs por imunofluorescência. Houve uma diferença estatística no número das CECs (P=0.001, CD31+CD144+CD45dimCD133-; P

Orientadores: Antonio Condino Neto, Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado)- Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: SIRP 'alfa'(Signal Regulatory Protein 'alfa') é um receptor que medeia funções inibidoras em fagócitos. Sua ativação e conseqüente fosforilação dos ITIMs ocorre pela ligação ao CD47 presente na membrana dos eritrócitos, e permite o recrutamento e a ativação de SHP-1, a qual desfosforila substratos específicos envolvidos na mediação de diversos efeitos fisiológicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da dexametasona (dexa) e de IFN?/TNFa sobre a expressão de SIRPa e SHP-1; a consequência desta regulação sobre a eritrofagocitose; e o nível de expressão gênica de SIRPa e SHP-1 em monócitos de pacientes com anemia hemolítica autoimune (AHAI) antes e depois de corticoterapia. Monócitos de doadores sadios e células mielomonocíticas U937 foram cultivados por 48 horas com dexa (1µM) ou IFN? (100U/ml) e TNFa (1000U/ml), por 6 horas com Hemina® (30uM), ou por 72 horas com prednisolona (0,15 e 1mg/l). Monócitos foram isolados de pacientes com AHAI antes e depois da corticoterapia. A expressão gênica de SIRPa e SHP-1 foi determinada por PCR em Tempo Real, a expressão protéica de SIRPa e SHP-1 foi determinada por Western Blotting, e a capacidade de eritrofagocitose foi determinada por microscopia. IFN? e TNFa, in vitro, promoveram o aumento da expressão gênica e protéica de SIRPa e a expressão gênica de SHP-1, em paralelo com a redução da capacidade de eritrofagocitose em monócitos normais. Em contrapartida, embora tenha aumentado a expressão gênica de SIRPa e SHP-1, dexa in vitro não alterou a expressão destas proteínas, assim como não alterou a capacidade de eritrofagocitose de monócitos normais. A expressão gênica de SIRPa e SHP-1 foi maior em monócitos de pacientes com AHAI em comparação a doadores sadios. Após corticoterapia, a expressão gênica de SIRPa e SHP-1 em monócitos de pacientes com AHAI se mostrou similar a doadores sadios. Pacientes com AHAI estudados antes da corticoterapia apresentaram baixos níveis de hemoglobina e após corticoterapia esse índice de mostrou normal. A expressão gênica de SIRPa foi aumentada pela cultura de monócitos com hemina, mas a expressão de proteína permaneceu a mesma. Nossos resultados confirmam o papel fundamental da SIRPa na regulação da eritrofagocitose e sugere que a expressão de mRNA de SIRPa em monócitos de pacientes com AHAI antes de corticoterapia é aumentada pela liberação de heme, e que a redução da expressão gênica de SIRPa após corticoterapia se deve a um efeito indireto desta droga pela redução da eritrofagocitose e diminuição da disponibilidade de heme. Abstract: SIRPa (Signal Regulatory Protein a) is an inhibitory receptor in phagocytes. Its activation and consequent phosphorylation of ITIMs occurs by the binding to CD47 on erythrocyte membrane, what allows SHP-1 recruitment, which dephosphorylates specific substrates involved in the mediation of several physiologic effects. The aim of this work was to determine the role of dexamethasone and IFN?/TNFa upon SIRPa and SHP-1 expression, and the consequence of this regulation over erythrophagocytosis; and to evaluate the regulation of SIRPa and SHP-1 in peripheral blood monocytes (PBM) of autoimmune hemolytic anemia (AIHA) patients before and after glucocorticoid (GC) therapy. PBM from healthy donors and U937 myelomonocytic cells were cultured for 48 hours with dexamethasone (1µM) or IFN? (100U/ml) and TNFa (1000U/ml), for 6 hours with Hemin (30uM), or for 72 hours with prednisolone (0.15 and 1mg/l). PBM were isolated from AIHA patients under GC therapy or not. SIRPa and SHP-1 gene expression was determined by Real Time PCR, SIRPa and SHP-1 protein level was determined by Western Blotting, and erythrophagocytosis was determined by microscopy. IFN? and TNFa increased SIRPa gene and protein expression and SHP-1 gene expression, in parallel with a decrease in erythrophagocytosis ability in PBM. On the other hand, although SIRPa and SHP-1 gene expression was significantly increased, dexamethasone did not alter SIRPa and SHP-1 protein expression, and did not alter erythrophagocytosis ability in monocytes. SIRPa and SHP-1 expression was significantly higher in PBM from AIHA patients compared to normal. After GC therapy, SIRPa and SHP-1 expression was similar in PBM of AIHA patients compared to healthy donors. AIHA patients studied before glucocorticoid therapy showed low hemoglobin and after glucocorticoid therapy the level of hemoglobin was normal. SIRPa gene expression was increased by culture with hemin, but protein expression remained the same. Our results confirm the key role of SIRPa in erythrophagocytosis regulation and suggest that SIRPa mRNA expression in AIHA patients before glucocorticoid therapy is increased by heme release, and the decrease of SIRPa gene expression after glucocorticoid therapy is due to an indirect effect of this drug by the reduction of erythophagocytosis and free heme availability. Doutorado Doutor em Farmacologia

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: ARHGAP21 é uma proteína pertencente à família RhoGAP e apresenta atividade GAP sobre Cdc42 e RhoA, interage com ARF-GTPases e com a-catenina, modulando a dinâmica da actina associada às membranas do Golgi e a integridade das junções aderentes. Devido ao relato da elevada expressão de ARHGAP21 em tecido nervoso surgiu o objetivo da presente tese que foi avaliar a expressão e a função de ARHGAP21 no tecido neural normal e neoplásico. Nossos resultados mostraram que ARHGAP21 localiza-se no núcleo e na região peri-nuclear de vários tipos celulares, e nos prolongamentos celulares de neurônios primários, e interage com FAK na região peri-nuclear. Os resultados da depleção de ARHGAP21 por moléculas de shRNAi indicaram que ARHGAP21 inibe a migração de células derivadas de glioblastoma multiforme através do controle negativo de ARHGAP21 sobre Cdc42, pela inativação da sinalização FAK?p130CAS, e pelo controle da secreção de metaloprotease-2. Além disso, a expressão da proteína ARHGAP21 correlaciona-se com o grau tumoral de astrocitomas in vivo, indicando a existência de um possível controle negativo de ARHGAP21 sobre a transformação ainda maior destas células, já que sua depleção in vitro resultou em aumento do grau tumoral. Em tecido cerebral normal, evidenciamos elevada expressão de ARHGAP21 em córtex e cerebelo humano. Além disso, o gene ARHGAP21 murino mostrou-se altamente expresso em E17, dia em que termina a migração de precursores neurais e que coincide com a queda de expressão de Mmp-2. Portanto, ARHGAP21 demonstrou, em sistema nervoso normal, controle semelhante sobre a expressão do gene Mmp-2 ao observado em linhagens de glioblastoma. Nossos resultados sugerem que ARHGAP21 pode ser uma poderosa reguladora da migração celular em diferentes tecidos e, assim, ter papel crucial no controle da progressão de diferentes tipos tumorais. Abstract: : ARHGAP21 is a RhoGAP protein with GAP activity over Cdc42 and RhoA, it also interacts with ARF-GTPases and with a-catenin, controlling actin dynamics on Golgi membranes and the integrity of adherens junctions, respectively. Due to ARHGAP21 high expression levels in nervous tissues has emerged the objective of the present thesis that was evaluate the expression levels and the function of ARHGAP21 in the normal and neoplasic nervous system. Our results evidenced that ARHGAP21 localizes to the nucleus and perinuclear region of several cell types, and on cell protrusions in primary mouse neurons, and interacts with FAK in the perinuclear region. Results of ARHGAP21 depletion by shRNAi molecules evidenced that ARHGAP21 inhibits glioblastoma cell migration through the negative control of Cdc42, the inhibition of FAK?p130CAS signaling, and through the control of metaloprotease 2 secretion. Besides that, ARHGAP21 expression correlates to tumor grade on astrocytomas samples, indicating the existence of a negative control of ARHGAP21 on astrocytoma cellular transformation, since its depletion in vitro resulted in higher malignity of T98G glioblastoma cell line. In normal cerebral tissue, ARHGAP21 murine gene is highly expressed on E17 animals, day in which neuronal precursor's migration finishes and when there is a reduction in mmp-2 expression. Therefore, ARHGAP21 showed in normal nervous system, similar control of mmp-2 gene expression as observed in glioblastoma cell lines. Our results suggest that ARHGAP21 might be a master regulator of cellular migration in different tissues and, like this, it may has a crucial role in the control of tumor progression. Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Importante passo para a compreensão dos processos fisiopatológicos das neoplasias é a identificação de genes ativamente expressos e das funções biológicas de cada proteína codificada por estes genes. Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 (ANKHD1) foi inicialmente identificada em células de adenocarcinoma de próstata humano (LNCaP), no ano de 2003. Entretanto, seu padrão de expressão e sua função ainda não haviam sido caracterizados. A ANKHD1 é uma proteína ortóloga à Multiple Ankyrin repeat and single KH domain (Mask) da Drosophila melanogaster. Mask foi identificada através de um rastreamento genético utilizado para detectar novas proteínas associadas à proteína tirosina fosfatase Corkscrew (CSW), homóloga à Src Homology-2 domain-containing protein tyrosine Phosphatase-2 (SHP2) humana. SHP2 é uma fosfatase de tirosina citoplasmática codificada pelo gene PTPN11 e exerce papel fundamental no desenvolvimento da hematopoese normal e leucêmica. Os objetivos gerais do presente estudo foram caracterizar o padrão de expressão gênica e protéica de ANKHD1 em células hematopoéticas normais e leucêmicas e sua participação nas vias de sinalização celular. Neste estudo, foi demonstrada a elevada expressão gênica e protéica de ANKHD1 em linhagens de leucemias agudas humanas (KG-1, HEL, K562, NB4, HL-60, Jurkat, MOLT4, Raji, Daudi e Namalwa) e em amostras de 38 pacientes com diagnóstico de leucemia aguda, quando comparadas às células hematopoéticas normais. A expressão protéica de ANKHD1 em diferentes tecidos humanos normais (rim, baço, estômago, intestino delgado, músculo esquelético, fígado, pulmão e linfonodo) foi detectada em intensidades variáveis. A associação da ANKHD1 com SHP2 foi identificada, através de Western Blotting, em células de leucemia mielóide crônica em fase blástica (K562) e células LNCaP. Entretanto, esta associação não foi detectada nas linhagens leucêmicas KG1, HL60, Daudi e Jurkat. A ANKHD1 foi localizada no citoplasma de células hematopoéticas normais e leucêmicas. Detectou-se a fosforilação de ANKHD1 em serina em células leucêmicas, mas não em células hematopoéticas normais. Através de ensaio de duplo híbrido em levedura, utilizando-se uma biblioteca de cDNA de medula óssea humana normal, detectou-se a interação de ANKHD1 com as proteínas SIVA1 e SIVA2, proteínas pró-apoptóticas altamente expressas em linhagens de leucemia linfóide aguda. Análises preliminares indicaram que a inibição da expressão protéica de ANKHD1, através de RNAi, induziu à apoptose celular em células leucêmicas, sugerindo uma função anti-apoptótica à ANKHD1. Em conclusão, o presente estudo identificou ANKHD1 como uma nova proteína altamente expressa em leucemias agudas, associada à SHP2 e SIVA em diferentes células, e, possivelmente, envolvida com o fenótipo anormal da célula leucêmica através de uma função anti-apoptótica. Os achados aqui descritos sugerem que ANKHD1 pode ser uma molécula alvo para a terapia da leucemia no futuro, e permitirão direcionar novos estudos com o objetivo de melhor elucidar as funções específicas de ANKHD1 em diferentes células hematopoéticas normais e leucêmicas Abstract: One step in the path towards building a comprehensive molecular portrait of human cancer is the definition of actively expressed genes and the function of their coding proteins. The Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 protein (ANKHD1) was first described in humans in a prostate carcinoma cell line LNCaP, in 2003; however, its expression pattern and its function have not yet been described. ANKHD1 is an orthologous protein of the Drosophila melanogaster, MASK (Multiple Ankyrin repeat and single KH domain), where it was first identified using a genetic screen designed to discover proteins that interact with the protein tyrosine phosphatase Corkscrew (CSW), which is a homolog to the SH2-containing protein tyrosine phosphatase (SHP2) in humans. SHP2 is a cytoplasmic protein-tyrosine phosphatase, coded by the PTPN11 gene and plays an important role in the development of normal hematopoiese and leukemogenesis. The aim of the present study was to characterize the gene and protein expression pattern of ANKHD1 in normal hematopoietic cells and in leukemia cells, and its role in signaling pathways. In the present study, the overexpression of ANKHD1 mRNA and its protein was demonstrated in human leukemia cell lines (KG-1, HEL, K562, NB4, HL-60, Jurkat, MOLT4, Raji, Daudi and Namalwa) and in 38 patients with a diagnosis of acute leukemia, compared to normal hematopoietic cells. The ANKHD1 protein was found to have a variable expression in different normal tissues (kidney, spleen, stomach, small intestine, skeletal muscle, liver, lung and lymph node). An association of ANKHD1 and SHP2 was found, through imunopreciptation and Western Blotting, in the chronic myeloid leukemia blastic phase cell line (K562) and in LNCaP cells. However, this association was not detected in the leukemia cell lines, KG1, HL60, Daudi and Jurkat. ANKHD1 was found located in the cytoplasm of normal hematopoietic cells and leukemia cells. ANKHD1 was found to be phosphorylated at serine in leukemic cells, but not in normal hematopoieitic cells. Through the yeast two-hybrid system, using a cDNA library from normal human bone marrow, the interaction of ANKHD1 with SIVA1 and SIVA2 was detected. SIVA isoforms are pro-apoptotic proteins, overexpressed in acute lymphoblastic leukemia cell lines. Preliminary studies showed that the inbition of ANKHD1 expression, through RNAi, resulted in increased apoptosis in leukemic cells, which suggests an anti-apoptotic function for ANKHD1. In conclusion, the present study identified ANKHD1 as a new protein that is overexpressed in leukemic cells. The protein interacts with SHP2 and SIVA in different cells and is probably associated with the abnormal phenotype of the leukemia cell through its anti-apoptotic function. These findings suggest that ANKHD1 may be a molecular target for a rational therapy for leukemia in the near future, and open a new field of investigation to better define the specific roles of ANKHD1 in different normal and leukemic hematopoietic cells Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Jose Andres Yunes Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A resistência intrínseca ou adquirida aos compostos quimioterápicos é uma das mais importantes causas dos insucessos no tratamento das LLAs pediátricas. A interação da LLA com o microambiente da medula óssea contribui para a proliferação e resistência ao regime quimioterápico das células leucêmicas através de uma grande variedade de mecanismos celulares que provavelmente incluem: aumento da expressão de transportadores celulares, aumento no processo de reparo do DNA, diminuição na regulação dos alvos das drogas, mudanças na regulação do ciclo celular e alteração nas vias apoptóticas. No presente estudo observou-se que a interação estabelecida entre células estromais e células de LLA-B, promoveu a ativação destas como avaliado pela análise das moléculas de superfície das células leucêmicas ao longo dos períodos de cultivo, além da sobrevivência e/ou proliferação em mais de 60% dos casos in vitro. A comunicação entre os dois tipos celulares também mostrou a influência do estroma na modulação da expressão transcricional de 17 genes relacionados com a resistência e sensibilidade a quimioterápicos em células de LLA-B. A modulação teve como conseqüência o aumento nos níveis de expressão da maioria dos genes de resistência e a queda de expressão da maioria dos genes de sensibilidade. Sendo assim, a LLA, pela interação com as células estromais, apresentaram uma alteração que as levou a um fenótipo característico de células resistentes. Essa alteração de expressão mediada pelo contato com o estroma foi confirmada por estudos funcionais de dois genes relacionados com a resistência. O gene KCNN4 em linhagens celulares, que quando submetidas à ação do clotrimazol apresentaram maior viabilidade na presença do que na ausência do estroma; e a adição da proteína recombinante IGFBP-7 no sistema de co-cultura promoveu a resistência e até mesmo proliferação na presença da L-asparaginase. Esta proteína também se mostrou atuante na proliferação das células estromais. Estes resultados mostram dois genes de LLA, que quando modulados pelo contato com o estroma podem contribuir com a maior resistência ao regime quimioterápico, podendo vir a ser usados como alvo para posteriores terapias Abstract: The intrinsic or acquired chemotherapy resistance composites one of the most important causes of failures in the treatment of pediatric ALL. The ALL and bone marrow microenvironment nteraction contributes for the proliferation and resistance to the chemotherapy regimen of leukemic cells probably through a great variety of cellular mechanisms, including increase of the expression of cellular transporters, increase in the process of DNA repair, downregulation of drugs targets, changes in the regulation of cellular cycle and alteration in the apoptotic ways. In the present study it was observed that the interaction established between stromal cells and pre-B ALL, evaluated through analysis of surface molecules in leukemic cells throughout the periods of culture, were important for the survival and/or proliferation in more than 50% of the cases in vitro. This interaction also showed the influence of stroma in the transcriptional profile of 17 genes related with the resistance and sensitivity to chemotherapeutic agents in pre-B ALL cells. The modulation had as consequence the increase in the levels of expression of the majority of the resistance genes and the decrease of expression of the majority of the sensitivity genes. Being thus, these cellular types, for the interaction with the stromal cells, had presented an alteration that took them to one phenotype characteristic of resistant cells. This stroma-mediated alteration was confirmed by functional studies of two genes related with the resistance. Gene KCNN4 three leukemic cell lines, that when submitted to the action of clotrimazole they had presented greater viability in the presence than in the absence of stroma; and the addition of recombinant protein IGFBP-7 in the co-culture system promoted the resistance and proliferation of primary ALL cells in the presence of the L-asparaginase. This protein also induced proliferation of stromal cells. These results show two genes of ALL, that when modulated for the contact with stroma, can contribute with a resistance to the chemotherapic regimen, becoming possible targets for posterior therapies Mestrado Genética Animal e Evolução Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Fernando Ferreira Costa Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: AHSP é uma proteína eritróide específica que apresenta afinidade de ligação com a-globinas, estabilizando essas moléculas e dessa forma, evitando a precipitação nos precursores eritróides e bloqueando danos celulares causados pela oxidação de cadeias globínicas. Camundongos portadores de P-talassemia com deleção do gene AHSP apresentaram maior precipitação de cadeias a-globinas nas hemácias e níveis acentuados de anemia. Estudos in vitro utilizando proteína recombinante demonstraram menor geração de espécies reativas de oxigênio quando a-globinas encontram-se estabilizadas pela AHSP. Com o objetivo de analisar a importância da proteína AHSP como modulador de gravidade clínica nas síndromes P-talassêmicas o gene AHSP foi analisado em amostras de DNA de pacientes com P-talassemia, atendidos pelo Hemocentro da Unicamp, e em amostras controles durante minha tese de mestrado. Durante estes estudos, três características do gene AHSP foram detectadas. Estas características do gene AHSP foram investigadas durante o desenvolvimento deste presente trabalho. Primeiro, um polimorfismo localizado no posição 12888 no gene AHSP, que leva a substituição de uma Asparagina na posição 75 por uma Isoleucina (N75I), foi identificado em uma paciente heterozigota para P-talassemia (Pj9/pA) com anemia grave e em processos transfusionais freqüentes. Outras duas famílias apresentaram o polimorfismo N75I. Entretanto, nestes casos a presença do polimorfismo no gene AHSP não se correlaciona claramente com a gravidade clínica. O sequênciamento de amostras de indivíduos controles de várias partes do mundo sugerirão uma baixa freqüência deste polimorfismo na população analisada. Estudos de indivíduos saudáveis positivos para o polimorfismo N75I demonstraram precipitação e oxidação de cadeias globínicas nas hemácias. Análises funcionais com proteína recombinante sugerem que a proteína AHSP N75I apresenta características de ligação com a-globínas normais, mas é menos eficiente em evitar geração de espécies reativas de oxigênio por estas cadeias globínicas. Estes efeitos, quando em conjunto com ?-talassemia poderiam resultar em anemia mais grave, demonstrando a proteína AHSP N75I como um modificador genético nas síndromes talassêmicas. Segundo, através de análises computacionais, nós identificamos uma estrutura secundária na região 3'-UTR do RNA mensageiro do gene AHSP. semelhante a um elemento responsivo a ferro (IRE), presente em todas as espécies que apresentam o gene AHSP. Várias evidências demonstraram que, mesmo não apresentando as características principais para a caracterização de um IRE, esta estrutura secundária do gene AHSP é reconhecido pelas proteínas reconhecedoras de IREs (IRPs) regulando a estabilidade da molécula de RNA mensageiro em resposta aos níveis de ferro: 1) Recuperação do RNA mensageiro do gene AHSP através da imunoprecipitacão das proteínas IRP1 e IRP2: 2) Níveis elevados de ferro desestabilizam o RNA mensageiro do gene AHSP: mutações neste IRE levam à desestabilização constitutiva do RNA mensageiro; 3) Níveis elevados de ferro desestabilizam o RNA mensageiro do gene AHSP em camundongos que apresentam excesso de ferro. Estes dados contribuem para o melhor entendimento de como IRE atípicos podem ainda ser funcionais e sugerem um mecanismo que poderia regular a estabilidade de cadeias globínicas de acordo com os níveis de ferro. Além disso, sugerem que o excesso de ferro, que ocorre em pacientes com (3-talassemia. podem ser determinante na gravidade da doença por, provavelmente, aumentar os níveis de a-globinas livres e precipitando nos precursores eritróides. E, em terceiro, através de busca de sítios de ligação de fatores de transcrição no gene AHSP, nós encontramos um elemento MARE localizado no final do segundo éxon. Estudos de imunoprecipitaçâo de cromatina demonstraram ligação dos fatores de transcrição Nrf2, Bachl e Maf ao elemento MARE do gene AHSP e regiões controle. Concluindo, estes resultados demonstraram pela primeira vez um polimorfismo no gene AHSP que produz uma proteína não completamente funcional que pode estar relacionada com gravidade à p-talassemia e, além disso, descrevem dois mecanismos inéditos da regulação da expressão do gene AHSP que podem ser importantes na regulação deste gene em outras doenças hematológicas e durante a eritropoiese Abstract: Alpha-hemoglobin stabilizing protein (AHSP) is an erythroid-specific molecular chaperone that binds the cx-chains of hemoglobin, preventing their precipitation and deleterious effects. Loss of AHSP exacerbates a-globin precipitation and anemia in a murine model for p-thalassemia. In vitro, recombinant AHSP inhibits the production of reactive oxygen species (ROS) by a-globin. To further define the role of AHSP as a modifier of P- thalassemia, we analyzed AHSP sequence for mutations in a large population of (3- thalassemic and control subjects. From this genomic screening three interesting features of the AHSP gene were found. First, a single nucleotide change that converts asparagine 75 to leucine (N75I) was identified in a patient who was heterozygous for P-thalassemia (p39/(3A). She presented with an unusually severe anemia that required regular blood transfusion. Another two families were positive detected for the SNP N75I. but the presence of other known genetic modifiers for thalassemia in these families made hard to correlate clinical severity with AHSP. Of the unrelated control subjects tested just one (0.35%) contained the SNP N75I. Analysis of red blood cells from this subject revealed normal hemoglobin indices but a small number of Heinz bodies, suggesting a non-fully functional AHSP. Analysis of the biochemical properties of the recombinant mutant protein showed that the binding affinity of AHSP N75I for a- hemoglobin is normal. Importantly, compared to wild type AHSP, the N75I mutant protein exhibited significantly reduced capacity to inhibit ROS production by a-hemoglobin. Hence, AHSP N75I may be less effective at conferring protection from oxidative-mediated damage by free a-hemoglobin in erythrocytes. These effects, when coupled with P-thalassemia, could result in more severe anemia, implicating AHSP N75I as a potential genetic modifier. Second, by computational algorithms, we identified IRE-like stem-loop structures in AHSP mRNA of multiple species, yet the primary sequences deviate significantly from canonical IRE consensus sequences determined by studies of classical IREs, such as Transferring receptor and Ferritin. Several lines of evidence now show that the AHSP IRE binds IRPs to regulate mRNA stability in an iron-dependent fashion: 1) AHSP mRNA co-immunoprecipitates with IRPs. 2) AHSP mRNA is destabilized by iron in both erythroid and heterologous cells; disruption of the IRE renders the mRNA constitutively unstable. To study how iron regulates AHSP expression in vivo, we treated mice with iron dextran for 10 days and then examined AHSP mRNA in Terll9+ erythroid progenitors by RT-PCR. We found that short-term iron overload reduced AHSP mRNA levels. Our findings indicate that AHSP mRNA stability is regulated by iron via an atypical 3'-UTR IRE. These findings extend the potential repertoire for functional IREs that do not conform as the previously defined canonical consensus sequences. In addition, they provide a potential mechanism by which erythroid cells can regulate globin stability according to iron status. As such, iron overload, which occurs in patients with p thalassemia, might aggravate the disease by further elevating the levels of toxic free a globin. And third, by computation analysis of transcriptional sites, we found a potential MARE element located at the end of the second exon. Experiments of chromatin imunoprecipitation assay determined the binding of the transcript factor Nrf2, Bachl and Maf to the MARE element of AHSP gene, as well to the positive controls. Overall, these results demonstrated for the first time a polymorphism on AHSP gene that produce a non fully functional protein that might be correlated with severity in p-thalassemia and two new mechanisms that control the AHSP gene expression with potential implications in another hematological diseases besides thalassemias and closely connecting AHSP with erythropoiesis Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientador: Claudia Bincoletto Trindade Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Estudos experimentais envolvendo a caracterização fármaco-toxicológica de novos fármacos são de grande importância na pesquisa inicial sobre drogas (ERDAL et al., 2005). Sendo assim, neste projeto um dos nossos objetivos iniciais foi avaliar os possíveis efeitos antineoplásicos de uma nova classe de drogas organometálicas contendo paládio como metal de transição, denominada paladaciclo ferroceno 1:2, utilizando para isto, a linhagem de células leucêmica K562 (leucemia mielóide crônica) e Jurkat (leucemia linfóide aguda). Os valores de IC50% obtidos na linhagem K562 após 72 horas de tratamento com o composto paladaciclo foram 4,1 e 2,9 µM, nos testes de redução do MTT e exclusão por azul de trypan, respectivamente. Através da fragmentação de DNA observamos que o composto foi capaz de induzir apoptose nas células K562 e Jurkat. Aspectos morfológicos de apoptose nestas células também foram confirmados através da coloração de acredine orange visualizadas em microscopia de fluorescência nas células K562. Utilizando acredine orange, um corante que tem a característica de se acumular principalmente em lisossomas secundários de células tumorais, nós também analisamos o mecanismo bioquímico envolvido no processo de morte celular das células K562 induzidas pelo composto paladaciclo. Nossos resultados demonstraram que a expressão dos genes envolvidos no controle da apoptose (Bcl-2 e Bax) em ambas as linhagens celulares tratadas com o paladaciclo é similar ao controle sem tratamento. Por outro lado, o composto em estudo (6,0 µM) induziu a permeabilização da membrana lisossomal de células K562 após 5 horas de tratamento com ativação das caspases efetoras da apoptose 3 e 6. Este processo de ativação das caspases também foi observado após 72 horas de incubação com o paladaciclo. Como a catepsina B está abundantemente presente nos lisossomoas e sua liberação para o citosol é esperada após alterações da permeabilidade da membrana lisossomal, investigamos também a ativação de ambas as caspases, descritas acima, após a incubação das células K562 com um inibidor de catepsina B (CA074) por 2 horas antes da exposição ao paladaciclo (6,0 µM). Este estudo forneceu um resultado bastante interessante, pois demonstrou que a ativação das caspases efetoras da morte celular programada foi prevenida, sugerindo assim que a catepsina B está fortemente associada ao processo apoptótico em células K562. Sendo assim, podemos sugerir que o composto paladaciclo apresenta potencial antileucêmico, merecendo estudos adicionais que comprovem sua eficácia terapêutica Abstract: Experimental studies involving the pharmaco-toxicogical properties of new drugs are of very importance in its initial development (ERDAL et al., 2005). In this study it was evaluated the possible antileukemic effects of a new organometallic class of drugs called palladacycle ferrocene 1:2, using the K562 and Jurkat leukaemia cell lines. The cell death mechanism of cytotoxicity induced by the Biphosphinic Palladacycle Complex (BPC) was studied using a K562 leukaemia cell line. The IC50% values obtained for K562 cells post 72 h of BPC were less than 5.0 µM by using MTT and trypan blue assays. Complex triggers apoptosis in K562 and Jurkat cells, inducing DNA fragmentation, as analysed through electrophoresis. Using the Acridine Orange (AO) vital staining combining fluorescence microscopy it was confirmed the presence these process in K562 cells. Lysosomal membrane permeabilization was also observed in K562 cells post 5 h of BPC, which suggests intralysossomal accumulation by proton-trapping, previous study, revealed that its pKa value ranged from 5.1 to 6.5. Caspase-3, and -6 activity induced by BPC in K562 cells was prevented by the cathepsin B inhibitor (CA-074). These events occurred in the presence of endogenous Bcl-2 and Bax expression. Taken together, these data suggest a novel lysosomal pathway for BPCinduced apoptosis, in which lysosomes are the primary target and cathepsin B acts as death mediator Mestrado Farmacologia Mestre em Farmacologia

Orientador: Mary Luci de Souza Queiroz Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Neste trabalho investigamos os efeitos do extrato de Chlorella vulgaris (ECV) em animais expostos ao chumbo e infectados com Listeria monocytogenes. Para a realização dos experimentos, camundongos receberam simultaneamente doses do ECV e acetato de chumbo durante 10 dias. Ao final deste período os animais foram infectados. A capacidade do ECV de reverter a mielossupressão induzida pelo chumbo foi demonstrada pelo aumento no número de CFU-GM e restabelecimento do potencial clonogênico das células pluripotentes da medula óssea em culturas de longa duração (LTBMC). A administração da alga aumentou a atividade das células NK e a capacidade proliferativa de linfócitos nos animais expostos ao chumbo e infectados. A eficácia da Chlorella nestes modelos foi demonstrada pela ação quelante do ECV, onde observamos uma redução de 34% nos níveis de metal no sangue quando a alga foi administrada simultaneamente ao chumbo. Além disso, experimentos com camundongos C57BL/6 com deficiência funcional do gene para IFN-g, demonstraram a importância dessa citocina na proteção conferida pelo ECV. O tratamento com o ECV estimulou a secreção de citocinas do tipo Th1 (IL-1, IFN-g e TNF-a) no grupo infectado e normalizou os níveis dessas citocinas nos grupos expostos ao chumbo e infectados/expostos ao chumbo. Da mesma forma, a produção de citocinas do tipo Th2 (IL-6 e IL10) foi significativamente modulada pelo extrato da alga nos grupos expostos ao chumbo, infectados e infectados/expostos ao chumbo Abstract: In this work, we investigated the effects of Chlorella vulgaris extract (CVE) in lead-exposed and Listeria monocytogenes infected mice. Experiments were carried out in mice treated simultaneously with CVE and lead acetate for 10 days. At the end of this period, the animals were infected. The capacity of CVE to prevent the myelosuppression induced by lead was demonstrated by the increased numbers of CFU-GM in clonal assays and the restored clonogenic potential of pluripotent stem cells in long-term bone marrow cultures (LTBMC). The extract also stimulated NK cell activity and lymphocyte proliferation in lead-exposed and infected animals. A 34% reduction of blood lead levels was observed when CVE was given to mice simultaneously to lead acetate, suggesting a chelating activity of Chlorella. Experiments in mice lacking a functional IFN-g gene demonstrated that this cytokine is of paramount importance in the protection afforded by CVE. The CVE treatment stimulated the secretion of Th1 cytokines (IL-1, IFN-g e TNF-a) in the infected group, and normal levels of these cytokines were determined in the lead-exposed groups. Likewise, the production of Th2 type cytokines (IL-6 and IL-10) was modulated by the algae extract in all groups studied. Doutorado Doutor em Farmacologia

Orientador: Sara Teresinha Ollala Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A reconstituição da linhagem hematopoiética é um procedimento comum no tratamento de várias doenças hematológicas e não hematológicas. A medula óssea tem sido a principal fonte de obtenção de células tronco nos últimos 50 anos. Recentemente, células tronco obtidas de sangue periférico pós-mobilização e células mononucleares de sangue de cordão umbilical humano têm sido utilizadas com sucesso. Entretanto, as células tronco parecem ter características diferentes. Vários estudos foram publicados, recentemente, analisando a expressão gênica de sub populações de células tronco de linhagem hematopoiética de medula óssea, sangue periférico e de sangue de cordão. Tendo em vista que os procedimentos de terapia celular e transplante são realizados com a infusão de sangue total, o objetivo deste trabalho foi de analisar a expressão gênica das células mononucleares totais de sangue de cordão umbilical humano, a partir da técnica de análise seriada de expressão gênica (SAGE), e compará-Ia com a biblioteca de células mononucleares de medula óssea depositada on fine no Sagemap database. A expressão das proteínas de ciclo celular foi estudada através do método de "immunobfotting': a partir de células de sangue de cordão de recém nascidos prematuros e de termo, submetidas a cultura líquida de curta duração e em cultura em meio sem i-sólido de metilcelulose, suplementados com fatores estimulantes de crescimento. As células foram analisadas de quatro em quatro horas durante 24 horas e após, a cada 24 horas até 96 horas. A leitura das culturas em metilcelulose foi realizada no 7° e no 14o. dia. A análise de expressão gênica das células mononucleares de sangue de cordão evidenciou: 44.924 tags totais (15.519 tags únicas; 7772 genes conhecidos; 3935 seqüências preditas ou anotadas e 3812 genes desconhecidos) A medula apresentou 36577 tags totais (13075 tags únicas, 6711 genes conhecidos; 3371 seqüências preditas ou anotadas e 2993 genes desconhecidos). A análise funcional foi realizada através dos programas Gene Ontofogy Consortium e David. A distribuição por categoria foi similar nas duas bibliotecas. A análise detectou 48 genes com diferença na abundância de expressão ~ 10 e :510 e classificados no programa UniGene. Trinta e cinco foram mais expressos em sangue de cordão e estavam relacionados com resposta imune, ciclo celular e migração trans endotelial (homing). A validação do SAGE foi realizada através do método de reação em cadeia da polimerase, em tempo real quantitativo (qPCR), em 11 genes diferencialmente expressos, confirmando os resultados obtidos em 10 dos 11 genes validados, apresentando uma porcentagem de confirmação de 90%. Os resultados de alfa, beta e gama globina foram comparáveis aos da ontogenia da linhagem hematopoiética. F11 receptor, CDC25B, TGFA, SMARCC2, SKP1A, e NKG7 foram mais expressos em sangue de cordão e S100-A8 na medula óssea. A análise dos ensaios clonogênicos evidenciou um aumento significativo no número de colônias no i e no 14° dia nas culturas de sangue de neonatos prematuros, com significância estatística. Houve um aparecimento precoce das colônias no sétimo dia de cultura. As características morfológicas das culturas das células dos prematuros, no sétimo dia, eram semelhantes as das culturas de termo no décimo quarto dia. As culturas de prematuros no décimo quarto dia apresentavam grande quantidade de fibroblastos e se assemelharam, em número e morfologias, às de recém nascidos de termo com vinte e um dias de cultura. A análise da expressão das proteínas de ciclo celular demonstrou aumento de expressão de p130 à partir de 4 horas, cumulativo, desaparecendo ou diminuindo a partir de 24 horas. A expressão de p107 ocorreu após as 24 horas de cultura, acumulando até 96 horas. Entretanto, as expressões de p130 e p 107 foram maiores nas células de sangue de cordão que nas da medula óssea. Estes resultados sugeriram que as células de sangue de cordão umbilical de recém nascidos prematuros poderiam apresentar uma rápida progressão em ciclo celular. Os resultados aqui obtidos abrem novas perspectivas na caracterização funcional destes genes que poderão contribuir para um maior conhecimento da biologia das células de sangue de cordão umbilical Abstract: Haematopoietic reconstitution is a common procedure for many haematological and non-haematological diseases. Up to now, total mononuclear bone marrow cells have been the main source for this procedure. Lately, total mononuclear peripheral and cord blood cells have also been successfully used. Many studies of gene expression profile of bone marrow, peripheral or cord blood manipulated cells have been performed during the last few years but, as total mononuclear cells have usually been used in clinical practice, the present study had the aim to compare, using serial analysis of the gene expression (SAGE), cord blood mononuclear cells with the bone marrow mononuclear celllibrary already deposited in Sagemap database. The cell cycle proteins expression were analysed by immunoblotting proceeding with umbilical cord blood cells from premature and full term neonates, submitted to clonogênic assays performed with short liquid culture and semi-solid methylcellulose culture, supplemented with growth factors. The cells were collected and analysed each four hours during the first 24 hours. Then, they were collected and analysed each 24 hours till 96 hours Cord blood revealed 44.924 tags (total) representing 15.519 unique tags (7772 known genes; 3935 sequence predicted or annotated; 3812 no matches). Bone marrow showed 36577 tags (total) representing 13075 unique tags (6711 known genes; 3371 sequence predicted or annotated; 2993 no matches). Genes were annotated using Gene Ontology Consortium. Category distribution was similar in both libraries. We found 48 genes with fold change difference ~ 10 and ~ 10 and UniGene number. Thirty-five were most expressed in cord blood and were related with immune response, cell cycle and homing. SAGE validation was performed by quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR) of 11 differentially expressed genes confirming the SAGE results in 10 genes with a confirmation rate of 90%. Alpha, beta and gamma globin results were comparable with haematopoiesis ontogeny. F11 receptor, CDC25B, TGFA, SMARCC2, SKP1A, and NKG7 were most expressed in cord blood and S100-A8 in bone marrow. Fourteen highly expressed genes were function described. The semi-solid cultures analysis demonstrated that the cells of premature neonates had an early growth of CFU-E/BFU-E, CFU-GM and CFU-GEMM on the 7thday of culture, and the number of these colonies on the 7thand 14thday of culture was higher than fuI! term neonate's cells culture with statistic significance. The morphological characteristics on ih day of culture were comparable to those from full term neonates obtained on the 14thday. The premature cells cultures on the 14thday showed even fibroblasts and were comparable to those of full term neonates on the 21st day in terms of number and morphology of the colonies. The cell cycle protein expression analysis demonstrated the expression of p130 increased after the first 4 hours and accumulated, disappearing, or diminishing after 24 hours. On the other hand the p107 expression appeared after 24 hrs and accumulated until 96 hrs. However, the p130 and p107 expression was twofold higher in premature cells compared to full term cells. These results suggest that premature cells have a rapid exit from GO/G1 to S-phase Thus, homing, cell cycle differentiation, and immune response related genes seem to be highly expressed in cord blood cells. Further studies verifying the role of these genes may contribute for greater knowledge regarding cord blood cell biology Doutorado Clínica Médica Doutor em Clínica Médica

Orientador: Sara T. O. Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A infecção pelo vírus linfotrópico de células T tipo I (HTLV I) tem sido associada à leucemia/linfoma T do adulto (LLTA), à paraparesia espástica tropical! mielopatia associada ao HTLV I (PET/MAH), à uveíte e, recentemente, à Síndrome de Sjõgren e outras doenças do sistema conjuntivo. Os fatores que detenninam a evolução para essas doenças relacionadas à infecção são desconhecidos, mas podem estar ligados à predisposição genética e à resposta imune do hospedeiro. Camundongos com ausência do gene GATA3 demonstram várias e graves anormalidades morfológicas e fisiológicas no sistema nervoso central e periférico, além de comprometimento da hematopoese durante o desenvolvimento embrionário. Há, portanto, semelhanças entre os sistemas comprometidos na ausência do gene GATA3 e aqueles alterados secundariamente à infecção pelo HTLV I. Vários estudos sugerem que uma fosfoproteína viral presente no HTLVI, denominada Tax, ative a transcrição de vários genes envolvidos na produção de citocinas ou na resposta e na proliferação celular, como c-fos, c-myc, erg-I, IL-I, IL-2, GM-CSF. Entretanto, a crelação entre a infecção pelo vírus HTLV I e o fator de transcrição GATA3 ainda não havia sido determinada. Os objetivos do presente trabalho foram caracterizar a relação entre o fator de transcrição GATA3 e o vírus HTLV I, utilizando-se, para tanto, a técnica de RT-PCR semiquantitativo; analisar a relação entre o fator de transcrição GATA3 e o vírus HTLV I, por meio de estudos de interação DNA/proteína; e demonstrar, por estudos funcionais em modelos celulares in vitro, a resposta das regiões de controle transcricional do gene GATA3 à proteína Tax. Demonstramos, através do RT-PCR semi-quantitativo que ocorre uma evidente redução na expressão do gene GATA3 em portadores saudávies da infecção pelo HTLVI, e também de forma mais acentuada nos portadores de Leucemia Linfoma T do Adulto e Paraparesia Espástica Tropical/Mielopatia associada ao HTLVI. Estudos in vitro, que utilizaram construções com o gene reporter CAT direcionado pelo promotor e silenciador do gene GATA3 co-transfectados com vetores de expressão da proteína Tax e seu mutante, revelaram que Tax exerce atividade discreta no promotor de gene GATA3, mas reprime de modo marcante a atividade do promotor na presença de seu silenciador. Essa repressão provavelmente ocorre através da interação de tax com o fator de trans.crição ZEB, o silenciador do promotor do gene GATA3, uma vez que interação deste com a proteína Tax foi demonstrada no estudo de retardamento em gel. O estudo demonstrou, pela primeira vez, a regulação do gene GATA3 pelo vírus HTLVI. Essa regulação pode estar envolvida na fisiopatologia das doenças relacionadas à infecção pelo HTLVI Abstract: The HTLV-I nonstructural protein Tax plays a crucial role in cellular transformation. It activates the transcription factors of various cellular genes and interacts with cellular proteins. Limited data are available on the interaction between specific T cell transcription factor GATA3 and Tax. hnplication for the significance ofGATA3 on T-cell development and function, (Th2) differentiation, and a role ofGATA3 during immune response has been reported. To determine the effect of the Tax protein on GATA3 gene expression, we investigated the interaction between this protein and the GATA3 promoter and repressor regions. The semi quantitative RT-PCR demonstrated a considerable decrease in the expression of the GATA 3 cDNA all subjects infected by HTLV I and no expression of GATA 3 mRNA was observed in one subject with ATLL and another with HAM/TSP. Results demonstrated an interaction between Tax and GATA3 gene and a role ofTax in the negative regulation of GATA3 expression, through its interaction with the repressor, ZEB. This interaction may be involved in the pathophysiology of adult T cell leukemiallymphoma and tropical spastic paraparesis/HTLV-I-associated myelophathy Doutorado Clínica Médica Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Maria Lourdes Barjas-Castro, Joyce Maria Annichino-Bizzacchi Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: o fator de von Willebrand(FVW)é uma glicoproteína multimérica que possui papel fundamental na hemostasia primária formando pontes entre glicoproteínas plaquetárias e estruturas do endotélio vascular. Este fator também atua como carreador do Fator VIII (FVIII) da coagulação. Numerosos fatores influenciam a concentração plasmática do antígeno do fator de von Willebrand (FVW:Ag), e dentre eles o grupo sangüíneo A80 é considerado um dos fatores de maior importância. Vários autores demonstraram que índivíduos do grupo sangüíneo O possuem a concentração do FVW:Ag maís baixa e atividade do fator VIII coagulante (FVIII:C) reduzida quando comparados com os outros grupos (A, 8 e A8) Abstract: Von Willebrandfactor (VWF)plays a key role in primaryhemostasis. Various factors influence the FVW plasma level and ABO blood groups are considered the most important factor. Recent studies have demonstrated that individuais carrying one O allele have significantly lower plasma levels of VWF and FVIII than to those carrying no O allele.The objective of this study was to correlate the ABO gene polymorphisms with plasma levels of VWF, FVIII and ristocetin cofator. Blood donors of different blood groups (122) defined by sorological and molecular tests were submitted to VWF:Ag (ELlSA)and FVIII(coagulometric method) dosage and tested for ristocetin cofactor (RCo) Mestrado Farmacologia Mestre em Farmacologia

Orientadores: Fernando Ferreira Costa, Valder Roberval Arruda Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: As plaquetas estão associadas não só às atividades hemostáticas, como também à resposta inflamatória. O comprometimento funcional das plaquetas está relacionado à ocorrência de patologias hemorrágicas e ao maior risco para desenvolvimento de aterosclerose e doença arterial oclusiva. O primeiro objetivo deste estudo foi estudar as alterações do complexo das glicoproteínas de membrana plaquetária (GP) Ib(a e f3)-IX-V que levam à perda da sua capacidade hemostática, resultando na patologia hemorrágica denominada Síndrome de Bernard-Soulier (SBS). Foram avaliadas as alterações moleculares da GP Iba, que contém os sítios de ligação para fator de von Willebrand (FvW), trombina e integrinas (presentes na região N-terminal globular da GP Iba). Entre os casos com plaquetopenia persistente avaliados no Ambulatório de Hemostasia do Hemocentro da Unicamp, houve a confirmação do diagnóstico de SBS em três pacientes. Em dois destes indivíduos com SBS foi possível identificar duas mutações distintas em homozigose na região N-terminal globular da GP Iba. Uma destas mutações é resultado da troca de T~A, levando à substituição da Cys209 ~ Ser, comprometendo uma das ligações dissulfídicas que ocorrem entre os resíduos Cys209 - Cys248 e Cys211 - Cys268. Esta mesma mutação já havia sido descrita anteriormente por Simsek e cols. (1994). A segunda mutação evidenciou pela primeira vez a ocorrência da troca de T~C, com substituição da Leu115~Pro, na região das repetições ricas em leucina da GP Iba. Em ambos os casos a avaliação por citometria de fluxo mostrou que a GP Iba estava ausente, sugerindo que estes resíduos sejam essenciais para manter a integridade da molécula. o terceiro paciente apesar do diagnóstico clínico e laboratorial de 888, confirmado pela ausência das GP Iba e GP IX pela citometria de fluxo evidenciou exclusivamente uma alteração não descrita no códon iniciador ATG do gene da GP IbB, levando à substituição da -25Met --7 Arg em heterozigose. No entanto, foi observado que outros membros da família, apesar de assintomáticos, eram portadores da mesma alteração. Embora na literatura, a 888 seja relacionada exclusivamente com mutações ocorrendo nos genes da GP Iba, GP IbB e GP IX, é possível que a diferença fenotípica e clínica deste caso possa revelar outros mecanismos reguladores do complexo GP Ib-IX-V possam estar envolvidos na ocorrência da 888. Na outra parte deste estudo, foi estudada a prevalência genotípica de três polimorfismos da GP Iba: seqüência Kozak, HPA-2 e VNTR. A avaliação de 492 indivíduos brasileiros, pertencentes a três grupos étnicos distintos (caucasóides; negróides e indígenas), permitiu a identificação de dez haplótipos distintos, onde: o Kozak-TT/HPA-2aaNNTR-CC foi o mais comum (-40%) entre os caucasóides e negróides e o Kozak- TT/HP A-2aaNNTR-CC e Kozak- TC/HP A-2aaNNTR-CC estiveram presentes na mesma proporção entre os indígenas. Embora anteriormente fosse descrita a presença de uma ligação de desequilíbrio entre os polimorfismos VNTR e HPA-2, neste estudo esta ligação não foi completa em cerca de 10% dos indivíduos de todos os três grupos. Dois indivíduos não relacionados apresentaram uma variante rara, o alelo VNTR - E, onde há perda da seqüência de 39 pb, o que foi confirmado pelo seqüenciamento da região. O estudo funcional das plaquetas destes indivíduos e seus familiares, não evidenciaram diferença em relação às demais variantes do VNTR. alelo VNTR-A com quatro cópias da repetição de 39 pb, presente em populações asiáticas, não foi encontrado em nenhum dos cerca de 1.000 indivíduos aqui estudados. No entanto, entre duas espécies de primatas não humanos (chimpanzé e gorila), ambos apresentaram oalelo VNTR-A em homozigose (Kozak-TT/HPA- 2aaIVNTR-AA). Foi possível desta maneira sugerir um novo mecanismo evolutivo para o surgimento das variantes do gene da GP Iba, onde diferentemente do proposto anteriormente, acreditamos que a variante com maior número de cópias tenha precedido as demais, e com a perda sucessiva destas cópias, as variantes menores foram surgindo. Finalmente em um estudo caso-controle investigou-se o risco para ocorrência de infarto agudo do miocárdio (IAM) relacionado aos três polimorfismos da GP Iba. Foram avaliados 350 indivíduos com antecedente de IAM, divididos em grupo 1, que foram incluídos no momento do primeiro IAM e grupo 2, que sobreviveram a um ou mais episódio de IAM há mais de seis meses. Estes pacientes foram pareados por sexo, idade e raça a 350 controles. O genótipo VNTR-CD, assim como o alelo D, foi mais freqüente entre os pacientes com IAM que entre os controles. Embora esses resultados sejam diferentes do descrito na literatura. A análise da gravidade da doença coronariana oclusiva, baseada no número de vasos com obstrução de pelo menos 50% do lúmen, mostrou um aumento significativo da prevalência do alelo D entre os indivíduos com doença mais grave. Os resultados deste trabalho corroboram com estudos anteriores sobre a influência dos polimorfismos do gene da GP Iba e a função plaquetária Abstract: Platelets are associated not only with haemostatic activity, but also with inflammatory response. Functional alterations of platelets are related with bleeding diseases and with a greater risk for developing atheriosclerosis and occlusive artery disease. In this study we analyzed the molecular alterations in the platelet membrane glycoprotein (GP) Iba, the subunit of the complex GP Ib(a and ~)-IX-V. The GP Iba contains binding sites for von Willebrand factor (vWF), thrombin and actin-binding proteins. First of ali, we studied the mutations in the complex GP Ib-IX-V related with the 1055of haemostatic function, resulting in a bleeding disease denominated Bernard-Soulier syndrome (BSS). We identified two distinct mutations in homozygous affecting the Nterminal globular region (where the vWF and thrombin biding sites are located) in two unrelated subjects with BSS. One of these mutations, was first describe by Simsek et aI., 1994, where a homozygous single base pair mutation T-7A, resulted in a substitution of a Cys209 -7 Ser, which involving one of the two disulfide loops from the C-terminal flanking sequence between Cys209 - Cys248 and Cys211 - Cys268. The second subject with BSS presented for the first time, the occurrence of a single base pair exchange T-7C, leading to a single amino acid substitution of the Leu115-7Pro, in the region of the leucine-rich repeats of the GP Iba. In both cases a 1055of GP Iba expression was observed, suggesting that these residues, are essential in maintaining the integrity of the molecule. The third case of BSS, presents serious hemorrhagic symptoms and an intense reduce in the platelet number, in addition to a lack of expression of GP Iba and GP IX. Although none of the other family members presented a bleeding history, the mother of the patient, a maternal uncle and her maternal grandfather, presented a mild macrothrombocytopenia. The sequence of the involved genes (GP Iba, GP Ib(3e GP IX), revealed a non described alteration with the exchange of T~G in initial start ATG codon of the GP Ib(3gene exclusively, leading to the substitution of the -25Met ~ Arg in heterozygosity as in the patient and between the affected members of the family. Thus, it may be that the BSS phenotype in this patient involves other proteins or gene regulators related to the complex GP Ib-IX-V. There are no other genes described involving BSS development , except the first three described, GP Iba, GP Ib(3e GP IX. In the other part of this study, we determined the prevalence of the distinct genetic variants of the GP Iba, resulting from three polymorphisms: Kozak sequence, HPA-2 and VNTR. First, 492 subjects from three distinct Brazilian ethnic groups were evaluated, including: Caucasians; African descents, and Indigenous. The presence of 10 distinct haplotypes were determined. The most common (-40%) haplotype was the Kozak-TT/HPA-2aaNNTR-CC for both Caucasian and African descents. However, among Indigenous, Kozak-TT/HPA-2aaNNTR-CC and Kozak-TC/HPA-2aaNNTR-CC were equal/y present. Although a strong linkage disequilibrium between VNTR and HPA-2 polymorphism had been observed at first, here we determined incomplete linkage disequilibrium in 10% of the subjects from ali ethnic groups. Two unrelated subjects presented the allele VNTR - E, arare variant lacking the 39bp repeat, and functional platelet studies among these subjects and their family members revealed no abnormalities. No VNTR-A allele, the largest variant containing 4 copies of the repeats, was identified among approximately 1,000 subjects studied in this population. However, homozygosity for the VNTR-A allele (Kozak-TT/HPA-2aaNNTRAA) was determined in two distinct species of non-human primates (chimpanzee and gorilla). These results suggest a greater complex evolutionary mechanism in the macroglycoprotein region of the GP Iba gene, different from that previously proposed, an hypothesis is that the largest variant, VNTR-A should be considered the oldest allele and that subsequent deletions resulted in the smaller forms. We also carried out a case-control study correlating the three polymorphisms of the GP Iba and the risk for myocardial infarction (MI) occurrence. 350 subjects who had suffered a previously episode of MI, were divided into: group 1, having suffered the first MI at the moment of inclusion and group 2, who had survived to one or more episodes of MI, in which the last episode had occurred at least six months before enrollment. These patients were matched by sex, age and race to 350 controls. Genotype VNTRCD, as well as allele D were more frequent among the patients with MI than among controls. Although this differed from that previously described, it was possible to observe that when the severity of coronary artery disease among these patients was analyzed, assigned by the number of affected vessels by coronary angiography, the allele O was also associated with more extensive disease. Also, it is in accordance to functional data related to the polymorphisms of GP Iba gene previously described Doutorado Clínica Médica Doutor em Clínica Médica

Orientador : Radovan Borojevic Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O microambiente da medula óssea desempenha importância fundamental na proliferação e diferenciação das células progenitoras hematopoéticas bem como no controle do egresso dessas células para o sangue periférico. Embora moléculas da matriz extracelular, juntamente com citocinas, sejam cruciais na compartimentalização dos microambientes da medula óssea, ainda não se conhecem os pré-requesitos para que um determinado estroma possa sustentar a hematopoese. Usando uma linhagem celular (FDC-Pl) dependente de fator de crescimento, comparamos modelos experimentais de estromas periféricos e de medula óssea, que sustentam ou não a proliferação mielóide "in vitro". Observamos que todos os estromas produzem um grupo similar de hemopoetinas, incluindo o fator estimulador de colônias de macrófagos e granulócitos (GM-CSF), o qual pode ser liberado das monocamadas estromais, através de altas concentrações de sais, numa forma biologicamente ativa. Por outro lado, glicosaminoglicanos (GAGs) obtidos a partir desses estromas, exibiram uma capacidade de modulação da atividade biológica do GM-CSF variável, dependendo da concentração utilizada. Fibroblastos de pele, que não são capazes de sustentar a mielopoese "in vitro", sintetizam GAGs que podem inibir a atividade mielopoética de GM-CSF. Concluímos que, a qualidade dos glicoconjugados pericelulares dos estromas, presentes no microambiente local, é determinante para que um dado estroma seja capaz de sustentar a mielopoese, mesmo quando hemopoetinas biologicamente ativas são localmente produzidas. Os aspectos espaciais desse microambiente e as interações moleculares entre as células do estroma e progenitores mielóides foram investigados. Demonstramos que esse contato fisico pode disparar um "capping" de moléculas de superfície celular incluindo glicoconjugados de ácido siálico e proteoglicanos. Juntas, essas moléculas, potencialmente interativas com o GMCSF, geram um ambiente intercelular esfecífico, promovendo condições fisico-químicas requeri das para essa interação. A identificação da expressão dos HSPGs associados as superfícies celulares foi monitorada através de RT -PCR. Os estromas analisados mostraram expressão de mRNA para glipicam, betaglicam e sindecam-4. O tratamento das monocamadas estromais com PI-PLC (fosfolipase C) e tripsina branda, confinnou a presença de HSPGs de superfície celular (glipicam) e sindecam, respectivamente. Aproximadamente, 20% dos HSPGs obtidos, estão associados à membrana através de âncoras de GPI enquanto o restante, 80%, permanece integrado à membrana plasmática. Demonstramos que as moléculas marcadas com sulfato radioativo, deslocadas da superfície celular das células estromais após tratamento com tripsina branda, são capazes de aumentar a atividade biológica do GM-CSF, quando comparadas com aquelas deslocadas por PIPLC as quais não apresentaram diferenças significativas se comparadas com o controle. Esses resultados sugerem a existência de HSPGs transmembranares e associados via âncora de GPI nas superfícies das células estromais, e que, a atividade biológica de GM-CSF na proliferação de FDC-Pl "in vitro", é aumentada através de uma possível interação física entre o fator de crescimento e um HSPG transmembranar Abstract: The bone marrow microenvironrnent plays an important role in promoting hematopoietic progenitor cell proliferation and differentiation, as well as their controlled release into the circulation. It has been shown that the extracellular matrix elements in combination with cytokines are crucial for compartmentalization of the bone marrow environrnent, but it is not clear which are the molecular and structural requirements for a given stroma to sustain hematopoiesis. Using the growth factor-dependent cell line FDC-Pl, we have compared in vitro experimental models of bone marrow and peripheral stromas, two of which sustain myeloid proliferation and one which does not. We have found that all the stromas produced a similar set of hemopoietins, including the GM-CSF, which could be released from the stromal cell layer in an active form by high-salt buffers. On the other hand, glycosaminoglycans (GAGs) obtained from stromas had variable concentration-dependent capacity to modulate the GM-CSF activity. The skin fibroblasts, which can not sustain myelopoieis in vitro, synthesized GAGs that could inhibit the myelopoiesis-promoting activity of GM-CSF produced by the same cells. We conclude that the quality of the stroma pericellular glycoconjugates, present in microenvironrnent, is determinant for the ability of a given stroma to sustain myelopoiesis, even when biologically active hemopoietins are locally produced. The spatial organization of this microenvironrnent and molecular interactions among stroma cells and myeloid progenitors was investigated, and we have shown that the physical intercellular contact triggers the capping of cell surface molecules, including sialylated glycoconjugates and proteoglycans. Together, they generated the specific intercellular environrnent, rich in molecules potentially interactive with GM-CSF, and providing the physicochemical conditions required for this interaction. We have partially assessed the identification of the core proteins of cell-associated HSPGs of the stromal cell lines monitoring their expression by RT-PCR. The assayed stromas expressed mRNA for glypican, syndecan-4 and betaglycan. The stromal layers treatment with PI-PLC and mild trypsin confirmed the presence of hydrophobic cell surface HSPG glypican and syndecan, respectively. About 20% of the HSPG are linked to membrane by glycosilphosphatidylinositol (GPI) anchor while the remainder, 80%, are integrated in the plasma membrane. We have shown that the 35 -s labeled molecules dislodged from stroma cell membranes by mild treatment with trypsin increased the biological activity of the GM-CSF, whilst those dislodged by phospholipase-C did noto These results suggested the existence of both transmembrane HSPG and GPI-HSPG and that the biological activity of GM-CSF in FDC-Pl proliferation, in vitro, is increased by a physical interaction between growth factor and transmembranar HSPG Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador : Sara T. O. Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Doutorado

Orientador : Sara T. O. Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A anemia falcifonne é uma doença hereditária com alta incidência na população, causada por um defeito estrutural na cadeia da f3-globinaque origina a HbS. Essa hemoglobina anômala, sob baixas tensões de oxigênio, fonna polímeros intracelulares, provocando a defonnação dos eritrócitos que por sua vez bloqueiam a microcirculação, ocasionando infarto de vários órgãos. Estudos clínicos demonstraram que a HbF possui a capacidade de inibir a polimerização da HbS e reduzir a falcização, melhorando assim o quadro clínico. A indução farmacológica por vários compostos químicos, dentre os quais a hidroxiuréia (HU), 5-azacitidina, butirato e os hormônios esteróides, aumentam a síntese de HbF em pacientes com anemia falciforme. A regulação da expressão da HbF está relacionada à presença de elementos ativos ligados em "eis" ao complexo da f3-globina, bem como de proteínas regulatórias do processo de transcrição gênica denominadas fatores de transcrição, como as proteínas GATA-I, GATA-2 e NF-E2, expressas principalmente na linhagem eritróide. Esse projeto teve por objetivo estudar o efeito da HU e do honnônio progesterona na modulação da expressão gênica pelos fatores de transcrição GATA-I, GATA-2 e NF-E2 e do gene y globina, em células da linhagem eritróide obtidas através da cultura de duas fases a partir de sangue periférico de doadores de sangue atendidos no Hemocentro da Unicamp. A expressão dos genes destes fatores de transcrição foi determinada por RT-PCR semiquantitativo e quantificação por densitometria. Os nossos resultados mostraram que nas células tratadas com HU ou progesterona houve aumento significativo da expressão do fator de transcrição GATA-I e do gene y globina a partir de 96hs da Fase TI do sistema de cultura líquida em duas fases até o seu término com 2I6hs, quando comparada com as células sem tratamento (P < 0,05, teste de Wilcoxon). A expressão do fator de transcrição NF-E2 não demonstrou softer influência pela administração de HU e progesterona durante todo o processo de diferenciação eritróide e ambos os fármacos não exerceram qualquer influência de caráter significativo sobre a expressão do fator de transcrição GATA-2 (p> 0,05, teste de Wilcoxon) Abstract: Sickle cell anemia is a very common hereditary disease caused by a structural defect in the beta-globin chain, giving rise to HbS. This anomalous hemoglobin, under low oxygen tensions, forms intracellular polymers, causing deformation of the erythrocytes which, in tum, block the micro-circulation and cause infarction in various organs. Pharmacological induction using various chemical compounds, the best known being hydroxyurea (HU), 5-azacytidine, butyrate and steroid hormones, increase the synthesis of HbF in sickle cell patients. The regulation of the expression of HbF is related to the presence of active elements linked "cis" to the beta-globin as well as to the presence of regulatory proteins of the genomic transcription process (known as transcription factors), such as the GATA-I, GATA-2 and NF-E2 proteins, expressed principally in the erythroid lineage. This project aimed to study the effect of HU and the hormone progesterone on the modulation ofthe genetic expression ofthe transcription factors GATA-I, GATA-2 , NF-E2 and the gamma globin gene in erythroid lineage cells obtained iTomtwo-phase culture of peripheral blood donors at the Hemocenter, UNICAMP. The expression of the transcription factors was determined by semi-quantitative RT-PCR and quantified by densitometry. Our results demonstrate that in the cells treated with HU and progesterone there was a significant increase, when compared with the untreated cells (PO.O5,Wilcoxon test) Mestrado Ciências Básicas Mestre em Clínica Médica

Orientador: Sara Terezinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia Resumo: A esferocitose é um tipo comum de anemia hemolítica hereditária cujo primeiro defeito molecular foi caracterizado em 1992. A proteína banda 3, codificada pelo gene AE1, foi a primeira isoforma clonada de uma famma de genes de trocadores de ânions "Anion Exchanger-AE gene family" e é a mais abundante das proteínas integrais da membrana eritrocitária. Alterações moleculares neste polipeptídeo estão associadas à formação de esferócitos. Hemácias esferocíticas são osmoticamente frágeis, estando mais sujeitas à lise e ao sequestramento pelo baço, o que encurta seu tempo de vida. A proteína banda 3 também é expressa nos rins, na membrana basolateral de células alfa intercaladas do tubo coletor cortical, onde é responsável pela reabsorção de bicarbonato, compensando a secreção de ácidos pela H+ ATPase vacuolar apical, e participando da regulação fina do equilíbrio ácido-básico. Tanto a banda 3 eritrocitária como a renal são isoformas de um mesmo gene que através de um promotor tecido específico, diferem quanto à transcrição. O mRNA da banda 3 renal não apresenta os três primeiros exons observados na forma eritróide. O presente estudo teve o objetivo de investigar as alterações moleculares e regulação do gene da banda 3 na esferocitose hereditária em 5 pacientes com deficiência de banda 3, e investigar possíveis alterações neste gene em cinco pacientes com acidose renal tubular distal. Este estudo foi baseado no rastreamento de mutações e polimorfismos no gene mencionado, incluindo a região promotora, que também pode estar envolvida na fisiopatologia da doença. Para detecção das alterações moleculares foram utilizadas as técnicas de PCR, análise de polimorfismo de conformação em fita simples, subclonagem e sequenciamento. O estudo do cDNA foi realizado após a transcrição reversa do mRNA extraído de reticulócitos por RT-PCR. Outro objetivo foi investigar as alterações renais de pacientes com esferocitose hereditária e deficiência de banda 3, uma vez que esta proteína também é expressa nos rins. Os estudos renais foram realizados através da avaliação da capacidade de acidificação tubular distal e obtenção de medidas de bicarbonatúria, pH urinário, acidez titulável e excreção de amônia no período basal e após estímulo com furosemida. Também foi avaliado o contratransporte de sódio e lítio em hemácias de pacientes com esferocitose hereditária, uma vez que esta é uma medida indireta do contra-transporte Na+/H+, envolvido na regulação do pH intracelular do eritrócito e na homeostase ácido-básica do organismo, por secretar ácido e reabsorver Na+ em epitélio renal. Nossos resultados caracterizaram duas novas mutações no gene AEI. O estudo da Banda 3 Campinas, uma mutação no sítio doador de clivagem no intron 8, demonstrou a perda de bicarbonato pela urina dos pacientes afetados e um aumento na atividade de contra-transporte de sódio e lítio nas hemácias. A Banda 3 Pinhal, uma substituição de um resíduo de arginina altamente conservado, por histidina no domínio transmembrana, é a segunda mutação afetando o codon 490 da banda 3, e pode ser um "hot spot" para mutações no gene AEI. As hemácias destes pacientes apresentaram menor número de sítios para o inibidor DIDS. Outra mutação caracterizada foi a Banda 3 MODtefiore, previamente descrita. O estudo dos pacientes com acidose renal tubular distal revelou uma nova mutação na região promotora renal em um paciente com acidose renal tubular distal incompleta, que pode estar associada com o defeito na reabsorção de bicarbonato pelos rins. O estudo da acidose também caracterizou um novo polimorfismo no intron 3, a deleção da adenina 1233, com frequência alélica de 0,34 em 120 cromossomos analisados. Um conflito de sequência (quatro guaninas no lugar de três nt. 1272-1274) também foi verificado em todos indivíduos estudados. O polimorfismo Asp38-7Ala (Darmstad) foi encontrado em uma paciente com acidose, mas parece não estar relacionado com a doença. Finalmente concluímos que mutações no gene da banda 3 podem estar associadas com a esferocitose hereditária e com a acidose renal tubular distal incompleta, pois isoformas da proteína são expressas nas hemácias e nas células a-intercaladas. Sugerimos que em casos onde há perda de ânions pelos rins, mecanismos de compensação podem estar ativados, como o aumento da atividade excretora de prótons pela Na+/H+, ou pela H+-ATPase vacuolar apical. A fim de realizar estudos de interações protéicas, foi subclonado o domínio citoplasmático completo da fosfolípide scramblase dos seguintes tecidos humanos: cérebro, testículos e baço. A sequência do cDNA da enzima scramblase usada no ensaio duplo-híbrido resultou no fenômeno de auto-ativação, que é uma razão comum da falha do rastreamento pelo método duplo-híbrido Abstract: Hereditary spherocytosis is a common type of hemolytic anemia. The first molecular defect in the band 3 gene associated with spherocytosis was characterized in 1992. Band 3, codified by the AEl gene, was the first isoform to be c10ned of a family of genes of anion exchangers (Anion Exchanger-AE gene family) and is the most abundant of the integral proteins of the erythrocyte membrane. The molecular alterations in this polypeptide are associated to spherocyte formation. Spherocytic red cells have osmotic fragility , and are more liable to undergo lise and splenic sequestration, which decreases their life span. Band 3 protein is also expressed in the kidney, in the basolateral membrane of the cortical collecting duct intercalated alpha cells, where it is responsible for the bicarbonate reabsorption, compensating the acid secretion at apical membrane by the H+ ATPase vacuolar, and taking part in the fine regulation of the acid-base equilibrium. Both erythrocyte and renal band 3 are isoforms of the same gene, which differ in transcription due to a tissue-specific promoter. The first three exons are not present in the erythroid form of renal band 3 rnRNA. The aim of this study was to investigate the molecular alterations and gene regulation, of band 3 in hereditary spherocytosis in 5 families with band 3 deficiency. This study was based on the screening of mutations and polymorphisms of the gene formerly mentioned, inc1uding the promoter region, which might be involved in the pathophysiology of the disease. In order to detect the molecular alterations, PCR technique, single strand conformation polymorphism analysis, subc10nning and sequencing were used. The cDNA study was performed afier the reverse transcription of the rnRNA extracted from the reticulocytes using RT-PCR. Another aim was to investigate the renal alterations of patients with hereditary spherocytosis and band 3 deficiency, as this protein is also expressed in the kidneys. Renal studies were performed using urinary acidification tests and measures of. bicarbonate, urinary pH, acid titration and ammonia excretion during the basal period and afier furosemide stimulation. The sodiumllithium countertransport activity in the red blood cells of patients with hereditary spherocytosis was also assessed, as it is an indirect measure of the Na + /Ir countertransport, which is involved in the intracellular pH regulation of the erythrocyte and in the acid-base homeostasis of the organism, secreting acid and reabsorbing Na + in the renal epithelium. Our results caracterized two novel mutations in the AEI gene. The study of Band 3 campinas, a mutation at the splice donor site in the intron 8, revealed a bicarbonate loss by the urine from patients and an increase in the sodiumllithium countertransport activity of their red blood cells. The Band 3 Pinhal is a highly conserved arginine to histidine substitution in the transmembrane domain. This is the second mutation affecting the codon 490 of band 3, and could represent a hot spot for mutations in the AEI gene. The red blood cells of these patients showed a reduced number of sites for DIDS, the band 3 anion exchange inhibitor. Another mutation found was the Band 3 Montefiore, previously described. The study of the patient's tubular acidosis revealed a new mutation neighboring the kidney promoter in a child presenting incomplete distal renal tubular acidosis, which might be associated with the kidney bicarbonate reabsorption defect. The acidosis study also caracterized a novel polymorphysm in intron 3, the adenine 1233 deletion, with an allele frequency of 0.34 in the 120 chromossomes analyzed. A sequence conflict (four guanines in the place of three nt.1272-1274) was also verified in all subjects studied. The polymorphysm Asp38-7Ala (Darmstad) was found in one patient with acidosis, but was not related with the disease. Finally, we conc1uded that mutations in the band 3 gene may be associated with hereditary spherocytosis and with incomplete distal renal tubular acidosis, as the band 3 isoforms are expressed in the red cells and in the renal {X-intercalated cells. We suggest that the proton excretion mechanisms, as the Na+/H+ exchanger or the vacuolar Ir-ATPase, might be activated to compensate the basal bicarbonate loss by the kidney. In order to perform protein interaction studies, we have subc10ned the entire cytoplasmic domain inc1uding part of the transmembrane segment of phospholipid scramblase from the following human cDNA tissues: brain, testis and spleen. The cDNA sequence of phospholipid scramblase used in the two-hybrids system caused auto-activation, a common reason for failure of two-hybrid screens Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Sara T. O. Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Oncogenes são genes que afetam o crescimento e desenvolvimento celular normal. A maioria dos oncogenes se constitui de formas modificadas de genes normais, denominados de protoncogenes. o protoncogene RAS, encontrado em diversos organismos, codifica uma proteína com atividade de ligação à Guanina trifosfato (GTP) normal, sem atividade de GTPase. O gene RAS mutante é encontrado em muitos seres humanos com cânceres do pulmão, cólon e pâncreas; o produto deste gene mutante é responsável pela divisão incontrolada de células cancerosas. O óxido nítrico é uma importante molécula sinalizadora sintetizada em diversos tecidos humanos, por proteínas codificadas em uma família de genes da NO sintase . A produção de NOS pode ser induzida por diversas substâncias tais como, endotoxinas, citocinas, lipopolissacarídeos bacterianos (LPS) e por 1a-interleucina. O NO ativa a p21ras em células T humanas, como pode ser observado pelo aumento da ligação GTP-p21ras.Recentemente, um grupo de pesquisadores identificou o sítio de interação entre NO e p21ras que é responsável pela iniciação da transmissão do sinal. O presente trabalho teve como objetivo analisar a interação do NO com a proteína p21RAS em células de linhagens leucêmicas mielóide (U937, HL60 e K562) e estudar a expressão do RAS e da iNOS em pacientes com Leucemia Mielóide Aguda.Linhagens leucêmicas foram incubadas com o lipopolissacarídeo (LPS) e interferon y (IFNy) indutores da NO sintase. A expressão da iNOS e do RAS foi analisada através de imunocitoquímica, western blotting e citometria de fluxo. Para se confirmar o aumento da atividade do RAS foi analisada a fosforilação das MAPK p42/44. A dosagem de NO dissolvido no meio foi feita utilizando-se o reagente de Griess. Analisando os resultados obtidos foi possível chegar às seguintes conclusões: 1. Células de leucemia mielóide aguda apresentam superexpressão de iNOS. 2. O aumento da expressão da iNOS, em pacientes com LMA, é independente da p21 RAS. 3. Em linhagens leucêmicas com mutação no N-RAS houve maior - expressão da iNOS em condições basais e redução do NO após estímulo com LPS. 4. As linhagens leucêmicas K562, U937 e HL60 apresentam uma iNOS insensível à estimulação por LPS e IFNy, nos tempos e concentrações apresentadas. 5. A linhagem K562 possui RAS susceptível a aumento da sua expressão por estímulos de LPS e LPS + IFNy nos tempos e concentrações apresentadas Abstract: Oncogenes are genes which affect the normal cellular growth and development. Most oncogenes are derived from normal genes, called protoncogenes. The protoncogene RAS, found in various organisms, codify a guanine triphophate linkage protein, without GTPase activity. The RAS mutant is found in some cancers as lung, breast and colon cancer. Nitric Oxide is an important signaling molecule synthesized, in many different human tissues, by a family of three Nitric Oxide Synthases. The NOS can be induced by addition of Human recombinant Interferon (lFN y), endotoxins, cytocins and bacterial Lipopolissacharide (LPS). Nitric Oxide can activate the RAS in Human T cells, by increasing GTP-p21ras ratio. Recently,the interactionsite was found on CYS 118 on the p21 molecule. The aim of the present study was to analyze the interaction between p21 and nitric oxide in myeloid leukemia cell lines (K562, HL60, and U937 and the expression of RAS and iNOS in human acute myeloid leukemia (AML). The main conclusions reached by this study were that AML cells overexpress iNOS, and this is independent of p21ras.Cultured cells with NRAS mutation express higher iNOS amo~nts, and decrease the NO amount when stimulated with LPS plus IFN. At ali incubation times and ali LPS and IFN concentrations, iNOS was insensible in culture cells. The K562 RAS are 68 liable to increase it's expression by stimulation with LPS and LPS+IFNy treatment at ali times and concentrations shown Mestrado Farmacologia Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Sara Terezinha Olalla Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os Linfomas Não Hodgkin (LNH) são neoplasias originárias de linfócitos B e/ou T. A classificação histológica dessas doenças é complexa, sendo que há uma tendência em se agrupar os diferentes subtipos nas categorias de baixo, intermediário ou alto grau de malignidade segundo critérios clínicos. A proteína BCL-2 foi descoberta a partir de linfomas foliculares (baixo grau de malignidade) que apresentam a translocação t(14;I8) a qual aproxima seqüências promotoras do gene de cadeias pesadas de imunoglobulinas (1gH) ao gene de bcl-2 (B-Cell Lymphoma 2), tornando-a superexpressa nesses tumores. A proteína BCL-2 está envolvida na resistência a diversos agentes quimioterápicos e na regulação de apoptose. Sabe-se que células de vida longa em nosso organismo, como os linfócitos B de memória, neurônios, células que margeiam membranas basais, etc, apresentam bcl-2 superexpresso. Acredita-se que falhas no sistema de recombinação homóloga, no período em que a expressão de bcl-2 deve ser ativada em linfócitos de memória, sejam responsáveis tanto pela desregulação da apoptose e ciclo celular nos LNH, e ainda um passo inicial para a tumorigênese. Nós analisamos a expressão de algumas proteínas da família BCL-2, pró (BAX e BAK) ou anti-apoptóticas (BCL-2 e MCL-I) por imunohistoquímica em lâminas de tecido tumoral obtidas de uma série histórica de 128 casos de LNH atendidos no Hospital de Clínicas da UNICAMP com graus de malignidade baixo, intermediário e alto. Nossos resultados mostraram expressão da proteína BCL-2 em cerca de 55% dos casos nos LNH de alto grau, 85% nos LNH de grau intermediário e 90% nos LNH de baixo grau de malignidade. Houve uma maior percentagem de células positivas para a proteína BAX, sendo 94% para os casos de LNH de alto grau, 100% nos LNH de grau intermediário e 74% nos casos de LNH de baixo grau de malignidade. Para a proteína BA.K, observamos 88% de positividade para os casos de LNH de alto grau, 75% de positividade para os casos de LNH de grau intermediário e 95% nos LNH de baixo grau. A proteína MCL-1 apresentou os mais altos níveis de detecção, sendo que de todos os casos estudados, somente 3 casos de LNH de alto grau de malignidade foram negativos. Neste trabalho observamos a correlação entre os níveis de expressão das proteínas MCL-l e BAX (p=0,0028) e uma tendência de correlação entre BAX e BAK (p=0,063) nos LNH de alto grau de malignidade. A expressão de BCL-2 foi significativamente maior nos LNH de graus baixo e intermediário quando comparados aos LNH de alto grau de malignidade (x2=16,294 e p=0,001). A proteína BAX apresentou níveis de expressão semelhantes nos LNH de graus intermediário e alto, mas significativamente menor nos LNH de baixo grau de malignidade (p=0,02). Os dados inéditos deste trabalho, como a expressão aumentada de BAK e MCL-l em LNH, associados a dados já descritos na literatura como o aumento de expressão de BCL-2 e BAX, sugerem que a expressão aumentada de proteínas reguladoras do apoptose devem estar implicadas na etiopatogenia e fisiopatologia dessas neoplasias. Estudos de regulação gênica dessas proteínas poderão indicar diferenças entre elementos responsivos desses homólogos, relacionados ao controle da apoptose Abstract: Non Hodgkin's Lymphomas (NHL) are neoplasm originated from B and/or T lymphocytes. These lymphomas can be classified into categories named low, intermediate or high malignant risk, according to clinical criteria. The BCL-2 protein was described in follicular lymphomas (low grade of malignancy) that harbor the t(14;18) translocation. This translocation brings the promoter sequences from immunoglobulin Heavy (IgH) chains gene near to bcl-2 (B-Cell Lymphoma 2) gene, tuning it over expressed in these tumours. The BCL-2 protein is important in the resistance to many chemotherapeutic agents and regulation of apoptotic mechanism. It has been observed that long lived cells as memory B cells, neurons, stem-cells at the edge of basement membranes, etc, over express bcl-2. Non Hodgkin's Lymphomas present alterations on apoptosis and cell cycle, probably due to defects in the homologous recombination system, by the time bcl-2 is expressed in memory cells. This could be an initial step to tumor genesis. The aim of our study was to analise by immunohistochemical techniques the distribution of pro (BAX and BAK) and anti (BCL-2 and MCL-1) apoptotic proteins of the BCL-2's family on tissue slides obtained from 128 cases of NHL seen at Hospital de Clínicas UNICAMP. We found BCL-2 protein expression in 55% of the NHL high grade, 85% of the NHL intermediate grade and 90% of the NHL low grade. BAX protein was highly expressed in alI categories: 94% at high grade NHL, 100% of the intermediate grade and 74% of the low grade NHL. BAK protein showed expression in 88% of the NHL high grade, 75% in NHL intermediate grade and 95% in NHL low grade. MCL-1 protein had the highest levels of expression, being positive in alI cases studied, except three cases of NHL high grade. In this study, we found correlation between MCL-1 and BAX expression levels (p=0,0028) and a tendency of correlation between BAX and BAK (p=0,063) in high-grade NHL tumours. BCL-2 expression was significant1y higher in low and intermediate grade malignancy tumours compared to expression levels of this protein in NHL of high-grade malignancy (x2=16,294 and p=0,001). BAX protein expression levels were similar in NHL of intermediate and high-grade tumours but significant1y lower in low grade malignancy tumours (p=0,02). The inedited data of this study as high BAR. and MCL-I expression in NHL, associated to the already published high expression of BAX in high and intermediate grade NHL and BCL-2 in low and intermediate grades NHL, in agreement with the literature, suggest that apoptotic regulating proteins may be implicated in etiopathogeny and psychopathology in these diseases. Studies on genetic regulation of these proteins may indicate differences between homologous responsive elements altering apoptosis control Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: O sistema ABO é considerado o mais importante grupo de aloantígenos eritrocitários. Os antígenos A e B são glicoproteínas, cujas estruturas antigênicas dependem da atividade de enzimas, glicosiltransferases, que são produtos do gene ABO. Este gene esta localizado no cromossomo nove e apresenta sete exons, sendo os dois últimos responsáveis pela maior parte da seqüência da proteína codificada. Foram estudados os exons seis e sete de dez doadores do subgrupo Â3 com estudo familiar em três casos e de 71 Ameríndios da tribo Parakanã. Os doadores Â3 foram pré selecionados de acordo com critérios sorológicos e posteriormente foi realizado extração do DNA genômico seguido de amplificação dos dois últimos exons através da reação em cadeia da polimerase. O rastreamento das alterações moleculares nos doadores Â3 foi feito através do polimorfismo de conformação de fita simples de DNA e por seqüenciamento direto. Os índios foram submetidos a amplificação dos exons seis e sete e posterior digestão por enzimas de restrição, com o objetivo de definir a presença .da deleção 261 G e das mutações: G542A, T646A e C771T. Os resultados demonstraram que todos doadores são heterozigotos (A3O) e não , apresentam a mutação G871A previamente descrita. O exon sete é polimórfico em indivíduos A3 e com o estudo familiar foi possível concluir que a deleção 1060C assim como as mutações C467T, T646A e G829A são muito freqüentes neste subgrupo. O grupo sangüíneo O dos índios Parakanãs se caracteriza pela presença da deleção 261 G. O polimorfismo G542A foi demonstrado em 22% dos alelos O e as mutações T646A e C771 T em 65%. Estes resultados são distinto das freqüências descritas em Yanomanis, Araras e Kayapos, o que sugeri provável influencia dos efeitos Gargalo e Fundador neste grupo Indígena Abstract: The ABO blood group is the most clinically important human alloantigen system in transfusion medicine and includes many variant phenotypes. Phenotypic heterogeneity is due structural differences of the glycosyltransferase gene on chromosome nine, which controls the synthesis of transferase capabie of transferring one immunodominant sugar residue to the substrate H. We have studied the last two coding exons of ABO gene, which occupy 91 % of the soluble form of A1 transferase, from ten unrelated Â3 donors and 71 Parakanã Amerindians. The Â3 subgroup was defined according to immunohematological evaluation. Exons six and seven of the ABO gene were amplified and submitted to single strand conformation polymorphism and direct sequencing. The Amerindians were studied by PCR-RFLP for determination the 261 G deletion, the T646A and C771T mutations described in O 1variant and the G542A substitution. Ali Â3 donors have showed heterozygosity for the 261 G deletion (Â30) and have not presented the G871A mutation, previously described in this blood subgroup. The exon seven were heterogeneous at the molecularl~vel and with family studies were possible to conclude that the 1 D6DC deletionand the C467T, T646A and G829A mutations were frequently in this subgroup Ali Amerindians studied were 01 as described in other Indians group. Otherwise, the Parakanã presented lower frequencies of the G542A (22%), T646A and C771T mutation (65%) than other tribes. We concluded that the G542A and probably the O 1v allele are not distributed homogeneously among ali Amazonian Amerindians. The distinct result found in Parakanã Indians suggests a consequence of random genetic drift Doutorado Doutor em Clínica Médica

Orientador: Mary Luci de Souza Queiros Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Neste trabalho estudamos o crescimento e diferenciação dos precursores hematopoiéticos da medula óssea, na ausência de fatores estimuladores de colônias (autoproljferação) em vinte e oito pacientes com Leucemia Mielóide Aguda (LMA), doze pacientes com Síndrome Mielodisplásica (SMD) e dezenove controles (indivíduos normais). Os nossos resultados demonstraram que pacientes com LMA e SMD apresentam um aumento autócrino no número de colônias hematopoiéticas que é significativamente superior ao observado em indivíduos normais (p = 0.001). Além disso, verificamos que a presença de autoproliferação celular está associada a um mau prognóstico nas leucemias agudas, pois os pacientes com autoproliferação celular (n = 15) apresentaram uma sobrevida menor em relação aos pacientes com ausência de capacidade autoproliferativa (n = 13), (p = 0.01). O estudo da sobrevida celular, realizado através da caracterização morfológica por microscopia óptica de células apoptóticas, revelou um baixo índice de células apoptóticas em pacientes com LMA (n = 18, P = 0.001) em relação aos controles. Por outro lado, pacientes com SMD apresentaram um alto índice de apoptose celular quando comparado aos indivíduos normais (n = 11, p = 0.001). Em relação à expressão do proto-oncogene bcl-2, verificamos novamente resultados opostos entre os pacientes com LMA e SMD, pois observamos um alto índice de expressão do bcl-2 em células mononucleares de pacientes com LMA (n = 28, P = 0.002) em relação aos controles, e um baixo índice de expressão do proto-oncogene bcl-2 em células mono nucleares de pacientes com SMD (n = 15, p = 0.002). Além disso, verificamos uma correlação linear negativa entre a expressão do proto-oncogene bcl-2 e apoptose celular em pacientes com LMA (rs = - 0.664; P < 0.001). A elevada expressão do bcl-2 verificada nos pacientes com LMA também indica uma interferência deste proto-oncogene na resposta celular à quimioterapia, pois sua expressão estava significativamente maior em pacientes refratário& à quimioterapia (p = 0.03). Sendo assim, os resultados obtidos neste trabalho contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no processo de resistência celular à quimioterapia nos pacientes com LMA e também ajudam a esclarecer, pelo menos em parte, alguns processos envolvidos na hematopoiese desordenada nos casos de SMD Abstract: In this work we studied the growth and differentiation of early bone marrow progenitor cells in the absence of exogenous growth factors (autonomous proliferation), the bcl-2 expression and the number of apoptotic cells in mononuclear bone marrow cells from patients with confirmed diagnosis of Acute Myeloid Leukaemia (AML) and Myelodysplastic Syndrome (MDS). Bone marrow cells from normal individuals were used as controls. We observed an increased percentage of bcl-2 expression on mononuclear bone marrow cells from AML patients in relation to controls (p = 0.002). Accordingly, the number of apoptotic cells was reduced (p = 0.001) and there was a negative correlation between bcl-2 expression and the number of apoptotic cells (r= - 0.664, P < 0.001) in these patients. In addition, bcl-2 expression was significantly increased in the chemotherapy resistant group in relation to the responsive group (p = 0.03). Survival in the group of AML patients with autonomous proliferation was reduced (p = 0.01). These results suggest that a high bcl-2 expression and the presence of autonomous proliferation are related with a poor prognosis in AML. In the MDS patients, the autonomous proliferation and the percentage of apoptotic cells were also significantly greater when compared to controls (p = 0.001). However, bcl-2 expression was significantly lower on mononuclear bone marrow cells from MDS patients In relation to normal individuals (p = 0.002 - Wilcoxon). These results suggest that the autonomous proliferation observed in these patients is counteracted by the high range of cell death which is probably related to the lower bcl-2 expression Doutorado Doutor em Ciências Biológicas

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Nos últimos anos, o sangue de cordão umbilical humano (scuh) vem se tornando fonte alternativa viável, para obtenção de célula precursora de linhagem hematopoiética devido à facilidade em ser obtido, manipulado e rico em células precursoras. Estas células são mais imaturas que as da medula óssea, tendo grande capacidade de proliferação, replicação e transfecção. Apresenta, quando transfectada, maior expressão do material introduzido. No intuito de estudar a viabilidade destas células para reconstituir linhagem hematopoiética, analisamos sua capacidade de proliferação em cultura em meio de metilcelulose, antes e após criopreservação e transplantando-as em camundongos portadores de imunodeficiência severa combinada (SCID), irradiados. Foram coletadas, no período de junho de 1996 a agosto de 1998, 75 bolsas de scuh. Houve uma variação no volume de sangue coletado de 1 a 120 ml com média de 57 ml. O número médio de células viáveis foi de 119 x105 /ml de sangue de cordão. Nos estudos clonogênicos as médias observadas foram 216 colônias de CFU/BFU-E, 134 colônias de CFU-GM e 22 colônias de CFU-GEMM. Durante o estudo notamos uma proliferação intensa nas culturas de sangue de cordão de prematuros quando comparados com os neonatos de termo. Os prematuros apresentaram um maior número de células precursoras viáveis (371 x 105/ ml de sangue de cordão) que os de termo (74 células. x 105/ ml de sangue de cordão) Na leitura feita no 8° dia de cultura, encontramos 284 CFU/BFU-E nos prematuros e 19 colônias nos de termo (p=0,003). Em relação às CFU-GM os prematuros apresentaram 196 colônias/ml de sangue de cordão e os de termo 15 colônias Iml (p=0,003). Foram encontradas 29 colônias de CFU-GEMMM nos prematuros e nenhuma colônia nos de termo (p=0,003) No 14° dia, os prematuros apresentaram 358 colônias de CFU/BFU-E e os de termo 216 colônias (p=0,061); 219 colônias de CFU-GM e os de termo 120 colônias (p=0,075); 41 colônias de CFU-GEMM e os de termo 23 colônias (p=0,040). Tal fato poderia estar relacionado com o maior número de células precursoras existente em prematuros que se relaciona com a ontogenia da hemopoiese. Entretanto a diferenciação nos diferentes tipos de colônia se encontra também acelerado. As culturas dos prematuros no 8° dia foram semelhantes às de termo no 14° dia, já apresentando grande quantidade de CFU-GEMM. As culturas do 14° dia já apresentavam BFU-E, as quais, só aparecem nas de termo no 21° dia, apresentando também, intensa proliferação celular, dificultando a contagem. Provavelmente as células dos prematuros analisados (idade gestacional entre 20 e 32 semanas) devem entrar em ciclo celular antes que as de termo. Este achado está sendo objeto de estudo o estudo da viabilidade das células após o congelamento demonstrou que elas permaneceram viáveis após a crio preservação, mantendo, nos estudos clonogênicos, sua capacidade proliferativa e na imunofenotipagem, a proporção de células CD34+ foi semelhante à realizada pré- congelamento. O transplante foi realizado em 20 camundongos de linhagem SCID/SCID, após terem sido irradiados com 300 rads de fonte de Césio, injetando-se 1,0 x 10 7 células mononucleares de scuh em veia orbitária. Concomitantemente, num dos experimentos foi sacrificado um animal sem ser irradiado e transplantado, sendo feita a avaliação do mesmo modo que para avaliar a pega dos transplantados. Para avaliação da pega, os camundongos foram sacrificados 8 semanas após transplante, sendo feita cultura de lavado de medula óssea dos camundongos em meio sem i-sólido de metilcelulose com fatores estimulantes de crescimento recombinantes, específicos para linhagem celular humana e análise através de imunofenotipagem por citometria de fluxo com anticorpos monoclonais para células humanas. Foram obtidas amostras de sangue periférico, macerado de pulmão, baço e de lavado de medula óssea A pega na 8a semana pós transplante ocorreu em 6 dos 21 camundongos; 15 animais morreram na 1 a semana pós, irradiação, o que pode acontecer pois a linhagem SCID é mais sensível que as outras linhagens. Houve intensa proliferação nas culturas, dificultando a contagem das CFU-C. A análise através da citometria de fluxo foi positiva em 3 dos 6 casos. Foram analisados 6.000 a 10.000 eventos. A porcentagem encontrada de células captadas pelos anticorpos foi expressa em relação ao campo de linfócitos. Foram encontradas, no sangue periférico, 400 células com 26,03% de CD45, 4,50% de CD2, 30,14% de CD3, 1,03% de CD19. No pulmão, 2500 células com 18,65% de CD45, 16,32% de CD3 e 0,37% de CD19. Na medula óssea, 1000 células, com 12,80% de CD45, 4,45% de CD3, 0,855 de CD8, 0,03% de CD34. No baço, haviam 2300 células sendo 36,84% de CD45, 28,27% de CD3, e 1,62% de CD19. No camundongo sem transplante não houve marcação para células humanas. Mediante os dados apresentados, que se relacionam com os da literatura, as células precursoras do sangue de cordão são capazes de reconstituir a linhagem hematopoiética após ablação da medula e devido às suas caracteristicas, imaturidade, grande capacidade de proliferação e autogeração podem ser adequadas para terapia gênica Abstract: During the past 14 years, human umbilical cord blood (UCB) has become an important source of hematopoietic stem cells The collection and manipulation of UCB is easy and due to the rich content of progenitors cells, when cultured, these cells provide a high enough number of GM-CSF colonies to allow recovery of the hematopoietic lineage. UCB progenitor cells display a great ability to proliferate and self-renewal and are capable of multilineage expression in secondary colony cultures. In addition, UCB cells can be efficiently infected with retroviruses and provide a high level of expression of the introduced sequence. So, UCB cells can also be used in gene therapy. To evaluate the proliferative potential of UCB stem cells to recover hematopoietic lineage, we collected between june, 1996 to august 1998, 75 UCB bags and analyzed, before and after cryopreservation, their viability and proliferative capacity in methylcellulose culture, we also performed transplantation of these cells into SCIO mice in order to recover bone marrow after ablative irradiation. The collected volume medium was 57ml, the medium viable number of mononuclear cells was 119 x105/ml of cord blood. The medium CFU-C founded in clonogenic studies were: 216. CFU-E, 134 CFU-GM and 22 CFU-GEMM. During our study we discovered that cultures from UCB cells of premature neonates had an early growth of CFU-E/BFU-E, CFU-GM and CFU-GEMM, on the 8th day of culture, and that the number and morphological characteristics of these colonies were comparable to those from fuI! term neonates obtained on the 14th day. The prematures presented, on the 8th day of culture, 284 CFU/BFU-E while, in full term neonates there were 19 colonies (p=O,003). We found 196 CFU-GM colonies in the premature group and 15 colonies in the full term group (p=O,OO3), 27 CFU-GEMM colonies in the premature group and none in the full term group (p=O,OO3). On the 14th day of culture the results were as following: CFU/BFU-E - premature 358 x full term 216 (p=O,061), CFU-GM - premature 219 x full term 120 (p=O,075) and CFU-GEMM - premature 41 x fuIl term 23 (p=0,040). These results indicated that premature UCB cells have a higher proliferative potential, this capacity may not be only related to their higher concentration of primitive hematopoietic progenitor cells, but rather to a different timing to entry into the cell cycle. The study about cryopreservation demonstrated that the viability and clonogenic results were comparable with the results before cryopreservation. In order to evatuate the viabiity of UCB cells to recover hematopoieic lineage, fractioned UCB cells were transplanted' into sublethaly irradiated severe combined immunodeficient (SCIO) mice. We transplanted 21 mice, 6 engrafted and 15 dead during the fist week post transplantation, probably by the fact that SCIO lineage had great irradiation sensibiliy than the others mice lineages, even when we use 300 rads .The engrafted group demonstrated multilineage engraftment, analyzed by fluorescenceactivated-cell sorting (FACS) with monoclonal antibody for human cells, and clonogenic studies with mice bone marrow cells, in methylcellulose culture with human recombinant stimulating factors. Our FACS results were: peripheral blood, 400 cells with 26,03% of C045, 4,50% of C02, 30,14% of CD3, 1,03% of CD19; lung, 2500 cells with 18,65% of C045, 16,32% C03 and 0,37% of CD19; bone marrow,1000 cells with 12,80% of C045, 4,45% of C03, 0,855 of C08 and 0,03% of C034; spleen, 2300 cells with 36,84% of C045, 28,27% of C03, and 1,62% of CD19. We had done the same analysis with one untransplanted mouse. There was not any positive cell in the F ACS analysis with monoclonal antibody for human cells. These results demonstrated that umbilical cord blood cells were capable to recover bone marrow after ablative. therapies and might be in the future, the ideal source of progenitors cells for transplantation and gene therapy Mestrado Clínica Médica Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Edson Antunes Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Nossos resultados demonstram que, utilizando anticorpo monoclonal de camundongo através de imunohistoquímica, eosinófilos peritoneais de rato expressam a NOS II (30.2 +/- 11.6%) e III (24.7 +/- 7.41%). A migração de eosinófilos in vitro foi avaliada usando-se uma microcâmara de quimiotaxia de 48 poços, e os agentes quimiotáxicos empregados foram N-formil-metionil leucil-fenilalanina (fMLP, 5 x '10 POT. -8 M') e leucotrieno 'B IND. 4' ('LTB IND. 4', '10 POT. -8 M'). O L-NAME (mas não o D-NAME) inibiu significativamente a migração de eosinófilos induzida pelo fMLP (54% de redução para a concentração de 1.0 mM; P

Orientador: Sara T. O. Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A proposta deste estudo foi avaliar o comportamento de diferentes bolsas de coleta de sangue, utilizando parâmetros bioquímicos que interprete, in vitro, o metabolismo dos eritrócitos durante a conservação. Para este trabalho utilizamos bolsas de Poli (cloreto) de vinila (PVC) com di-octil-ftalat (DOP), tendo Citrato-fosfato-dextrose-adenina (CPDA) como anticoagulante. Utilizamos concentrados de hemácias coletados em seis diferentes bolsas: Terumo@ (TE), Baxter@ (BA), Grifols@ (GR), Hemobag@ (HE), Asem@ (AS) e Alex istar@ (AL). Estes concentrados foram obtidos por fracionamento de sangue total e foram armazenados a 4°C, por 35 dias. Os parâmetros bioquímicos avaliados foram: sódio e potássio plasmático, dosados por fotometria de chama; pressão de CO2, O2 e pH, determinada por gasômetro, a 37>C, em aparelho Stat Profile 5 Analyzer (Nova Biomedical, Waltham, MA); adenosina trifosfato (A TP), 2,3 difosfoglicerato (2,3 DPG) e hemoglobina plasmática, utilizando-se

Orientador: Sara Terezinha Olalla Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O eritrócito humano contém uma tirosina quinase associada à sua membrana que fosforila a banda 3. O sítio de fosforilação tem sido identificado preferencialmente na tirosina 8, no N-terminal da banda 3, mas também na tirosina 21 e, essa região tem sítios de ligação com alta afinidade por várias proteínas periféricas incluindo hemoglobinas, hemicromos e enzimas glicolíticas. Muitas das funções das proteínas são controladas por sucessivas modificações reversíveis como seu estado de fosforilação. A fosforilação do domínio citoplasmático da banda 3 do eritrócito humano purificado, por uma proteína tirosina quinase, resultou na inibição da ligação com aldolase, G3PD, fosfofrutoquinase e hemoglobina e ativação de glicólise. No presente estudo, examinamos o grau de fosforilação da tirosina da banda 3 em 34 pacientes com hemoglobinopatias: 15 com anemia falciforme, 6 com S¿BETA¿ talassemia, 6 com hemoglobinopatia SC e 7 com p talassemia. Para esta avaliação foi utilizada a técnica de immunoblotting com anticorpo anti-fosfotirosina. No grupo de pacientes com doenças falciformes, a fosforilação aumentou de 2 a 10 vezes comparada com a fosforilação do controle normal (SS=7.8±2.7 vezes; SC=3.8±1.3 vezes; Sp= 5.2±2.0 vezes). No grupo de ß talassemia a fosforilação também aumentou ('BETA¿ tal=4.3±t3.7 vezes), mas nesse grupo 3 pacientes apresentaram fosforilação da tirosina da banda 3 próximo do nível apresentado pelo controle normal (1, 1.5 e 1.7 vezes). No entanto, não houve diferença significativa na fosforilação da tirosina da banda 3 entre os vários grupos testados, exceto quando comparamos a fosforilação em hemácias intactas de pacientes com anemia falciforme(SS) e pacientes com hemoglobinopatia SC (U=6, p

Orientador: Sara T. Olalla Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: No presente trabalho foram analisados 10 pacientes com EIH e seus familiares através do estudo das proteínas totais em SDS-P AGE (Sistema Fairbanks 3,5-17% e Sistema Laemmli 12%), estudo da auto-associação de heterodímeros de espectrina e digestão tríptica da espectrina. Seis destas famílias apresentaram defeito na auto-associação dos heterodímeros de espectrina, sendo dois casos de Sp a 1150-46, três famílias com Sp a 1165e uma família com uma ß-espectrina encurtada, conforme evidenciado por técnica de westem-blotting com anticorpo anti-ß espectrina. Numa das famílias com Sp a 1165, um dos pacientes apresentou também uma ß-espectrina alongada, mas esta associação não determinou maior gravidade da doença ou aumento dos dímeros de espectrina. Uma família e um paciente apresentaram deficiência de proteína 4.1 e em dois casos não foi possível detectar, pela metodologia empregada, o defeito proteico. Nos pacientes Sp a 1165 kDa a pesquisa de heteroduplex após a amplificação do exon 4 do DNA genômico da cadeia alfa da espectrina demonstrou o aparecimento de uma banda com migração retardada nas três famílias estudadas sugerindo a duplicação do codon TTG. Em uma paciente Sp a 1150-46 kDa o sequenciamento do exon 6 da cadeia a-sp mostrou uma mutação de ponto CTG leu -+ CCG pro em um alelo no codon 260. Este é o primeiro estudo das alterações proteicas da ElH na população brasileira. A ß-espectrina alongada observada neste trabalho é o segundo caso descrito na literatura enquanto que a ß-espectrina "truncada" é, provavelmente, a menor ß-sp já descrita. O estudo da auto-associação dos heterodíineros de espectrina foi também levado a efeito em 26 pacientes com doenças cujo aparecimento de eliptócitos no esfregaço de sangue periférico era freqüente (7 LMC, 6 mielofibrose, 5 anemia ferropriva, 3 anemia megaloblástica e 5 anemia falciforme). Destes, um paciente com LMC apresentou aumento de dímeros de espectrina sugerindo, neste caso, um prejuízo na auto-associação de heterodímeros de espectrina Abstract: The aim of this work was to study the protein defects in Hereditary Elliptocytosis (HE) in a brazilian population and to analyse the self-association of spectrin in patients without HE whose elliptocytes are frequently observed. Red cell membrane of ten patients with HE and their rei atives were investigated by SDS-PAGE (Fairbanks' system 3,5-17% and Laemmli's system 12%), by non denaturing gels for spectrin heterodimer self-association study and by the tryptic digestion of spectrin. Six families presented a defect in the spectrin self-association: two had Sp a I/50-46, three with Sp a I/65 and one with a "truncated" ß-spectrin as observed by westem-blotting using anti-ß espectrin antibody. In one family with Sp a I/65, one patient presented also a elongated ß-espectrin but this association did not increase the amount of spectrin dimers or the clinical severity of the disease. One family and one patient presented a deficiency of protein 4.1 and in two families, the protein defect was not detected by the approach used in this study.In the Sp a I/65 kDa patients, the analysis of heteroduplex after amplification of exon 4 of the genomic DNA for the a-spectrin chain revealed the appearance of a slower migrating band in the three families studied suggesting the duplication of codon TTG. In one patient with Sp a I/50-46 kDa the sequencing of exon 6 of the a-sp chain showed a point mutation CTG leu - CCG pro in an allele in codon 260. As far as we know, this is the first study of red cell membrane in hereditary elliptocytosis in a brazilian population. The elongated ß -spectrin observed in this study is the second case described in the literature and the truncated ß-spectrin probably corresponds to the smaller ß-sp already described.The study of the spectrin heterodimer self-association was also performed in 26 patients with diseases in which elliptocytes are frequently observed in peripheral blood smears (7 CML, 6 myelofibrosis, 5 iron deficiency anemia, 3 megaloblastic anemia and 5 sickle cell disease). Only one patient with CML had increased IeveIs of the spectrin dimer, which suggested a defect in the spectrin heterodimer self-association Mestrado Mestre em Farmacologia