Fatores geneticos moduladores da gravidade clinica nas Beta-talassemias : o exemplo da proteina AHSP (Alpha Hemoglobin Stabilizing Protein)

Orientador: Fernando Ferreira Costa Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: AHSP é uma proteína eritróide específica que apresenta afinidade de ligação com a-globinas, estabilizando essas moléculas e dessa forma, evitando a precipitação nos precursores eritróides e bloqueando danos celulares causados pela oxidação de cadeias globínicas. Camundongos portadores de P-talassemia com deleção do gene AHSP apresentaram maior precipitação de cadeias a-globinas nas hemácias e níveis acentuados de anemia. Estudos in vitro utilizando proteína recombinante demonstraram menor geração de espécies reativas de oxigênio quando a-globinas encontram-se estabilizadas pela AHSP. Com o objetivo de analisar a importância da proteína AHSP como modulador de gravidade clínica nas síndromes P-talassêmicas o gene AHSP foi analisado em amostras de DNA de pacientes com P-talassemia, atendidos pelo Hemocentro da Unicamp, e em amostras controles durante minha tese de mestrado. Durante estes estudos, três características do gene AHSP foram detectadas. Estas características do gene AHSP foram investigadas durante o desenvolvimento deste presente trabalho. Primeiro, um polimorfismo localizado no posição 12888 no gene AHSP, que leva a substituição de uma Asparagina na posição 75 por uma Isoleucina (N75I), foi identificado em uma paciente heterozigota para P-talassemia (Pj9/pA) com anemia grave e em processos transfusionais freqüentes. Outras duas famílias apresentaram o polimorfismo N75I. Entretanto, nestes casos a presença do polimorfismo no gene AHSP não se correlaciona claramente com a gravidade clínica. O sequênciamento de amostras de indivíduos controles de várias partes do mundo sugerirão uma baixa freqüência deste polimorfismo na população analisada. Estudos de indivíduos saudáveis positivos para o polimorfismo N75I demonstraram precipitação e oxidação de cadeias globínicas nas hemácias. Análises funcionais com proteína recombinante sugerem que a proteína AHSP N75I apresenta características de ligação com a-globínas normais, mas é menos eficiente em evitar geração de espécies reativas de oxigênio por estas cadeias globínicas. Estes efeitos, quando em conjunto com ?-talassemia poderiam resultar em anemia mais grave, demonstrando a proteína AHSP N75I como um modificador genético nas síndromes talassêmicas. Segundo, através de análises computacionais, nós identificamos uma estrutura secundária na região 3'-UTR do RNA mensageiro do gene AHSP. semelhante a um elemento responsivo a ferro (IRE), presente em todas as espécies que apresentam o gene AHSP. Várias evidências demonstraram que, mesmo não apresentando as características principais para a caracterização de um IRE, esta estrutura secundária do gene AHSP é reconhecido pelas proteínas reconhecedoras de IREs (IRPs) regulando a estabilidade da molécula de RNA mensageiro em resposta aos níveis de ferro: 1) Recuperação do RNA mensageiro do gene AHSP através da imunoprecipitacão das proteínas IRP1 e IRP2: 2) Níveis elevados de ferro desestabilizam o RNA mensageiro do gene AHSP: mutações neste IRE levam à desestabilização constitutiva do RNA mensageiro; 3) Níveis elevados de ferro desestabilizam o RNA mensageiro do gene AHSP em camundongos que apresentam excesso de ferro. Estes dados contribuem para o melhor entendimento de como IRE atípicos podem ainda ser funcionais e sugerem um mecanismo que poderia regular a estabilidade de cadeias globínicas de acordo com os níveis de ferro. Além disso, sugerem que o excesso de ferro, que ocorre em pacientes com (3-talassemia. podem ser determinante na gravidade da doença por, provavelmente, aumentar os níveis de a-globinas livres e precipitando nos precursores eritróides. E, em terceiro, através de busca de sítios de ligação de fatores de transcrição no gene AHSP, nós encontramos um elemento MARE localizado no final do segundo éxon. Estudos de imunoprecipitaçâo de cromatina demonstraram ligação dos fatores de transcrição Nrf2, Bachl e Maf ao elemento MARE do gene AHSP e regiões controle. Concluindo, estes resultados demonstraram pela primeira vez um polimorfismo no gene AHSP que produz uma proteína não completamente funcional que pode estar relacionada com gravidade à p-talassemia e, além disso, descrevem dois mecanismos inéditos da regulação da expressão do gene AHSP que podem ser importantes na regulação deste gene em outras doenças hematológicas e durante a eritropoiese Abstract: Alpha-hemoglobin stabilizing protein (AHSP) is an erythroid-specific molecular chaperone that binds the cx-chains of hemoglobin, preventing their precipitation and deleterious effects. Loss of AHSP exacerbates a-globin precipitation and anemia in a murine model for p-thalassemia. In vitro, recombinant AHSP inhibits the production of reactive oxygen species (ROS) by a-globin. To further define the role of AHSP as a modifier of P- thalassemia, we analyzed AHSP sequence for mutations in a large population of (3- thalassemic and control subjects. From this genomic screening three interesting features of the AHSP gene were found. First, a single nucleotide change that converts asparagine 75 to leucine (N75I) was identified in a patient who was heterozygous for P-thalassemia (p39/(3A). She presented with an unusually severe anemia that required regular blood transfusion. Another two families were positive detected for the SNP N75I. but the presence of other known genetic modifiers for thalassemia in these families made hard to correlate clinical severity with AHSP. Of the unrelated control subjects tested just one (0.35%) contained the SNP N75I. Analysis of red blood cells from this subject revealed normal hemoglobin indices but a small number of Heinz bodies, suggesting a non-fully functional AHSP. Analysis of the biochemical properties of the recombinant mutant protein showed that the binding affinity of AHSP N75I for a- hemoglobin is normal. Importantly, compared to wild type AHSP, the N75I mutant protein exhibited significantly reduced capacity to inhibit ROS production by a-hemoglobin. Hence, AHSP N75I may be less effective at conferring protection from oxidative-mediated damage by free a-hemoglobin in erythrocytes. These effects, when coupled with P-thalassemia, could result in more severe anemia, implicating AHSP N75I as a potential genetic modifier. Second, by computational algorithms, we identified IRE-like stem-loop structures in AHSP mRNA of multiple species, yet the primary sequences deviate significantly from canonical IRE consensus sequences determined by studies of classical IREs, such as Transferring receptor and Ferritin. Several lines of evidence now show that the AHSP IRE binds IRPs to regulate mRNA stability in an iron-dependent fashion: 1) AHSP mRNA co-immunoprecipitates with IRPs. 2) AHSP mRNA is destabilized by iron in both erythroid and heterologous cells; disruption of the IRE renders the mRNA constitutively unstable. To study how iron regulates AHSP expression in vivo, we treated mice with iron dextran for 10 days and then examined AHSP mRNA in Terll9+ erythroid progenitors by RT-PCR. We found that short-term iron overload reduced AHSP mRNA levels. Our findings indicate that AHSP mRNA stability is regulated by iron via an atypical 3'-UTR IRE. These findings extend the potential repertoire for functional IREs that do not conform as the previously defined canonical consensus sequences. In addition, they provide a potential mechanism by which erythroid cells can regulate globin stability according to iron status. As such, iron overload, which occurs in patients with p thalassemia, might aggravate the disease by further elevating the levels of toxic free a globin. And third, by computation analysis of transcriptional sites, we found a potential MARE element located at the end of the second exon. Experiments of chromatin imunoprecipitation assay determined the binding of the transcript factor Nrf2, Bachl and Maf to the MARE element of AHSP gene, as well to the positive controls. Overall, these results demonstrated for the first time a polymorphism on AHSP gene that produce a non fully functional protein that might be correlated with severity in p-thalassemia and two new mechanisms that control the AHSP gene expression with potential implications in another hematological diseases besides thalassemias and closely connecting AHSP with erythropoiesis Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Fisiopatologia Médica