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Orientador: Prof. Dr. David Alexander Mitchell Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Defesa : Curitiba, 31/05/2022 Inclui referências Resumo: O interesse na produção de oligossacarídeos através da transglicosilação tem crescido nos últimos anos. Nas transglicosilações catalisadas por enzimas que seguem o mecanismo Ping Pong bi bi, há três reações concorrentes: a transglicosilação, a hidrólise primária (hidrólise da molécula doadora inicial) e a hidrólise secundária (hidrólise do produto de transglicosilação). Nas transglicosilações controladas cineticamente, o rendimento máximo do produto de transglicosilação depende das seletividades da enzima para transglicosilação em relação a ambas reações de hidrólise. Os métodos atuais para determinar a seletividade caracterizam apenas a seletividade da transglicosilação em relação à hidrólise primária. No trabalho atual, foi desenvolvido um modelo que pode ser usado para estimar ambas as seletividades a partir de um perfil de reação de rendimento percentual do produto de transglicosilação traçado em relação ao consumo percentual da molécula doadora. Através de estudos de caso da literatura, foi demonstrado como o modelo pode ser utilizado para quantificar os resultados de mutações destinadas a melhorar a seletividade. O modelo também foi usado para explorar estratégias para melhorar o rendimento do produto de transglicosilação. Esta exploração demonstra que não é suficiente ter altas seletividades para a transglicosilação em relação à hidrólise, sendo também necessário que a reação de transglicosilação tenha uma constante de equilíbrio razoavelmente alta. Abstract: Interest in the production of oligosaccharides by transglycosylation has grown in recent years. In enzyme-catalyzed transglycosylations that follow the Ping Pong bi bi mechanism, there are three competing reactions: the transglycosylation itself, primary hydrolysis (i.e. of the initial donor molecule) and secondary hydrolysis (i.e. of the transglycosylation product). In kinetically controlled transglycosylations, the maximum yield of the transglycosylation product depends on the selectivities of the enzyme for transglycosylation in relation to these hydrolysis reactions. Current methods for determining selectivity only characterize the selectivity for transglycosylation in relation to primary hydrolysis. The current work develops a model that can be used to estimate both selectivities from a reaction profile of percentage yield of transglycosylation product plotted against the percentage consumption of the donor molecule. Case studies from the literature are used to show how the model can be used to quantify the results of mutations aimed at improving selectivity. The model is also used to explore strategies for improving the yield of the transglycosylation product. This exploration demonstrates that it is not sufficient to have high selectivities for transglycosylation in relation to hydrolysis, it is also necessary that the transglycosylation reaction have a reasonably high equilibrium constant.

Orientador: Prof. Dr. David Alexander Mitchell Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Defesa : Curitiba, 25/08/2020 Inclui referências: p. 126-130 Resumo: Devido ao crescente interesse em biorrefinarias, processos que envolvem hidrólises enzimáticas de polissacarídeos tenderão a receber cada vez mais atenção. Assim, os modelos matemáticos correspondentes a tais processos também serão ferramentas com crescente importância para orientar projetos e operações de processos. Para sistemas nos quais os polissacarídeos são atacados por uma ou mais enzimas, os modelos estocásticos são frequentemente preferíveis aos modelos determinísticos, tendo em vista a complexidade exigida neste tipo de abordagem para as deduções exigidas. Porém, para serem ferramentas úteis e práticas para orientar os projetos fabris e a operação dos processos, tais modelos estocásticos não podem avançar em termos de grau de reação, de forma que o avanço deve ocorrer em função do tempo. Atualmente, vários modelos estocásticos já foram desenvolvidos para descrever a hidrólise de polissacarídeos, em que em muitos deles o avanço ocorre em termos de tempo. Ainda assim, alguns utilizam parâmetros que não têm significado biológico reconhecido; e em outros, ajustes a dados experimentais são feitos após a simulação para o eixo do tempo. Além disso, em muitos trabalhos há a solicitação de informações de difícil obtenção experimental, o que poderia inviabilizar a aplicação do método. No presente trabalho, são propostos modelos estocásticos que avançam no tempo de maneira totalmente consistente com a teoria cinética enzimática clássica: os parâmetros de tais modelos são constantes de especificidade e constantes de saturação, sendo demonstrado como esses parâmetros poderiam ser obtidos para outros sistemas. Foram apresentados quatro estudos de caso, com diferentes objetivos específicos. O primeiro estudo de caso aborda um sistema hipotético para a hidrólise de tetrassacarídeos por uma enzima capaz de hidrolisar qualquer ligação glicosídica, com exceção da ligação glicosídica que envolve a unidade no término redutor do oligossacarídeo, sendo demonstrado que as previsões do modelo estocástico são iguais às de um modelo determinístico baseado em equações diferenciais com expressões cinéticas. Posteriormente, no segundo estudo de caso, foi descrita a hidrólise de tiofenil N-acetil-?-(1,6)-pentaglucosamina por DispersinB, sendo reforçado que os perfis advindos do modelo estocástico são equivalentes aos do modelo determinístico, contudo, com a diferença de que foi empregado um sistema real neste estudo, com dados experimentais que facilitaram a constatação de que os perfis descreveram bem os resultados que seriam obtidos na prática. No terceiro estudo de caso, foi modelado um sistema em que não seria conveniente usar um modelo determinístico, ou seja, a hidrólise de uma mistura de oligômeros de ácido Dgalacturônico por endopoligalacturonases. Por fim, no quarto estudo de caso, o método foi aplicado para um sistema com mais de uma enzima, tendo sido demonstrado como o modelo poderia ser usado para otimizar a proporção entre a poliendogalacturonase e a metilesterase. A abordagem desenvolvida pode levar à concepção de uma nova classe de modelos estocásticos para abordagens que envolvem hidrólises de suspensões coloidais de polissacarídeos. Palavras-chave: Hidrólise enzimática. Modelo Estocástico. Modelo Determinístico. Cinética Enzimática Clássica. Suspensão Coloidal de Polissacarídeos. Abstract: Due to the growing interest in biorefineries, processes involving enzymatic hydrolysis of polysaccharides will tend to receive more attention every day. Therefore, the mathematical models corresponding to such processes will also be tools of increasing importance to guide process projects and operations. For systems in which polysaccharides are attacked by one or more enzymes, stochastic models are often preferable to deterministic models, in view of the complexity required in this type of approach for the required deductions. However, to be useful and practical tools to guide the manufacturing projects and the operation of the processes, those stochastic models cannot advance in terms of the degree of reaction, so the advance must occur as a function of time. Currently, several stochastic models have already been developed to describe the hydrolysis of polysaccharides, in which in many of them the advance occurs in terms of time. Still, some use parameters that have no recognized biological significance; and in others, adjustments to experimental data are made after the simulation for the time axis. In addition, in many studies there is a request for information that is difficult to obtain experimentally, which could make the application of the method unfeasible. In the present work, stochastic models that advance in time are proposed in a way totally consistent with the classic enzymatic kinetic theory: the parameters of such models are specificity constants and saturation constants, showing how these parameters could be obtained for other systems. Four case studies were presented, with different specific objectives. The first case study addresses a hypothetical system for the hydrolysis of tetrasaccharides by an enzyme capable of hydrolyzing any glycosidic bond, with the exception of the glycosidic bond that involves the unit at the reducing end of the oligosaccharide, showing that the predictions of the stochastic model are equal to those of a deterministic model based on differential equations with kinetic expressions. Subsequently, in the second case study, the hydrolysis of thiophenyl N-acetyl-?-(1,6)-pentaglucosamine by DispersinB was described, reinforcing that the profiles resulting from the stochastic model are equivalent to those of the deterministic model, however, with the difference that a real system was used in this study, with experimental data that facilitated the verification that the profiles described well the results that would be obtained in practice. In the third case study, a system was modeled in which it would not be convenient to use a deterministic model, that is, the hydrolysis of a mixture of D-galacturonic acid oligomers by endopoligalacturonases. Finally, in the fourth case study, the method was applied to a system with more than one enzyme, and it was demonstrated how the model could be used to optimize the ratio between poliendogalacturonase and methylesterase. The developed approach may lead to the design of a new class of stochastic models for approaches involving hydrolysis of colloidal polysaccharide suspensions. Keywords: Enzymatic hydrolysis. Stochastic model. Deterministic model. Classic enzyme kinetics. Colloidal polysaccharide suspension.

Orientador: Prof. Dr. Luiz Fernando de Lima Luz Junior Coorientadores: Prof. Dr. Éliton Fontana e Prof. Dr. David Alexander Mitchell Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Quimica. Defesa : Curitiba, 30/10/2019 Inclui referências: p.73-79 Resumo: O aumento da emissão de gases prejudiciais para o aquecimento global, em especial o CO2, tem incentivado cada vez mais os pesquisadores a buscar tecnologias de tratamento e redução da emissão de CO2. Dentre as técnicas avaliadas pela academia, a injeção de CO2 em matrizes rochosas tem se mostrado em ascendência devido à alta capacidade de retenção desta espécie química em reservatórios, além do potencial para utilização como técnica de Recuperação Avançada de Petróleo. Muitos dos estudos desenvolvidos sobre a injeção de CO2 até então, buscaram avaliar o processo através de um aspecto reativo sem se preocupar com o escoamento realizado. Devido a isso, o objetivo deste trabalho é avaliar o escoamento de fases fluidas por meio de análises experimentais e simulações para obter perfis de perda de carga e cálculo de permeabilidades de sistemas porosos definidos. A metodologia utilizada para o sistema foi dividida em uma análise experimental e uma análise numérica. A análise experimental foi desenvolvida para determinação da permeabilidade do meio poroso através da medição da perda de carda do sistema. Já a análise numérica foi realizada por dois sistemas independentes sendo o primeiro sistema um meio poroso 2D para avaliação da diferença de representação de um meio poroso de geometria definida e um meio poroso pseudo-homogêneo e o segundo uma simulação do sistema experimental para comparação dos valores experimentais de perda de carga medidos. As permeabilidades obtidas para as vazões de 5 mL/min, 10 mL/min e 15 mL/min foram respectivamente : 61,3x10-12 m²; 107,5x10-12 m² e 150,3 x10-12 m². A análise numérica 2D do sistema demonstrou que a diferença entre um meio poroso de geometria definida e um meio poroso pseudo-homogêneo é baixa e dentro do aceitável com um valor máximo de erro associado igual à 5,76%. Já a análise numérica para comparação do sistema experimental apresentou valores de queda de pressão com um erro associado máximo de 12,10%. As análises realizadas apresentaram uma consistência plausível para o sistema experimental. Além disso, por meio deste trabalho foi possível observar o comportamento de escoamento e o perfil de velocidades para o modelo que é de grande interesse para avaliação de sistemas porosos. Palavras-chave: Escoamento em meio poroso, perda de carga, injeção de fluidos em meios carbonáticos. Abstract: The increase in the emission of gases harmful to global warming, especially CO2, has increasingly encouraged researchers to seek technologies for treatment and reduction of CO2 emissions. Among the techniques evaluated by the academy, the injection of CO2 in rocky matrices has been shown to be in ascendancy due to the high retention capacity of this chemical species in reservoirs, in addition to the potential for use as an Advanced Petroleum Recovery technique. Many of the studies developed on CO2 injection so far, sought to evaluate the process through a reactive aspect without worrying about the flow performed. Because of this, the objective of this work is to evaluate the flow of fluid phases through experimental analyzes and simulations to obtain head loss profiles and calculation of permeability of defined porous systems. The methodology used for the system was divided into an experimental analysis and a numerical analysis. The experimental analysis was developed to determine the permeability of the porous medium by measuring the loss of card of the system. The numerical analysis was performed by two independent systems, the first being a 2D porous medium for evaluating the difference in representation of a porous medium of defined geometry and a pseudo-homogeneous porous medium and the second a simulation of the experimental system for comparing the values experimental head loss measurements. The permeabilities obtained for flow rates of 5 mL / min, 10 mL / min and 15 mL / min were respectively: 61.3x10-12 m²; 107.5x10-12 m², and 150.3x10-12 m². The 2D numerical analysis of the system demonstrated that the difference between a porous medium of defined geometry and a porous medium pseudo-homogeneous is low and within the acceptable range with a maximum value of associated error equal to 5.76%. The numerical analysis for comparison of the experimental system, however, showed pressure drop values with a maximum associated error of 12.10%. The analyzes performed showed a plausible consistency for the experimental system. In addition, through this work it was possible to observe the flow behavior and the speed profile for the model that is of great interest for the evaluation of porous systems. Keywords: Porous flow, pressure drop, fluid injection in carbonate media.

Orientador: Prof. Dr. David Alexander Mitchell Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Defesa : Curitiba, 28/02/2020 Inclui referências Resumo: O interesse em biorrefinarias para o processamento de resíduos cítricos tem aumentado nos últimos anos. Um dos produtos dessa biorrefinaria é o ácido Dgalacturônico que é obtido a partir da hidrólise multi-enzimática da pectina. O ácido D-galacturônico pode ser usado como reagente base para diversos outros produtos de interesse comercial como o ácido L-ascórbico. Um modelo matemático capaz de descrever a ação de um sistema multienzimático nos substratos da biorrefinaria de polpa cítrica seria de grande interesse pois permitiria a otimização dos processos que envolvem essa biorrefinaria. Atualmente existem alguns modelos que descrevem a hidrólise enzimática de substratos pécticos por uma única enzima, mas não existe nenhum modelo que descreva uma hidrólise multi-enzimática e que possa ser diretamente aplicada a hidrólise da pectina e seus derivados. O presente trabalho desenvolve um modelo estocástico, baseado no método de Monte Carlo, para descrever a ação de um sistema multi-enzimático, contendo endopoligalacturonases, exopoligalacturonases e esterases, na hidrólise total dos ácidos poligalacturônico, oligogalacturônico e da homogalacturonana visando produzir o ácido D-galacturônico, com enfoque em determinar a velocidade relativa entre as enzimas. Também é analisado o efeito que diferentes proporções das enzimas causam nos perfis de hidrólise. Este trabalho apresenta uma maneira mais correta de representar a velocidade relativa entre enzimas do que os trabalhos encontrados atualmente na literatura. Palavras-chave: sistema multi-enzimático, modelo estocástico, pectina, ácido D-galacturônico. Abstract: The interest in citrus waste biorefineries has been increasing recently. One of the products that originate from this biorefinery is the D-galacturonic acid that comes from the hydrolysis of the extracted pectin using a multi-enzyme system as the catalyst. The D-galacturonic acid can be used as a platform chemical for the production of several compounds of commercial interest like L-ascorbic acid. A mathematical model capable of describing the enzymatic actions of a multienzyme system on the biorefinery substrates, such as polygalacturonic acid, would be of great interest in the process optimization of such a biorefinery. Currently there are a few works that describe the enzymatic hydrolysis of pectin and pectin like substrates, but there is no work that studies the action patterns of multi-enzyme systems and can be directly applied on the hydrolysis of the pectin and its substrates. This current work develops a stochastic model, based on the Monte Carlo method to describe the action of a pool of enzymes, containing endopolygalacturonases, exopolygalacturonases and esterases during the complete hydrolysis of oligogalacturonates, polygalacturonates and homogalacturonan aiming to produce D-galacturonic acid, focusing mostly on determining which enzyme will act on given reaction step. This work also observes the effects that different ratios in the enzymatic pool can have in the reactions. This work introduces a better way to represent de relative velocities between enzymes in comparison with the works found in the present literature. Keywords: multi-enzyme system, stochastic model, pectin, D-galacturonic acid.

Orientador: Prof. Dr. David Alexander Mitchell Coorientadora: Prof. Dr. Maura Harumi Sugai-Guérios Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Defesa : Curitiba, 29/05/2018 Inclui referências: p.100-113 Área de concentração: Engenharia Química Resumo: Análise de imagens de biofilamentos tem se tornado uma parte importante na pesquisa em biologia e biotecnologia, pois ela não só elucida a morfologia destas estruturas, mas também fornece ideias sobre o desenvolvimento destas estruturas. Além disso, a morfologia pode ser correlacionada com outras variáveis. Por exemplo, análise de imagem de fungos filamentosos permite correlacionar produtividade de enzimas com diferentes morfologias. Há um interesse em compreender como o micélio de um fungo filamentoso se desevolve ao crescer em substratos sólidos. Para estudar isso, foram obtidas imagens 3D do fungo em crescimento em diversos tempos, objetivando computar dados da morfologia e dinâmica de crescimento: velocidades de extensão da colônia e de pontas, número e posição de ramificações e pontas, comprimentos de segmentos, entre outros dados. Porém, antes de computar estes dados, foi feita uma análise da literatura de métodos de traçado de biofilamentos. A análise foi realizada para facilitar a compreensão do vasto número de métodos disponíveis, desde componentes individuais (e.g. técnicas de realçe de filamentos) a workflows completas de traçado de biofilamentos. Também há muitas opções de implementações de software. Na análise, foram incluídas 87 publicações envolvendo workflows de traçado de filamentos ou componentes. Para a análise, criou-se uma classificação (10 classes, que incluem interação com o usuário, abordagem teórica, técnica de imageamento, entre outras classes e 120 sub-classes) para apoiar a análise com o uso de conceitos de teoria de grafos. A metodologia proposta poderá ser utilizada no futuro com ferramentas de semântica web e uma base de dados e permitirá analisar um número maior de dados. Desta análise, identificaram-se os métodos mais comuns de melhoramento de imagem (Realçe de filamentos, 44.9%, suavização, 16.3% e Subtração de background 14.3%) e as tendências em abordagens teóricas (e.g. abordagens baseadas em grafos juntas à algoritmos de aprendizado de máquina, realçe de filamentos como o gradient vector flow seguidos de abordagem Levei-set fast-marching). Após a análise da literatura, foram selecionados os métodos de melhoramento mais comuns e avaliados segundo seu impacto na qualidade da imagem. Os testes foram realizados em duas amostras de imagem (experimentos do crescimento de Aspergillus niger de microscopia confocal de varredura a laser) através de um planejamento fatorial completo e análise do índice de similaridade estrutural, SSIM, e razão sinal-ruído, SNR. Resultados mostraram que o algoritmo rolling bali de subtração de background com raio 20 pixels teve o maior efeito positivo em SSIM e SNR no geral. Então, ao utilizar as imagens melhoradas como entrada, foram testados 5 métodos de traçado de filamentos (APP, APP2, NeuTube, NeuronStudio e NeuroGPS-Tree). Os resultados do traçado foram avaliados qualitativamente: O método NeuTube mostrou os resultados visualmente mais acurados. Definiu-se então o método e foram traçadas as imagens completas 3D e no tempo e obtivemos parâmetros morfométricos e da dinâmica do crescimento do fungo (perfis de biomassa e comprimentos totais, por exemplo). Embora se observe que o uso de traçado de filamentos é promisor para obter mais dados do crescimento de fungos filamentosos, discutiu-se a necessidade de aprimorar as técnicas de preparo de amostra e das configurações na aquisição das imagens, de maneira a aumentar a qualidade final das imagens e fornecer resultados mais confiáveis e concretos após o traçado para então tirar conclusões dos dados. Palavras-chave: fungos filamentosos, filamentos biológicos, análise de imagem, traçado de filamentos, melhoramento de imagem. Abstract: Image analysis of biofilaments is becoming an important part of research on biology and biotechnology because it does not only elucidates the morphology of such structures but also gives insights into their development. Additionally, the morphology can be correlated with other variables. For example, image analysis of filamentous fungi allows the correlation of enzyme productivity with different morphologies. We are interested in understanding how the mycelium of a filamentous fungus develops during growth on solid substrates. In order to study that, time-lapsed 3D images of the fungus during growth were obtained, with the intention of computing growth dynamics and morphometric data: colony and tip extension rates, number and positions of branches and tips, segment lengths, among others. However, prior to computing this data, we analysed the literature of biofilament tracing methods. The analysis was done to facilitate the understanding of the vast number of methods available, from single components (e.g. filament enhancement techniques, and specialized model-based approaches) to complete biofilament tracing workflows. There were also many software implementations options. The analysis comprised 87 publications proposing complete biofilament tracing workflows or workflow components. For the analysis, we created a classification methodology (10 main classes, including user interaction, theoretical approach, imaging technique, among other classes and 120 sub-classes) and analysed the publications using graph theory concepts. The proposed methodology could be used in the future with semantic web tools and crowd-sourced web-based databases, allowing the analysis of greater number of data. Out of this analysis, we identified the most common image enhancement methods (Filament enhancement 44.9%, smoothing 16.3%, background subtraction 14.3%) and the theoretical approach trends for biofilament tracing (e.g. graph-based approaches coupled with machine learning algorithms, image enhancement such as gradient vector flows followed by model-based fast marching approach). Following the literature analysis, we selected the most common image enhancement methods to be used prior to biofilament tracing and evaluated their impact on image quality. The tests were done on two sample images (experiments of the growth of Aspergillus niger on two different carbon sources obtained by confocal laser scanning microscopy) through a full factorial design of experiments and analysis of the structural similarity index, SSIM and signal-to-noise ratio, SNR. Results show that background subtraction (Rolling-ball algorithm, 20 pixels radius) had the most positive effect on SSIM and SNR. Then, using the enhanced images as input, we tested 5 different biofilament tracing methods (APP1, APP2, NeuTube, NeuronStudio and NeuroGPS-Tree). We evaluated the tracing results visually and qualitatively: NeuTube was the method with the most visually accurate results. After choosing NeuTube as the best method, we applied it to our complete 3D time-lapsed images and computed some growth dynamics and morphmetric parameters (e.g. biomass profiles, segment and total lengths). Although we indicate that biofilament tracing methods are a promising approach to obtain more data on the growth of the filamentous fungi, we discuss the need to improve the sample preparation techniques and image acquisition set-up in order to increase the quality of the images so the tracing results provide more reliable and concrete results to draw conclusions. Keywords: filamentous fungi, biological filaments, image analysis, filament tracing, image enhancement.

Orientadora : Prof. Dr. David Alexander Mitchell Coorientadora : Profª Drª Nadia Krieger Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 30/05/2017 Inclui referências : f. 83-86 Resumo: O fenômeno da processividade pode ser observado em muitas enzimas envolvidas na sacarificação de polissacarídeos. As probabilidades de ataque processivo, assim como as constantes de especificidade, variam de acordo com o tamanho do substrato. Quando os substratos são várias ordens de grandeza maiores que a enzima, como ocorre na hidrólise de polissacarídeos, as probabilidades de ataque processivo e a especificidade da enzima por moléculas de diferentes tamanhos pouco variam. Porém, quando a hidrolase está agindo em oligossacarídeos, a determinação destes parâmetros torna-se interessante, pois a enzima tem valores para estes parâmetros que são signficativamente diferentes para substratos que diferem no grau de polimerização por poucas unidades. A vantagem de se conhecer as constantes de especificidade relativas e as probabilidades de ataque processivo é que elas podem ser aplicadas em modelos matemáticos da reação de hidrólise que serviriam, por exemplo, para dimensionar biorreatores, para otimizar bioprocessos em uma biorrefinaria ou, ainda, para guiar experimentos de mutação em hidrolases, onde estes parâmetros seriam considerados na seleção do mutante desejado para ser submetido a novas rodadas de mutação. Entretanto, ainda não há um modelo matemático que seja válido para toda a extensão da reação de hidrólise, nem métodos que extraiam estes parâmetros simultaneamente a partir de perfis completos de hidrólise. Nos modelos disponíveis na literatura, os autores assumiram simplificações que os tornam válidos apenas para frações específicas da reação ou dificultam sua aplicação para sistemas mais complexos. O objetivo desta dissertação de mestrado foi, portanto, expandir o método Fingerprinting para extrair, além das constantes de especificidade relativas, as probabilidades de ataque processivo de perfis de hidrólise de oligossacarídeos lineares e elaborar modelos corretos para representar reações com processividade. A eficiência desta adaptação do método Fingerprinting foi comprovada pela sua aplicação em três estudos de caso de ?-amilases hidrolisando maltooligossacarídeos, de complexidade crescente, utilizando dados experimentais retirados da literatura. O primeiro estudo de caso trata da hidrólise de maltoheptaose, o sistema mais simples onde se pode observar processividade. O segundo estudo de caso foi desenvolvido sobre resultados da hidrólise de maltooctaose, um sistema com duas possíveis etapas processivas, onde o produto final da extremidade redutora é o mesmo produto removido da extremidade não-redutora pela enzima após cada ataque, o que exige uma outra abordagem para calcular a fração de hidrólise. O terceiro estudo de caso aborda a hidrólise de maltoundecaose, um sistema com três possíveis etapas processivas, onde o modelo foi ajustado a mais de um perfil de hidrólise simultaneamente. Como resultados deste trabalho, foram desenvolvidos modelos matemáticos conceitualmente corretos e válidos para toda a extensão da reação, em função do tempo e da fração de reação, para sistemas onde uma exoenzima hidrolisa um oligômero linear de forma processiva. Obteve-se, também, um método para se determinar constantes de especificidades relativas e probabilidades de ataque processivo que é mais simples de se aplicar do que outros métodos disponíveis na literatura, pois exige um número menor de experimentos. Palavras-chave: Processividade. Constantes de especificidade. Modelagem matemática. Fingerprinting. Hidrolases. Abstract: Processive action can be observed in many enzymes involved in the saccharification of polysaccharides. The probabilities of processive action, as well as the specificity constants, vary according to the size of the substrate. When substrates are several orders of magnitude larger than the enzyme, as occurs in polysaccharide hydrolysis, the probabilities of processive action and the specificity constants of the enzyme for molecules of different sizes do not vary much. However, when the hydrolase is acting on oligosaccharides, the determination of these parameters becomes interesting, since the enzyme has significantly different values of these parameters for substrates that differ in degree of polymerization by only a few units. The advantage of knowing the relative specificity constants and the probabilities of processive action is that they can be applied in mathematical models of the hydrolysis reaction that would serve, for example, to size bioreactors, to optimize bioprocesses in a biorefinery or to guide mutagenesis experiments in hydrolases, where these parameters would be considered in the selection of the desired mutant to undergo further rounds of mutation. However, prior to the current work, there was no valid mathematical model that described the full extent of the hydrolysis reaction, nor any method to extract the parameters simultaneously from complete hydrolysis profiles. In the models that were available in the literature, the authors made simplifying assumptions that limited the models to describing specific fractions of the reaction or prevented their application in more complex systems. The objective of this work was, therefore, to expand the Fingerprinting method to extract both relative specificity constants and the probabilities of processive action from hydrolysis profiles of linear oligosaccharides and to elaborate correct models to represent reactions with processivity. The suitability of this adaptation of the Fingerprinting method was proven by its application in three case studies of increasing complexity involving ?-amylases hydrolysing maltooligosaccharides, using experimental data from the literature. The first case study deals with the hydrolysis of maltoheptaose, the simplest system in which processivity can be observed. The second case study involves the hydrolysis of maltooctaose, a system with two possible processive steps, where the end product of the reducing end is the same product as that removed from the non-reducing end by the enzyme in each attack, which requires a different approach to calculating the fractional reaction extent. The third case study addresses the hydrolysis of maltoundecaose, a system with three possible processive steps, where the model was fitted to more than one hydrolysis profile simultaneously. In this work, conceptually correct mathematical models were developed, being valid for the entire extent of the reaction, as functions of time and of fractional reaction extent, for systems where an exoenzyme hydrolyzes a linear oligomer processively. A method was also obtained to determine relative specificity constants and probabilities of processive action that is simpler to apply than other methods available in the literature, since it requires a smaller number of experiments. Key-words: Processivity. Specificity constants. Mathematical model. Fingerprinting. Hydrolases.

Orientador : Prof. Dr. David Alexander Mitchell Coorientadora : Profª. Drª. Nadia Krieger Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 28/06/2017 Inclui referências: f. 100-105 Resumo: O Brasil é o maior produtor de suco de laranja do mundo e a previsão é que processe 12,85 milhões de toneladas da fruta na safra 2016/2017, o que representaria 62% do processamento mundial. Por consequência, o Brasil é o maior gerador de polpa cítrica, composta pelas cascas, resíduos da polpa e sementes (aproximadamente 50% da massa da fruta). Atualmente, a polpa cítrica é em grande parte descartada em aterros industriais, o que gera ônus econômico e ambiental. Em busca da solução, surgiu o conceito da biorrefinaria de polpa cítrica, com o objetivo de transformar essa biomassa em energia, biocombustíveis e químicos. Em torno de 25% da polpa cítrica é composta por pectina, um heteropolissacarídeo estrutural formado majoritariamente por ácido D-galacturônico, aproximadamente 70% dos seus monossacarídeos. Como a pectina possui pequena demanda no mercado em relação ao seu potencial de produção, sua hidrólise para obter ácido D-galacturônico é uma alternativa para viabilizar a biorrefinaria. O ácido D-galacturônico é um intermediário para a produção de ácido L-galactônico, ácido L-ascórbico e ácido múcico, compostos com aplicação na indústria de alimentos, cosméticos e fármacos. A obtenção do ácido D-galacturônico depende da hidrólise completa de substratos pécticos realizada pela ação de diferentes enzimas, uma vez que a hidrólise química pode degradar o monossacarídeo de interesse. A modelagem matemática da hidrólise enzimática é uma ferramenta para o dimensionamento e a otimização dessa etapa. Contudo, os atuais modelos da hidrólise completa de substratos pécticos são ferramentas limitadas, pois são demasiadamente simplificados. Um modelo útil como ferramenta de otimização deve individualizar a ação das diferentes pectinases e prever a concentração dos substratos, intermediários e produtos ao longo do tempo. Neste trabalho, foram realizadas as primeiras etapas do desenvolvimento desse modelo. Foram desenvolvidos dois modelos estocásticos, baseados no método Monte Carlo, para a ação de enzimas cruciais na produção de ácido D-galacturônico, as endo- e exopoligalacturonases. Esses modelos estão de acordo com a teoria da cinética enzimática clássica, fato que não ocorre em modelos estocásticos de reações similares já descritos na literatura. Os parâmetros cinéticos utilizados nos modelos são as constantes de especificidade relativas da enzima, tanto para cada substrato, como para cada reação possível com um mesmo substrato. A etapa final de uma sacarificação é a hidrólise de oligossacarídeos, e as especificidades das enzimas variam significantemente frente o tamanho do oligômero e a posição de clivagem. Para caracterizar essas especificidades, o método Fingerprinting foi estendido nesse trabalho para ser aplicado em esquemas de reação ramificados, como é o caso da hidrólise de oligossacarídeos. Esse método traz vantagens frente aos métodos já descritos na literatura, como ensaios de velocidade inicial e método da frequência de clivagem por ligação, uma vez que todas as especificidades relativas podem ser determinadas a partir de um único perfil completo de reação. Diante das limitações dos modelos matemáticos atuais, este trabalho lança bases para o desenvolvimento de um modelo matemático da hidrólise total de substratos pécticos por consórcio de enzimas. Palavras-chave: Biorrefinaria, Pectina, Ácido D-galacturônico, Hidrólise enzimática, Constantes de especificidade, Modelagem matemática. Abstract: Brazil is the largest producer of orange juice in the world and is expected to process 12.85 million tons of the fruit in the 2016/2017 harvest, which would represent 62% of the world's processing. As a consequence, Brazil is the largest producer of waste citrus, composed of peels, pulp residues and seeds (approximately 50% of fruit mass). Currently, most of the citrus waste is discharged in industrial landfills, which generates economic and environmental burden. In search of the solution, the concept of biorefinery of citrus waste emerged, with the objective of transforming this biomass into energy, biofuels and chemicals. About 25% of the citrus waste is composed of pectin, a structural heteropolysaccharide formed predominantly of D-galacturonic acid, approximately 70% of its monosaccharides. Since pectin has little market demand in relation to its production potential, its hydrolysis to obtain D-galacturonic acid is an alternative to enable biorefinery. D-galacturonic acid is an intermediate for the production of L-galactonic acid, L-ascorbic acid and mucic acid, compounds with application in the food, cosmetic and pharmaceutical industry. The production of D-galacturonic acid depends on the complete hydrolysis of pectic substrates carried out by the action of different enzymes, since the chemical hydrolysis can degrade the monosaccharide of interest. The mathematical modeling of enzymatic hydrolysis is a tool for the design and optimization of this hydrolysis step. However, the current models of complete hydrolysis of pectic substrates are limited tools, since they are too simplified. A useful model as an optimization tool should individualize the action of the different pectinases and predict the concentration of the substrates, intermediates and products over time. In this work, the first steps of the development of this model were taken. Two stochastic models, based on the Monte Carlo method, were developed for the action of crucial enzymes in the production of D-galacturonic acid, endo- and exopoligalacturonases. These models are in accordance with the theory of classical enzymatic kinetics, a fact that does not occur in stochastic models of similar reactions already described in the literature. The kinetic parameters used in the models are the relative specificity constants of the enzyme for each substrate, as well as for each possible reaction with the same substrate. The final step of a saccharification is the hydrolysis of oligosaccharides, and the specificities of the enzymes vary significantly against the size of the oligomer and the cleavage position. To characterize these specificities, the Fingerprinting method was extended in this work to be applied in branched reaction schemes, as is the case of oligosaccharide hydrolysis. This method has advantages over the methods already described in the literature, initial rate assays and bond cleavage frequency method, since all relative specificities can be determined from a single complete reaction profile. In view of the limitations of current mathematical models, this work lays the foundations for the development of a mathematical model of the total hydrolysis of pectic substrates by a consortium of enzymes. Keywords: Biorefinery, Pectin, D-galacturonic acid, Enzymatic hydrolysis, Specificity constants, Mathematical modeling.

Orientador : Prof. Dr. Luiz Fernando de Lima Luz Jr. Coorientador : Prof. Dr. David Alexander Mitchell Coorientadora : Profª. Drª. Anelize Manuela Bahniuk Rumbelsperger Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Defesa: Curitiba, 30/08/2017 Inclui referências : f.92-95 Resumo: As técnicas de Recuperação Avançada de Petróleo, do inglês EOR (Enhanced Oil Recovery), e captura e armazenamento de CO2, CCS (Carbon Capture and Storage) consistem respectivamente na injeção alternada de CO2 e água do mar em reservatórios para pressurização e aumento de produção, e ainda possibilitando o armazenamento de CO2 em rochas carbonáticas na presença ou não de água. Em ambas as situações as pressões são elevadas e conduzem à reações entre a rocha e o fluido injetado. Considerando que a formação do pré-sal brasileiro é composta principalmente por rochas carbonáticas, assim como a maior parte dos reservatórios de petróleo, o estudo das reações envolvendo água, CO2 e rochas carbonáticas torna se relevante. O acompanhamento das reações de precipitação e dissolução da rocha carbonática quanto à morfologia e porosidade foi realizado via microtomografia de raio-X. O meio aquoso foi analisado quanto ao pH, condutividade e concentração dos íons via ICP, em amostras pré e pós reação com e sem agitação mecânica. Observou se aumento de porosidade de até 10,26% na rocha, devido à dissolução parcial da mesma e posterior precipitação de CaCO3 em poros menores. Em todas as amostras a massa final foi inferior a inicial. Já nos experimentos com agitação ocorreu a redução de conectividade e porosidade aberta. Estes resultados, podem contribuir para o melhor entendimento da alteração da estrutura da rocha, bem como a sua interferência na vida útil do reservatório e na permeabilidade da rocha, fatores predominantes para extração do óleo e segurança no armazenamento de CO2. Palavras chaves: Rochas carbonáticas. CO2 supercrítico. Injeção de CO2. Microtomografia. Porosidade. Dióxido de carbono. Solução salina. Água carbonatada. Alta pressão. Abstract: The Enhanced Oil Recovery (EOR) and Carbon Capture and Storage (CCS) technologies, respectively, consist in carbon dioxide and seawater alternating injection in oil reservoirs to increase pressure, which lead to a production increase and CO2 storage in carbonate rocks with or without water presence. For both situations, the high pressure induces reactions between the rock and the injection fluid. Considering that, Brazilian Pre-salt layer is mainly composed of carbonate rocks, similarly the most of oil reservoirs around the globe, the study of reactions involving CO2, water and carbonate rocks are very relevant. The precipitation and dissolution reactions are monitored by the variation of morphological properties like porosity and Euler number, these analyses are performed by X-Ray Micro tomography. Regarding the liquid phase measurements of pH, conductivity and ions concentration via ICP were compared using before and after reaction samples without perturbation and under mechanical agitation. There was an increase in the rock porosity of up to 10.26%. This change in porosity occurs by its own partial dissolution and posterior precipitation of calcium carbonate in microporous. Mass reduction occurred in all rock samples. While in the experiments with agitation occurred the reduction of connectivity and open porosity. These results may contribute to a better understanding of the change in the rock structure and how this interferes in the reservoir life cycle and the rock permeability, predominant factors for safe oil exploration in the field. The results obtained in this work can contribute to new research areas, besides enabling adjusting of preexisting models and helping to create new ones. Key words: Carbonate rocks. Supercritical CO2. CO2 injection. Micro tomography. Rock morphology. Oil reservoir. Enhanced recovery. Dissolution and precipitation. Calcite dolomite. Carbon dioxide. Brine. Carbonated water. High pressure.

Orientadora : Profª Drª Nadia Krieger Co-orientador : Prof. Dr. David Mitchell Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 24/02/2016 Inclui referências : f. 89-96 Resumo: O biodiesel é a principal alternativa ambientalmente correta para a substituição parcial ou total do Diesel obtido do petróleo, principalmente porque pode ser produzido a partir de fontes renováveis de óleos mediante reações de transesterificação. Embora o biodiesel seja convencionalmente produzido por catálise alcalina, o processo enzimático com lipases produzidas a baixo custo é de crescente interesse. Sólidos fermentados contendo lipases imobilizadas naturalmente de Rhizopus microsporus CPQBA 312-07 DRM (RMFS) e de Burkholderia contaminans LTEB11 (BCFS) foram obtidos por fermentação em estado sólido, usando bagaço de cana umedecido com uma solução nutriente mineral contendo óleo de soja como indutor. Estes sólidos foram secos, caracterizados e usados diretamente como biocatalisadores na transesterificação do óleo de palma em sistema livre de solvente. A reação de etanólise foi pré-otimizada em frascos de 25 mL, contendo 14,52 g de óleo de palma e 192 U de atividade hidrolítica das lipases dos sólidos fermentados. Para melhorar os rendimentos da reação, as estratégias avaliadas foram: (a) misturas dos sólidos fermentados em três proporções diferentes (3:1, 1:1 e 1:3, com relação às unidades de atividade de hidrólise), (b) adição de etanol em etapas e (c) reações realizadas em dois estágios, eliminando-se o glicerol adsorvido no sólido fermentado por lavagens com tert-butanol ou substituindo-o por um novo sólido fermentado. Obteve-se por ambas as estratégias, conversões máximas de 90 e 54% para BCFS e RMFS respectivamente, em 48 h. Os ensaios feitos com misturas dos sólidos não aumentaram o rendimento da reação. FSBC, em comparação com RMFS, mostrou uma menor inibição por etanol, maior produção de glicerol e menor inativação por produtos e subprodutos adsorvidos sobre o sólido. Os ensaios em reator de leito empacotado com BCFS em modo descontínuo em um sistema de circuito fechado produziu um máximo de conversão de 89,3% em 30 h, a uma razão molar etanol:óleo de 5,5:1, com quatro adições de etanol e com 12% de sólido em relação ao óleo de palma. As duplas lavagens sequenciais com n-hexano e tert-butanol foram a melhor opção para recuperar a eficiência dos sólidos e permitir assim, no caso do BCFS em reator de leito empacotado, um reuso de 5 ciclos de reação com 74% de conversão relativa. Estes resultados são promissores e podem dar novas ideias sobre o planejamento e otimização do uso dos sólidos fermentados como biocatalisadores na síntese de biodiesel. Palavras-chave: Fermentação no estado sólido, lipases, biodiesel, óleo de palma, sólidos fermentados, etanólise, Rhizopus microsporus, Burkholderia contaminans. Abstract: Biodiesel is the main environmentally friendly alternative for the partial or total replacement of the Diesel obtained from petroleum, principally because it can be produced from renewable oils through transesterification reactions. Although biodiesel is conventionally produced by alkaline catalysis, the enzymatic process with lipases produced at low cost is of increasing interest. Fermented solids containing naturally immobilized lipases from Rhizopus microsporus CPQBA 312-07 DRM (RMFS) and Burkholderia contaminans LTEB11 (BCFS) were obtained by solid-state fermentation, using sugarcane bagasse moistened with a mineral nutrient solution containing soybean oil as an inducer. These solids were dried, characterized and used directly as biocatalysts in the transesterification of the palm oil in a solvent-free system. The ethanolysis reaction was pre-optimized in vials flasks of 25 mL, containing 14,52 g of palm oil and 192 U of lipase hydrolytic activity of the fermented solids. To improve the yields of the reaction, the strategies evaluated were: (a) mixtures of fermented solids in three different proportions (3:1, 1:1 and 1:3 with respect to the hydrolysis activity units), (b) ethanol stepwise addition and (c) reactions performed in two stages, eliminating the glycerol adsorbed onto the fermented solid by washing it with tert-butanol or replacing it by a fresh fermented solid. It was obtained, by both strategies, maximum conversions of 90% and 54% for BCFS and RMFS respectively, in 48 h. The assays done with mixtures of solids did not increase the yields of the reaction. BCFS, compared to RMFS, showed less inhibition by ethanol, higher production of glycerol and less inactivation by products and by-products adsorbed on the solid. Assays in a packed-bed reactor (PBR) with BCFS in discontinuous mode in a closed-loop system produced a maximum conversion of 89,3% in 30 h, at a molar ratio ethanol:oil of 5,5:1 with four ethanol additions and with 12% of solid in relation to the palm oil. The dual sequential washings with n-hexane and tert-butanol were the best option to recover the solid efficiency and thus allow, in the case of BCFS in PBR, a reuse for 5 reaction cycles, with 74% of relative conversion. These results are promising and can give new insights on planning and optimizing the use of fermented solids as biocatalysts in biodiesel synthesis. Keywords: Solid-state fermentation, lipases, biodiesel, palm oil, fermented solids, ethanolysis, Rhizopus microsporus, Burkholderia contaminans.

Orientador : Prof. Dr. Luiz Fernando de Lima Luz Junior Coorientador : Prof. Dr. David Alexander Mitchell Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Defesa: Curitiba, 30/03/2016 Inclui referências : f.101-108 Resumo:A fermentação em estado sólido (FES) demonstra grande potencial por apresentar grande produtividade volumétrica e baixos custos de operação. Porém existem grandes desafios para que esta rota de produção seja aplicada em grandes escalas. Corridas de fermentação e testes para a larga escala são demasiadamente caras e demoradas e, devido a isto, os modelos matemáticos e as simulações computacionais tornam-se ainda mais importantes para a superação destes desafios. As técnicas de fluidodinâmica computacional (CFD) estão cada vez mais acessíveis, contudo não se encontra na literatura nenhuma aplicação do CFD em sistemas de FES. No trabalho atual, utilizou-se o software comercial de fluidodinâmica computacional ANSYS Fluent® 16.0 para desenvolver um modelo matemático para a transferência de calor e massa, juntamente ao crescimento microbiano em um biorreator em escala piloto de leito fixo. As simulações levam em consideração a dinâmica do fluxo em meios porosos, o não equilíbrio térmico e de concentrações de água entre as fases sólida e gasosa, o crescimento da biomassa (microrganismo), a geração de calor e água metabólicos, e a variação da permeabilidade do leito ao longo do tempo. Este modelo foi manualmente incluído no software por meio de UDFs (User Defined Functions). O uso do CFD apresenta a vantagem de prever possíveis gradientes de temperatura e de transferência de massa radiais gerados pela geometria complexa do sistema. A geometria foi baseada no biorreator piloto localizado nas instalações da Universidade Federal do Paraná. Ela foi desenhada em 3D no software ANSYS ICEM CFD® 16.0 e transportada para o Fluent para configurar todas as condições de operação. Baseou-se as simulações em dois experimentos de condições distintas, visando representá-los e compará-los aos resultados obtidos por CFD. Um experimento de FES foi promovido através do cultivo do fungo Aspergillus niger no biorreator piloto, cujas condições iniciais foram aplicadas para a simulação final do cultivo. Para a obtenção de parâmetros de permeabilidade, foram feitas medições de perda de carga em corridas de fermentação no biorreator piloto. O valor da perda de carga predita é similar à medida no experimentalmente. O mesmo modelo matemático foi capaz de descrever coerentemente as dinâmicas de transferência de calor e massa de ambos os experimentos. A predição do crescimento biológico ao longo do cultivo também produziu perfis de concentração de biomassa e de temperatura do leito concordantes com observações experimentais. Desta forma, se desenvolveu um meio robusto e confiável de testar condições de operação para produções de larga escala em biorreatores de fermentação em estado sólido. Palavras-Chave: Fermentação em Estado Sólido, FES, Fluidodinâmica Computacional, CFD, ANSYS Fluent. Abstract: Solid-state fermentation (SSF) has potential advantages for the production of certain biotechnological products, due to its large volumetric productivity and low operating costs. However, there are major challenges in obtaining adequate heat and mass transfer when this fermentation method is used at large scales. Mathematical models and computer simulations are useful tools for designing strategies to overcome these challenges, given the cost of large-scale fermentation experiments. It is therefore surprising that, to date, there are few examples of the application of computational fluid dynamics (CFD) to SSF bioreactors. In the current work, we used the commercial CFD software ANSYS FLUENT® 16.0 to develop a mathematical model for heat and mass transfer along the microbial growth in a pilot-scale packed-bed bioreactor. On the simulation were taken into account: the dynamics of airflow in the porous substrate bed; the lack of thermal and moisture equilibrium between the solid and gas phases; and the influence of the biological growth on the solid consumption, bed porosity and permeability and on the balances due the metabolic heat and water productions The model was inserted into the commercial CFD software ANSYS Fluent® 16.0 through UDF's (user defined functions). CFD models can predict radial temperature and mass transfer gradients in complex geometries of flow. The mesh and geometry were based on the pilot-scale bioreactor, located at the Federal University of Paraná facilities. The 3D geometry was drawn using ANSYS ICEM CFD® 16.0 and exported to Fluent in order to set all the operational conditions. The simulation conditions were based on two different experiments, aiming to represent them and compare them to the obtained CFD results. A SSF experiment was performed by growing the fungus Aspergillus niger on the pilot-scale bioreactor, which initial conditions were applied on the final cultivation simulation. The permeability parameters were estimated by the pressure drop data taken from the SSF run. The predicted pressure drop values were similar to the experimental readings. The same mathematical model was capable of describe coherently the dynamics of mass and heat transfer of both experiments. The biological growth prediction over the cultivation also produced biomass concentration and temperature profiles showed to be accordant to the experimental observations. Thus, the work intends to provide the basis for the development of a robust and reliable model for testing operating conditions and control strategies for large-scale cultivation in SSF bioreactors. Keywords: Solid State Fermentation, SSF, Computational Fluid Dynamics, CFD, ANSYS Fluent

Orientador : Prof. Dr. David Alexander Mitchell Coorientador : Prof. Pós-Dr. Ivo Neitzel Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Defesa: Curitiba, 31/03/2015 Inclui referências : f.51-55 Resumo: A hidrólise da pectina por misturas de enzimas pectinoliticas é uma etapa importante em biorrefinarias de resíduos cítricos. No entanto, apesar da hidrólise enzimática da pectina ter sido estudada por muitos anos, há relativamente poucos modelos matemáticos que descrevam a cinética deste processo. O desenvolvimento de modelos cinéticos com base nas equações diferenciais é bastante difícil devido à estrutura complexa da pectina e a mistura complexa de enzimas pectinoliticas envolvidas na sua degradação. Um modelo capaz de descrever a degradação enzimática de substratos pécticos será uma importante ferramenta para o projeto de um processo de hidrólise de pectina em uma biorrefinaria de polpa cítrica. Com isso o objetivo do presente trabalho foi de iniciar o desenvolvimento de um modelo de Monte Carlo com um sistema mais simples, ou seja, um modelo com uma enzima trabalhando com oligômeros de ácido D-galacturônico de cadeia linear. Os dados detalhados da hidrólise dos oligômeros pela enzima endopoligalacturonase foram obtidos da literatura (Bonnin et al., 2001, Study of the mode of action of endopolygalacturonase from Fusarium moniliforme, Biochimica et Biophysica Acta 1526, 301-309). A partir destes dados foi implementado um modelo que descreve as preferências de uma enzima endopoligalacturonase do Fusarium moniliforme durante a hidrólise dos oligômeros de ácido D-galacturônico com grau de polimerização (GP) entre 2 a 7, estes substratos foram referidos de acordo com o seu GP, como monômeros (S = GalA), dímeros (S = GalA2), trímeros (S = GalA3), tetrâmeros (S = GalA 4), pentâmeros (S = GalA5), hexâmeros (S = GalA6) e heptâmeros (S = GalA7) de ácido D-galacturônico, onde o "S" representa substrato. Os valores dos parâmetros relativos as constantes de especificidade, foram determinados usando a função "fminsearch" do MATLAB, que utiliza o método simplex para minimização de uma função objetivo. Neste caso particular, a sub-rotina que foi usada para calcular a função objetivo continha um programa que realizou cinco simulações Monte Carlo. A grande vantagem da análise realizada, é que ela permite atribuir as preferências para as várias reações que são possíveis para cada oligômero, isto é, ao contrario de Bonnin et al. (2001) que atribuiu uma constante de especificidade para cada oligômero. Ao se determinar uma constante de especificidade para cada reação de encontro da enzima com o substrato, é possível identificar qual é o tipo de substrato que a enzima prefere, bem como o tipo de ligação que a enzima prefere para fazer a reação de hidrólise, ou seja, com a definição de mais de uma constante de especificidade foi possível perceber que a enzima prefere o centro da molécula de substrato. Com este estudo foi possível identificar que a aplicação do modelo desenvolvido é viável, pois o ajuste foi realizado como todos os dados simultaneamente, e seria interessante continuar o estudo para estender o modelo para descrever situações mais complexas envolvendo substratos ramificados e misturas de enzimas com diferentes ações. Uma vez desenvolvido o modelo final será uma ferramenta útil na concepção e otimização de biorreatores enzimáticos para hidrólise de pectina em ácido D-galacturônico. Palavras-chave: Método de Monte Carlo. Pectina. Ácido D-galacturônico. Endopoligalacturonase. Constante de especificidade. Abstract: The hydrolysis of the pectin mixtures of pectinolytic enzymes is an important step in biorefinery citrus waste. However, despite pectin enzymatic hydrolysis has been studied for many years, there are relatively few mathematical models describing the process kinetics. The development of kinetic models based on differential equations is very difficult due to the complex structure of pectin and the mixture of pectinolytic complex enzymes involved in its degradation. Modelling the enzymatic degradation of pectic substrates will be important for the design of a pectin hydrolysis process in citrus pulp biorefineries. Therefore, the objective of this study is to start the development of a Monte Carlo model with a simpler system, in other words, a model with an enzyme working with acid oligomers D-galacturonic straight chain. The detailed data of the oligomers by the hydrolysis of endopolygalacturonase enzyme were obtained from the literature (Bonnin et al., 2001, Study of the mode of action of endopolygalacturonase from Fusarium moniliforme, Biochimica et Biophysica Acta 1526, 301-309). From these data, a model is implemented which describes the preferences of a Fusarium moniliforme endopolygalacturonase enzyme for the hydrolysis of oligomers of D-galacturonic acid with a degree of polymerisation (DP) between 2 and 7, these substrates were listed according to their GP, as monomers (S = GalA), dimers (S = GalA2), trimers (S = GalA3), tetramers (S = GalA4), pentamers (S = GalA5), hexamers (S = GalA6) and heptamers (S = GalA7) of D-galacturonic acid, where "S" represents a substrate. The parameter values for the constants of specificity were determined using the tool "fminsearch" MATLAB, which uses the simplex method to minimize an objective function. In this particular case, the subroutine that was used to calculate the objective function contained a program that held five Monte Carlo simulations. The great advantage of the analysis that was made is that it allows you to assign preferences for the various reactions that are possible for each oligomer, that is, as opposed to Bonnin et al. (2001) attributed a specificity constant for each oligomer. When determining a specificity constant for each enzyme against reaction with the substrate, it is possible to identify what kind of substrate the enzyme prefers, as well as the type of connection that the enzyme prefers to make the hydrolysis reaction, or that is, the definition of more than one specificity constant was revealed that the enzyme prefers the center of the substrate molecule. In this study it was identified that the application of the developed model is viable, because the adjustment is performed with all data simultaneously and continue the study would be interesting to extend the model to describe situations involving more complex branched substrates and enzyme mixtures with different actions. Once developed the final model will be a useful tool in the design and optimization for bioreactors enzymatic hydrolysis of pectin as D-galacturonic acid. Keywords: Monte Carlo method. Pectin. D-galacturonic acid. Endopolygalacturonase. Specificity constant.

Orientador : David Alexander Mitchell Co-orientadores : Prof. Dr. Marcos Lúcio Corazza e Profª Drª Nádia Krieger Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 23/11/2015 Inclui referências : f. 65-67 Resumo: Na última década, o interesse pela produção de biodiesel catalisada por lipases tem aumentado consideravelmente. Uma das principais razões para isto deve-se à catálise enzimática representar uma alternativa "verde" à catálise química tradicionalmente empregada na indústria. Entretanto, embora a rota enzimática forneça produto de maior qualidade, em condições de reação mais amenas e ausência de reações laterais, sua implantação em escala industrial ainda é limitada pelos altos custos do biocatalisador. Recentemente, estratégias visando reduzir os custos de produção de biocatalisadores têm sido estudadas. Uma dessas estratégias é a produção de lipases por fermentação em estado sólido e a consecutiva aplicação destes sólidos fermentados diretamente ao meio reacional para catalisar reações de transesterificação ou esterificação. Outra estratégia para reduzir os custos na produção enzimática de biodiesel é realizar reações em sistemas livres de solventes, o que permite o uso de reatores menores e a redução do impacto ambiental e das etapas de extração e recuperação do biodiesel. Além disso, a utilização de matérias-primas residuais, como as borras ácidas, para a produção enzimática de biodiesel oferece possibilidade de reduzir significativamente o custo do processo, uma vez que a matéria-prima representa cerca de 70-85% do custo total de produção. O uso de sólido fermentado para a produção de ésteres do biodiesel a partir de ácidos graxos da borra do óleo de soja em sistema livre de solvente foi investigado recentemente, onde foi mostrado que cerca de 30% do meio reacional era sorvido pelo sólido fermentado e que este meio sorvido tinha composição diferente da encontrada para o meio de reação líquido. A composição dessa fase sorvida, que representa o microambiente da lipase no sólido, tem implicações diretas na modelagem cinética da reação. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um modelo cinético combinado com o efeito de sorção para descrever a reação de esterificação de ácidos graxos da borra ácida do óleo de soja catalisada por sólido fermentado com atividade lipolítica em sistema livre de solvente. A sorção dos componentes do meio ao sólido fermentado seguiu uma isoterma de Langmuir multicomponente, enquanto a equação cinética foi expressa em termos de composição da fase sorvida. Com um único conjunto de parâmetros, foi possível encontrar bom ajuste do modelo aos dados experimentais obtidos nos estudos anteriores para três razões molares etanol:ácidos graxos (1:1, 1,5:1, 3:1), tanto para perfis de conversão quanto para composição nas fases líquida e sorvida. Além disso, foram construídos diagramas ternários experimentais de Equilíbrio Líquido-Líquido para o sistema "ácidos graxos + etanol + água + ésteres etílicos", e também foi feita a modelagem termodinâmica para este sistema. Este modelo termodinâmico pode ser usado, futuramente, para prever a separação das fases orgânica e aquosa no reservatório do sistema, permitindo o uso do modelo cinéticosorção para um sistema onde somente a fase orgânica do reservatório seja retornada ao leito fixo que contém o sólido fermentado. Com isso, o modelo poderá ser utilizado para realizar o escalonamento do processo de produção enzimática de biodiesel. Palavras-chave: biodiesel, Burkholderia cepacia, equilíbrio líquido-líquido, esterificação, lipase, sólido fermentado, modelagem cinética, modelagem termodinâmica Abstract: Over last decade, interest on biodiesel production catalyzed by lipases has been increased. One of the most important reasons for this is because enzymatic catalysis represents a greener alternative to chemical catalysis used on industry traditionally. However, although enzymatic route yields higher quality product at mild conditions with no side reactions its implementation in large scale is limited yet by high biocatalyst costs. Recently, strategies aiming to reduce production costs of biocatalysts have been studied. One of these strategies is producing lipases by solid state fermentation and consecutively applying these fermented solids in reaction media to catalyze transesterification and esterification reactions. Other strategy to reduce enzymatic biodiesel production costs is performing reactions in solvent-free systems, which allows using smaller reactors and decreasing environmental impact and extraction and recovery steps. Furthermore, the use of cheaper feedstocks, as soapstocks, to enzymatic production of biodiesel offers possibility of reducing process cost significantly, since feedstocks represent around 70-85% of whole production cost. Using fermented solid to produce biodiesel esters from fatty acids from soybean soapstock acid oil has been investigated recently, and it was shown that up to 30% of the total mass of the reaction medium sorbed onto the fermented solids during the process and that this sorbed phase had a composition that was quite different from that of the bulk reaction medium. Composition of sorbed phase, which represents lipase microenvironment into fermented solid, has implications in modeling reaction kinetics. Therefore, the aim of this study was develop a combined sorption-kinetic model capable of describing the reaction profiles in the esterification of fatty acids from soybean soapstock acid oil catalyzed by fermented solid with lipolytic activity in a solvent-free system. The sorption of the medium components onto the fermented solids followed a multicomponent Langmuir isotherm, while the kinetic equation was expressed in terms of the composition of the sorbed phase. With a single set of parameters, the model adjusted well to the experimental results for three different ethanol to fatty acid molar ratios (1:1, 1.5:1 and 3:1), not only for the overall conversion profile, but also for the compositions of the bulk reaction medium and the sorbed phase. Moreover, experimental ternary diagrams of Liquid-Liquid Equilibrium of system "fatty acids + ethanol + water + ethyl esters" were constructed and also thermodynamic modeling was performed to this system. These data could be used further to predict separation of organic and aqueous phases in reaction reservoir, allowing the use of kinetic-sortion model to a system where only organic phase be recycled to the packed bed that contains fermented solid. From this perspective, model would be applied to guide scale-up of enzymatic biodiesel production. Keywords: biodiesel, Burkholderia cepacia, liquid-liquid equilibrium, esterification, lipase, fermented solid, kinetic modeling, thermodynamic modeling

Orientador : Prof. Dr. David Alexander Mitchell Co+orientadora : Profª Drª Nadia Krieger Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 30/03/2015 Inclui referências Resumo: Os ésteres alquílicos do biodiesel são produzidos na indústria geralmente por transesterificação alcalina homogênea de triacilgliceróis provenientes de óleos vegetais com metanol. Este processo necessita de etapas de purificação do biodiesel para remoção do catalisador e do sal formado, de tratamento dos efluentes alcalinos gerados e ainda da recuperação do subproduto glicerol. Além disso, matérias-primas neutras e com baixo teor de água são requeridas, o que contribui para elevar o custo de produção do biodiesel. Uma das alternativas para contornar os problemas associados à catálise química é a utilização do processo enzimático com lipases, que podem catalisar reações de esterificação e de transesterificação e dispensam o uso de matérias-primas purificadas. Recentemente, no Laboratório de Tecnologia Enzimática e Biocatálise da Universidade Federal do Paraná, foi desenvolvido um processo com o intuito de reduzir os custos da produção enzimática do biodiesel. Este processo se consistiu na utilização de um sólido fermentado por Burkholderia lata (SFBL) para catalisar a esterificação etílica de ácidos graxos da borra de soja. O processo foi desenvolvido em escala laboratorial, com a utilização de biorreator de leito fixo contendo 12 g de SFBL e produziu altos rendimentos de ésteres etílicos (92%) em 31 h. Assim sendo, o objetivo geral deste trabalho foi de aumentar em pelo menos dez vezes a escala da produção de biodiesel a partir deste processo. Para tanto, foi montado um biorreator de leito fixo com três colunas em série preenchido com 120 g de SFBL, com circulação do meio reacional composto por oleína e etanol (1245 g). Para a remoção da água formada na reação, foi dimensionado um reservatório de meio reacional com barreira física, que favoreceu o aumento da velocidade inicial da reação, obtendo-se 88% de rendimento em 24 h. O sistema foi operado por 6 ciclos consecutivos de síntese (288 h). A conversão obtida ao final do primeiro ciclo, 91%, decresceu para 51% no final do sexto ciclo reacional. No primeiro ciclo, foi produzido 1 kg de ésteres e, até o sexto ciclo, foram acumulados 4,7 kg de ésteres, o que é equivalente a uma produção de 39 g de éster por g de sólido fermentado. Estes resultados são promissores, pois mostram que altas conversões podem ser mantidas no escalonamento do processo enzimático de produção do biodiesel usando sólidos fermentados como catalisadores. Palavras-chave: biodiesel, aumento de escala, esterificação, lipases, Burkholderia lata, fermentação em estado sólido, reator de leito fixo. Abstract: The ethyl esters that comprise biodiesel are produced industrially by homogeneous alkaline transesterification of the triacylglycerols of vegetable oils with methanol. This process requires steps for the removal from the biodiesel of the catalyst and of the salt that is formed, for the treatment of the alkaline effluent that is generated and for the recovery of the glycerol by product that is produced. Beyond this, the oil must be neutral and have a low moisture content, meaning that it makes a significant contribution to the cost of the biodiesel. One possible strategy for avoiding problems associated with chemical catalysis is to use lipases as catalysts, given that they can catalyze both esterification and transesterification and do not require highly purified raw materials. Recently, a process was developed in the Enzyme Technology and Biocatalysis Laboratory of the Federal University of Paraná, with the intention of reducing the costs of the enzymatic route. This process uses a fermented solid, produced using Burkholderia lata (denominated FSBL), to catalyze the ethyl esterification of fatty acids obtained from soybean soapstock. The process was operated at laboratory scale, using a packed-bed bioreactor containing 12 g of FSBL, and gave high ester yields, of 92% in 31 h. The objective of the current work was to increase the scale of this biodiesel production process at least 10-fold. To this end, a bioreactor consisting of three packed-beds in series was filled with a total of 120 g of FSBL and 1245 g of a medium comprised of olein and ethanol was recirculated through the reactor from a reservoir. The reservoir had an internal weir in order to retain the aqueous phase, such that only the organic phase was fed back to the reactor. This water removal strategy increased the initial velocity of reaction, giving 88% conversion in 24 h. This system was operated for six consecutive 48-h cycles of ester synthesis. The conversion that was obtained decreased from 91% at the end of the first reaction cycle to 51% at the end of the sixth reaction cycle. In the first cycle, 1 kg of esters was produced, while the six cycles produced a cumulative total of 4.7 kg of esters, which is equivalent to 39 g of ester produced per g of fermented solid that was used. These results are promising, since they demonstrate that high yields can be maintained in the scale-up of enzymatic biodiesel production processes involving fermented solids as the catalyst. Keywords: biodiesel, scale-up, esterification, lipases, Burkholderia lata, solid-state fermentation, packed-bed reactor

Orientador : Prof. Dr. David A. Mitchell Co-orientador : Prof. Dr. Luciano F. Huergo Co-orientador : Prof. Dr. Marcelo K. Lenzi Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 25/06/2015 Inclui referências : f. 97-100 Resumo: UTase é uma enzima regulatória em Escherichia coli que realiza a modificação covalente por uridililação das duas proteínas PII encontradas neste organismo, GlnB e GlnK. Além de sofrerem esta modificação covalente, as proteínas PII sofrem modulação alostérica pelos efetores ATP, ADP e 2-OG. O estado de PII, em termos da ligação destes efetores e da uridililação, define a ação de PII frente a seus diversos alvos regulatórios. Modelos matemáticos anteriores para a atividade de UTase não foram consistentes com seu mecanismo, de complexo ternário ordenado, pois não eram capazes de descrever seu perfil de inibição pelos produtos (Jiang et al., 1998). Esta dissertação é dividida em duas partes. Na primeira, é deduzido um conjunto de equações para a atividade de UTase que descrevem corretamente seu perfil de inibição pelos produtos. A limitação deste primeiro modelo, comum aos modelos prévios para UTase, é não descrever como o estado de ligação de PII, em termos de seus efetores, afeta sua uridililação por UTase. Na segunda parte desta dissertação, o primeiro modelo é integrado ao modelo de Rocha et al. (2013) para a ligação de efetores alostéricos à PII, resultando no primeiro modelo da atividade de UTase que leva em conta o estado de ligação de PII. Valores para as constantes do modelo foram obtidas da literatura diretamente (Jiang et al. 1998) ou estimados ajustando o modelo a dados experimentais extraídos (Jiang and Ninfa, 2011), mas conjunto de valores obtido não é consistente. Apesar disso, a abordagem e o conjunto de equações do modelo integrado fazem uma contribuição válida para a modelagem da uridililação de PII em E. coli. Palavras-chave: modelagem matemática, cinética enzimática, Uridililtransferase, Escherichia coli, PII, efetores alostéricos Abstract: UTase is a regulatory enzyme in Escherichia coli that modifies by uridylylation the two PII proteins found in this organism, GlnB and GlnK. Besides uridylylation, these PII proteins also suffer allosteric modulation by the effectors ATP, ADP and 2-oxoglutarate. The state of PII, in terms of the binding of these effectors as well as uridylylation, defines the action of PII towards is various regulatory targets. Previous mathematical models for the activity of UTase were not consistent with its mechanism, which is an ordered ternary complex mechanism, because they were not capable of describing its product inhibition profile (Jiang et al. 1998). This dissertation has two parts. In the first part, a set of equations is deduced for the activity of UTase which correctly describe its product inhibition profile. The limitation of this first model, common to the previous UTase models, is that it does not describe how the ligation state of PII, in terms of its effectors, affects the uridylylation of PII by UTase. In the second part of this dissertation, the first model is integrated with the model number 4 o Rocha et al. (2013) for the binding of allosteric effectors to PII, resulting in the first model of UTase activity to take into account the binding of effectors to PII. Values for the constants of the model were obtained from the literature directly (Jiang et al., 1998) or were estimated by adjusting the model to extracted experimental data from Jiang and Ninfa (2011), but the final set of values is not consistent. Despite that, the approach and set of equations of the integrated model make a valid contribution to the modelling of the uridylylation of PII in E. coli. Key-words: mathematical modelling, enzyme kinetics, Uridylyltransferase, Escherichia coli, PII, allosteric effectors

Resumo: A síntese de biodiesel em processos industriais é feita principalmente por transesterificação alcalina de triacilgliceróis provenientes de óleos vegetais com álcoois de cadeia curta. Novos processos e catalisadores têm sido estudados para possibilitar o uso de matérias-primas residuais, com teores significativos de ácidos graxos livres e água, inadequadas para o processo usual de produção de biodiesel. Estes estudos também contribuem para a utilização de processos com baixo impacto ambiental e diminuição dos custos de produção de biodiesel. Recentemente, o processo de hidroesterificação vem sendo estudado para a produção de biodiesel, o qual envolve uma etapa de hidrólise dos triacilgliceróis seguida de esterificação dos ácidos graxos livres. Este processo permite a utilização de matérias-primas independente do teor de ácidos graxos livres e umidade, uma vez que na etapa de hidrólise os triacilgliceróis são misturados com água formando glicerol e ácidos graxos livres. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um processo de esterificação etílica de ácidos graxos por catálise enzimática em reator de leito fixo preenchido com sólido fermentado com atividade lipolítica. Como substratos, foram utilizadas misturas de ácidos graxos obtidas por hidrólise em água subcrítica de matérias graxas de baixo custo, em ausência de catalisador. Os micro-organismos de Rhizopus microsporus e Burkholderia cepacia foram utilizados para a produção de sólidos fermentados com atividade lipolítica por fermentação em estado sólido. Inicialmente, o sólido fermentado de Burkholderia cepacia LTEB11 foi selecionado como catalisador e utilizado diretamente na reação de esterificação etílica de ácidos graxos. O óleo ácido da borra de soja foi selecionado como substrato para o estudo em reator de leito fixo em sistema livre de co-solvente, onde foram obtidos 92% de conversão em 31 h. A conversão obtida no primeiro ciclo foi mantida por 4 ciclos, diminuindo para 64% após 8 ciclos, equivalentes a 384 h de uso. Finalmente, para um melhor entendimento do processo, foi feito um estudo do equilíbrio termodinâmico da reação de esterificação, avaliando-se a composição das fases, a sorção dos componentes da reação no sólido fermentado e a conversão no equilíbrio. A maior conversão em éster foi obtida com razão molar (etanol:ácido graxo) 1,5:1 e foi maior do que a calculada por modelo termodinâmico (80%). A sorção dos componentes da reação influenciou na conversão no equilíbrio, que diminuiu com o aumento da sorção dos componentes hidrofílicos no sólido fermentado. As melhores condições estabelecidas neste estudo para síntese de ésteres etílicos em reator de leito fixo foram: 12% de sólido fermentado (em relação à massa de ácidos graxos livres) com umidade inicial de 10% (em base seca), sistema reacional mantido sem agitação, com recirculação apenas da fase orgânica, a 45°C. O processo de hidroesterificação possibilitou o uso de matérias-primas residuais sem necessidade de pré-tratamento, e a aplicação direta do sólido fermentado dispensou etapas adicionais de recuperação e imobilização da lipase. Estes fatores podem contribuir para a redução dos custos do processo de produção de biodiesel utilizando lipases.

Resumo: A degradação enzimática da pectina em oligossacarídeos e em ácido D-galacturônico é uma etapa importante em uma biorrefinaria baseada no uso de polpa cítrica. Alguns oligossacarídeos gerados possuem atividade biológica, enquanto o ácido D-galacturônico pode ser posteriormente convertido em várias moléculas com aplicações, incluindo agentes acidificantes, surfactantes, ácido ascórbico e bioplástico. Uma das limitações da degradação enzimática da pectina é a lentidão do processo, que se deve a dois fenômenos. Primeiro, a lentidão é atribuída ao fato de várias das enzimas envolvidas sofrem inibição pelo produto final, ácido D-galacturônico. Segundo, ocorre uma desaceleração significativa nos primeiros minutos da reação, que, até o momento, não foi explicada. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar a degradação enzimática de substratos pécticos, a fim de determinar a causa desta desaceleração inicial. Inicialmente, foram calculados os valores aparentes do parâmetro KM+ da equação de Michaelis-Menten, para os substratos pectina e ácido poligalacturônico. Para o complexo de pectinases da Sigma-Aldrich, os valores de KM+ foram 1,4 e 0,8 g L-1, para a pectina e o ácido poligalacturônico, respectivamente. Para o Pectinex Ultra SPL da Novozymes, os valores de KM+ foram 2,7 e 0,1 g L-1, para a pectina e o ácido poligalacturônico, respectivamente. Em relação aos valores reportados na literatura, os valores obtidos para KM+ são bem próximos. Após isso, a degradação de diferentes substratos pécticos foi caracterizada, com atenção ao início da reação. Com base na literatura sobre a degradação de outros polissacarídeos, foram levantadas quatro possibilidades para explicar a desaceleração no início da reação: inativação térmica das enzimas, inibição pelo ácido D-galacturônico, estagnação das enzimas em certas regiões do substrato e depleção rápida do substrato disponível. Nenhuma destas hipóteses foi capaz de explicar a desaceleração inicial. Contudo, ao analisar a distribuição dos tamanhos dos oligossacarídeos formados ao longo da reação, foi levantada a hipótese que a reação ocorre em duas etapas distintas. Na primeira etapa, que corresponde os primeiros 5 a 10 minutos de reação, predomina a quebra das moléculas de pectina em oligossacarídeos pela ação das endoenzimas. Com a exaustão das cadeias de pectina, ocorre uma desaceleração significativa. Segue-se, então, a segunda etapa, na qual os oligossacarídeos são degradados lentamente pelas exoenzimas e enzimas auxiliares. Com base nesta hipótese, foi proposto um modelo matemático simplificado, que conseguiu descrever, qualitativamente, os perfis obtidos experimentalmente para a liberação de ácido D-galacturônico e açúcares redutores.

Orientador : Prof. Dr. David Alexander Mitchell Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Defesa: Curitiba, 26/02/2014 Inclui referências Área de concentração: Desenvolvimento de processos químicos Resumo: As pectinases têm o potencial de serem utilizadas em biorefinarias de polpa cítrica para hidrolisar a pectina a ácido D-galacturónico, um precursor de vários intermediários químicos úteis. Contudo, as pectinases comerciais são caras. A produção de pectinases em fermentação em estado sólido (FES) é uma estratégia para minimizar os custos, no entanto, os estudos disponíveis na literatura estão limitados a escala de laboratório. O objetivo do presente trabalho foi realizar a ampliação de escala da produção de pectinases em FES, da escala laboratorial até a escala piloto. O trabalho foi realizado em três etapas: (1) otimização das condições de cultivo em frascos Erlenmeyer, (2) cultivos em biorreator de colunas e (3) cultivos em biorreator piloto. Foram utilizadas duas combinações de substrato e cepas, farelo de trigo e bagaço de cana para Aspergillus niger e bagaço de laranja e bagaço de cana para Aspergillus oryzae. Com a otimização das condições de cultivo, foi possivel obter atividades pectinolíticas de 30 U g-sólido-seco-1 para A. oryzae e 31 U g-sólido-seco-1, para A. niger. Estas atividades são 100% e 24% maiores do que as atividades obtidas nas condições de cultivo que eram usadas para as respectivas cepas antes do estudo de otimização. Os cultivos em biorreatores foram realizados em um biorreator de colunas contendo 12 g de substrato seco e em um biorreator de leito fixo em escala piloto contendo 20-30 kg de substrato seco. Ambos receberam aeração com ar saturado a 30°C e em ambos foram monitorados o consumo de O2 e a produção de pectinases. No biorreator de colunas, para A. oryzae, foi obtida uma atividade pectinolítica de 45 U g-sólido-seco-1, em 24 h, que corresponde a uma produtividade de 1,87 U g-sólido-seco-1 h-1. Para A. niger foi obtida uma atividade pectinolítica de 33 U g-sólido-seco-1, em 24 h, mas a produtividade máxima, de 1,95 U g-sólido-seco-1 h-1, ocorreu em 16 h. O valor máximo de consumo de O2 para A. oryzae foi de 145 ?mol h-1 g-sólido-seco-1, em 26 h, e para A. niger foi de 540 ?mol h-1 g-sólido-seco-1, em 16 h. Estes valores correspondem a velocidades de produção de calor metabólico de 21×10-3 e 78×10-3 W g-sólido-seco-1, respectivamente. Os cultivos no biorreator piloto foram realizados com A. niger. A produção de pectinases foi semelhante àquele obtida no biorreator de colunas. Em um cultivo realizado com farelo de trigo, com um leito de 23 cm de altura, os valores máximos obtidos foram 29 U g-sólido-seco-1, em 24 h, para a atividade pectinolítica e 1,18 U g-sólido-seco-1 h-1, em 16 h, para a produtividade. O valor máximo para o consumo de O2, ocorreu em 16 h e foi de 607 ?mol h-1 g-sólido-seco-1, e corresponde a uma produção de calor metabólico de 87×10-3 W g-sólido-seco-1. No entanto, neste cultivo o leito compactou. Um cultivo realizado com farelo de trigo e bagaço de cana (90%:10%, por massa), com um leito de 40 cm de altura, propicionou valores máximos de 25 U g-sólido-seco-1, em 14 h, para a atividade pectinolítica e 1,81 U g-sólido-seco-1 h-1, também em 14 h, para a produtividade. Nas primeiras 14 h não houve compactação do leito e a temperatura máxima atingida no leito foi de 35ºC. Desta maneira, a estratégia proposta neste trabalho para a ampliação da escala do processo de produção de pectinases por fermentação no estado sólido foi de manter a altura do leito em 40 cm e aumentar a largura do leito para vários metros. Palavras-chave: Pectinases. Fermentação no estado sólido. Biorreator de leito fixo. Aumento de escala. Abstract: Pectinases have the potential to be used in citrus waste biorefineries to hydrolyze pectin to D-galacturonic acid, a precursor of several useful chemical intermediates. However, pectinases are expensive. One strategy for minimizing costs is to produce the pectinases by solid-state fermentation (SSF), however, studies have been limited to laboratory scale. The aim of the present work was to scale-up an SSF process for pectinase production from laboratory scale to pilot scale. The work was carried out in three steps: (1) optimization of culture conditions in flasks, (2) cultivation in a column bioreactor and (3) cultivation in a pilot-scale bioreactor. Two combinations of substrate and strains were used, wheat bran and sugar cane bagasse for Aspergillus niger and orange bagasse and sugar cane bagasse for Aspergillus oryzae. With the optimization of culture conditions, it was possible to obtain pectinolytic activities of 30 U g-dry-solid-1 for A. oryzae and 31 U g-dry-solid-1 for A. niger. These values are 100% and 24% greater than the activities obtained using the culture conditions that were routinely used before the optimization. The fermentations in bioreactors were done in a column biorreator containing 12 g dry substrate and a pilot-scale packed-bed bioreactor containing 20-30 kg of dry substrate. Both were aerated with air saturated at 30°C. Both pectinase production and O2 consumption were monitored. In the column bioreactor, for A. oryzae the peak pectinolytic activity was 45 U g-dry-solid-1, in 24 h, which corresponds to a productivity of 1.87 U g-dry-solid-1 h-1. For A. niger, the peak pectinolytic activity was 33 U g-dry-solid-1, in 24 h, but the maximum productivity, of 1.95 U g-dry-solid-1 h-1, occurred at 16 h. The maximum O2 uptake rates occurred at 26 h for A. orzyae and were 145 ?mol h-1 g-1 and occurred at 16 h for A. niger and were 540 ?mol h -1 g-1. These values correspond to rates of metabolic heat production of 21×10-3 and 78×10-3 W g-dry-solid-1, respectively. The experiments in the pilot bioreactor were done with A. niger. The production of pectinases was similar to that obtained in the column bioreactor. In a fermentation done with wheat bran, using a bed height of 23 cm, the peak pectinolytic activity was 29 U g-dry-solid-1, at 24 h. Again, the maximum productivity, 1.18 U g-dry-solid-1 h-1, occurred at 16 h. The maximum O2 uptake rates, at 16 h, was 607 ?mol h-1 g-dry-solid-1, which corresponds to a metabolic heat production of 87×10-3 W g-dry-solids-1. However, in this fermentation the bed compacted. A fermentation done with wheat bran and sugarcane bagasse (90%:10%, by mass), with a bed height of 40 cm, gave maximum values of 25 U g-dry-solid-1, at 14 h, for the pectinolytic activity and 1.81 U g-dry-solid-1 h-1, also at 14 h, for the productivity. During the first 14 h, the bed did not compact and the maximum temperature obtained in the bed was 35ºC. It was concluded that the process for pectinase production could be scaled-up by maintaining the bed height of 40 cm and increasing the bed diameter to several meters. Key-words: Pectinases. Solid state fermentation. Packed-bed bioreactor. Scale-up.

Resumo: As proteínas PII são importantes reguladoras do metabolismo de nitrogênio em uma grande variedade de microrganismos. Tanto a estrutura tridimensional quanto a presença de sítios de ligação para os efetores ATP, ADP e 2-oxoglutarato (2-OG) são altamente conservadas na família das proteínas PII. Neste trabalho, a ligação de efetores alostéricos à GlnB de Escherichia coli foi modelada, considerando pela primeira vez a ligação simultânea de ATP, ADP e 2-OG. Diferentes modelos com relação às mudanças de afinidade durante ligações subsequentes dos nucleotídeos a um mesmo trímero foram construídos e comparados. O modelo escolhido foi capaz de predizer, de maneira precisa, a ligação de efetores à GlnB. Este modelo assume que a ligação da primeira molécula de nucleotídeo à PII causa uma mudança de conformação na proteína, fazendo com que a ligação subsequente de nucleotídeos à PII seja dificultada, além de assumir que ATP e ADP podem se ligar a diferentes subunidades do mesmo trímero. O modelo também incorpora a hipótese de que o 2-OG só pode se ligar à PII depois da ligação de ATP. Em proteobactérias, as proteínas PII também podem sofrer uridililação através da ação da UTase, que é regulada pela concentração de glutamina. Para medir a uridililação de PII e estudar como isto afeta os estados de PII no que diz respeito à combinação de efetores ligados a ela, foi utilizada uma constante de pseudo-equilíbrio, KU, que correlaciona o balanço entres os processos de uridililação e desuridililação de PII e a concentração de glutamina. Através do KU, foi possível predizer a influência exercida pela glutamina nos estados de GlnB. Além disso, já foi sugerido que as PII podem agir como sensores não só da concentração de 2-OG, mas também da razão ATP/ADP. As simulações indicam que as PII podem, de fato, agir como sensores de 2-OG e da razão ATP/ADP e que o modelo pode ser usado para investigar os efeitos de concentrações fisiológicas de ATP, ADP, 2-OG e glutamina nas concentrações dos estados de GlnB que interagem com ATase e NtrB. Em suma, o modelo pode ser usado para simular como esta parte do metabolismo reage de acordo com variações das condições celulares e, portanto, poderá ser usado como uma ferramenta para estudos futuros relativos aos estados de PII e sua interação com proteínas alvo.

Resumo: A necessidade de preservação do meio ambiente tem direcionado atenção do setor industrial às unidades de tratamento de efluentes. Dentre as diversas tecnologias existentes, o tratamento biológico por lodos ativados é uma das mais utilizadas, devido a sua excelente robustez. Na indústria do petróleo, não é diferente, devido principalmente a sua elevada eficiência na remoção de nitrogênio amoniacal. No entanto, a eficiência desta tecnologia está diretamente relacionada com a qualidade do efluente a ser tratado. Uma variação brusca na composição da entrada do sistema pode provocar choques químicos no sistema biológico, ou seja, inibir as reações, alterando significativamente a qualidade do efluente tratado, com o risco de não se atender a legislação. Desta forma, é muito importante prever os resultados da planta quando há uma perturbação nas variáveis de entrada, de forma que ações preventivas possam ser tomadas, minimizando os impactos. No entanto, elaborar um modelo fenomenológico de um sistema de tratamento biológico é uma tarefa extremamente difícil e exaustiva, devido à complexidade das reações envolvidas e a não linearidade do sistema. Devido a isto, a modelagem do sistema de lodos ativados utilizando a técnica de Redes Neurais torna-se uma alternativa viável e interessante. A modelagem por redes neurais foi aplicada no sistema biológico de tratamento de efluentes da Refinaria Presidente Getúlio Vargas - Petrobras, com o objetivo de estimar o teor de nitrogênio amoniacal no efluente tratado, a partir de dados de qualidade da carga e de variáveis medidas diretamente na planta. Os teores de DQO e NH3 na entrada do sistema, os teores de oxigênio dissolvido e os valores de pH do meio foram utilizados como dados de entrada da rede e são dados reais obtidos da unidade. Foram simuladas diversas estruturas utilizando o programa Simulated Annealing, como algoritmo de otimização. Os resultados obtidos na modelagem deste sistema mostram o potencial desta ferramenta na predição do teor de contaminantes no efluente tratado, que pode no futuro, ser implantada na unidade e servir como base para a tomada de decisão de ações preventivas quando da ocorrência de distúrbios operacionais.

Orientador : Prof. Dr. David Alexander Mitchell Co-Orientador: Prof. Dr. André Bellin Mariano Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Defesa: Curitiba, 25/04/2013 Inclui referências Resumo: A biomassa de microalgas se tornou uma promessa de matéria-prima para a produção de biocombustíveis, pois algumas espécies podem acumular em sua biomassa grandes quantidades de lipídeos, precursores da produção de biodiesel. O presente estudo está inserido no Núcleo de Pesquisa e Desenvolvimento de Energia Autossustentável (NPDEAS) da Universidade Federal do Paraná, o qual busca desenvolver a cadeia de tecnologias que possibilita a produção de biomassa e biodiesel de microalgas. O presente estudo uniu, pela primeira vez em escala laboratorial no NPDEAS, duas estratégias já utilizadas na literatura para aumentar a produção de biomassa e lipídeos de microalgas. A primeira é a utilização de aeração enriquecida com CO2 puro comercial no período iluminado, a fim de aumentar a velocidade de transferência de CO2 para o meio líquido e, por consequência, favorecer a realização da fotossíntese. A segunda é a utilização de cultivos mistos de microalgas, ou seja, cultivos originados de um primeiro inóculo composto de uma amostra coletada em ambiente aquático natural contendo uma mistura de espécies de microalgas. A comunidade de microalgas em um cultivo misto tende a apresentar oscilações no perfil de espécies, o que pode alterar a quantidade e a qualidade da biomassa, porém nenhum dos estudos sobre cultivos mistos descritos anteriormente na literatura aborda a reprodutibilidade dos experimentos. O presente trabalho teve o objetivo não somente de avaliar o efeito das duas estratégias na produção de biomassa e lipídeos, mas também de avaliar a repetibilidade e a reprodutibilidade de cultivos mistos. Este estudo demonstrou que a aeração enriquecida com 2% (v/v) de CO2 aumentou significativamente (alfa=0,01) a velocidade de crescimento na fase linear de 12 mg.L-1.dia-1, com aeração exclusiva por ar atmosférico, para 28 mg.L-1.dia-1. Porém, a inserção de aeração com 5% (v/v) de CO2 demonstrou a falta de reprodutibilidade desses resultados, uma vez que, enquanto em um 1° experimento, a velocidade de crescimento na fase linear, 32 mg.L-1.dia-1, não apresentou diferença significativa (alfa=0,01) em relação à do cultivo com 2% (v/v), em um 2° experimento, essa velocidade apresentou o valor significativamente menor (alfa=0,01) de 17 mg.L-1.dia-1. A falta de reprodutibilidade também se repetiu no conteúdo de lipídeos totais da biomassa seca, o qual se manteve inalterado (alfa=0,01) e em torno de 15% nos cultivos com apenas ar atmosférico, com 2% (v/v) de CO2 e no 1° cultivo com 5% (v/v) de CO2, mas apresentou queda significativa (alfa=0,01) para 12% no 2° cultivo. A utilização de aeração enriquecida de CO2 aumentou a repetibilidade dos cultivos mistos, uma vez que tornou mais próximas as curvas de crescimento dentro das replicatas de condição experimental. Essa aeração também diminuiu de 27% para 0% a fração de frascos que sofreram colapso, ou seja, morte prematura das células. Em experimentos futuros, o aumento da concentração celular inicial dos cultivos e o uso de inóculos mistos padronizados, pela mistura de cultivos estoque unialgais, são alternativas para aumentar a reprodutibilidade dos resultados. Abstract: Microalgal biomass has become a promising raw material for the production of biofuels, with some species of microalgae being able to accumulate large quantities of lipids, precursors of biodiesel, in their biomass. The present study contributes to the investigations being undertaken by the Nucleus of Research and Development of Self-Sustainable Energy (NPDEAS) of the Federal University of Paraná, which is seeking to develop a network of technologies for the production of biomass and biodiesel from microalgae. The present study brought together, for the first time in NPDEAS, two strategies that have been proposed in the literature to increase the production of microalgal biomass and lipids. The first is the use of air enriched with pure CO2 during the period of illumination, with the aim of increasing the rate of transfer of CO2 to the liquid phase and, consequently, increasing the rate of photosynthesis. The second is the use of mixed cultures of microalgae, namely cultures originating from samples collected in natural aquatic environments that contain various microalgal species. The microalgal community within a mixed culture tends to suffer from oscillations of the relative proportions of the various species present, which can affect the quantity and composition of the biomass produced. However, none of the previous literature studies that have involved mixed cultures has addressed the question of the reproducibility of the experiments. The present study, therefore, had the aim not only of evaluating the effect of these two strategies on the production of biomass and lipids, but also of evaluating the repeatability and reproducibility of the mixed cultures. Aeration with normal atmospheric air gave linear growth at a rate of 12.mg.L-1.day-1. This was increased to a linear growth rate of 28 mg.L-1.day-1 by using air enriched with 2% (v/v) CO2. However, the results obtained in two experiments using air enriched with 5% (v/v) CO2 demonstrated the lack of reproducibility of the results: in the first experiment the linear growth rate of 32 mg.L-1.day-1 was not significantly different (alfa=0.01) from that obtained with 2% (v/v) CO2, however, in the second experiment the linear growth rate was significantly lower (alfa=0.01), 17 mg.L-1.day-1. This lack of reproducibility was also apparent in the results for the total lipid content of the dry biomass: a value of 15% was obtained with atmospheric air, air enriched with 2% (v/v) CO2 and the first experiment with air enriched with 5% (v/v) CO2, however, in the second experiment with air enriched with 5% (v/v) CO2 the value was significantly lower (alfa=0.01), 12%. On the other hand, the use of air enriched with CO2 increased the repeatability of the mixed cultures: the growth curves obtained with the replicates supplied with CO2-enriched air were closer to one another than those for the replicates supplied with normal air. The use of CO2-enriched air also decreased the fraction of flasks that suffered "collapse", namely premature death of the cells: this collapse happened in 1 in 4 flasks for cultures supplied with normal air but did not happen for flasks supplied with CO2-enriched air. In future experiments, alternative strategies for improving the reproducibility of the results could involve, firstly, an increase in the initial concentration of the inoculum and, secondly, the use of controlled mixed cultures produced by mixing several pure strains of microalgae.

Orientador : Prof. Dr. David Alexander Mitchell Coorientador : Prof. Dr. André Bellin Mariano Coorientador : Prof. Dr. Luiz Fernando de Lima Luz Junior Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Defesa: Curitiba, 28/08/2013 Inclui referências Resumo: O biodiesel surge como uma alternativa de grande potencial por ser obtido a partir de fontes renováveis, tais como mamona, dendê (palma), girassol, babaçu, amendoim, pinhão manso, soja e gorduras animais, sendo considerado um combustível biodegradável. Quando utilizado óleo vegetal de plantas oleaginosas na produção do biodiesel, o custo da matéria-prima varia em torno de 70% - 85% do custo total da produção. Outra desvantagem da utilização de plantas oleaginosas é a ocupação de terras férteis, que faz com que a produção de biodiesel concorra com a produção de alimentos. Portanto a matéria-prima utilizada atualmente pode ser substituída por biomassa de microalgas. A biomassa de microalgas tem o potencial de ser convertido em biodiesel. No entanto, o custo de produção da biomassa de microalgas é alto. Este custo da produção de microalgas está diretamente relacionado com a aquisição dos nutrientes que compõem o meio de cultivo. Assim, desenvolver um sistema de reutilização do meio de cultivo permite reduzir o custo da produção de microalgas, pois, são aproveitados o meio aquoso e os nutrientes que não foram consumidos pelas microalgas durante o cultivo anterior. Neste sentido, esta pesquisa buscou avaliar o efeito da reciclagem repetida do meio de cultivo sobre o crescimento da microalga Scenedesmus sp. Para tanto, a microalga foi cultivada em meio sintético Chu durante 10 dias, após o período de cultivo a biomassa foi recuperada por sedimentação e o sobrenadante (meio clarificado) foi utilizado para fornecer 50% do volume no cultivo posterior o meio padrão (meio Chu) foi utilizado para completar os outros 50%. O meio de cultivo foi reciclado três vezes consecutivamente e o efeito da reciclagem foi avaliado através de densidade óptica a 540nm, produtividade de biomassa, lipídeos totais e perfil lipídico. Também foi quantificado o consumo de nitrato, fosfato, ferro e potássio, comparando com o cultivo realizado em meio padrão, o cultivo realizado com o meio reciclado teve maior produtividade de biomassa e lipídeos nos três reciclos realizados. Em relação ao perfil lipídico, o reciclo apresentou 9,8% de ácidos graxos poli-insaturados quando comparado com o meio padrão que foi de 23,7%, o resultado encontrado para o meio reciclado representa uma melhora na qualidade do biodiesel. Durante o período de cultivo, a microalga consome mais que 99% do nitrato, entre 10% a 30% de fosfato, 23% a 91% de ferro total e 1% a 19% de potássio fornecido. Após o período de cultivo no meio reciclado a concentração de biomassa seca ficou em média 600 mg L-1 e o teor de lipídeos 15%, enquanto para o cultivo realizado com o meio padrão a biomassa ficou em média 500 mg L-1 e o teor de lipídeos 11%. A reciclagem repetida do meio de cultivo (3 reciclos) permite reduzir o custo do meio em 34% para uma planta de produção de microalgas. Palavras-chave: biodiesel; microalga; reutilização do meio de cultivo. Abstract: Biodiesel is currently being promoted as an biodegradable alternative to petrodiesel, given that it is produced from renewable resources such as castor oil, palm oil (palm), sunflower, babassu oil, peanut, jatropha, soy and animal. Currently, the greater part of biodiesel is produced using oil from oleaginous plants as the feedstock. However, the use of oil crops has two disadvantages. Firstly, this raw material contributes 70 to 85% of the total cost of the biodiesel produced from it. Secondly, producing biodiesel from oil crops reduces the fertile land available for food production. The latter problem could be avoided by producing the oil for biodiesel using microalgae, which can be cultivated using land that is not appropriate for the cultivation of food crops. However, the costs of producing microalgal biomass are high. Since acquisition of nutrients for the culture medium contributes a significant proportion of the costs of growing microalgae, it would be advantageous to reutilize the culture medium, taking advantage of nutrients that are not consumed during the previous culture. This idea was tested in the current work by evaluating the growth of the microalgae Scenedesmus sp. during repeated recycles of the culture medium. This microalgae was cultivated in Chu medium for 10 days, after which the biomass was recovered by sedimentation and the clarified medium was used to provide 50% of the medium volume in the subsequent culture. Standard Chu medium was used to provide the other 50% of the volume. This recycle procedure was done three times consecutively. Culture performance was evaluated on the basis of the optical density at 540 nm, the productivity of biomass, the total lipids and the composition of the lipids produced. The consumption of nitrate, phosphate, iron and potassium during each cycle was also determined. In comparison to a culture undertaken in Chu medium, the cultures with recycle had a higher productivity of both biomass and lipids. The lipids produced in the cultures with recycle had a proportion of polyunsaturated fatty acids, 9.8% of when compared to the standard medium was 23.7%, which would lead to a better quality biodiesel. During the cultivation consumes over 99% of the nitrate, between 10% and 30% phosphate, 23% to 91% of total iron and 1% to 19% of potassium provided. For the cultures undertaken with recycled medium, the average dry biomass concentration was 600 mg L-1and the lipid content of this biomass was 15%. In comparison, for the cultures undertaken in Chu medium, the average dry biomass concentration was 500 mg L-1and the lipid content of this biomass was 11%. The recycling of the medium reduced medium costs by 34% and therefore represents a promising strategy for reducing the costs of producing microalgal biomass. Keywords: Biodiesel; Microalgae; Culture médium reutilization.

Resumo: O crescimento microscópico de fungos filamentosos sobre superfícies sólidas envolve uma série de processos, como translocação de nutrientes, ramificação, alongamento da hifa e diferenciação celular. Uma ferramenta capaz de integrar e compreender todos esses processos ao mesmo tempo é modelagem matemática. Porém devido a complexidade do sistema, se torna difícil a obtenção diretamente um modelo matemático global que descreva todos os processos simultaneamente. Dessa forma, é necessário dividir o sistema em sub-sistemas para que cada processo possa ser modelados separadamente e depois fundidos em um modelo global. Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi desenvolver dois modelos matemáticos para descrever dois processos que envolvem o crescimento microscópico de fungos filamentosos sobre superfícies sólidas. O primeiro modelo foi proposto para descrever os mecanismos de translocação de nutrientes e de alongamento de uma única hifa. Nesse modelo a hifa é representada como sendo composta de cubos, que podem ser tratados como tanques em série bem agitados. A fonte de maltose (nutriente limitante) se encontrava na base da hifa e são translocados por difusão e convecção dentro da hifa. Dentro da hifa a maltose é convertida em vesículas que são transportadas até ponta por convecção. Na ponta da hifa as vesículas se fundem e alongam o comprimento da hifa. O modelo foi calibrado para descrever o comprimento de uma hifa reprodutiva de Rhyzopus oligosporus com 24 horas de alongamento. Através da análise paramétrica do modelo, os parâmetros que mais influenciaram o alongamento da hifa foram os parâmetros relacionados ao fornecimento de maltose para hifa. O segundo modelo foi proposto para descrever as regras de ramificação e os processos de diferenciação. Neste modelo o sistema foi dividido em camadas de 140 ?m onde os segmentos de hifa podem alongar a ramificar em ângulos fixos de 90°. Esse modelo foi proposto tanto para descrição das hifas aéreas quanto penetrantes. As hifas aéreas foram descritas como sendo compostas por hifas vegetativas e reprodutivas. As hifas penetrantes foram descritas como sendo compostas por hifas vegetativas e desbravadoras. Esse modelo foi capaz de descrever com precisão tanto as hifas aéreas, quanto as hifas penetrantes. Os dois modelos propostos nesse trabalho podem ser fundidos em único modelo que seria capaz de descrever a maioria dos processos que ocorrem durante o crescimento microscópico de fungos filamentosos sobre superfícies sólidas.

Resumo

Este trabalho teve por objetivo a purificação e a caracterização cinética da lipase selecionada de Bacillus megaterium e a verificação do seu potencial para utilização em biocatálise em meio de solventes orgânicos. Dentre 36 cepas microbianas selecionadas para o screening inicial, a cepa de Bacillus megaterium CCOC P2637 apresentou a mais alta atividade lipolítica, tanto em placas de Petri, como em fermentação líquida (33 U/mL), tendo sido avaliada com relação ao seu potencial para utilização em biocatálise pela caracterização cinética e de estabilidade do extrato bruto e da lipase purificada. Para produção da enzima, o microrganismo foi cultivado em meio contendo sais, extrato de levedura e 1% de óleo de oliva, com incubação a 29 °C e 120 rpm. Após 72 h de cultivo, o sobrenadante foi separado das células por centrifugação e a enzima foi precipitada diretamente do sobrenadante de cultura pela adição de sulfato de amônio (80%), ressuspendida e dialisada, resultando no extrato bruto utilizado nos ensaios seguintes. O extrato bruto apresentou atividade frente a triacilgliceróis com cadeias entre 4 e 18 carbonos e frente a ésteres de pnitrofenila, destacando-se a maior atividade frente ao palmitato de p-nitrofenila. A temperatura para atividade máxima foi de 55 °C, sendo que a enzima foi razovelmente estável a 60 °C, mantendo 77% do valor inicial após 10 min de incubação. A estabilidade em solventes orgânicos foi estudada por incubação (1h, 30 °C) do extrato bruto em butanol, tolueno, hexano, heptano, isooctano e em várias porcentagens (de 25 a 100%) de acetona, etanol e isopropanol em água. O extrato bruto manteve 100% da atividade inicial nos solventes hidrofóbicos e foi surpreendentemente ativado na presença de porcentagens crescentes de etanol, isopropanol e acetona. A verificação da capacidade de catálise da enzima no sistema de micelas reversas AOT/n-heptano mostrou que as mais altas atividades específicas foram obtidas em W0 ([H2O]/[AOT]) 5 (111 U/mg) e 10 (104 U/mg) e a razão entre a atividade no meio orgânico e aquoso (Ro/a) foi de 1,9, indicando uma maior atividade no meio micelar do que no meio aquoso. Análises preliminares do extrato bruto por cromatografia de gel permeação indicaram que a enzima estava presente na forma de um agregado de alta massa molar. Com o tratamento do extrato bruto com CHAPS 1% (m/v) e aplicação em coluna Phenyl Sepharose Fast Flow obteve-se um fator de purificação de 70 e 18% de recuperação de atividade, observando-se 3 bandas de 32, 50 e 60 kDa na eletroforese SDS-PAGE. Como segunda estratégia de purificação, utilizou-se o tratamento do extrato bruto com isopropanol 30% (v/v), coluna Octyl Sepharose CL4B e eluição com isopropanol 60% (v/v). O fator de purificação obtido foi de 46, com recuperação de 86% da atividade e 3 bandas de 31, 52 e 63 kDa. Apenas a banda de 31 kDa apresentou atividade frente ao MUFbutirato, sendo que sua seqüência amino-terminal demonstrou 93% de homologia com a seqüência interna de uma colesterol esterase de Pseudomonas cepacia. A enzima purificada mostrou-se surpreendentemente mais estável do que o extrato bruto, apresentando atividade máxima em temperatura de 55-65 °C e na faixa de pH entre 6 a 9. A enzima foi estável a 50 °C, mantendo 50% da atividade após 86 min e entre pH 3 e 10,5, por 1h a 29 °C. Estes resultados mostram que a lipase de B. megaterium é uma enzima ainda não descrita na literatura, cujas propriedades cinéticas e de estabilidade são de grande interesse para aplicações em biocatálise

O objetivo principal do trabalho foi avaliar o potencial biotecnológico do cogumelo Lentinula boryana (Shiitake das Américas). Para isto foram feitos experimentos comparando os polissacarídeos presentes nos corpos de frutificação de L. boryana e L. edodes. Neste trabalho foi demonstrado que os polissacarídeos de L. boryana possuem características semelhantes a do L. edodes. Sabendo-se que o L. edodes é considerado um cogumelo medicinal devido às atividades biológicas dos polissacarídeos do seu corpo de frutificação, pode ser esperado que o L. boryana também possua atividades biológicas similares, o que é potencial biotecnólogico a ser explorado no futuro. Foram realizados experimentos sobre o crescimento micelial em placas onde foi demonstrado que L. boryana possui características de cultivo similares a L. edodes, mas possui maior sensibilidade a temperaturas elevadas (acima de 25 °C) e é mais sensível a concentrações elevadas de fontes simples de nitrogênio. Durante os estudos também foi verificado que a 28 °C o crescimento micelial é interrompido e ocorre a produção de um pigmento escuro que fica disperso no meio e no micélio. Com isso buscou-se avaliar o que seria este pigmento por análises espectrográficas (RPE, IV e RMN). Os resultados destas análises sugerem que este pigmento é uma melanina, provavelmente uma DOPA-melanina. Também foram verificados os fatores que influenciam na produção de melanina por L. boryana, nestas análises foi verificado que esta produção é estimulada pela elevação da temperatura e pela presença de outros microorganismos no meio de cultivo. A disponibilidade de nutrientes e de oxigênio também mostrou ser importante para a sua produção. As melaninas são substâncias que vêm sendo estudadas há muitos anos, existem trabalhos que demonstram possíveis aplicações das melaninas na industria e na medicina. Considerando o fato que o L. boryana produz melanina e estas possuem interesse biotecnológico isto pode sugerir mais um potencial para o L. boryana a ser explorado no futuro

Orientador : Prof. Dr. David Alexander Mitchell Co-Orientador: Prof. Dr. Luiz Fernando de Lima Luz Jr. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Defesa: Curitiba, 24/02/2012 Bibliografia: fls. 207-216 Resumo Resumo: O cultivo de microalgas em fotobiorreatores fechados possibilita a obtenção de elevada produtividade de biomassa por área ocupada, melhor controle dos parâmetros de processo e controle da contaminação por outros micro-organismos, porém ainda é pouco utilizado em larga escala devido à ausência de um projeto ideal para o equipamento. O dimensionamento do fotobiorreator pode ser realizado através da modelagem matemática dos parâmetros que apresentam maior influência sobre o crescimento das microalgas: intensidade luminosa e concentrações de O2 e CO2 dissolvidos. O objetivo do presente trabalho é propor um modelo matemático para a concentração de O2 e CO2 na fase gasosa e na fase líquida da coluna de gaseificação de um fotobiorreator tubular, o compartimento do fotobiorreator no qual ocorre a transferência de massa gás-líquido. O modelo proposto considerou uma fase líquida composta de água pura, sem microalgas, mas, apesar disso, foi validado com dados experimentais da literatura, obtidos durante o cultivo de microalgas. O efeito da salinidade do meio sobre o resultado do modelo foi estudado e observou-se que, considerando meio com biomassa e salinidade próxima à da água do mar, o fornecimento de carbono pode ser de 19% a 38% menor do que o estimado considerando apenas água, dependendo da altura da coluna. Por outro lado, a remoção de O2 é pouco alterada. O efeito dos erros das estimativas do holdup do gás e do coeficiente global de transferência de massa (kLa) sobre a previsão do modelo também foi avaliado, e verificou-se que tanto o fornecimento de CO2 quanto a remoção de O2 experimentais devem ser inferiores aos valores obtidos na simulação, em até 50%. O estudo da resposta do modelo às variações dos parâmetros de processo também foi realizado. Ao simular o sistema com velocidade superficial da fase líquida maior, observou-se um aumento inicial da absorção de CO2 seguido de um declínio. Por outro lado, ao aumentar o pH, a velocidade superficial gasosa ou a fração molar de CO2 no ar de entrada, houve apenas o aumento da absorção de CO2. Em pH 7,5, a influência da temperatura foi conforme o esperado: houve redução da absorção de CO2 com o aumento da temperatura. Entretanto, para pH 9,0 e 10,5, a absorção de CO2 foi maior em temperaturas superiores, porque o aumento do kLa compensou a diminuição da solubilidade do gás. Por fim, foram feitas simulações a fim de propor modificações na atual coluna de gaseificação do fotobiorreator do Núcleo de Pesquisa e Desenvolvimento em Energia Auto-Sustentável (NPDEAS) e, assim, obter maior produtividade de biomassa. Nesta análise, constatou-se que, para obter a produtividade desejada no fotobiorreator do NPDEAS, de 1,5 kg m-3 dia-1, é necessário aumentar o número de colunas de gaseificação e utilizar ar enriquecido com CO2 oriundo do tri-gerador instalado na planta. Entretanto, apenas com o modelo proposto neste trabalho, não é possível realizar um dimensionamento apropriado da coluna de gaseificação. Devido às interações entre a coluna de gaseificação e o compartimento de cultivo, é necessário um modelo mais completo para o fotobiorreator, que considere pelo menos a intensidade luminosa no interior do fotobiorreator e seu efeito sobre a velocidade de crescimento da microalga. Abstract: The cultivation of microalgae in closed photobioreactors enables high biomass productivity per occupied area, improved control of process parameters and control of contamination by other microorganisms, however, it is rarely used at large scale due to the lack of an ideal photobioreactor design. The design of a photobioreactor can be guided by a mathematical model that considers the parameters that most influence the growth of microalgae: light intensity and the concentrations of dissolved O2 and CO2. The objective of the present work is to propose a mathematical model for the O2 and CO2 concentrations in the gas and liquid phases of a gas transfer column of a tubular photobioreactor. Although the model considers a liquid phase composed of pure water, without the microalgae, it was validated using experimental literature data from algal cultures. The effect of medium salinity was studied by considering the characteristics of a sea water-based medium with biomass, and it was observed that the absorption of CO2 within the gas transfer column may be 19% to 38% less than the value estimated using the properties of pure water, depending on the height of the column. O2 removal, on the other hand, is hardly altered by the presence of salts or biomass. The effect of estimation errors in gas holdup and the global mass transfer coefficient (kLa) on the predicted results was also evaluated, and it was verified that experimental values of CO2 absorption, as well as O2 removal, may be up to 50% lower than values predicted by the model. The sensitivity of the predictions of the model to the values of key process parameters was also evaluated. With increasing values of the liquid superficial velocity, the efficiency of CO2 mass transfer first increased, but then fell. On the other hand, increases in pH, gas superficial velocity or CO2 molar fraction in the inlet gas improved CO2 mass transfer over the ranges studied. At pH 7.5, the influence of temperature was as expected: higher temperatures reduced CO2 absorption. At pH 9.0 and 10.5, however, CO2 absorption was higher at higher temperatures, because the increase in kLa more than compensated for the decrease of solubility of the gas. Finally, simulations were carried out in order to propose modifications to the current gas transfer column of the photobioreactor of the Center for Research and Development of Sustainable Energy of UFPR, aiming to achieve a productivity of 1.5 kg m-3 day-1. These analyses indicated that, in order to achieve this productivity, it is necessary to increase the number of gas transfer columns and to use air enriched with CO2 from the generator installed at the Center. However, the model developed in the current work is not a complete tool for the design of the gas transfer column: Due to the interactions between this column and the solar collector of the photobioreactor, it is necessary to develop a complete model for the photobioreactor that includes, at the very least, the light intensity in the interior of the photobioreactor and its effect on the growth rate of the microalgae.

Orientador : Prof. Dr. David Alexander Mitchell Co-orientadora : Profa. Dra. Nadia Krieger Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 27/02/2012 Bibliografia: fls. 78-86 Resumo: Biorrefinaria e um novo conceito que abrange as instalações industriais que utilizam a biomassa como matéria-prima para a produção de intermediários químicos, combustíveis e energia, analogamente as refinarias de petróleo. As biorrefinarias possuem três características principais: a preocupação com a utilização máxima da biomassa, a flexibilidade da planta para a utilização de diferentes fontes de matéria-prima, e o não comprometimento da área arável destinada a produção de alimentos. As biorrefinarias surgiram, portanto, para atender a crescente demanda por energia e materiais de origem renovável e obtidos em processos sustentáveis, ou seja, que minimizam seu impacto no meio ambiente. A biomassa de resíduos agroindustriais ricos em pectina, como a polpa cítrica, a polpa de beterraba e a cabeça de girassol, são bastante abundantes em alguns países e podem ser exploradas para a produção do acido D-galacturonico. Este composto possui alto valor agregado e podem ser vendido diretamente as indústrias de alimentos e cosméticos, ou pode servir como intermediário químico para a produção de outros compostos como a vitamina C e bioplasticos. Este trabalho avaliou duas estratégias de produção de acido D-galacturonico: (1) a produção de pectinases e hidrolise simultânea de um substrato rico em pectina e (2) a produção de pectinases para a aplicação sequencial em hidrolise do substrato. A fermentação no estado solido (FES) foi o processo escolhido para ambas as estratégias devido ao menor custo operacional e a maior produtividade de pectinases quando comparada a fermentação submersa. A primeira estratégia se baseou na utilização de uma cepa recombinante, o Aspergillus Níger ATCC 1015 ?gaaA, cedida pelo centro de pesquisa da VTT, Finlândia, onde foi deletado o gene da galacturonato redutase (gaaA). Esta enzima e a primeira da via do catabolismo do acido D-galacturonico, e a ausência da sua expressão impediria o consumo deste açúcar pelo microrganismo. No entanto, verificou-se que a cepa não foi capaz de acumular o acido D-galacturonico no solido fermentado. Na segunda estratégia foram testadas as linhagens A. Níger ATCC 1015, A. Níger CH4, A. Níger AW96, A. Níger AD96 e um Aspergilus SP. Ainda não identificado, isolado durante este trabalho. Os meios sólidos utilizados consistiram numa mistura de 30% (m/m) de bagaço de cana e 70% de outros substratos, bagaço de laranja, bagaço de laranja lavado ou farelo de trigo. A combinação de microrganismo e meio que resultou em maior atividade de pectinases foi o Aspergillus sp. em bagaço de laranja lavado, com 77 U/g em 19 horas de cultivo. Isto corresponde a uma produtividade de quatro U.G-1.h-1, que já e adequada para dar continuidade aos estudos de aumento de escala. Abstract: as feedstock for the production of chemical intermediates, fuel and energy, similarly to the petroleum refineries. Biorefineries have three main characteristics: the concern with the maximum utilization of biomass, the plant's flexibility to use different sources of raw material, and no impairment of Biorefinery is a new concept that includes industrial plants that use biomass arable land used to produce food. Biorefineries appeared, therefore, to meet the growing demand for energy and materials obtained from renewable sources and sustainable processes, which minimize their impact on the environment. Pectin-rich agroindustrial wastes, such as citric pulp, sugar beet pulp and sunflower heads, are quite abundant in some countries and can be exploited for the production of D-galacturonic acid. This compound has a high added value and can be sold directly to the food and cosmetics industry, or can be used as an intermediate in the chemical industry to produce other compounds such as vitamin C and bioplastics. The current research evaluated two strategies for the production of D-galacturonic acid: (1) the production of pectinases and simultaneous hydrolysis of a pectin-rich substrate and (2) the production of pectinases for subsequent application in the hydrolysis of substrate. Solid-state fermentation (SSF) was chosen for both strategies due to the lower operational cost and greater productivity of pectinases compared to submerged fermentation. The first strategy was based on the utilization of a recombinant strain, Aspergillus niger ATCC 1015 ?gaaA, courtesy of VTT, Technical Reserch Centre of Finland. In this strain the gene gaaA, which codes for galacturonate reductase, was deleted. This enzyme catalyzes the first step in the catabolism of galacturonic acid, and its absence should prevent the consumption of this sugar by the organism. However, this sugar did not accumulate during solid state fermentation. In the second strategy, the following strains were tested: A. niger ATCC 1015, A. niger CH4, A. niger AW96, A. niger AD96 and a yet unidentified Aspergillus sp. strain, isolated during this research. The solid media used consisted of a mixture of 30% (w/w) of sugar cane bagasse and 70% of other substrates, such as orange peel, washed orange peel or wheat bran. The combination of organism and substrate that resulted in the highest pectinase activity, 77 U/g in 19 hours of culture, was the Aspergillus sp. strain grown with washed orange peel. This result corresponds to a productivity of 4 U g-1 h-1, which provides a good basis for future scale-up studies.

Orientador: Prof. Dr. Jose Viriato Coelho vargas Coorientadores: Prof. Dr.David Alexander Mitchell, Prof. Dr. André Bellin Mariano Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia - PIPE. Defesa: Curitiba, 16/08/2011 Bibliografia: fls. 91-97 Área de concentraçao: Engenharia e ciencia dos materiais Resumo: As condições para o cultivo de microalgas Phaeodactylum tricornutum foram estudadas com o objetivo de aumentar o conteúdo de lipídios das algas para a produção de biodiesel. As variáveis investigadas nos experimentos foram: salinidade, fonte de carbono (glicerol e glicose) e fotoperíodo. A partir da cinética de crescimento, análise de biomassa e produção de lípidos, foi possível determinar a produtividade da espécie de microalga estudada. A produção de lípidos aumentou devido à adição de uma fonte de carbono para o meio de cultura. Além disso, a adição de fonte de carbono no início do cultivo apresentou o melhor resultado. Entre os valores de salinidade testados nos experimentos, o que resultou no maior crescimento de microalgas foi de 15 ‰. A melhor fonte de carbono assimilável pelas microalgas foi glicerol a uma concentração de 0,1 M, proporcionando culturas com até 1,3 g / L de biomassa. Cultivos mixotróficos com um fotoperíodo de 24 h de luz, na presença de glicerol resultou em 338,97 mg / L de lípidos, sendo 80% mais elevada do que o cultivo autotrófico. Resultados de biomassa seca (g / L) foram comparados com os resultados de simulação obtidos com um modelo matemático publicado anteriormente por um período de 450 h. O modelo foi capaz de estimar uma concentração final de biomassa seca em boa concordância com os dados experimentais. Abstract: The conditions for cultivation of microalgae Phaeodactylum tricornutum were studied with the objective of increasing algae lipid content for the production of biodiesel. The variables investigated in the experiments were: salinity, carbon source (glycerol and glucose) and photoperiod. From the growth kinetics, and the analysis of biomass and lipid production, it was possible to determine the productivity of the studied microalgae species. The lipids production increased due to the addition of a carbon source to the culture medium. Furthermore, the carbon source addition in the beginning of the cultivation provided the best result. Among the tested salinity values in the experiments, the one that resulted in the highest microalgae growth was 15 ‰. The best assimilated carbon source by the microalgae was glycerol at a concentration of 0.1 M, providing cultures with up to 1.3 g / L of biomass. Mixotrophic cultivation with a photoperiod of 24 h of light in the presence of glycerol resulted in 338.97 mg / L of lipids, which was 80% higher than the autotrophic one. Dry biomass (g / L) results were compared to simulation results obtained with a previously published mathematical model for a period of 450 h. The model was capable of estimating a final concentration of dry biomass in good agreement with the experimental data.

Orientador : Prof. Dr. David Alexander Mitchell Coorientador: Prof. Dr. Wagner Roberto de Oliveira Pimentel Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Defesa: Curitiba, 30/08/2011 Bibliografia: fls. 65-75 Resumo: O estudo da cinética da transesterificação enzimática de triacilgliceróis em éster de biodiesel na ausência de co-solvente é proposto neste trabalho. Sistemas ausentes de cosolventes vêm sendo estudados, pois além de serem mais corretos do ponto de vista ambiental, eliminam etapas de separação e recuperação do solvente. Entretanto, na literatura são encontrados diversos trabalhos que caracterizam a cinética da reação enzimática de modo superficial, sem a realização de maiores estudos que relacionam as reações cinéticas envolvidas. Dentre os modelos cinéticos encontrados, três descrevem reação com dois substratos e dois produtos; estes modelos foram testados e comparados a fim de selecionar o que melhor representa os dados experimentais. Os dois primeiros modelos seguem o mecanismo Ping Pong Bi Bi para explicar a cinética da reação de transesterificação na produção de biodiesel, com a incorporação de inibição por um dos reagentes, o álcool, enquanto o terceiro modelo propõe um mecanismo simples da reação de transesterificação no qual é desconsiderado o efeito de inibição do álcool. A modelagem matemática foi realizada utilizando dados experimentais encontrados na literatura. Os parâmetros cinéticos foram otimizados utilizando o método de algoritmo genético como ferramenta de otimização. A modelagem dos mecanismos encontrados na literatura e a simulação dos dados experimentais do sistema foram realizadas utilizando o software Matlab 7.0. Na escolha do modelo que melhor representou os dados experimentais, foram considerados os erros calculados e o coeficiente de correlação para cada conjunto de dados. O segundo modelo testado foi o que forneceu o melhor ajuste, nesse modelo tem-se a formação de biodiesel à medida que a o triacilglicerol é quebrado, entretanto novos ensaios são necessários para que seja medida, além do rendimento, a variação da concentração das demais espécies envolvidas no sistema ao longo do tempo de ensaio. Abstract:The current work analyzes the kinetics of the enzymatic transesterification of triacylglycerols, in a solvent free system, for the production of biodiesel esters. Solvent-free transesterification systems are more environmentally friendly, and eliminate the need for solvent separation and recovery steps. However, the kinetics of the transesterification reaction in this system have not been well characterized to date, with most studies simply limiting themselves to determining the optimum conditions for the reaction. In the current work three kinetic models that were recently proposed in the literature were tested against experimental results that were also obtained from the literature. The first two models are based on the Ping Pong Bi Bi mechanism and the third model proposes a mechanism that mimics simple chemical kinetics for each reaction. The genetic algorithm was used as an optimization tool to determine the parameters of the model that gave the best fit to the experimental results. The modeling and simulation were performed using Matlab 7.0. An inspection of the errors and the correlation coefficient for each data set showed that the second model tested gave the best fit. It is recommended that during future studies of enzymatic transesterification of triacylglycerols in solvent free systems the concentrations of all species in the system be determined, and not simply the concentration of biodiesel esters.

Orientador : Prof. Dr. Marcelo Kaminski Lenzi Coorientador: Prof. Dr. David Alexander Mitchel Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Defesa: Curitiba, 30/04/2010 Bibliografia: fls. 56-60 Resumo: O emprego de técnicas de modelagem de processos químicos é de fundamental importância para descrição matemática dos mesmos e a aplicação de técnicas de controle de processo que venham garantir sua operação segura e competitiva. Neste trabalho, aplicou-se o ferramental baseado em equações diferenciais de ordem fracionárias para a modelagem de sistemas de engenharia química. Mais especificamente, foram estudadas e aplicadas técnicas numéricas para problemas não reportados na literatura, concernentes à sistemas com geometria radial. Em uma segunda etapa, foram analisadas a mistura de sólidos e a dispersão axial sob a ótica de equações diferenciais fracionárias. A partir de dados experimentais previamente reportados na literatura, foram estimados parâmetros de modelos representados por equações diferenciais de ordem fracionária tipo parcial. Considerando a técnica heurística de algoritmos genéticos, foram estimados parâmetros do modelo de ordem fracionária e de ordem inteira para comparação. Em ambos os estudos, mistura de sólidos e dispersão axial, o modelo fracionário levou à menores valores da função objetivo usada para estimação de parâmetros. Para mistura de sólidos o modelo fracionário obteve FOBJ = 0,0480 e o modelo inteiro obteve FOBJ = 0,0501. Para dispersão axial, o modelo fracionário obteve FOBJ = 0,0593 e o modelo inteiro obteve FOBJ = 0,0766. Desta forma, o ajuste dos pontos experimentais mostrou-se melhor pelo modelo fracionário, o que pode ser comprovado pela inspeção visual dos gráficos comparativos, o que comprava a viabilidade do uso de equações diferenciais fracionárias para a modelagem de sistemas de engenharia química. Abstract: The use of process modeling techniques plays a key role for mathematical description of chemical processes and the consequent use of process control techniques which allow a safer and competitive operation. In this work, fractional differential equations were used to model chemical engineering systems. More specifically, numerical techniques were studied applied to solve equations not reported in the literature, mainly concerning radial systems. In a second step, solid mixture and axial dispersion were considered for modeling purposes using fractional differential equations. From experimental data previously reported in the literature, parameters were estimated in order to obtain a fractional partial differential equation based model to adequately describe the data. The heuristic technique of genetic algorithms was considered for parameter estimation and as benchmark of comparison integer order models were also obtained. In both studies, i.e., solid mixing and axial dispersion, the fractional based model lead to lower values of the objective function used for parameter estimation. For solid mixing studies, the fractional model lead to FOBJ = 0,0480, while the integer model lead to FOBJ = 0,0501. For axial dispersion, the fractional model lead to FOBJ = 0,0593 and the integer model lead to FOBJ = 0,0766. Consequently, the fractional model provided a better experimental data fit, which can also be proved by visual inspection of comparative plots. Therefore, fractional differential equations can be successfully used for chemical engineering systems modeling.

Orientador : David Alexander Mitchell Co-orientadores : Miguel Daniel Noseda e Luiz Fernando de Lima Luz Júnior Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 29/01/2010 Bibliografia: f. 99-106 A avaliação de espécies de microalgas, assim como a introdução de eficientes regimes de cultivo, meios de recuperação de biomassa e extração de lipídeos são necessários para viabilizar o uso destes organismos na produção de lipídeos como fonte de biocombustível. Neste trabalho foram primeiramente avaliadas diferentes metodologias de extração de lipídeos utilizando duas espécies de microalgas: Nannochloropsis oculata e Phaeodactylum tricornutum. Para isso foram realizadas diferentes adaptações do método de Folch et al. e do método de Bligh e Dyer, os quais são baseados no uso de uma mistura monofásica de clorofórmio, metanol e água. Esta avaliação indicou a metodologia de Bligh e Dyer adaptada como a mais eficiente e levou a seleção da microalga P. tricornutum para as etapas seguintes deste trabalho. Os efeitos do uso de agentes floculantes (NaOH e FeCl3) e soluções de lavagem (NaCl, NH4HCO3 e H2O) na recuperação de biomassa e teor lipídico foram então avaliados. Neste caso, o teor lipídico não foi afetado significativamente pelos processos testados. Levando em consideração simplicidade e baixo custo, foram selecionados o uso do floculante NaOH e da não utilização de solução de lavagem como processo geral de obtenção de biomassa. Como etapa final deste trabalho, foram avaliadas três diferentes maneiras de se cultivar a microalga P. tricornutum: cultivo em minifotobiorreator, cultivos em erlenmeyers de 2L (em regime de batelada e semicontínuo). Para o cultivo em minifotobiorreator, foram realizadas tentativas de cultivo e otimização do sistema e avaliação do efeito do bombeamento nas células. Neste caso não foram alcançadas condições definitivas para utilização deste sistema. Já o cultivo em regime de batelada foi avaliado em relação à concentração inicial de inóculo e fotoperíodo. As melhores condições encontradas foram então aplicadas a um regime de cultivo semicontínuo. De acordo com a comparação dos resultados obtidos, as condições de cultivo definidas neste trabalho foram regime semicontínuo, fotoperíodo de 24 h, concentração de inóculo na faixa de 30×10 elevado a 4 até 50×10 elevado a 4 cél.mL-¹ e taxa de diluição de 0,014 h-¹. Evaluation of microalgae species as well as the introduction of efficient culture systems, biomass recovering and lipid extraction are necessary for the utilization of these organisms as biofuel source. In this work, we have first evaluated different lipid extraction methodologies on two microalgae species: Nannochloropsis oculata and Phaeodactylum tricornutum. Different adaptations from Folch et al. and Bligh and Dyer methods, which are based on a monophasic mixture of chloroform, methanol and water were tested for lipid extraction. This evaluation indicated the adapted Bligh and Dyer conditions as the most suitable method and led us to select P. tricornutum for the next steps of this work. The effect of the use of flocculant agents (NaOH and FeCl3) and washing solutions (NaCl, NH4HCO3 and H2O) on biomass and lipid content were also evaluated. In this case, the lipid content was not affected by the process utilized. Considering simplicity and low cost, we selected NaOH solution as flocculant and we chose to not utilize any washing step after biomass recovering. We also evaluated three different ways of culturing P. tricornutum: miniphotobioreactor culturing and two types of 2 L erlenmeyer culturing (batch and semicontinuous system). For miniphotobioreactor, culturing attempts and pumping effects were studied; however, definitive culture conditions could not be established. Batch cultures were evaluated in terms of initial cell density and photoperiod. Selected conditions were then applied for semicontinuous system. The overall results indicated that the best culturing conditions were semicontinuous system, 24 h photoperiod, 30×10 to the power of 4 to 50×10 to the power of 4 cel.mL-¹ initial cell density and 0.014 h-¹ renewal rate.

Orientador : Prof. Dr. David Alexander Mitchell Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Defesa: Curitiba, 27/08/2010 Bibliografia: fls.137-141 Resumo: O crescimento de fungos filamentosos sobre superfícies úmidas e nutritivas em contato com o ar é um fenômeno importante em processos de grande destaque, como na fermentação no estado sólido (FES) e na decomposição da matéria orgânica. Ele ocorre por meio do aumento de biomassa através de estruturas fúngicas individuais que se assemelham a "tubos" microscópicos, conhecidas como hifas. Dentro delas ocorre um conjunto de fenômenos físicos e biológicos que já estão bem caracterizados isoladamente, mas que pouco se sabe sobre como interagem. Entender a interação entre os fenômenos é fundamental para compreender como ocorre a distribuição da biomassa acima das superfícies destes sistemas. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi de desenvolver um sistema matemático que permitisse estudar os diversos fenômenos físicos e biológicos importantes no crescimento de fungos filamentosos sobre a superfície de meios úmidos e nutritivos em contato com o ar. Dois submodelos foram desenvolvidos: primeiro, foi desenvolvido um modelo discreto para o crescimento do micélio fúngico no espaço aéreo acima da superfície de inoculação. Nele, cada hifa era representada por um conjunto de cubos alinhados no espaço ridimensional. Foi proposta a existência de dois tipos de biomassa: uma chamada vegetativa, bastante ramificada e que crescia em pequenas alturas até o momento da diferenciação; e a outra chamada de reprodutiva, menos ramificada, mais veloz e que crescia após o momento da diferenciação. Ao longo do crescimento, se uma hifa se encostasse em outra, ela poderia se redirecionar algumas vezes, porém em um número limitado de vezes até se tornar inativa. A incorporação dessas biomassas e do número limitado de redirecionamentos foi fundamental para que o modelo descrevesse razoavelmente os dados experimentais disponíveis na literatura, onde o perfil era de uma alta densidade de biomassa decrescendo até 1 mm de altura e uma densidade baixa e constante até 3,5 mm. Foi também demonstrado que o sistema é flexível o suficiente para que regras sejam alteradas ou adicionadas para simular outras sit ações. Segundo, foi desenvolvido um modelo para simular o crescimento de uma única hifa como um conjunto de tanques em série. Foram incorporadas a difusão intracelular de glucose e a evaporação de água pela ponta da hifa, a qual gerava um fluxo convectivo de líquido dentro dela. Com isso, a glucose era transportada a partir do início da hifa até à ponta, local onde ocorriam reações para sustentar o crescimento. O modelo mostrou que apenas com a difusão os nutrientes chegavam até a ponta a uma velocidade tal que a hifa estendia até 1 mm e altura nas 40 h simuladas. Por outro lado, com fluxo convectivo, a velocidade de translocação de nutrientes aumentava, a glucose chegava mais rapidamente até à ponta e a hifa alongava mais rapidamente, chegando até a uma altura de 3,5 mm em 40 h de simulação. O modelo foi calibrado de modo que possa ser incorporado ao modelo do crescimento do micélio, e então um modelo que reúna e integre a distribuição espacial da biomassa e translocação de nutrientes possa ser desenvolvido. Abstract: The growth of filamentous fungi on the surfaces of solid nutrient particles that are surrounded by an air phase is important in natural processes such as the degradation of organic matter and artificial cultivation processes such as solid-state fermentation. This growth occurs in the form of microscopic tubules, known as hyphae. The various biological and physical phenomena that occur within hyphae have been studied, but little is known about how they interact to control hyphal growth. An understanding of these interactions would lay the basis for understanding the distribution patterns of aerial hyphae within these systems. In this context, the objective of the current work was to develop a mathematical system for investigating the interactions amongst the various physical and biological phenomena that occur within aerial hyphae growing on moist solid nutritive surfaces in contact with an air phase. Two submodels were developed. In the first part of the work, a discrete model was developed to describe the growth of a fungal ycelium into the air space above a solid surface inoculated with spores. In this model, each hypha is represented by a set of contiguous cubes within a three dimensional control volume. Two types of biomass are included in the model: Vegetative biomass grows in a highly branched manner, occupying the air space near to the surface until the time of differentiation, after which reproductive hyphae, which extend more uickly and branch less frequently, grow away from the solid surface. During growth, if a hyphal tip bumps into a pre-existing hypha, it can choose another growth direction. However, if this happens several times, then the hyphal tip becomes inactive and that hypha ceases to extend. The incorporation of two types of biomass and rules for inactivation of hyphal tips was necessary in order for the model to be able to describe literature data for the density of aerial hyphae. These data show a high density of biomass until 1 mm above the surface and then a low biomass density up to 3.5 mm. The model system can easily be adapted with the incorporation of new rules in order to describe mycelial growth in other situations. In the second part of the work, a model, based on the n-tanks-in-series approach, was developed to simulate the growth of a single aerial hypha. The model describes intracellular diffusion of glucose and the evaporation of water from the hyphal tip, with this evaporation causing a convective flow within the hypha. In this manner, glucose is transported from the beginning of the hypha to the tip, where the reactions supporting hyphal extension occur. Simulations with the model suggest that if diffusion were the only mechanism by which nutrients reached the hyphal tip, then the hypha would only extend 1 mm over a 40 h period. On the other hand, with convective flow, the rate of nutrient supply to the tip would be sufficient to allow the hyphae to extend 3.5 mm over the same period. In the future, this transport submodel could be incorporated into the model of mycelial growth developed in the first part of the work, thereby producing a model that describes how the translocation of nutrients within aerial hyphae affects their spatial distribution.

Orientador: Prof. Dr. David Alexander Mitchell Co-Orientador: Luiz Fernando Lima Luz Jr Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Defesa: Curitiba, 31/08/2009 Bibliografia: fls.136-142 Resumo: A fermentação no estado sólido é um processo capaz de produzir diversos compostos de interesse comercial. Uma das dificuldades para a aplicação industrial deste método é a falta de sensores economicamente viáveis capazes de realizar medidas on-line da umidade da fase sólida, que se for reduzida demasiadamente pode limitar o crescimento do microrganismo e a produção dos metabólitos. O objetivo deste trabalho foi de desenvolver um modelo matemático determinístico para inferir a umidade da fase sólida em um biorreator com aeração forçada e agitação intermitente. A combinação de duas características distingue este modelo de inferência de modelos anteriores: a primeira, é que o modelo descreve os gradientes axiais da umidade do leito ao invés de assumir que o leito é homogêneo; a segunda, é que o modelo descreve as transferências de massa e energia entre a fase gasosa e sólida dentro do leito ao invés de assumir que estas fases estão em equilíbrio. As medidas do processo fornecidas ao modelo de inferência eram as temperaturas da fase gasosa em diferentes alturas do leito. Inicialmente, o modelo de inferência foi testado com um modelo preditivo do biorreator: quando as temperaturas da fase gasosa do modelo preditivo foram fornecidas ao modelo de inferência, o modelo de inferência calculou corretamente a umidade da fase sólida. Na seqüência, motivado pelo fato que um biorreator real possui um número limitado de sensores de temperatura, o modelo preditivo foi utilizado para gerar curvas de temperatura da fase gasosa em função da altura do leito em diferentes tempos de cultivo. Equações empíricas foram ajustadas a estes perfis de temperatura, com a intenção de usar estas equações no modelo de inferência para estimar temperaturas dentro do leito do biorreator de escala piloto nos pontos intermediários aos sensores, que estão localizados nas alturas de 0, 5, 18, 33 e 50 cm, representando a base, três alturas intermediárias e o topo do leito. Entretanto, em um teste no qual o modelo preditivo foi utilizado para gerar temperaturas da fase gasosa nestas alturas do leito, o modelo de inferência estimou melhor a umidade da fase sólida quando temperaturas nas regiões intermediárias dos sensores foram obtidas por interpolação linear. No terceiro passo, o modelo de inferência, com interpolação linear das temperaturas, foi empregado para investigar o melhor posicionamento dos três sensores internos no leito. Foi observado que as melhores estimativas da umidade do leito eram obtidas quando os sensores estavam concentrados na região inferior do leito. Na última parte do trabalho, o modelo de inferência foi testado em cultivos de Aspergillus oryzae sobre uma mistura de soja e farelo de trigo no biorreator de escala piloto. Durante estes cultivos as temperaturas do gás de entrada e saída do biorreator e nas alturas internas do leito de 5,18 e 33 cm foram monitoradas. Amostras do leito foram removidas nas mesmas alturas dos sensores para a determinação da umidade do leito. Na altura de 5 cm o modelo inferiu o ressecamento do leito mais acentuado do que as medidas experimentais. Nas alturas do leito de 18 e 33 cm a umidade real estava abaixo da umidade inferida. Foi concluído que o modelo de inferência tem potencial para fornecer estimativas adequadas da umidade da fase sólida, mas em trabalhos futuros seria necessário obter melhores estimativas dos parâmetros chaves, especialmente dos coeficientes de transferência de massa e calor. Abstract: Various products of commercial interest can be produced by solid-state fermentation. One of the difficulties faced in this cultivation method is the lack of simple sensors that can be used to measure the water content of the solids on-line; this is an important state variable since, if it falls to low values during the process, the growth of the microorganism and the production of metabolites will be adversely affected. The aim of the current work was to develop a deterministic mathematical model to infer the water content of the solids in a bioreactor with forced aeration and intermittent agitation. The combination of two features distinguishes this inference model from previous models: Firstly, the model describes axial gradients in water content, rather than assuming that the bed of solids is well mixed and, secondly, the model describes heat and mass transfer between the solids and gas phases within the bed, rather than assuming that these two phases are in equilibrium with one another. The input for the inference model is comprised of gas phase temperatures measured at different heights within the bed of solids. Initially the inference model was tested against a predictive model of the bioreactor: when the gas phase temperatures from this predictive model were supplied to the inference model, the inference model correctly calculated the solid phase water content. In a second step, motivated by the fact that in a real bioreactor there is a limited number of temperature sensors, the predictive model was used to generate gas phase temperature profiles for different cultivation times. Empirical equations were adjusted to these temperature profiles, with the intention of using these equations within the inference model to estimate temperatures within the bed of a pilot-scale bioreactor, at points between the temperature sensors, which are located at the bed heights of 0, 5 18, 33 and 50 cm, representing the bottom of the bed, three internal heights, and the top of the bed. However, in a test in which the predictive model was used to generate gas phase temperatures at these bed heights, the inference model estimated the solid phase water content best when temperatures in the intervening regions were obtained simply by linear interpolation. In a third step, the inference model, with linear interpolation of temperatures, was used to investigate the optimum positioning of the three internal bed sensors. It was shown that the best estimates of bed moisture content will be obtained when the internal sensors are concentrated in the bottom part of the bed. In the last part of the work, the inference model was tested in cultivations carried out in the pilot-scale bioreactor and involving the growth of Aspergillus oryzae on a mixture of wheat bran and soybeans. During these cultivations gas phase temperatures were monitored at the air inlet and outlet and at the internal bed heights of 5, 18 and 33 cm. Samples also were removed from these bed heights for the determination of the solid phase water content. At a bed height of 5 cm the model inferred a rate of drying of the solids that was higher than the experimentally measured rate. On the other hand, at the bed heights of 18 and 33 cm, the model overestimated the solids phase water content. It was concluded that the inference model has the potential to give adequate estimations of the solids phase water content, but that further work will be needed to obtain better estimates of key parameters, especially the mass and heat transfer coefficients.

Orientador : David Alexander Mitchell Co-orientadores: Guilherme L. Sassaki e Nadia Krieger Inclui bibliografia e anexos

Orientador: David Alexander Mitchell Co-orientador: Luiz Fernando Lima Luz Jr Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduaçao em Engenharia - PIPE. Defesa: Curitiba, 2007 Inclui bibliografia e anexos Área de concentraçao: Engenharia de Processos Térmicos e Químicos

Orientador: David A. Mitchell Co-orientador: Moacir Kaminski Inclui apêndices Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduaçao em Engenharia - PIPE. Defesa: Curitiba, 2006 Inclui bibliografia e anexos Área de concentraçao: Engenharia de processos térmicos e químicos

Orientador: David Alexander Mitchell Co-orientador: Luiz Fernando de L.Luz Jr Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduaçao em Engenharia - PIPE. Defesa: Curitiba, 2005 Inclui bibliografia e anexo Área de concentraçao: Engenharia de processos térmicos e químicos Resumo: A fermentação em estado sólido consiste no crescimento de um microrganismo em partículas úmidas de substrato orgânico com ausência ou quase ausência de água entre as partículas do sólido. Esta técnica de fermentação tem potencial para produzir vários produtos biotecnológicos com maiores rendimentos do que a fermentação submersa. Entretanto, ainda há problemas na aplicação desta tecnologia para a produção comercial, especialmente no que diz respeito ao controle da temperatura e da umidade no leito do substrato em biorreatores de grande escala. Modelos matemáticos dos biorreatores podem ser utilizados como ferramentas para desenvolver estratégias de operação e controle dos biorreatores. O presente trabalho mostra o aprimoramento de um modelo matemático previamente desenvolvido para descrever a operação de um biorreator em escala piloto com aeração forçada e agitação intermitente. Para a utilização deste modelo, foi necessário ajustar a isoterma e os coeficientes de transferência de calor e de massa para o sistema escolhido, que consiste no substrato soja (Glycine max) e no microrganismo Rhizopus oryzae. Além disto, o modelo previamente desenvolvido admite que a isoterma do substrato é a mesma do substrato fermentado. Em uma primeira etapa, foram realizados experimentos para determinar as isotermas da soja e da soja fermentada e foi verificado que para uma dada atividade de água, a combinação soja-microrganismo possuiu maior conteúdo de água do que soja pura. Este fato demonstrou a importância da inclusão da biomassa na equação da isoterma do substrato. Foi proposto um método de cálculo no modelo para a isoterma da soja fermentada através das isotermas da biomassa pura e da soja pura. Em uma segunda etapa, foram realizadas simulações do modelo para avaliar a influência da alteração dos coeficientes de transferência de massa e calor no comportamento do leito. Tais simulações indicaram que as diminuições destes coeficientes apresentam efeito significativo no desempenho do processo. Também foram realizados experimentos no biorreator onde as previsões do modelo foram comparadas com os perfis experimentais de resfriamento, nos quais verificou-se a necessidade de ajustes dos coeficientes de transferência de massa e calor no modelo matemático. Abstract: Solid-state fermentation involves the growth of microorganisms on moist solid organic particles in the absence or near-absence of water in the inter-particle spaces. This fermentation technique has the potential to produce various biotechnological products in yields higher than those obtained in submerged liquid fermentation. However, problems remain that hinder the use of this technology for commercial processes, the most important of these problems being the difficulty of controlling the temperature and moisture content of the substrate bed within large-scale bioreactors. Mathematical models of bioreactors can be used as tools to guide the development of strategies for the operation and control of solid-state fermentation bioreactors. The present work aimed to improve a mathematical model that had previously been developed to describe the operation of a pilot-scale bioreactor with forced aeration and intermittent agitation. In order to use this model, it was necessary to adjust the isotherm and mass and heat transfer coefficients to the system used, namely a substrate consisting of soybeans (Glycine max) and the microorganism Rhizopus oryzae. Beyond this, the isotherm used in the model assumed that the isotherm of fermented substrate was the same as that of unfermented substrate. In the first part of the work, isotherms were obtained for unfermented soybeans and fermented soybeans, and it was shown that, for a given water activity, the presence of the microorganism led to a higher water content. This result demonstrated the importance of including the biomass content of the fermenting soybeans in the equation for the isotherm. A method was proposed for calculating the isotherm of fermented soybeans on the basis of the isotherms of pure biomass and pure soybeans. In the second part of the work, simulations with the mathematical model were undertaken in order to evaluate the influence of alterations in the mass and heat transfer coefficients on the behavior of the substrate bed. These simulations indicated that heat and mass transfer coefficients lower than those previously incorporated into the model could affect process performance significantly. Finally, experiments were undertaken in which the model predictions were compared with temperature data obtained during cooling of a hot bed of cooked soybeans. These experiments indicated the need for more careful estimates of the heat and mass transfer coefficients.

Orientador : David Alexander Mitchell Co-orientadores : Emanuel Maltempi de Souza e Nadia Kriger Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2005 Inclui bibliografia As lipases, classificadas como carboxilester hidrolases (E.C. 3.1.1.3), são enzimas largamente aplicadas em biocatálise. Uma das lipases com maior aplicação é a lipase de Burkholderia cepacia. O objetivo deste trabalho foi o de desenvolver a metodologia de evolução dirigida para melhorar a estabilidade da lipase de B. cepacia em dimetil formamida 80 % (v/v) em água.O gene lip que codifica para a lípase de B. cepacia foi modificado in vivo na estirpe mutagênica E. coli XL-1 Red. Esta estirpe é um triplo mutante dos genes mutS, mutD e mutT, genes envolvidos na replicação do DNA e no reparo de erros de pareamento, e por este motivo tem a sua taxa natural de mutagênese aumentada cerca de 5000 vezes. A cada 12 h foi realizada uma subcultura com esta bactéria, totalizando 9 subculturas ou 108 h de cultivo. Os plasmídeos da última subcultura foram purificados e transformados em E. coli XL-1 Blue (Stratagene, USA). Dos transformantes obtidos 384 foram submetidos a um screening em DMF 80 %. Juntamente com a geração da biblioteca de mutantes, foi desenvolvido um método de screening utilizando o substrato fluorogênico MUF-butirato (butirato de metilumbeliferila). O ensaio baseou-se na relação do aumento da fluorescência gerado pela reação, com a intensidade luminosa detectada nas imagens. Os ensaios foram executados em placas de 96 poços irradiando-se as placas com luz UV, a 365 nm, anteriormente à captura das imagens. Para capturar as imagens utilizou-se uma câmera CCD (charge-coupled device) com um tempo de exposição de 6,9 segundos. A quantificação de luminosidade foi determinada utilizando o software LabWorks4®. As principais vantagens apresentadas por este ensaio foram a rapidez e sua sensibilidade, em relação ao método de hidrólise do pNPP (palmitato de p-itrofenila). Da triagem inicial de 386 transformantes, não foi possível selecionar mutantes com maior estabilidade ao DMF com a população de transformantes avaliada. A análise de sequenciamento de DNA do operon liphp mostrou que a lipase selvagem utilizada neste trabalho é 100 % similar a lipase previamente seqüenciada (KORDEL et al, 1991). Somente para a proteína auxiliadora ou foldase é que foram encontradas alterações em duas posições, arginina13 e glutamina301. A mesma seqüência, quando submetida ao alinhamento frente seis outras proteínas foldases de espécies do gênero Burkholderia, apresentou homologia quanto a estes dois aminoácidos, sugerindo que a seqüência deste trabalho difere da seqüência previamente depositada no GENBANK (QUYEN; SCHMIDT-DANNERT; SCHMID, 1999). Resumo: As lipases, classificadas como carboxilester hidrolases (E.C. 3.1.1.3), são enzimas largamente aplicadas em biocatálise. Uma das lipases com maior aplicação é a lipase de Burkholderia cepacia. O objetivo deste trabalho foi o de desenvolver a metodologia de evolução dirigida para melhorar a estabilidade da lipase de B. cepacia em dimetil formamida 80 % (v/v) em água.O gene lip que codifica para a lípase de B. cepacia foi modificado in vivo na estirpe mutagênica E. coli XL-1 Red. Esta estirpe é um triplo mutante dos genes mutS, mutD e mutT, genes envolvidos na replicação do DNA e no reparo de erros de pareamento, e por este motivo tem a sua taxa natural de mutagênese aumentada cerca de 5000 vezes. A cada 12 h foi realizada uma subcultura com esta bactéria, totalizando 9 subculturas ou 108 h de cultivo. Os plasmídeos da última subcultura foram purificados e transformados em E. coli XL-1 Blue (Stratagene, USA). Dos transformantes obtidos 384 foram submetidos a um screening em DMF 80 %. Juntamente com a geração da biblioteca de mutantes, foi desenvolvido um método de screening utilizando o substrato fluorogênico MUF-butirato (butirato de metilumbeliferila). O ensaio baseou-se na relação do aumento da fluorescência gerado pela reação, com a intensidade luminosa detectada nas imagens. Os ensaios foram executados em placas de 96 poços irradiando-se as placas com luz UV, a 365 nm, anteriormente à captura das imagens. Para capturar as imagens utilizou-se uma câmera CCD (charge-coupled device) com um tempo de exposição de 6,9 segundos. A quantificação de luminosidade foi determinada utilizando o software LabWorks4®. As principais vantagens apresentadas por este ensaio foram a rapidez e sua sensibilidade, em relação ao método de hidrólise do pNPP (palmitato de p-nitrofenila). Da triagem inicial de 386 transformantes, não foi possível selecionar mutantes com maior estabilidade ao DMF com a população de transformantes avaliada. A análise de sequenciamento de DNA do operon liphp mostrou que a lipase selvagem utilizada neste trabalho é 100 % similar a lipase previamente seqüenciada (KORDEL et al, 1991). Somente para a proteína auxiliadora ou foldase é que foram encontradas alterações em duas posições, arginina13 e glutamina301. A mesma seqüência, quando submetida ao alinhamento frente seis outras proteínas foldases de espécies do gênero Burkholderia, apresentou homologia quanto a estes dois aminoácidos, sugerindo que a seqüência deste trabalho difere da seqüência previamente depositada no GENBANK (QUYEN; SCHMIDT-DANNERT; SCHMID, 1999).

O objetivo principal do trabalho foi otimizar a produção de esporos de Clonostachys rosea para uso no controle biológico do fungo Botrytis cinerea, causador do mofo cinzento no morangueiro, baseando-se na utilização de grãos através de técnicas de fermentação em estado sólido (FES). Optou-se pela FES pois este processo fornece vantagens como baixo custo, praticidade e fácil execução, sendo a tecnologia ideal para ser transferida diretamente ao produtor rural, que poderá produzir seu biofungicida de uma maneira simples e de baixo custo. Inicialmente foi feita a padronização das condições para a produção de esporos e os protocolos para avaliá-la, onde optou-se por: cultivar o fungo em 24 h luz e 24 ºC por ser a condição onde apresentou desenvolvimento e esporulação mais rápidos; preparar inóculo a partir de placas incubadas a 8 dias que apresentaram elevada produção de esporos; fazer a agitação por 30 minutos da amostra em solução de água e Tween para assegurar a liberação máxima de esporos e misturar bem o substrato colonizado antes de retirar a amostra para avaliar a produção. Foi feita também a caracterização da cinética de produção de esporos e a equação logística foi a que melhor descreveu os perfis de produção. Através da avaliação de perfis feitos com diferentes substratos, o arroz branco tipo agulhinha foi selecionado para o cultivo do fungo. A seguir, foram feitos estudos de otimização das condições de cultivo através da seleção de condições ideais, sendo que as mais promissoras, foram: adição de 7,5 mL para cada 10 g de substrato antes da autoclavagem; uso de tampão de algodão e gaze para fechar os erlenmeyers;concentração inicial de inóculo de 2 x 10 elevado a 5 esporos g-¹ substrato seco e agitação manual a cada 15 dias ou sem agitação. Com essas condições foram obtidos rendimentos de 3,36 x 10 elevado a 9 esporos g-¹ de arroz em 60 dias, valor igual aos melhores relatados na literatura. Além disso, o fungo apresentou variações na coloração em diferentes condições de temperatura e fotoperíodo e o estudo preliminar para caracterizar o pigmento produzido na condição de 12 h de luz e 20 ºC, indicou que ele é um triacilglicerídeo composto por 10 diferentes ácidos graxos. É importante dar continuidade a este estudo, tentando elucidar a estrutura destes compostos, para, no futuro, pesquisar sua função e, quem sabe, encontrar alguma aplicação biotecnológica

Apêndice Orientador: Prof. Dr. David Alexander Mitchell Coorientador: Prof. Dr. Guilherme Lanzi Sassaki Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Curso de Pós-Graduação em Ciências: Bioquímica Inclui referências: p. 98-101 Resumo: O corpo de frutificação do basidiomiceto Ganoderma lucidum é utilizado no Oriente há mais de 2000 anos para o tratamento de diversas doenças. Há atualmente um grande interesse no desenvolvimento do cultivo submerso para a produção de micélio e produtos bioativos como polissacarídeos e teipenóides. Este trabalho aborda aspectos morfológicos e fisiológicos do fungo em culturas líquidas preparadas para serem usadas como inóculo e nas culturas principais do processo. Nas culturas do inóculo não ocorre consumo de glucose nas primeiras fases do crescimento na forma de pellets, entretanto este crescimento é bastante alto, pois o fungo utiliza outras fontes de carbono presentes no meio para formar biomassa. O consumo de glucose só ocorre após a desagregação dos pellets. O início do consumo da glucose e a desagregação dos pelleís coincidem com o aumento da produção de exopolissacarídeos. Neste trabalho, sugere-se que as alterações morfológicas são decorrentes de alterações fisiológicas no consumo de substratos e produção de exopolissacarídeos. Durante o cultivo principal, um perfil morfológico e fisiológico semelhante ao do cultivo do inóculo é observado, entretanto os fenômenos não são tão claros devido à sobreposição de diferentes fases de desenvolvimento da biomassa inoculada. Os exopolissacarídeos produzidos tanto nas culturas do inóculo como no cultivo principal foram analisados de forma preliminar e os resultados sugerem a presença de (beta)-glucanas. Neste trabalho, avaliouse também o efeito da concentração do inóculo e da alimentação de quantidades extra de glucose durante o cultivo principal. A produção de exopolissacarídeos atingiu valores de 5,7 ± 0,4 g/L após a alimentação extra de glucose. Este valor é 3,3 maior que a máxima concentração de exopolissacarídeos reportada na literatura para esta espécie. O melhor entendimento sobre a influência de fatores morfológicos e fisiológicos na produção de polissacarídeos poderá ser uma ferramenta útil para o desenvolvimento de processos em larga escala.