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À escala global, a conjugação das atividades humanas com o rápido incremento da população e os sucessivos avanços tecnológicos exercem uma crescente pressão sobre os ambientes marinhos. Atualmente, o lixo marinho é uma das maiores ameaças à vitalidade do Oceano Global: leva à destruição de habitats, à mortalidade de várias espécies, a efeitos adversos na nossa saúde e à quebra geral da produtividade económica providenciada pelo mar. Foi tendo em conta a magnitude e as consequências da disseminação do lixo marinho e a exposição que a região do Algarve tem ao problema, que o Centro Ciência Viva de Tavira assumiu a coordenação do Projeto A Minha Praia, entre Agosto de 2018 e Julho de 2019: um projeto de monitorização ambiental e de sensibilização para a conservação do meio marinho e promoção de hábitos de consumo sustentáveis, através de ações de civismo ambiental e de ciência cidadã. O Projeto A Minha Praia foi um dos vencedores da primeira edição do Orçamento Participativo Portugal (OPP) em 2017, e a sua execução foi garantida pela colaboração entre os três Centros Ciência Viva (CCVs) da região, com o envolvimento de várias entidades regionais e nacionais. Com este projeto, criou-se uma rede de monitorização do lixo marinho em seis praias do Algarve, na qual o público escolar e as camadas mais jovens da região realizaram ações periódicas de sensibilização para a problemática do lixo marinho, sua origem e alcance, bem como a sua catalogação e recolha. O lixo recolhido foi triado e classificado de acordo com a metodologia OSPAR, produzindo informação que foi entregue à Agência Portuguesa do Ambiente, a entidade responsável pela monitorização do lixo marinho em Portugal. O Projeto A Minha Praia também apresenta uma vertente técnica, já que nos CCVs aproveitamos para demonstrar que o plástico, que é o maior componente do lixo encontrado no mar e zonas costeiras, deve ser encarado como um matéria-prima a ser aproveitada, reciclada e transformada em novos objetos de carácter prático ou artístico que prolongam a vida útil deste material., Concretização deste poster no âmbito do projecto OPP-A Minha Praia (OPP220/437), financiado pela Ciência Viva - Agência Nacional para a Cultura Científica e Tecnológica e pela FCT - Fundação para a Ciência e Tecnologia

Um ano de escola n’A Minha Praia – sensibilização para a problemática do lixo marinho utilizando a ciência-cidadã como ferramenta O Algarve reúne um conjunto de características que o tornam particularmente vulnerável à presença de lixo marinho e aos seus efeitos nefastos: uma orla costeira longa (aprox. 200km), um destino turístico muito popular, uma população residente concentrada no litoral e uma fração significativa da sociedade cuja subsistência depende de atividades económicas ligadas ao mar (pesca, marisqueio, extração de sal, passeios turísticos, etc.). Foi tendo em conta a magnitude e as consequências da propagação do lixo marinho na região que o Centro Ciência Viva de Tavira coordenou o projeto A Minha Praia, um dos vencedores da primeira edição do Orçamento Participativo Portugal (OPP) em 2017, e cuja execução foi garantida pela colaboração entre os três Centros Ciência Viva (CCVs) no Algarve, com o envolvimento de várias entidades regionais e nacionais. Este projeto permitiu que cerca de 933 alunos provenientes de 17 escolas fossem sensibilizados para a conservação do meio marinho, para hábitos de consumo sustentáveis e para o civismo ambiental, em simultâneo com ações de ciência-cidadã, nas quais periodicamente monitorizavam a presença de lixo marinho em seis praias da costa sul do Algarve. Ainda dentro da função didática do projeto, demonstramos a valorização do plástico (que é o maior componente do lixo marinho), aproveitando-o, reciclando-o e transformando-o em novos objetos que prolongam a sua utilidade., Esta apresentação foi dinamizada no âmbito do projecto OPP-A Minha (OPP220/437), financiado pela Ciência Viva - Agência Nacional para a Cultura Científica e Tecnológica e pela FCT - Fundação para a Ciência e Tecnologia.

Apresentação oral no 17º Congresso Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, Coimbra, 2018 Introdução: Nos últimos anos, tem-se verificado um aumento do consumo ilícito de cocaína, de opiáceos e de novas substâncias psicoativas (NSP), quer de forma isolada quer em simultâneo. Esta última situação, ou seja, a presença de mais do que um grupo de drogas de abuso (DA) numa amostra, traduz-se, em termos analíticos, no desafio de se desenvolver metodologias capazes de analisar em simultâneo várias classes de compostos alvo – os chamados métodos multi-drug (multi-analitos). Estes métodos procuram otimizar o circuito laboratorial e, consequentemente, reduzir os tempos de resposta e respetivos custos associados. Por continuar a ser a técnica mais comum nos laboratórios de toxicologia forense, o desenvolvimento de métodos que incluem a GC-MS continua a ser uma realidade. Tal fica a dever-se quer à robustez e facilidade de utilização desta tecnologia, quer à sua capacidade para cumprir os requisitos atualmente exigidos em termos de análise de DA. Neste trabalho, pretendeu-se desenvolver e validar um método analítico multi-drug, utilizando a extração em fase sólida (SPE) e GC-MS, para detetar e quantificar 23 DA pertencentes aos grupos da cocaína, dos opiáceos e das NSP, em amostras de sangue total ante e/ou post mortem. Material e Métodos: A metodologia analítica incluiu um procedimento de SPE com recurso a colunas OASIS MCX®, seguida de derivatização por sililação e posterior determinação analítica através de um cromatógrafo Agilent 6890N acoplado a um espectrómetro de massa com um detetor de massas do tipo quadrupólo simples Agilent 5973N. Resultados e Discussão: Para as 23 DA, foram selecionados 3 iões de diagnóstico, entre eles um ião de quantificação, e para os respetivos padrões internos selecionou-se um único ião. Na validação do método, seguiram-se as normas internacionalmente aceites em toxicologia forense, tendo sido avaliados diversos parâmetros. O procedimento revelou-se específico/seletivo para todos os analitos. Devido às distintas concentrações terapêuticas, tóxicas e letais das DA selecionadas, as mesmas foram distribuídas por 3 painéis, a que corresponderam 3 gamas de trabalho (painel 1: 50-4000 ng/mL, painel 2: 5-100 ng/mL e painel 3: 25-1000 ng/mL), de acordo com o intervalo mais adequado. Comprovou-se a linearidade das gamas de trabalho para todas as DA, exceto para a pseudoefedrina, a efedrina, a norefedrina e o TFMPP. Para os restantes 19 analitos, verificou-se a heterocedasticidade dos dados, tendo sido estudados 6 modelos de regressão linear ponderada. O fator de ponderação escolhido para cada DA foi o que apresentou melhor classificação no ranking final aferido com base no valor médio de r2, no somatório de erros relativos, no limite de repetibilidade e na incerteza expandida, escolhendo-se para a maioria das DA os fatores 1/y1/2 e 1/x2. Relativamente aos limites analíticos, estabeleceram-se limites de deteção (LD) de 25, 2 e 10 ng/mL para os painéis 1, 2 e 3 respetivamente. Para a pseudoefedrina e a efedrina LD=25 ng/mL, e para a norefedrina e o TFMPP LD=50 ng/mL. O método funciona apenas para rastreio destas DA, pois não foi possível determinar o seu limite inferior de quantificação (LIQ), bem como estabelecer uma gama de trabalho adequada. O LIQ das 19 DA quantificáveis corresponde ao nível mais baixo de cada gama de trabalho. Não se observaram fenómenos de arrastamento e o rendimento de extração das DA variou entre 62,07% e 97,14%. Os limites de repetibilidade e os valores de incerteza expandida combinada apresentaram resultados compatíveis com a utilização em rotina para o tipo de amostras em causa. O cumprimento dos critérios de aceitação aplicados à validação demonstra a adequabilidade do método proposto para a análise simultânea de DA em amostras biológicas e em contexto forense, viabilizando a sua aplicação à rotina laboratorial. info:eu-repo/semantics/publishedVersion

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz Dentes imaturos necrosados, com ou sem lesão periapical, representam um grande desafio para o tratamento endodôntico convencional. A instrumentação mecânica do canal é, na maior parte dos casos, contra-indicada, já que pode debilitar ainda mais as paredes radiculares finas e frágeis. Conseguir uma obturação adequada revela-se também altamente complexo, dada a ausência de um ápex formado que permita a compactação do material obturador, dificultando assim o selamento apical. Convencionalmente, a apexificação tem sido a técnica de eleição para abordar estes dentes permanentes jovens que perderam a sua vitalidade. Seja através da aplicação de hidróxido de cálcio (HC) ou, mais tarde, recorrendo ao agregado de trióxido mineral (MTA), a verdade é que nenhuma das opções permite fortalecer esses dentes, melhorando o seu prognóstico. Apesar de criar condições para a obturação do canal, as raízes permanecem finas e curtas, e o dente susceptível à fractura como resultado de uma relação corono-radicular desfavorável. A revascularização pulpar, técnica incluída no contexto da endodontia regenerativa, pode contribuir para a melhoria do prognóstico destes dentes altamente comprometidos, baseando-se no conceito de que células estaminais multipotentes da região apical podem restabelecer-lhes a capacidade de se desenvolver fisiologicamente. Durante as últimas duas décadas, um sem número de casos têm sido reportados indicando a eficaz promoção do desenvolvimento radicular, tanto no que diz respeito à espessura das suas paredes, como ao seu comprimento, com o respectivo encerramento apical. A compreensão das bases biológicas por trás destes fenómenos regenerativos é um passo fulcral no sentido de permitir uma mudança de paradigma em relação à abordagem de dentes imaturos necrosados.

Mestrado em Engenharia Electrónica e Telecomunicações As redes de acesso têm vindo a ser alvo de profundas alterações decorrente, principalmente, da utilização de fibra ótica e das tecnologias celular 4G. A motivação para estas alterações tem a ver com o aumento do consumo de largura de banda provocado pela utilização cada vez mais generalizadas de serviços de serviços como internet e aplicações de vídeo. A introdução de novos dispositivos M2M para vigilância, contagem remota de eletricidade, água e gás, etc. irá acentuar esta tendência. Tendo em vista aquilo que poderá ser a evolução do mercado M2M residencial, esta dissertação teve por objetivo avaliar alguns dos impactos que este novo tipo de comunicações poderá ter nas redes de acesso. Foram construídos alguns cenários evolutivos do mercado alvo: (i) do it yourself, (ii) globalmente centralizado, e (iii) hibrido, onde se procura perceber os fatores que influenciam os custos associados as infraestruturas de comunicação (Rede de acesso), bem como o seu dimensionamento. Os investimentos necessários para a introdução de equipamentos dedicados ao M2M são de grande dimensão e para lidar com a incerteza associada a todos estes fatores torna-se imperioso recorrer a ferramentas adequadas de análise tecno-económica e avaliação das soluções de engenharia associadas a cada um dos cenários a considerar. The access networks had been targeted with several changes due, mainly, to the use of optical fiber, and wireless technologies 4G. The motivation behind these changes has been the bandwidth consumption growth caused by the generalized use of services like internet and video applications. The introduction of M2M devices to vigilance, smart metering, etc. will accentuate this trend. Watching what the M2M Residential market evolution could be, this dissertation, aim to evaluate the impact that this new type of communications, can have in the access network. It were build some market scenarios of the evolution of the target market, (i) do it yourself, (ii)globally centralized, and (iii) hybrid scenario, where one looked to realize the factors that influences the costs associated with the network, as well as its sizing. The investments needed for the introduction of M2M dedicated equipment are big, and to deal with the uncertainty of all estimated evolutionary factors, it’s really important to use the right technical-economic tools to evaluate the engineering solutions of a project of this nature.

Numa escola que se encontra em transformação no sentido de se adaptar aos contextos sociais, culturais e políticos que a rodeiam, cabe aos professores serem agentes ativos na definição do caminho a percorrer, visando o aumento da qualidade educativa a proporcionar aos nossos jovens. O questionamento inerente à reflexão sobre o percurso profissional levou à identificação da situação problema e à formulação daquela que é a questão de partida deste trabalho: Como é que a Supervisão Pedagógica (e o trabalho colaborativo a ela associado) poderá contribuir para a melhoria da reflexão conjunta entre os professores do Grupo Disciplinar de Física e Química, promovendo o seu desenvolvimento Profissional? Para dar resposta a esta questão, elaborámos o enquadramento teórico, orientado pelas palavras-chave e com recurso a autores de referência, no qual pretendemos salientar as principais investigações que conferem suporte às temáticas subjacentes a este trabalho: a reflexão interpares na promoção do desenvolvimento profissional dos professores, a Supervisão pedagógica e a importância da formação docente e do trabalho colaborativo na qualidade educativa. Como o objetivo geral do trabalho de projeto é conceber um Projeto de Intervenção de Supervisão Pedagógica no Grupo Disciplinar de Física e Química, visando a melhoria do trabalho colaborativo, a promoção das atitudes reflexivas e investigativas dos docentes e o seu desenvolvimento profissional, a terceira parte foi estruturada com base nos princípios subjacentes à metodologia de projeto. Recolhemos opiniões através de Inquéritos por Questionário, realizados a todos os professores do grupo, e através de Entrevistas, realizadas apenas às professoras Coordenadora e Subcoordenadora do Departamento de Matemática e das Ciências Experimentais, da Escola Secundária Rosa. O Projeto de Intervenção de Supervisão Pedagógica deverá ser implementado e desenvolvido no Grupo Disciplinar de Física e Química da escola referida e com ele pretendemos aprofundar as práticas supervisivas e colaborativas entre os docentes, através da realização de Ciclos completos de Supervisão Pedagógica, de acordo com as fases preconizadas por Goldhammer., In a school that is changing in order to respond to the various social, cultural and political backgrounds that surround it, teachers are expected to be active agents in the definition of what route to take, aiming at increasing quality of the education provided to our young people. Questioning associated with the reflection on the professional career led to the identification of the problem situation and the formulation of that which is the research question of this work: How can Pedagogical Supervision (and the collaborative work associated with it) contribute to the improvement of joint reflection among teachers of the Physics and Chemistry Group, thereby promoting their professional development? To address this issue, we have prepared the theoretical framework, guided by keywords and using reference authors. In this theoretical framework we intend to highlight the main investigations that give support to the themes underlying this work: peer reflection in promoting professional development among teachers, pedagogical Supervision and the importance of teacher training and collaborative work in the quality of education. As the general aim of this project is to design a Supervision Project within the Group of Teachers of Physics and Chemistry and by doing this to improve the quality of collaborative work, to promote both investigative and reflective attitudes among teachers and their professional development, the third section of this work has been based on the principles underlying the project methodology. We have collected opinions by applying questionnaire surveys to all the teachers in the group, and also through interviews conducted with the Coordinator and the Delegate Coordinator of the Department of Mathematics and Experimental Sciences at the Escola Secundária Rosa. This Pedagogical Supervision Intervention Project is to be carried out and developed among the Physics and Chemistry Group of Teachers at Escola Secundária Rosa, our aim consisting in promoting deeper collaborative and supervisory practices among the teachers, by performing full Cycles of Supervision and by following the steps suggested by Goldhammer., Orientação : Nilza Henriques dos Santos

Dissertação de Mestrado em Engenharia Mecânica na especialidade de Engenharia e Gestão Industrial, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. O presente trabalho foi desenvolvido na SramPort, empresa que se dedica ao fabrico e montagem de alguns componentes para bicicletas, e surgiu como uma forma de reduzir tempos de mudança de fabrico em linhas de montagem de correntes, por forma a libertar recursos para outras intervenções, igualmente importantes. Para essa redução, tevese como referência os vários princípios de Lean Manufacturing estudados, em especial ametodologia SMED (Single Minute ExChange of Die). No decorrer da realização deste trabalho, foram então analisadas quatro linhas de montagem de correntes de bicicleta, sendo seleccionado o grupo de mudança mais complicado dessas linhas. Nesse grupo eram feitas todas as tarefas que poderiam também ocorrer nos outros grupos, e desse modo, estudando-o, foi possível preparar guias de procedimento e sugerir melhorias para todos eles. Como resultados, para esse grupo mais complicado obteve-se uma redução de 47% no tempo total de paragem de produção (observada no último ensaio efectuado), e propôs-se uma redução de cerca de 60%, atendendo aos melhores tempos observados nos três ensaios de SMED efectuados. Para outras linhas de montagem, houve inclusive grupos de mudança para os quais o tempo ideal, e portanto proposto, originaria uma redução de 70% do tempo de paragem de produção. Para todas elas, as melhorias implementadas resultaram em investimentos nulos, mas foram também propostas melhorias com investimento, estas não implementadas, mas apresentadas nesta dissertação. Adicionalmente, foi ainda iniciado um trabalho de SMED numa prensa que produz placas interiores, sendo proposta uma sequência mais organizada de trabalho. Ficou no geral ainda muito para fazer, mas os objectivos gerais foram cumpridos, e agora cabe à empresa garantir o contínuo seguimento das melhorias propostas. Abstract This work was developed in SramPort, a company engaged in the manufacture and assembly of some components for bicycles, and emerged as a way of reducing changeover times in assembly lines of chains, in order to release resources for other interventions, equally important. To achieve this reduction the reference were the various principles of Lean Manufacturing, in particular the methodology SMED (Single Minute ExChange of Die). Throughout this work, four assembly lines of bicycle chains were then analyzed, being selected the most complicated changeover group of those lines. In this group were made all the tasks that could also occur in the other groups, and thus studying it, was possible to prepare procedure guides and suggest improvements to all of them. As a result, for this most complicated group a 47% reduction was obtained in the total time of production stop (seen in the last test performed), and a reduction of about 60% was proposed, given the best observed time in all the three SMED tests carried out. For the other assembly lines, there was even changeover groups whose ideal time, and therefore proposed, rose to a 70% reduction of the time of production stop. In all cases, the improvements implemented resulted in zero investment. However also were proposed although not implemented improvements that needed investment. Additionally, a SMED work was also initiated on a press that produces inner plates, being proposed a more organized sequence of work. Generally, there is still much more to be done, but the overall objectives have been accomplished, and now it is for the company to ensure the continuous monitoring of the proposed improvements. Colaboração Institucional: SramPort - Transmissões Mecânicas, Lda.

Submitted by Helena Fortuna (hfortuna@ubi.pt) on 2013-01-18T09:54:14Z No. of bitstreams: 1 tese Miocardites Pedro Domingues.pdf: 571202 bytes, checksum: 80236c9f52bc050c1a34ecfe7977df6e (MD5) Made available in DSpace on 2013-01-18T09:54:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese Miocardites Pedro Domingues.pdf: 571202 bytes, checksum: 80236c9f52bc050c1a34ecfe7977df6e (MD5) Previous issue date: 2011-06

Concepts like interfaces, synergies, fuzzy logic, organisational synapses and networking rule our days. These concepts orbit around the term “interactions”. Literally, interactions are everything. For instance, graphite and diamond are just carbon atoms “interacting” differently. Currently, customers demand a broader vision from organizations. In order to fulfil this demand organizations implemented and certified their management systems focusing different stakeholders’ requirements and according to several organisational standards, being the most reported ones ISO 9001, ISO 14001 and OHSAS 18001. Despite of the difficulties to achieve a consensual definition, if we consider concepts like quality tools, “Quality” is mainly an “action” concept. Thus, the main challenge faced by quality management systems (QMS) in an integrated environment would be philosophical: to leave the spotlights of an “action” based approach and to embrace the subtleness of the “interaction” approach. It is common sense that the system defining, promoting and stimulating interactions should not be involved in the action itself. Implications of this new role to play by quality management system are huge. Traditional organisational structures place quality transversally to production processes. It is expected that quality management system adopts a more vertical organisational orientation in order to accomplish new objectives posed by management systems integration. Human behaviour towards item production or service performance should change according new organisational placement by QMS. Each worker despite their organisational function should have a priori and a posteriori quality requirements knowledge, being critical a precise boundaries definition among elements constituting the responsibility chain. Auditing procedures should be adjusted too. Potential synergies between processes, internal and external communication flow, objectives redefinition, policies adjustment and a new vision horizon are among some check-points to be assessed by the audit team. It should be assure that top management commitment is not with a system but with an organisational philosophy. Processes indicators should be available at all time and by several persons. This requirement is not far fetch in our days due to the currently available networks and information systems. Non conformity detection, treatment and correction, under an integrated approach, should not be a middle management meeting of the affected process. In this case, quality procedures should assure that Environmental and Occupational Health and Safety representatives are involved and empowered to discuss decisions to be made. In this article we analyze the reposition of the quality management system after an integration process pointing out the practical implications of this newly perspective. It is intended to be an initial contribution to a newly task already achieved by other systems and sciences: the assessment of “interactions” in management systems.

A irregularidade longitudinal, caracterizada habitualmente pelo Índice Internacional de Irregularidade (IRI – International Roughness Index), é um dos parâmetros de estado dos pavimentos rodoviários cuja variabilidade pode ter consequências relevantes nas estratégias de reabilitação e, consequentemente, nos custos e na sua vida de serviço. Por esta razão, este artigo tem por principal objectivo proporcionar às entidades referidas informação útil no que respeita à variabilidade do IRI, calculado a partir de dados obtidos por vários perfilómetros. Assim, foram seleccionados cinco veículos do tipo”multifunções”, que pertencem quer a empresas de consultadoria quer a instituições de investigação, e três trechos de estrada com camadas de desgaste em betão betuminoso drenante, betão betuminosos rugoso e betão betuminoso “convencional”. Cada veículo percorreu cinco vezes cada trecho nos dois sentidos de tráfego. O espaçamento adoptado para o cálculo do IRI foi de 100 m. A média e o desvio padrão foram os parâmetros usados para estudar a variabilidade dos resultados. De uma forma geral verificou-se que o valor do desvio padrão do IRI é 20 a 30% do valor da média.

O Canabidiol (CBD) e o Δ9-tetrahidrocanabinol (Δ9-THC) são duas moléculas lipofílicas da classe dos fitocanabinóides presentes na planta Cannabis sativa. Alegadamente, o CBD é a molécula da planta com mais propriedades terapêuticas, um tema atual e de grande controvérsia, não sendo, no entanto, uma substância ilícita com efeitos psicoativos. Por outro lado, o Δ9-THC, apesar de também apresentar potencial terapêutico, provoca efeitos psicoativos. Recentemente, em Portugal e noutros países, ficaram disponíveis no mercado produtos e medicamentos à base de CBD e/ou de Δ9-THC. Desta forma, são necessários estudos que explorem certos fatores, parâmetros e substâncias que possam interagir com ambas as moléculas ou influenciar as concentrações destas. Neste trabalho, após uma revisão bibliográfica relevante para a temática, foram analisadas descritivamente e estatisticamente amostras com concentrações de CBD, de Δ9-THC e dos seus dois principais metabolitos, o 11-hidroxi-Δ9- tetrahidrocanabinol (11-OH-THC) e o 11-nor-9-carboxi-Δ9-tetrahidrocanabinol (THC-COOH). Na estatística foram explorados alguns parâmetros como a idade, a presença ou ausência de substâncias medicamentosas e acidentes de viação fatais e não fatais. Paralelamente, verificaram-se possíveis correlações entre os canabinóides presentes nas amostras post mortem, de clínica forense e da fiscalização pela autoridade de segurança rodoviária. Na análise descritiva, as amostras de canabinóides foram divididas em três grupos dependendo da sua natureza, nomeadamente amostras post mortem, amostras de clínica forense e amostras de fiscalização rodoviária. Estas amostras foram interpretadas num contexto forense e, em algumas situações, foram formuladas possíveis interações entre os canabinóides e outras substâncias presentes nas amostras. Estatisticamente, não houve diferenças significativas entre a idade dos consumidores e a concentração de canabinóides no sangue de amostras post mortem. Contudo, o Δ9-THC apresentou diferenças significativas entre a presença e a ausência de substâncias medicamentosas e também entre os grupos de casos em que os acidentes de viação foram fatais e não fatais. Além disso, nas amostras post mortem, apenas estiveram correlacionados os canabinóides Δ9-THC e 11- OH-THC e 11-OH-THC e THC-COOH, nas amostras relativas à clínica forense os canabinóides CBD e 11-OH-THC e CBD e THC-COOH e, finalmente, nas amostras de autoridade de segurança rodoviária apenas os canabinóides Δ9-THC e THC-COOH. Em relação à análise descritiva, foram desenvolvidas várias hipóteses, nomeadamente a possível inibição das enzimas do Citocromo P450 quando o CBD e o Δ9-THC são consumidos simultaneamente com o midazolam, o diazepam e a fluvoxamina, o consumo de canábis agravar a progressão de doenças como a Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (SIDA) e a tuberculose e o consumo isolado de canábis rico em Δ9-THC, o consumo simultâneo de canábis e de álcool e o consumo também simultâneo de canábis, álcool e cocaína instigar acidentes de viação. Também foram colocadas as hipóteses da improbabilidade do consumo de 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA) inibir o metabolismo de canabinóides e vice-versa, o consumo de canábis rico em Δ9- THC por uma criança de 1 ano ser acidental e por fim, que o consumo de canábis rico em CBD também por parte de uma criança de 2 anos ser contínuo e com propósitos meramente terapêuticos. Concluindo, este estudo permitiu gerar hipóteses a ser testadas em estudos no futuro, uma vez que no nosso estudo o tamanho total das amostras é baixo e não significativo. Cannabidiol (CBD) and Δ9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC) are two lipophilic molecules of the phytocannabinoid class present in the Cannabis sativa plant. Allegedly, CBD is the plant molecule with the most therapeutic properties, a current and highly controversial topic, however, it is not an illicit substance with psychoactive effects. On the other hand, Δ9-THC, despite also having therapeutic potential, causes psychoactive effects. Recently, in Portugal and in other countries, CBD and / or Δ9-THC products and medicines became available on the market. Thus, studies are needed to explore certain factors, parameters and substances that can interact with both molecules or influence their concentrations. In this work, after a literature review relevant to the topic, samples with concentrations of CBD, Δ9-THC and its two main metabolites, 11-hydroxy-Δ9-tetrahydrocannabinol (11- OH-THC) and 11-nor-9-carboxy-Δ9-tetrahydrocannabinol (THC-COOH) were descriptively and statistically analyzed. In the statistics, some parameters were explored, such as age, the presence or absence of medicated substances and fatal and non-fatal road accidents. In parallel, there were verify possible correlations between the cannabinoids present in the post mortem samples, from the forensic clinic and from the fiscalization by the road safety authority. In the descriptive analysis, the cannabinoid samples were divided into three groups depending on their nature, namely post mortem samples, samples from forensic clinic and samples from road enforcement. These samples were evaluated in a forensic context and, in some situations, possible interactions between cannabinoids and other substances present in the samples were formulated. Statistically, there were no significant differences between the age of consumers and the concentration of cannabinoids in the blood of post mortem samples. However, Δ9-THC showed significant differences between the presence and absence of medicinal substances and also between groups of cases in which road accidents were fatal and non-fatal. In addition, in the post mortem samples, only the cannabinoids Δ9-THC and 11- OH-THC and 11-OH-THC and THC-COOH were correlated, in the samples related to the forensic clinic the cannabinoids CBD and 11-OH-THC and CBD and THC-COOH and, finally, in the road safety authority samples only cannabinoids Δ9-THC and THC-COOH. Regarding the descriptive analysis, several hypotheses have been developed, namely the possible inhibition of Cytochrome P450 enzymes when CBD and Δ9-THC are consumed simultaneously with midazolam, diazepam and fluvoxamine, the consumption of cannabis aggravate the progression of diseases as the Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) and tuberculosis and the isolated consumption of cannabis rich in Δ9-THC, the simultaneous consumption of cannabis and alcohol and the simultaneous consumption of cannabis, alcohol and cocaine to instigate road accidents. The hypothesis of the improbability of the consumption of 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA) to inhibit the metabolism of cannabinoids and vice versa, the consumption of cannabis rich in Δ9-THC by a 1 year old child was accidental and, finally, that the consumption of cannabis rich in CBD by a 2 year old child is continuous and for purely therapeutic purposes. In conclusion, this study allowed us to generate hypotheses to be tested in future studies, since in our study the total sample size is low and not significant. Mestrado em Bioquímica

A diarreia pós-desmame (DPD) nos leitões é uma doença multifatorial, caracterizada por alterações entéricas propícias à infeção intestinal por Escherichia coli enterotoxicogénica e pela elevada mortalidade destes animais após o seu desmame, representando perdas económicas elevadas para a indústria suína. Apesar do tratamento farmacológico com antibióticos ser eficaz no controlo de DPD, a sua utilização é limitada devido ao desenvolvimento de bactérias multi-resistentes a vários antibióticos e o perigo, subjacente, para a saúde pública. Desta forma, é imperativo o desenvolvimento de estratégias não farmacológicas para o controlo de DPD. Esta dissertação foca-se primeiro no desenvolvimento de um produto líquido único e completo, que promova o controlo desta doença, sem recorrer a antibióticos. O produto Swine Sweet Health apresenta na sua constituição diversos compostos ativos interessantes, como glucose, sais, mistura de ácidos orgânicos, cinamaldeído e ácido láurico, com potencial para atuar nas várias vertentes do problema, como o tratamento da desidratação e infeção bacteriológica intestinal nestes animais. Para além disso, contém palatabilizantes, na tentativa de incremento das ingestões e minimização da mortalidade. Após o desenvolvimento de três formulações do produto no laboratório da D.I.N., diferenciadas pela presença de cinamaldeído, ácido láurico ou ambos estes compostos, realizaram-se estudos de aceitabilidade do produto nos animais, nas explorações da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, e estudos de estabilidade de um mês, segundo a legislação nacional e europeia. Estes estudos demonstraram uma ausência de rejeição destas formulações do produto in vivo e a garantia de estabilidade físico-química e microbiológica destes ao fim de um mês, mesmo quando sujeitos a temperaturas elevadas, até 41,5 ºC. Assim que ficar demonstrada a sua estabilidade, a longo prazo, e o seu potencial in vivo, este produto final poderá ser comercializado e terá um elevado impacto no mercado, inserindo-se num segmento de mercado não explorado em Portugal para produtos líquidos, pelas empresas nacionais de alimentação animal Post-weaning diarrhea (DPD) in piglets is a multifactorial disease, characterized by enteric changes associated with intestinal infection by enterotoxigenic Escherichia coli and by high mortality of these animals after weaning, representing high economic losses for pig industry. Although the effective pharmacological antibiotic treatment for DPD control, it’s use is reduced through the development of multi-resistant bacteria to various antibiotics and the underlying danger to public health. Thus, it’s imperative the development of non-pharmacological strategies for DPD control. This dissertation focuses, first, on the development of a unique and complete liquid product, named Swine Sweet Health, that promotes the control of this disease without using antibiotics. This product contains in its constitution several interesting active compounds, such as glucose, salts, a mixture of organic acids, cinnamaldehyde, and lauric acid, with the potential to act on the various aspects of the problem, such as the treatment of dehydration and intestinal bacteriological infection in these animals. In addition, it contains palatalizing agents, in the attempt to increase the ingestion of this product and minimization of the mortality. After the development of three different formulations of the product, in the DIN laboratory, product acceptability studies were carried out on animals at the University of Trás-os-Montes e Alto Douro. Also, stability studies of one month, were performed, according to National and European legislation. These studies demonstrated a lack of rejection of these formulations in vivo and the assurance of physical-chemical and microbiological stability of these formulations at one month, even when subjected to elevated temperatures, up to 41,5°C. Once its long-term stability and in vivo potential have been proven, this final product can be commercialized and will have a high impact on the market, being part of a market segment not exploited in Portugal, for liquid products, by national animal feed companies Mestrado em Bioquímica

Mestrado em Bioquímica - Bioquímica Clínica Submitted by Cristina Santos (cmaria@ua.pt) on 2018-03-21T09:57:34Z No. of bitstreams: 1 Tese_AnaSofiaDias_FINAL.pdf: 3319638 bytes, checksum: 2c058d0354676325bbdcda493c4b633b (MD5) Made available in DSpace on 2018-03-21T09:57:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_AnaSofiaDias_FINAL.pdf: 3319638 bytes, checksum: 2c058d0354676325bbdcda493c4b633b (MD5) Previous issue date: 2017-12-20

Mestrado em Bioquímica, ramo de Métodos Biomoleculares A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa, sendo a forma mais comum de demência. As projeções para 2030 apontam para 75,6 milhões de casos, e o triplo para 2050. A doença de Alzheimer é caracterizada pela presença de deposição do péptido β-amilóide e tranças neurofibrilares. Durante o processo neurodegenerativo, as propriedades físico-químicas das membranas são alteradas. Esta alteração pode resultar de uma desregulação nas proporções dos fosfolípidos e gangliósidos e/ou de mudanças nos rácios. Assim, o objetivo principal deste trabalho foi identificar alterações no perfil de fosfolípidos e de gangliósidos em cérebro de modelo de ratinho triplo transgénico 3xTG-AD de forma a melhor compreender a patologia da doença de Alzheimer e identificar possíveis biomarcadores. Através da uma abordagem lipidómica usando HILIC-LS-MS determinou-se o efeito das 3 mutações presentes no modelo experimental, associadas à doença de Alzheimer, no perfil dos lípidos extraídos da fase aquosa e da fase orgânica do cérebro. Sucintamente, verificou-se um aumento da abundância relativa das classes de fosfolípidos PE, LPE, PEp, PG, PS e de sulfatidos, e uma diminuição da classe de PI, relativamente ao grupo controlo. Na análise dos gangliósidos, na fase aquosa, observou-se uma diminuição dos gangliósidos com apenas um ácido siálico, GM1 e GM2, e o aumento dos gangliósidos mais complexos, GT1, 9-O-acetil GT1b e GQ1. Estes resultados permitem-nos discriminar as amostras de acordo com o grupo a que pertencem, estando as variações de abundância relativa dos lípidos intimamente relacionadas com a doença. Em conclusão, o nosso trabalho permitiu detetar alterações na homeostasia dos gangliósidos e fosfolípidos na doença de Alzheimer, enfatizando a sua importância em condições fisiológicas. Este trabalho fornece uma nova visão de como, na sua globalidade, os fosfolípidos e os gangliósidos podem ser utlizados como possíveis marcadores da doença de Alzheimer. Alzheimer's disease is a neurodegenerative disease and the most common form of dementia. Projections for 2030 point to 75.6 million cases, and almost triple by 2050. Alzheimer's disease is characterized by the deposition of β-amyloid peptide and neurofibrillary tangles. During the neurodegenerative process, the physicochemical properties of the membranes are changed, affecting cell function. This change can result from a disruption in the proportions of phospholipids and ganglioside and/or changes in ratios and may contribute to this condition. Thus, the main objective of this work is to identify changes in the phospholipid profile and ganglioside in triple-transgenic model (3xTG-AD) in order to better understand the pathology of Alzheimer's disease and identify potential biomarkers. Through a lipidomic approach it was determined the effect of the 3 mutations present in the experimental model associated with Alzheimer's disease, in lipid profile extracted from the aqueous phase and the organic phase of the brain. Briefly, there was an increase in relative abundance of the phospholipid classes PE, LPE, PEp, PG, PS and sulfatides, and a decrease of PI class, relative to the control group. In the analysis of gangliosides was observed a decrease in ganglioside with only one sialic acid, GM1 and GM2, and increased of more complex gangliosides, GT1, 9-O-acetyl GT1b and GQ1. These results allow us to discriminate the samples according to the group they belong, with changes in relative abundance of lipids intimately associated with the disease. In conclusion, our study allowed us to detect changes in the homeostasis of gangliosides and phospholipids in Alzheimer's disease, highlighting its importance in physiological conditions. This study provides a new view as a whole, that phospholipids and ganglioside can be used as possible markers of Alzheimer's disease.

Mestrado em Bioquímica, especialização em métodos biomoleculares Submitted by Carla Jesus (cjesus@ua.pt) on 2017-05-19T10:28:02Z No. of bitstreams: 1 Dissertação- Marta Dâmaso.pdf: 2334201 bytes, checksum: 038b650f86c708bb022d86715bb5d73a (MD5) Made available in DSpace on 2017-05-19T10:28:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação- Marta Dâmaso.pdf: 2334201 bytes, checksum: 038b650f86c708bb022d86715bb5d73a (MD5) Previous issue date: 2016-07-29

Mestrado em Bioquímica, especialização em métodos biomoleculares A inflamação é um processo indispensável para permitir o retorno à homeostasia dos tecidos após uma determinada lesão. Os processos inflamatórios encontram-se associados a várias condições de doença, sendo um dos principais fatores associados à morbilidade e mortalidade das patologias. Por sua vez, os fosfolípidos têm sido cada vez mais associados a processos inflamatórios, pelo que alterações no seu perfil poderão estar relacionados com alterações no processo inflamatório. Assim, o objetivo geral deste trabalho centrou-se na identificação e quantificação de alterações no perfil de fosfolípidos induzido pela inflamação em modelos in vivo, no lúpus eritematoso sistémico, e em modelos in vitro, em células de monócitos THP-1, através de uma abordagem lipidómica. O lúpus eritematoso sistémico é uma doença autoimune de natureza inflamatória marcada por fases de remissão e recaída. Contudo, ainda não existe um meio de diagnóstico eficiente de forma a prever atempadamente o ciclo desta doença. Os extratos lipídicos de plasma foram analisados por TLC, observando-se diferenças significativas nas classes de fosfolípidos PC, LPC e PS. A análise dos ácidos gordos por GC-MS demonstrou alterações significativas nos ácidos gordos C16:0 e C22:6. Pela análise estatística multivariada e discriminante aplicada aos resultados obtidos por HPLC-MS e MS/MS observaram-se diferenças significativas nas classes PC, LPC e PE. Desta forma, estas classes sofrem alterações significativas de acordo com a fase em que a patologia se encontra, fase de remissão ou fase de recaída. A abordagem lipidómica permitiu, assim, distinguir entre os dois fenótipos da doença, sendo estes caracterizados por alterações nas classes de fosfolípidos mencionadas. Para avaliar as adaptações à resposta inflamatória in vitro recorre-se a linhas celulares de células do sistema imune, como os macrófagos ou monócitos. Estas células foram tratadas com LPS, um indutor de stresse inflamatório, e com tunicamicina, um indutor do stresse do retículo endoplasmático. Por TLC observaram-se alterações significativas nas classes de fosfolípidos PE e PG, e pela análise de ácidos gordos observaram-se diferenças significativas nos ácidos gordos C16:1-cis, C18:0, C20:2 e C22:6. Por sua vez, a análise estatística multivariada e discriminante dos resultados obtidos pela técnica de HPLC/MS e MS/MS permitiu verificar que as classes PC, PI, PE e PS são aquelas que mais contribuem para a distinção entre os dois tipos de stresse. Assim, a metodologia aplicada permitiu verificar que o perfil lipídico das células se altera consoante a natureza do estímulo inflamatório. Palavras-chave Resumo Concluindo, a abordagem lipidómica aplicada neste trabalho demonstrou ser eficaz na análise e identificação das classes de fosfolípidos das condições estudadas, sendo possível distinguir entre cada uma das condições em ambos os estudos realizados. Assim, o estudo lipidómico permitiu uma melhor compreensão dos processos fisiopatológicos envolvidos no processo inflamatório do lúpus e das células. Este facto poderá ser utilizado como forma de diagnóstico e tratamento, permitindo atuar antes do agravamento dos sintomas associados aos processos inflamatórios. Inflammation is a crucial process for the defense mechanisms of the host against injuries. Inflammatory processes are associated with various disease condition and are one of the main factors associated with diseases morbidity and mortality. In turn, the phospholipids have been increasingly associated with inflammatory processes, so that changes in the phospholipid profile can be related to changes in the inflammatory process. Thus, the aim of this work has focused on the identification and quantitation of changes in phospholipids profile induced by inflammation in in vivo models, systemic lupus erythematosus and in in vitro models, THP-1 monocyte cells through a lipidomic approach. Systemic lupus erythematosus is an autoimmune disease characterized by remission and relapse phases, however there is still no effective means of diagnosis to timely predict the appearance of the phases. The lipid extracts from plasma were analysed using TLC and showed significant differences in PC, LPC and PS. GC-MS technique was used to assess changes in the fatty acid profile, and showed significant changes in C16:0 and C22:6 fatty acids. The multivariate and discriminant statistical tests applied to the results obtained by HPLC-MS and MS/MS showed significant differences in the PC, LPC and PE. Thus, these phospholipid classes suffer significant changes according to the pathology state, remission or relapse phase. The lipidomics approach allowed to distinguish between the two phenotypes of the disease, which are characterized by changes in the phospholipid profile. In vitro models using cell lines of immune cells such as macrophages or monocytes are frequently used to evaluate the changes in cell phenotype and metabolic pathways in response to the inflammatory stimuli. THP-1 monocytes cells treated with LPS and tunicamycin showed significant changes in phospholipid classes PE and PG using TLC. The GC-MS technique showed differences in the fatty acids C16:1-cis, C18:0, C20:2 and C22:6. In turn, the multivariate and discriminant analysis of the results obtained by HPLC/MS and MS/MS showed that PC, PI, PE and PS are the phospholipid classes that contribute the most to the distinction between the two types of stresse. Thus, the applied methodology has shown that the cells lipid profile is altered depending on the nature of the inflammatory stimulus. In conclusion, the lipidomics approach applied in this study proved to be suitable for the analysis and identification of phospholipid classes of the studied conditions studied, once it is possible to distinguish between each of the conditions in both studies. Thus, the lipidomic approach allowed a better understanding of the pathophysiological processes involved in the inflammatory process of lupus and cells. This may be used as diagnosis and treatment, allowing to act before the symptoms aggravation associated with inflammatory processes.

Mestrado em Bioquímica - Bioquímica Clínica O aumento da resistência a antibióticos exige atualmente um maior esforço no desenvolvimento de terapêuticas alternativas. Os biofármacos com base em anticorpos, reconhecidos pela sua especificidade, constituem uma alternativa promissora no tratamento de infeções, bem como de cancro, alergias, doenças auto-imunes e inflamação. A imunoglobulina Y (IgY) da gema do ovo apresenta diversas vantagens relativamente à IgG de mamíferos, sendo aplicada em imunoterapia passiva, imunoprofilaxia, diagnóstico e métodos imunológicos. No entanto, as técnicas tradicionais de extração da IgY a partir da matriz lipídica que é a gema de ovo não são adequadas para a sua obtenção em grandes quantidades e com um elevado grau de pureza de um modo económico e rápido. Uma vez que a indústria farmacêutica exige que as proteínas terapêuticas apresentem um elevado grau de pureza, é necessário desenvolver novos processos eficazes e económicos que permitam a extração e purificação da IgY. Os sistemas aquosos bifásicos (SABs) são sistemas do tipo líquido-líquido utilizados na extração e purificação de biomoléculas. São sistemas maioritariamente constituídos por água, biocompatíveis e têm a capacidade de preservar a integridade e atividade biológica das proteínas. Na inexistência de uma técnica ideal de extração e purificação da IgY, a utilização de SABs poderá responder a esta problemática; contudo deverá avaliar-se a preservação da funcionalidade do anticorpo após o processo. Face ao exposto, o objetivo desta dissertação de mestrado consiste em extrair e purificar a IgY num único passo utilizando SABs constituídos por líquidos iónicos (LIs) e polipropileno glicol 400 g.mol-1 (PPG 400). Adicionalmente, pretende-se avaliar a atividade e estabilidade da IgY em várias soluções aquosas de polímeros, sais e LIs para verificar se a técnica de purificação não compromete a funcionalidade do anticorpo. Verificou-se que as proteínas presentes na gema de ovo apresentam uma maior afinidade para as fases enriquecidas em LIs, em detrimento das fases de PPG 400. Após optimização de várias condições, conseguiu-se alcançar uma recuperação máxima de 85 % da IgY na fase inferior dos sistemas (enriquecida em LI) com 44 % de pureza, num único passo. Relativamente à atividade e estabilidade do anticorpo em soluções aquosas de polímeros, sais e LIs não se verificaram alterações ao nível da estrutura secundária, embora possam ocorrer algumas modificações na reatividade da IgY na presença destas soluções. The increased antibiotic resistance to microorganisms requires nowadays a greater effort on the development of alternative therapeutics. Antibody-based biopharmaceuticals, recognized by their specificity, are a promising alternative used in the treatment of infections, as well as in cancer, allergies, autoimmune diseases and inflammation. The egg yolk immunoglobulin Y (IgY) has several advantages over mammalian IgG, being applied in passive immunotherapy, immunoprophylaxis, diagnostic and immunological methods. However, the traditional techniques of extraction and purification of IgY from the yolk’s lipidic matrix are not suitable for obtaining large quantities of pure antibodies by an inexpensive and quick approach. Considering that the pharmaceutical industry requires pure therapeutic proteins, it is necessary the development of new economical and effective processes for the extraction and purification of IgY. Aqueous biphasic systems (ABS) are liquid-liquid systems used for the extraction and purification of biomolecules. They are mostly composed of water, are biocompatible and able to maintain the proteins integrity and biological activity. Due to the absence of an ideal technique of extraction and purification of IgY, the application of ABS can respond to this problem; however, the preservation of the antibody functionality should be evaluated after the process. In summary, the objective of this MSc thesis consists on the extraction and purification of IgY in a single step using ABS composed of ionic liquids (ILs) and polypropylene glycol 400 g.mol-1 (PPG 400). Moreover, the IgY activity and stability in various aqueous solutions of polymers, salts and ILs was ascertained to verify if the purification technique does not compromise the antibody functionality. It was found that all proteins present in egg yolk have a higher affinity to the IL-rich phases over the PPG 400 phases. After several conditions optimization, an IgY maximum recovery of 85 % in the bottom phase (IL-enriched phase) with 44 % of purity was obtained in a single step. Regarding the antibodies activity and stability in polymers, salts and ILs aqueous solutions it was not verified alterations on the secondary structure, however some modifications may occur in the reactivity of IgY in these solutions.

Mestrado em Bioquímica - Bioquímica Clínica O stress oxidativo está associado ao envelhecimento e a inúmeras patologias, nomeadamente a doenças neurodegenerativas e cardiovasculares, e a diversos outros fatores. O stress oxidativo leva à oxidação de importantes biomoléculas como os lípidos e, ao contrário da maior parte dos produtos de oxidação de fosfolípidos e ácidos gordos insaturados (PUFAS), os produtos de oxidação de glicosfingolípidos (GSLs) têm sido escassamente estudados. Os glicosfingolípidos são moléculas muito diversificadas estruturalmente e com importantes funções, essencialmente no sistema nervoso central (SNC) onde estão localizados maioritariamente. Deste modo, alterações na estrutura dos GSLs conduzirão a consequente comprometimento das suas funções e ao possível desenvolvimento de patologias. Assim para identificar as modificações oxidativas que ocorrem em glicosfingolípidos e pressupor consequentes efeitos biológicos nas células sob stress oxidativo, prepararamse sistemas modelo biomiméticos com diferentes GSLs os quais foram expostos a radicais hidroxilo gerados sob condições da reação de Fenton (H2O2 e Fe2+) e as reações foram monitorizadas por diferentes metodologia utilizando a espectrometria de massa. Os resultados obtidos com este estudo permitiram-nos identificar vários produtos de oxidação produzidos durante a oxidação desta classe de lípidos. Os produtos de oxidação observados em comum, em todos os GSLs estudados (C16:0GalCer, C24:1GalCer, C24:1LacCer e GM1) foram as suas correspondentes ceramidas. Estas atuam como agentes pro-apoptóticos e podem in vivo promover a neurodegeneração nas células sob stress oxidativo. Também foi possível observar produtos com inserção de oxigénio junto às duplas ligações ou na cadeia de esfingosina (no caso do GM1) ou na cadeia de ácido gordo monoinsaturada (no caso da C24:1GalCer, C24:1LacCer), corroborando o facto de que ácidos gordos saturados não são susceptíveis à oxidação por radicais. Interessantemente em ambos os GSLs de cadeias glicosiladas compostas com mais de um açúcar (C24:1LacCer e GM1) observou-se a despolimerização oxidativa da porção glicosilada por quebra das correspondentes ligações glicosídicas. Esta degradação leva à formação de GlcCer no caso de oxidação de LacCer ou na formação de outros gangliósidos (GM2, GM3, asialoGM1 e asialoGM2) e glicolípidos (LacCer e GlcCer), no caso de oxidação de GM1. A formação por via radicalar não enzimática destes GSLs leva a distúrbios no perfil lipídico. Previamente, em certas doenças, foram observadas variações na concentração do perfil de gangliósidos e de ceramidas. Estes dados permitem sugerir que em células em condições de stress oxidativo, a acumulação de gangliósidos mais simples e ceramidas poderá ter uma contribuição de produtos da degradação oxidativa dos gangliósidos e GSLs mais complexos. Este trabalho contribui assim para uma melhor compreensão das modificações estruturais que ocorrem em alguns glicosfingolípidos em condições de stress oxidativo. Os produtos de oxidação aqui identificados suportam a sua possível futura deteção em sistemas biológicos. The oxidative stress is associated with aging, with many pathologies, including neurodegenerative and cardiovascular diseases and with several other factors. Oxidative stress leads to oxidation of important biomolecules such as lipids. Unlike most of the phospholipids and unsaturated fatty acid (PUFAS) oxidation products, the glycosphingolipids oxidation products have been scared addressed. The glycosphingolipids (GSLs) are a class of lipids with high structural diversity and have important functions, namely in central nervous system (SNC) where are major components. Thus, alterations in GSLs structure will lead to consequent impairment of its functions and the possible development of pathologies. In this context, for identify the oxidative modifications that occurs in glycosphingolipids and presumed consequent biologic effects in cells under oxidative stress, biomimetic model systems with different GSLs were used and exposed to hydroxyl radical produced under Fenton reaction conditions (H2O2/Fe2+), the reactions were monitored by mass spectrometric techniques. The obtained results allowed to identify several oxidation products generated during the oxidation this lipidic class. Ceramides were detected as oxidation products for all studied of GSLs (C16:0GalCer, C24:1GalCer, C24:1LacCer and GM1). Interestingly, ceramides are pro-aptotic agents, so can be promote neurodegeneration in vivo in cells under oxidative stress. Also it was possible to observe products formed by the addition of with oxygen atoms in the vicinity of the double bond whether in sphingosine backbone (in case of GM1) or in monounsaturated fatty acid chain (in case of C24:1GalCer and C24:1LacCer), corroborating the hypothesis that saturated fatty acids don’t are susceptible the radicalar oxidation. Interestingly, in both GSLs with glycosylated chains composed with more of one sugar (C24:1LacCer and GM1) it was possible to observe the oxidative depolymerization of glycan linked to ceramide through of cleavage of the correspondents glycosidic bonds. It allowed us to suggest that in cells under oxidative stress, where previously were observed variations in concentration of normal content of the gangliosides and ceramides namely in certain neurodegenerative diseases, it is possible that change sin GSL profile can be have the contribution of oxidative stress. In fact, this contribution can be associated with the non-enzymatic oxidative degradation of more complexes gangliosides in simple gangliosides and ceramides. This work contributes to a better understanding of the fate of some glycosphingolipids under conditions of oxidative stress. The oxidation products here identified supports their possible future detection in biological systems.

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia Industrial e Ambiental Os biofármacos, particularmente os anticorpos, têm-se demonstrado bastante eficazes no tratamento de várias doenças, tais como esclerose múltipla, Alzheimer ou cancro. Os anticorpos presentes na gema de ovo, nomeadamente a imunoglobulina Y (IgY), são uma possível alternativa aos anticorpos de mamíferos (IgG), uma vez que desempenham uma função semelhante e podem ser obtidos em grande quantidade, sem a utilização de técnicas invasivas. Apesar das vantagens apresentadas, o custo de produção de IgY com elevado grau de pureza, exigido pela indústria farmacêutica, continua a ser muito elevado devido à inexistência de um método eficaz para a extração seletiva e posterior purificação destes anticorpos. Assim, neste trabalho, estudaram-se sistemas aquosos bifásicos (SAB) constituídos por polímero e tampão fosfato/ácido cítrico (a diferentes valores de pH), como uma técnica alternativa de extração e purificação de IgY a partir da gema de ovo, tendo sido avaliado o efeito da variação do pH. De entre os vários SAB avaliados, os que permitiram melhores resultados em termos de extração seletiva e de purificação da IgY foram os SAB constituídos por polietilenoglicol (PEG) com uma massa molecular de 10 kDa e por tampão K2HPO4/C6H8O7 a pH 4,5 (fator de purificação de 73,8 %). De acordo com os resultados obtidos pode-se constatar que o pH do tampão tem influência na partição das proteínas, sendo que quando o pH aumenta, a quantidade total de proteínas que vão para a fase superior também aumenta. No entanto, a purificação total da IgY não foi alcançada num único passo de extração. Biopharmaceuticals, particularly antibodies, have demonstrated to be quite effective in the treatment of various diseases, such as multiple sclerosis, Alzheimer’s disease or cancer. The antibodies found in egg yolk, and in particular immunoglobulin Y (IgY), are a possible alternative to mammalian antibodies (IgG), once they perform a similar function and can be obtained in large quantities without the use of invasive techniques. Despite these advantages, the production cost of IgY with high purity, as demanded by the pharmaceutical industry, still remains high due to the absence of a cost-effective purification method for IgY. Therefore, in this work, aqueous biphasic systems (ABS) composed of a polymer and phosphate/citric acid buffer (at diferente pH values) were studied as an alternative technique for the selective extraction and purification of IgY from egg yolk, with the effect of pH being evaluated. Amongst the several ABS investigated, the best results on the selective extraction and purification of IgY were obtained with an ABS composed of polyethylene glycol (PEG) with a molecular mass of 10 kDa and the buffer K2HPO4/C6H8O7 at pH 4.5 (with a purification factor of 73.8 %). According to the obtained results, it was found that the pH of the medium largely influences in proteins partitioning, since when the pH increases, the amount of total proteins that migrate to top phase also increases. However, the complete purification of IgY was not achieved in a single step.

Mestrado em Bioquímica - Bioquímica Clínica O cordão umbilical é, hoje em dia, uma importante fonte de células estaminais. Estas podem ser isoladas a partir do sangue do cordão umbilical (UCB), mas também do próprio tecido (UC), tendo sido desenvolvidas técnicas de criopreservação e bancos para o seu armazenamento. Cada amostra apresenta características diferentes, variando quer no número de células presentes, quer na viabilidade das diferentes populações celulares. Assim, este trabalho consistiu na análise retrospetiva de amostras criopreservadas na Crioestaminal em relação a diferentes fatores, que podem afetar a qualidade das amostras, nomeadamente fatores neonatais como o sexo, peso e idade gestacional, fatores obstétricos, que inclui o tipo de parto e o número de recém-nascidos por parto e fatores maternos como a idade e a presença e/ou desenvolvimento de doença durante a gravidez. Também analisamos fatores relativos à colheita e condições de transporte e a sua relação com a qualidade das amostras. Foram reunidos os dados relativos a 9543 amostras de UCB e 4775 amostras de UC e relacionados através de uma análise estatística. Desta forma, verificou-se que recém-nascidos com maior peso e idade gestacional, bem como o parto vaginal e o nascimento de apenas um bebé se relacionam com uma maior qualidade das amostras de UCB. Também o sexo do recém-nascido e a idade materna mostraram afetar a qualidade destas amostras. Por outro lado, em amostras de UC, recém-nascidos com menor peso e idade gestacional, assim como o parto por cesariana, relacionaram-se com uma maior qualidade deste tipo de amostras. Conclui-se, ainda, que uma redução do intervalo de tempo entre a colheita e o processamento, como também uma otimização do processo de colheita com melhores práticas de desinfeção, poderão contribuir para um aumento da qualidade das amostras. Assim, o estudo destes fatores poderá contribuir para uma melhoria da qualidade de amostras de UCB e UC criopreservadas, e desta forma para um maior sucesso da transplantação. Nowadays, the umbilical cord is considered one of the most important sources of stem cells. These cells can be isolated either from the umbilical cord blood or from the tissue itself, which led to the development of cryopreservation techniques and storage banks. Each sample exhibits different characteristics, varying both in the number of cells and in the viability of several cellular populations. Therefore, this work consisted in the retrospective analysis of various factors, such as neonatal factors like sex, weight and gestational age, obstetric factors which included the type of delivery and the number of newborns by birth and maternal factors like the age and the presence and/or development of diseases during the pregnancy in cryopreserved samples at Crioestaminal. Furthermore, factors associated with sample collection and transport conditions were also analyzed and related with sample quality. Data was gathered from 9543 UCB samples and 4775 UC samples and was later statistically analyzed. In this way, it was observed that newborns with higher weight and gestational age, as well as a vaginal delivery and the birth of only one baby resulted in higher UCB sample quality. Besides this, the newborn’s gender as well as the maternal age also affected the quality of these samples. On the other hand, in UC samples, newborns with a low weight and gestational age, as well as a cesarean delivery, were related with a superior quality in this kind of samples. It was also verified that a reduction of the period between the sample collection and the processing, as well as the optimization of the sample collection process with better disinfection practices led to a quality increase in both types of samples. Ultimately, the study of these factors contributed to a quality improvement of cryopreserved UCB and UC samples, resulting in a higher transplantation success rate.

Mestrado em Bioquímica - Métodos Biomoleculares O leite é um alimento com elevado valor nutritivo, do qual se destaca a sua composição proteica rica em aminoácidos essenciais. Os lacticínios, em particular os leites fermentados, têm vindo a ser alvo de inúmeros estudos no sentido de conhecer melhor a sua matriz e avaliar as suas potencialidades ao nível da saúde humana. A utilização de novas culturas de arranque tem sido um campo largamente explorado com a introdução de probióticos no processo de produção destes lacticínios, contudo o principal foco destes estudos tem sido a obtenção de péptidos com actividade biológica. A este interesse pela obtenção de novos produtos com impacto positivo na saúde, junta-se o facto de leites de diferentes origens apresentarem diferente composição, o que tem impacto não só ao nível nutricional, mas também ao nível económico-social. Devido a estas diferenças, a valorização dos diferentes tipos de leite sob os pontos de vista já enumerados ganha ainda mais importância. No sentido de valorizar os leites de cabra e ovelha, foram preparados leites fermentados com as estirpes probióticas Lactobacillus casei-01, Lactobacillus paracasei LAFTI® L26 e Bifidobacterium animalis Bb-12. Como referência foram também preparados leites de vaca fermentados com as mesmas estirpes probióticas. Os leites fermentados produzidos foram processados de modo a obter-se fracções com pesos moleculares abaixo dos 3kDa, as quais foram testadas para determinar as actividades anti-hipertensiva e antioxidante dos diferentes leites fermentados. As fracções com actividade biológica foram posteriormente analisadas por espectrometria de massa de modo a tentar identificar os péptidos responsáveis pela actividade registada. Os leites fermentados preparados neste trabalho não apresentaram actividade anti-hipertensiva. Contudo todos os leites apresentaram actividade antioxidante com especial destaque para os leites fermentados com os lactobacilos. Da análise por espectrometria de massa não foi possível identificar nenhum péptido responsável pela actividade biológica das amostras. Milk is a food with high nutritional value, which has a high content of essential amino acids among its proteins. Dairy products, particularly fermented milks, have been the target of numerous studies to better understand its matrix and evaluate its potential in terms of human health. The use of new starter cultures has been largely studied with the introduction of probiotics in the production of dairy products, however the main focus of these studies have been the production of peptides with biological activity. In addition to this interest for new products with positive impact on health, milk from different sources have different composition. This milk variability has an impact not only on nutrition, but also on economic and social fields. For that reason, studying different types of milk is of great significance. Ir order to enhance goat and sheep milks, fermented milks with probiotic strains Lactobacillus casei-01, Lactobacillus paracasei LAFTI® L26 and Bifidobacterium animalis Bb-12 were prepared. As a standard the same probiotic milks were prepared with cow’s milk. The fermented milks produced were processed in order to obtain fractions with molecular weights below 3kDa. Then, these fractions were tested to determine antihypertensive and antioxidative activities in the different milks. The biologically active fractions were posteriorly analyzed by mass spectrometry in order to identify the bioactive peptides. The results obtained in this study didn’t show any antihypertensive activity. On the other hand, antioxidative activity was detected in all fermented milks, especially in those fermented with lactobacilli. Analysis by mass spectrometry wasn’t conclusive in order to identify the peptides responsible for such biological activity.

Mestrado em Bioquímica Alimentar O queijo, devido às suas características, tem-se mostrado como um bom veículo de probióticos e têm sido descritos na literatura inúmeros péptidos bioactivos resultantes desta matriz. A complexa actividade proteolítica que conjuga a acção das enzimas endógenas do leite, o agente coagulante e as estirpes bacterianas adicionadas é a principal causa para a variedade de péptidos que têm vindo a surgir. Mais recentemente, os estudos têm-se focado em queijos de cabra e de ovelha devido ao seu crescente consumo. Com o objectivo de se avaliar o efeito dos probióticos na produção de péptidos bioactivos em queijo, procedeu-se à manufactura de queijos de leite de vaca, cabra e ovelha inoculados com Lactobacillus casei-01 ou Bifidobacterium lactis B94. Ao longo de 56 dias de maturação a 12 ºC, avaliou-se a viabilidade das estirpes probióticas assim como a extensão da proteólise e a presença de actividade antioxidante e anti-hipertensiva nas fracções inferiores a 3 KDa. Foram também realizados estudos preliminares de análise por espectrometria de massa. Observou-se uma boa viabilidade de ambas as estirpes ao longo do tempo nos queijos de vaca, cabra e ovelha que se manteve praticamente constante, atingindo valores de 109 CFU/g queijo, excepto para a B. lactis B94 em queijo de leite de vaca. Os índices de proteólise revelaram um aumento do número de pequenos péptidos nos queijos inoculados com L. casei-01 e B. lactis 94 ao longo dos 56 dias de maturação, embora esse aumento se tenha notado mais nos primeiros dias de maturação, especialmente nos queijos inoculados com L. casei-01. Registou-se a presença de actividade antioxidante nos queijos de vaca, cabra e ovelha ao longo do tempo, mas atingiram-se valores mais elevados nas amostras controlo com 56 dias de maturação a 12ºC. Apenas no queijo de ovelha com B. lactis B94, se observaram valores de actividade antioxidante semelhantes aos das amostras controlo. No que respeita à actividade anti-hipertensiva, verificou-se que a presença das estirpes probióticas nos queijos de cabra e ovelha se repercutiu num aparecimento de actividade com valores de IC50 na gama dos 9.9 e 51.2 g/mL. A análise de algumas das fracções com valores mais promissores de actividade anti-hipertensiva por HPLC-ESI-MS, confirmou a existência de um elevado número de péptidos, sendo que o número total de péptidos observáveis foi superior nas amostras contendo as estirpes probióticas o que se poderá relacionar, ainda que com necessidade de estudos mais aprofundados, com a presença de uma actividade inibidora mais intensa. Assim, poder-se-á concluir que a adição das estirpes L. casei-01 e B .lactis B94 em queijos de cabra e ovelha favorece a formação de péptidos com potencial actividade anti-hipertensiva. The cheese due to its characteristics has been shown to be a good vehicle for probiotics and it has also been reported in scientific literature numerous bioactive peptides in this kind matrix. The complex proteolytic activity that combines the action of endogenous milk enzymes, the coagulant agent and the added bacterial strains are the main cause for the variety of peptides that have been emerged. More recent studies have been focused on the goat and sheep cheeses due to their increasing consumption. In order to evaluate the effect of probiotics in the production of bioactive peptides in cheeses, it was manufactured cow, goat and ewe’s cheeses inoculated with Lactobacillus casei-01 and Bifidobacterium lactis B94. Through 56 days of ripening at 12 ºC, it was evaluated strain viability as well as the degree of proteolysis and the presence of antioxidant and antihypertensive activities in the fractions lower than 3 kDa. Preliminary studies were also made by mass spectrometry analysis. It was observed good viability of both strains along the 56 days of ripening in all cheeses, which remained almost constant, reaching values of 109 CFU/g, except for B. lactis B94 in cow’s cheese. The proteolysis indexes revealed an increase of small peptides in the cheeses inoculated with L. casei-01 e B. lactis 94 throughout ripening period, which was more pronounced in the first days of ripening especially in cheeses inoculated with L.casei-01. The presence of antioxidant activity was observed in all cheeses along the time, but the higher values were achieved in the control samples with 56 day of ripening. Only in ewe’s cheese inoculated with the B. lactis 94 strains it was observed similar values to those of to control samples. In terms of antihypertensive activity, it was found that the presence of the bacterial strains in the goat and sheep cheeses lead to values of IC50 activity between 9.9 and 51.2 g/mL. The analysis of some fractions with higher promising antihypertensive activity by HPLC-ESI-MS confirmed the existence of a large number of peptides. The total number of observable peptides was higher in samples containing probiotic strains which could be related with the presence of a stronger inhibitory activity; however, more studies are needed to support this observation. According to the results, it can be concluded that the presence of the L. casei-01 and B. lactis B94 strains in cow and goat cheeses favours the formation of peptides with potential antihypertensive activity.

Mestrado em Bioquímica - Métodos Biomoleculares No córtex cerebral de rato, a libertação de noradrenalina (NA) pode ser desencadeada por activação de neurónios que se projectam a partir do locus coeruleus ou então por activação local dos receptores NMDA do glutamato. Ambos os processos são regulados por nucleótidos como o ATP, através da activação de receptores P2Y, embora os subtipos de receptores P2Y envolvidos ainda não tenham sido identificados. O ATP desempenha igualmente um papel importante na captação de NA pelos astrócitos e na comunicação neurónio-astrócito em sinapses noradrenérgicas e uma desregulação na transmissão noradrenérgica pode contribuir para várias patologias como as perturbações do humor (depressão, doença bipolar, mania, ansiedade) e as doenças neurodegenerativas. O objectivo deste estudo consistiu na caracterização dos receptores P2Y envolvidos na regulação da transmissão noradrenérgica no córtex cerebral de Rato, através do estudo do efeito de vários agonistas purinérgicos e da sua interacção com antagonistas selectivos, na modulação da libertação de NA induzida por estimulação eléctrica (100 pulsos a 5 Hz) em fatias de córtex, e na captação de NA em culturas primárias de astrócitos. Os nucleótidos ATP, ADP, ADPβS, UTP, UDP inibiram a libertação de NA até 58% com a seguinte ordem de potência: ADP ≥ ATP> ADPβS > UTP≥ UDP. O efeito inibitório do ADP (0,3 mM) e do ADPβS (0,3 mM) foram ambos bloqueados pelos antagonistas selectivos dos receptores A1 e P2Y1, DPCPX (0,1 μM) e MRS 2500 (1 M), respectivamente. Os efeitos inibitórios do UTP (1 mM) e UDP (1 mM) foram ambos antagonizados pelo MRS 2578 (1 M) que é um antagonista selectivo para os receptores P2Y6. Ao contrário do ADP (0,3 mM), o efeito do ADPβS (0,3 mM) não foi modificado pela desaminase da adenosina (ADA, 2U/ml), excluindo um papel da adenosina nos efeitos antagonizados pelo DPCPX (0,1 μM). No entanto o efeito do ADPβS foi abolido pela combinação de DPCPX (0,1 μM) e MRS 2500 (1 μM), sugerindo parte do efeito inibitório deste agonista na libertação de NA poderá ser mediada por heterodímeros A1/P2Y1. Nas culturas de astrócitos, os agonistas ADP S (0,1 mM), UDP (1 mM) e CGS 21680 (0,1 μM) aumentaram captação de NA até 117 %. O efeito do ADPβS (0,1 mM) foi antagonizado pelo MRS 2500 (0.1 μM) e pelo antagonista selectivo dos receptores P2Y12 AR-C66096 (10 μM). O efeito do UDP (1 mM) foi atenuado pelo MRS2578 (1 μM) e o efeito facilitatório do CGS 21680 (0,1 μM) na captação de NA foi atenuado pelo antagonista selectivo dos receptores A2A SCH58261 (30 nM). Em conclusão, os nucleótidos inibem a libertação de NA por activação de receptores P2Y1, P2Y6, A1 e possivelmente heterodímeros A1/P2Y1. Também aumentam a captação de NA pelos astrócitos através da activação de receptores P2Y1, P2Y12,P2Y6 e A2A, em ambos os casos conduzindo a uma inibição da transmissão noradrenérgica no córtex cerebral. In the rat cerebral cortex, release of noradrenaline (NE) can be triggered by activation of neurons projecting from locus coeruleus and by locally released glutamate through activation of NMDA receptors. Both mechanisms are regulated by nucleotides such as ATP, which acts through activation of P2Y receptors; however the subtypes involved have not yet been identified. ATP plays an equally important role in the uptake of NE by astrocytes and in the neuron-astrocyte communication at noradrenergic synapses, with a deregulation of noradrenergic transmission being associated to the pathogenesis of several mood disorders and neurodegenerative diseases. The aim of this thesis was to identify, in the rat barin cortex, the P2Y receptors involved in the regulation of noradrenergic transmission by testing the effect of several purinergic agonists and its interaction with selective antagonists in NE release, evoked by electrical field stimulation (100 pulses at 5 Hz) of cortical brain slices, and in NE uptake by primary cultures of cortical astrocytes. The nucleotides ATP, ADP, ADPβS, UTP and UDP caused an inhibition of NE release up to 58% with the following order of potency: ADP≥ATP> ADPβS>UTP≥UDP. The inhibitory effect of ADP (0,3 mM) and ADPβS (0,3 mM) were both attenuated by the selective antagonists of A1 and P2Y1 receptors, DPCPX (0,1 μM) and MRS 2500 (1 M), respectively. The inhibitory effects of UTP (1 mM) and UDP (1 mM) were antagonized by MRS 2578 (1 M) which is a selective P2Y6 receptor antagonist. Unlike the effect of ADP (0,3 mM), the effect of ADPβS (0,3 mM) was not changed by the adenosine deaminase, excluding the participation of adenosina on the effects antagonized by DPCPX (0,1 μM). However, the effect of ADPβS was abolished by DPCPX (0,1 μM) in combination with MRS 2500 (1 μM), suggesting that a component of the inhibitory effect of this agonist in the NA release could be mediated by A1/P2Y1heterodímers. In primary astrocyte cultures, the agonists ADP S (0,1 mM), UDP (1 mM) and CGS 21680 (0,1 μM) all increased NE uptake up to 117 %. The effect of ADPβS (0,1 mM) was almost abolished by MRS 2500 (0.1 μM) and was also attenuated by the P2Y12 antagonist AR-C66096 (10 μM) whereas the effect of UDP (1 mM) was attenuated by MRS 2578 (1 μM) and the facilitatory effect of CGS 21680 (0,1 μM) on NE uptake was reduced by the selective antagonist of A2A receptors SCH 58261 (30 nM). In conclusion, the nucleotides tested inhibited NE release evoked by electrical stimulation through activation of P2Y1, P2Y6, A1 receptors and eventually A1/P2Y1 heterodímers. Additionally, they increased NA uptake by astrocytes upon activation of P2Y1, P2Y12 ,P2Y6 e A2A receptors, in both cases leading to an inhibition of the noradrenergic transmission in the rat brain cortex.

Mestrado em Métodos Biomoleculares A α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (α-1,4-D-glucano glucanohidrolase, EC 3.2.1.1) catalisa a hidrólise das ligações α-1,4-glucosídicas em oligossacarídeos e polissacarídeos. A α-amilase humana é uma proteína secretora que é produzida tanto nas glândulas pancreáticas como salivares, constituindo uma porção significativa da saliva e desempenhando um papel importante na digestão inicial do amido, glicogénio e outros polissacarídeos. A oxidação catalisada por metais (MCO) das proteínas possui um papel importante durante o stress oxidativo. O objectivo principal da realização deste trabalho foi a caracterização e identificação das modificações sofridas pela α-amilase quando oxidada pelo peróxido de hidrogénio (10, 1 e 0,1mM) numa reacção catalisada por metais num sistema in vitro. A espectrometria de massa combinada com a cromatografia líquida foi usada para identificar as modificações sofridas por cada uma das α-amilases em estudo. Relativamente à actividade enzimática, após sujeito a processo oxidativo, a α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens sofre menor perda de actividade enzimática do que a α-amilase salivar humana. Quando se utiliza uma concentração de H2O2 de 10mM observa-se uma maior diminuição da actividade enzimática para cada uma das α-amilases quando comparado com uma concentração de H2O2 de 1mM e 0,1mM. Quando comparamos os resultados das modificações sofridas por cada uma das α-amilases verificamos que a α-amilase salivar humana, quando sujeita a uma concentração de H2O2 de 10mM possui um menor número de resíduos modificados (23) quando comparada com a α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (26). Para uma concentração de reagente de H2O2 de 1mM, a α-amilase salivar humana apresenta também um menor número de resíduos oxidados (26) ao fim de 4 horas quando comparado o número dos resíduos oxidados observados para a α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (44). Os resultados sugerem que o processo de oxidação na α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens progride mais rapidamente do que na α-amilase humana. Isto apesar de a actividade do Bacillus amyloliquefaciens se manter, em termos relativos, mais elevada. O número de resíduos de cisteína é significativamente superior na α-amilase salivar humana, não existindo outras diferenças significativas que permitam justificar a diferença de resíduos oxidados observados. A observação da oxidação da cisteína na posição 399 aos 30 minutos pode justificar a perda mais rápida da actividade enzimática, observada no caso da α-amilase salivar humana. O número diferente de resíduos observados resíde muito provavelmente no facto de o processo oxidativo ser mais lento no caso da α-amilase salivar humana. Este facto pode ser justificado pela presença de inumeras pontes dissulfureto nesta proteína, o que a torna mais compacta e portanto o acesso do radical hidroxilo aos resíduos mais difícil. É importante notar que estes resíduos de cisteína se verificaram ser, em grande medida, resistentes ao processo oxidativo. ABSTRACT: The α-amylase from Bacillus amyloliquefaciens (α-1,4-D-glucan glucanohidrolase, EC 3.2.1.1) catalyzes the hydrolysis of α-1,4-glucosidic links in oligosaccharides and polysaccharides. The human α-amylase is a secretory protein that is produced both in pancreatic and salivary gland, and is a significant constituent of saliva, playing an important role in the initial digestion of starch, glycogen and other polysaccharides. The oxidation catalyzed by metals (MCO) of the protein has an important role during oxidative stress. The main purpose of this work is the characterization and identification of α-amylase oxidative modifications by hydrogen peroxide catalyzed by metals in a system in vitro Fenton system. Mass spectrometry, combined with liquid chromatography, was used to identify the oxidative changes of each of the α-amylase under study. Regarding enzyme activity, after the oxidative process, the α-amylase from Bacillus amyloliquefaciens suffers less loss of enzyme activity than the human salivary α-amylase. When using a concentration of H2O2 of 10mM there is a greater decrease in enzyme activity for each of the α-amylase when compared to a concentration of 1mM and 0.1mM of H2O2. When comparing the results of the changes of each of the α-amylases we found that the human salivary α-amylase, when subjected to a concentration of 10mM of H2O2.has a smaller number of modified residues (23) when compared with α-amylase of Bacillus amyloliquefaciens (26). For a concentration of 1 mM of H2O2.the human salivary α-amylase also has a smaller number of oxidized residues (26) after 4 hours of oxidation when compared the number of oxidized residues observed for α-amylase from Bacillus amyloliquefaciens (44). The results suggest that the oxidation process in α-amylase from Bacillus amyloliquefaciens progresses more rapidly than in human salivary α-amylase. This occurs despite the fact that the activity of Bacillus amyloliquefaciens remains relatively higher. The number of cysteine residues is significantly higher in human salivary α-amylase and no other significant differences justify the difference observed in the number of oxidized residues. The observation of oxidation of cysteine at position 399 at 30 minutes, observed for the human salivary α-amylase, can justify the faster loss of enzyme activity. The different number of residues observed is very likely to be the result of the slower oxidative process in the case of human salivary α-amylase. This can be justified by the presence of numerous disulfide bridges in this protein, which makes it more compact and therefore the access of the hydroxyl radical to the amino acid residues is more difficult. It is important to note that these cysteine residues were found to be very resistant to the oxidative process.

Mestrado em Métodos Biomoleculares A tuberculose é uma doença infecto-contagiosa, cujo agente etiológico é o Mycobacterium tuberculosis, que tem permanecido, até aos dias de hoje, como um sério problema mundial de saúde pública. Depois de ter sido considerada sob controlo, a tuberculose ressurgiu de uma forma bastante preocupante, na medida em que o número de casos da doença aumentou drasticamente devido à co-infecção com o Vírus da Imunodeficiência Humana (VIH). Outros factores, também importantes, como o aparecimento de estirpes clínicas de M. tuberculosis resistentes a antibióticos, contribuíram para o aumento da doença. A imunodeficiência causada pelo VIH e a resistência a drogas trouxeram problemas acrescidos no controlo da tuberculose. A tuberculose recorrente é frequentemente atribuída à reactivação da estirpe de M. tuberculosis responsável pelo primeiro episódio de doença. Contudo, pode também resultar de uma re-infecção com outra estirpe de M. tuberculosis ou de infecções mistas. A identificação da causa de recorrência pode ser feita por tipagem molecular das estirpes de M. tuberculosis isoladas a partir de amostras clínicas seriadas. Os métodos de tipagem mais adequados a este fim são o RFLP por IS6110 e o MIRU-VNTR. O conhecimento da causa de recorrência é importante para o manuseamento clínico do doente. Neste trabalho, foram estudadas 39 estirpes clínicas de M. tuberculosis pertencentes a nove indivíduos com tuberculose recorrente. A totalidade das estirpes foi analisada por RFLP IS6110. As estirpes analisadas pela metodologia MIRU-VNTR obedeceram aos seguintes parâmetros (i) nos casos em que não houve alteração do perfil de tipagem por RFLP IS6110, ao longo do tempo, foi escolhida a primeira estirpe analisada de cada doente, (ii) nos casos em que se verificou alteração do perfil de RFLP IS6110 analisaram-se estirpes de cada um dos perfis obtidos. Os resultados obtidos por RFLP IS6110 permitiram concluir que apenas um doente apresenta efectiva alteração do padrão de tipagem das estirpes isoladas ao longo do tempo. Neste caso, verificou-se ganho de um elemento de inserção IS6110 pela estirpe isolada 2 anos e meio após a primeira estirpe analisada neste estudo. Outra das estirpes recuperadas deste doente apresentava uma morfologia diferente da esperada para um M. tuberculosis. Por isso, foi identificada, de novo, verificando-se ser um Mycobacterium intracellulare. As razões para este facto não foram investigadas, uma vez que este estudo incide apenas sobre estirpes de M. tuberculosis. Existe ainda outro doente em que uma das estirpes seriadas apresenta um perfil de tipagem distinto do das outras estirpes. No entanto, esta ocorrência não corresponde a uma evolução nas estirpes deste doente, visto que, a alteração surge entre estirpes com o mesmo perfil de RFLP IS6110. Assim, conclui-se que, provavelmente, ocorreu uma troca de amostras clínicas. A análise dos resultados de tipagem por RFLP IS6110 permite concluir que as estirpes dos nove doentes se organizaram em nove clusters, sendo que (i) as estirpes de dois dos doentes estudados pertencem ao mesmo cluster; (ii) as estirpes de outro doente estão divididas por dois clusters; (iii) e uma estirpe surge isolada. Os resultados obtidos da tipagem por MIRU-VNTR mostram que para um cut-of de 0.3, as estirpes se distribuem pelas famílias LAM (40%) e Haarlem (10%). As restantes estirpes (50%) não obtiveram correspondência na base de dados. A diversidade alélica para os MIRU-VNTR loci foi a seguinte: Mtub04, 0.62; ETRC, 0.58; MIRU04, -0.11; MIRU40, 0.6; MIRU10, 0.58; MIRU16, 0.6; Mtub21, 0.4; QUB11b, 0.62; ETRA, 0.24; Mtub30, 0.58; MIRU26, 0.62; MIRU31, -0.11; Mtub39, 0.62; QUB26, 0.73; QUB4156, 0.24. Este trabalho permitiu-nos concluir que a tuberculose recorrente nos nove doentes estudados se deve à persistência da estirpe de M. tuberculosis inicial, ou por reactivação quando existe mais do que um episódio de doença, ou por resistência aos fármacos usados no tratamento. Esta última causa é de todo a mais importante, já que todas as estirpes analisadas são resistentes à maioria dos fármacos de 1ª e 2ª linha. ABSTRACT: Tuberculosis is an infectious disease, caused by the etiological agent Mycobacterium tuberculosis, which has remained a serious global health problem until today. Having been considered under control until some 20 years ago, the number of cases of the illness drastically increased since then due to co-infection with the Human Immunodeficiency Virus (HIV). Moreover, the emergence of clinical strains of M. tuberculosis resistant to antibiotics has contributed to the increase of the disease. The immunodeficiency caused by HIV and drug resistance pose serious problems to the control of tuberculosis. Tuberculosis recurrence is frequently attributed to the reactivation of the M. tuberculosis isolate responsible for the first episode of the disease. However, this can also be due to an infection with another isolate of M. tuberculosis, or to mixed infections. The cause of recurrence can be identified by molecular typing of serial isolates of M. tuberculosis. IS6110 RFLP and MIRU-VNTR are the methods of choice for genotyping of M. tuberculosis clinical isolates. Knowledge of the cause of recurrence is important for clinical management of patients. In this work, 39 clinical isolates of M. tuberculosis belonging to nine individuals with recurrent tuberculosis were studied. All strains were analyzed by IS6110 RFLP. MIRU-VNTR was used to type (i) the first strain of each patient when serial strains showed no change in the RFLP profile throughout the time or (ii) each strain with a different IS6110 profile when there was a change in the fingerprinting pattern of the serial strains. IS6110 RFLP results showed that only one patient displayed a change in the pattern of serial isolates with gain of one IS6110 band. One of the strains isolated from this patient was identified as Mycobacterium intracellulare. The reasons for this were not investigated since this study is focused only in tubercle bacilli. Another patient has an isolate with an IS6110 RFLP profile completely different from the other isolates, which probably corresponds to a swapped sample. Analysis of the results using Bionumerics led to the conclusion that the patients included in this study are organized in nine clusters, being that (i) strains from two of the patients belong to the same cluster, (ii) strains of one patient are divided in two clusters, (iii) and a strain is isolated. Results of MIRU-VNTR were analyzed using MIRU-VNTRplus programme, which allows identification of lineages. For a cut-off of 0.3, 40% of the strains belong to the LAM family, 10% to the Haarlem family and the remaining 50% did not find a match in the database. The allelic diversity of the MIRU-VNTR loci, is: Mtub04, 0.62; ETRC, 0.58; MIRU04, -0.11; MIRU40, 0.6; MIRU10, 0.58; MIRU16, 0.6; Mtub21, 0.4; QUB11b, 0.62; ETRA, 0.24; Mtub30, 0.58; MIRU26, 0.62; MIRU31, -0.11; Mtub39, 0.62; QUB26, 0.73; QUB4156, 0.24. This work showed that the cause of recurrent tuberculosis in the nine patients studied is due to persistence of the initial strain of M. tuberculosis, to reactivation when there is more than an episode of disease, or to antibiotic resistance. The latter cause is the most important of all, since all the analyzed strains are resistant to the majority of the 1st and 2nd line drugs.

Mestrado em Métodos Biomoléculares Avançados A tuberculose é um grave problema de saúde pública responsável por cerca de 8 milhões de casos novos de doença e quase 3 milhões de mortes anualmente. O tratamento insuficiente ou inadequado, a toma irregular ou o abandono da terapêutica são as principais causas de desenvolvimento e multiplicação de estirpes resistentes aos fármacos utilizados. Por este motivo, o número de estirpes de Mycobacterium tuberculosis resistentes à rifampicina e isoniazida tem vindo a aumentar, tornando-se urgente a implementação de técnicas rápidas e fiáveis de detecção destas resistências. A isoniazida é um dos principais antibióticos administrados no tratamento da tuberculose. O mecanismo genético de resistência à isoniazida é complexo, envolvendo mutações nos seguintes genes: catalase-peroxidase (katG), enoil- (transportadora de acil) reductase (inhA), β-cetoacil-(transportadora de acil) sintetase (kasA) e alquil–hidroperóxido reductase (aphC). As mutações são geralmente polimorfismos de um só nucleótido, no mesmo codão, que dão origem a um outro aminoácido. O desenvolvimento de testes genotípicos pode contribuir para a rápida e adequada detecção da infecção por estirpes de M. tuberculosis resistentes aos fármacos. Para a elaboração desta dissertação implementou-se uma técnica de PCR em tempo real que permite identificar alterações no codão 315 do gene katG. Estas mutações estão relacionadas com o desenvolvimento de elevado nível de resistência à isoniazida. Estudaram-se 71 estirpes de M. tuberculosis que apresentam resistência a esta droga pelo método das proporções em Lowenstein-Jensen. Em 30% destas estirpes identificou-se a mutação no codão 315 do gene katG em que há substituição de uma serina por uma treonina. Não se verificou a presença de outras substituições nesta posição. A metodologia implementada permite a detecção correcta da resistência ao fármaco, abrindo a possibilidade de vir a ser usada em diagnóstico. Foi também possível a adaptação desta metodologia a DNA genómico extraído de esfregaços de exames directos positivos. Deste modo, tornou-se ainda mais rápida a determinação da presença de mutações, não sendo necessário aguardar o crescimento da estirpe. De futuro, prevê-se a aplicação desta metodologia rápida de forma a identificar mutações neste ou noutros genes que conferem resistências à INH e também a outras drogas utilizadas no tratamento da TB. Assim, torna-se possível caracterizar as estirpes clínicas existentes, e integrar estas técnicas na rotina laboratorial. ABSTRACT: Tuberculosis is a serious public health problem with one third of the world population infected with Mycobacterium tuberculosis. Inappropriate treatment can result in the development of resistant strains. For this reason, the early detection of drug resistance is essential for effective patient management and implementation of infection control measures. Because M. tuberculosis grows extremely slowly, susceptibility testing can take about 3 to 6 weeks to complete. However, in the last few years there has been a considerable progress in our understanding of the mechanisms of action of the anti-mycobacterial agents, and the basis of resistance to these compounds. As a result, a number of novel assays based on real-time PCR technology have recently been developed to detect mutations that confer resistance to antituberculous drugs. Isoniazid is a critical component of the first-line multidrug therapy of tuberculosis. The molecular basis of antitubercular isoniazid resistance is complex. Resistant strains have been found to contain mutations in the following genes: catalase – peroxidase (katG), enoyl-acyl carrier protein reductase (inhA), β-ketoacyl-acyl carrier protein synthase (kasA) and alkylhydroperoxid redutase (ahpC). The present study reports the use of a real-time PCR assay, in a reference laboratory setting, that can detect mutations that confer resistance to isoniazid. Seventy one M. tuberculosis clinical isolates were identified as resistant to isoniazid by the proporthion method. From these, about 30% were found to have katG Ser315Thr mutation. Other substitutions in this position were not present. In addition, the methodology used allows detection of isoniazid resistance directly from DNA extracted from positive fluorescence stained slides, which contributes to an even more rapid diagnosis. In the future, novel real time PCR assays aimed at being used on a routine basis will be implemented in order to detect mutations responsible for resistance to other anti-tuberculous drugs.

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