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O objetivo do presente estudo foi avaliar o perfil e a carga microbiológica de amostras de Cannabis sativa apreendidas pela Polícia Civil de Minas Gerais, no âmbito do estado, a fim de avaliá-las quanto ao risco à saúde de seus usuários, em especial os imunossuprimidos. Foram analisados artigos científicos nacionais e internacionais envolvendo o tema, assim como outros estudos e reportagens sobre a Cannabis, a fim de dar um panorama geral sobre a planta, aspectos históricos, a legislação que envolve a droga e seu potencial mercadológico e terapêutico. Com a metodologia utilizada, foram encontradas cargas consideráveis e potencialmente prejudiciais de bactérias e fungos. 98% das amostras excederam os limites de bactérias estabelecidos pela Farmacopeia Brasileira e 67% excederam os limites estabelecidos para fungos filamentosos/leveduras. Das 49 amostras analisadas, somente uma exibiu contagem de microrganismos adequados ao consumo. Com as análises procedidas para identificação dos microrganismos presentes, foi possível identificar bactérias dos gêneros Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus e Kurthia, além de bacilos Gram-positivos e Gram-negativos não identificados; leveduras dos gêneros Candida e Geotrichum; e fungos filamentosos dos gêneros Aspergillus e Penicillium. Concluiu-se que a quantidade e os tipos de microrganismos encontrados na Cannabis ilegalmente comercializada em Minas Gerais configuram-se como um risco à saúde dos usuários e que a liberação do plantio para fins medicinais, atualmente em discussão no Congresso Nacional, pode ser uma alternativa para diminuir o risco à saúde pública. The objective of the present study was to evaluate the profile and microbiological load of samples of Cannabis sativa seized by the Civil Police of Minas Gerais, in order to evaluate them regarding the risk to users health, especially those who are immunosuppressed. National and international scientific articles on the subject were analyzed, as well as other studies and news on Cannabis, in order to provide an overview of the plant, historical aspects, legislation involving the drug and its market and therapeutic potential. With the methodology used, considerable and potentially harmful loads of bacteria and fungi were found. 98% of the samples exceeded the limits of bacteria established by the Brazilian Pharmacopeia and 67% exceeded the limits established for fungi/yeasts. From 49 samples analyzed, only one showed a count of microorganisms suitable for consumption. With the analysis used to identify the microorganisms present, it was possible to identify bacteria of the genera Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus and Kurthia, in addition to unidentified Gram-positive and Gram-negative bacilli; Candida and Geotrichum yeasts; and filamentous fungi of the genera Aspergillus and Penicillium. It was concluded that amount and types of microorganisms found in Cannabis illegally traded in Minas Gerais constitute a risk to the health of users and that the release of planting for medicinal purposes, currently under discussion in the National Congress, may be an alternative to reduce the risk to public health.

No estudo, avaliamos a susceptibilidade antimicrobiana, a presença de fatores de virulência codificadores de genes e do sistema CRISPR, bem como a capacidade de produzir enzimas líticas entre isolados clínicos (n=44) de E. faecalis e E. faecium. Todos os isolados de enterococos apresentaram fenótipo de multirresistência. Metade dos isolados de E. faecalis exibiram alto nível de resistência a gentamicina pelo teste fenotípico, vários deles abrigando o gene aac(6')Ie-aph(2″)Ia. O gene vanA foi o mais frequente entre os isolados de E. faecium resistentes à vancomicina. Foram observadas altas prevalências dos genes de virulência esp e efaA; o gene hyl foi mais associado com E. faecium, enquanto os genes ace and efaA foram mais frequentemente detectados em E. faecalis. A atividade de caseinase foi frequentemente detectada entre os isolados. Gelatinase e DNAse foram predominantes entre E. faecalis, enquanto a capacidade hemolítica foi frequente entre os isolados de E. faecium. Vinte e nove isolados apresentaram pelo menos um sistema CRISPR. Vários isolados de E. faecalis abrigavam o gene aac(6’)-Ie-aph(2’’)-Ia e um lócus CRISPR. Os lócus CRISPR foram positivamente correlacionados com a presença dos genes efaA e gelE, e as atividades de gelatinase e DNAse, enquanto a ausência de CRISPR foi relacionada com a presença do gene hyl. Esses resultados mostram que cepas de E. faecalis e E. faecium isolados de hospital contendo genes de fatores de virulência apresentam concomitantemente lócus CRISPR e determinantes de resistência a antimicrobianos. In this study, we evaluated the antimicrobial susceptibility, the presence of gene-encoding virulence factors and CRISPR systems, as well as the ability to produce lytic enzymes among clinical E. faecalis and E. faecium isolates (n=44). All enterococci isolates showed phenotypes of multi-drug resistance. Half of the E. faecalis isolates exhibited high-level gentamicin resistance phenotype, several of them harboring the aac(6')Ie-aph(2″)Ia gene. The gene vanA was the most frequent among vancomycin-resistant E. faecium. High prevalence of the virulence genes esp and efaA were observed; hyl gene was more associated with E. faecium, while ace and efaA genes were more frequently detected in E. faecalis. Caseinase activity was frequently detected among the isolates. Gelatinase and DNAse activities predominated among E. faecalis, while hemolytic capability was frequent among E. faecium isolates. Twenty-nine isolates showed at least one CRISPR system investigated. Several E. faecalis isolates harbored the aac(6’)-Ie-aph(2’’)-Ia gene and a CRISPR loci. CRISPR loci were positively correlated to efaA and gelE genes, and gelatinase and DNAse activities, while CRISPR loci absence was related to hyl gene presence. These results show that hospital- adapted strains of E. faecalis and E. faecium harboring virulence genes show the concomitant presence of CRISPR loci and antibiotic resistance determinants. Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Infecções neonatais causadas por microrganismos produtores de biofilme são mais persistentes e de difícil tratamento. Klebsiella spp. são importantes patógenos nosocomiais frequentemente envolvidos em surtos nas Unidades de Terapia Intensiva Neonatais (UTINs). Esses patógenos são capazes de produzir biofilme em superfícies bióticas e abióticas, aumentando a sua permanência nas superfícies. O objetivo desse estudo foi detectar a produção de biofilme em amostras de Klebsiella pneumoniae e Klebsiella oxytoca provenientes do ambiente, mãos dos profissionais de saúde e corrente sanguínea de neonatos internados uma UTIN. A detecção da produção de biofilme foi feita pela técnica de microplaca, utilizando cristal violeta para quantificação da biomassa, safranina para matriz extracelular e (2,3-Bis-(2- Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide) para avaliação da atividade metabólica. Além disso, as Unidades Formadoras de Colônia (UFC) foram contadas para a quantificação do número de células viáveis presentes no biofilme. No total, foram utilizadas no estudo 33 amostras de Klebsiella spp., sendo 28 amostras de Klebsiella pneumoniae e cinco de Klebsiella oxytoca. Todas as amostras foram forte produtoras de biofilme, porém 14 amostras produziram mais biofilme do que o controle, em pelo menos um dos três métodos colorimétricos utilizados e 15 foram menos eficientes nessa produção. A produção de biofilme das demais amostras não foram estatisticamente significantes. Comparando a produção de biofilme produzida pelas duas espécies, Klebsiella pneumoniae foi mais eficiente na produção de biomassa e matriz extracelular do que Klebsiella oxytoca. Já a atividade metabólica avaliada no biofilme das duas espécies, não houve diferenças estatisticamente significantes, assim como o número de células viáveis presentes no biofilme produzidas pelas duas espécies. A produção de biofilme por Klebsiella spp. garante uma maior permanência desses patógenos na unidade, devido a uma maior proteção garantida pela produção da matriz extracelular. Quanto maior o tempo de permanência desses microrganismos na unidade, maiores são as chances do neonato adquirir uma infecção. Esse estudo mostra a importância de microrganismos produtores de biofilme em uma UTIN e a utilização de três métodos colorimétricos e um quantitativo para a avaliação de diferentes parâmetros do biofilme, que constituem-se como ferramentas baratas e eficazes para a detecção da produção de biofilme bacteriano. Neonatal infections caused by biofilm-producing microorganisms are more persistent and difficult to treat. Klebsiella spp. are important nosocomial pathogens often involved in outbreaks in Neonatal Intensive Care Units (NICUs). These pathogens are capable of producing biofilm on biotic and abiotic surfaces, increasing their permanence on the surfaces. The aim of this study was to detect biofilm production in samples of Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca from the environment, hands of health professionals and bloodstream from a NICU. The detection of biofilm production was performed by microplate technique, using crystal violet for biomass quantification, extracellular matrix safranin and (2,3-Bis - (2- Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl) - 2H - Tetrazolium – 5 - Carboxanilide) for evaluation of metabolic activity. In addition, Colony Forming Units (CFU) were counted to quantify the number of viable cells present in the biofilm. In total, 33 samples of Klebsiella spp. were used in the study, being 28 samples of Klebsiella pneumoniae and five samples of Klebsiella oxytoca. All samples were strong biofilm producers, but 14 samples produced more biofilm than control, in at least one of the three colorimetric methods used and 15 were less efficient in this production. The biofilm production of the other samples were not statistically significant. Comparing the biofilm production produced by the two species, Klebsiella pneumoniae was more efficient in biomass and extracellular matrix production than Klebsiella oxytoca. As for the metabolic activity evaluated in the biofilm of the two species, there were no statistically significant differences, as well as the number of viable cells present in the biofilm produced by the two species. Biofilm production by Klebsiella spp. guarantees a longer permanence of these pathogens in the unit, due to the greater protection guaranteed by the extracellular matrix production. The longer the stay of these microorganisms in the unit, the greater the chance of the newborn acquiring an infection. This study shows the importance of biofilm-producing microorganisms in a NICU and the use of three colorimetric and quantitative methods for the evaluation of different biofilm parameters, which are cheap and effective tools for detecting bacterial biofilm production. Dissertação (Mestrado)

Os membros do gênero Trichophyton são importantes patógenos humanos causadores de micoses cutâneas, e a espécie T. rubrum é a responsável pela maioria dos casos. Atualmente há uma grande necessidade de desenvolver novos fármacos antifúngicos, visto que os medicamentos disponíveis apresentam problemas como falta de eficácia e elevada toxicidade. Diante disto, o objetivo do trabalho foi avaliar a atividade de nove compostos da classe de beta-amino cetonas contra espécies de Trichophyton. A atividade antifúngica foi determinada pelo ensaio de microdiluição em caldo, a partir do qual foram definidas as concentrações inibitórias mínimas (CIM) dos compostos. Dentre os compostos testados, o 3- (morfolina-4-il)-1-fenilpropan-1-ona (AB1) foi o mais ativo, apresentando CIM de 7,81 µg/mL contra T. rubrum. Este composto demonstrou também alguma seletividade para T. rubrum em comparação a outro fungo (Candida albicans - CIM de 250 µg/mL) e a bactérias [Staphylococcus aureus (CIM de 62,5 µg/mL) e Escherichia coli (CIM de 250 µg/mL)]. Além disso, AB1 exibiu atividade fungicida e foi igualmente ativo contra conídios e hifas de T. rubrum, sendo também ativo contra amostras clínicas de Trichophyton spp. Nestas amostras clínicas os valores de CIM de AB1 foram frequentemente menores do que aqueles do antifúngico de referência (fluconazol). Foi testada ainda a toxicidade de AB1 em células humanas (MRC-5), usando o ensaio com MTT, por meio do qual foram determinados os valores de IC50 (concentração que inibe 50% do crescimento celular) e do índice de seletividade (IS), os quais foram 37,75 µg/mL e 4,83, respectivamente. Também foi avaliada sua toxicidade in vivo em larvas de Galleria mellonella, onde o composto não demonstrou toxicidade até a maior concentração testada (160 mg/mL). Por fim, foi realizado o ensaio de microscopia confocal de varredura a laser, que revelou danos na membrana celular e inibição no crescimento das hifas de T. rubrum após o tratamento com AB1. O conjunto dos dados indica que o composto AB1 possui potencial para ser desenvolvido como novo agente antifúngico direcionado para o tratamento de micoses causadas por espécies de Trichophyton. The members of Trichophyton genus are important human pathogens that cause cutaneous mycoses, and the species T. rubrum is responsible for most cases. Currently, there is a great need to develop new antifungal drugs, since the available drugs has problems such as lack of effectiveness and high toxicity. In view of this, the aim of the work was to evaluate the activity of nine compounds of beta-amino ketones class against Trichophyton species. The antifungal activity was determined by the broth microdilution assay, from which the minimum inhibitory concentrations (MIC) of the compounds were defined. Among the compounds tested, 3-(morpholin-4-yl)-1-phenylpropan-1-one (AB1) was the most active, presenting MIC of 7.81 µg/ml against T. rubrum. This compound also demonstrated some selectivity for T. rubrum compared to another fungus (Candida albicans - MIC of 250 µg/ml) and bacteria [Staphylococcus aureus (MIC of 62.5 µg/ml) and Escherichia coli (MIC of 250 µg/ml)]. In addition, AB1 exhibited fungicidal activity and was equally active against conidia and hyphae of T. rubrum, being also active against clinical samples of Trichophyton spp. In these clinical samples, the MIC values of AB1 were often lower than those of the reference antifungal (fluconazole). AB1 toxicity in human cells (MRC-5) was also tested, using the MTT assay, by means of which the IC50 values (concentration that inhibits 50% of cell growth) and the selectivity index (SI) were determined, which were 37.75 µg/ml and 4.83, respectively. Its in vivo toxicity was also evaluated in Galleria mellonella, where the compound did not demonstrate toxicity until the highest concentration tested (160 mg/ml). Finally, a laser scanning confocal microscopy assay was performed, which revealed damage to the cell membrane and inhibition in the growth of T. rubrum hyphae after treatment with AB1. The data set indicates that the compound AB1 has the potential to be developed as a new antifungal agent directed to the treatment of mycoses caused by species of Trichophyton. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

O surgimento de cepas de Klebsiella pneumoniae resistentes aos carbapenêmicos e polimixinas é uma ameaça ao tratamento antimicrobiano. Neste estudo, nós investigamos as bases moleculares da resistência a colistina em 23 cepas de Klebsiella pneumoniae produtoras de carbapenemase do tipo KPC (KP-KPC), de colonização e infecção, provenientes de um surto ocorrido em um hospital público de ensino no Brasil. Utilizou-se a análise do sequenciamento completo do genoma para determinar os mecanismos de resistência a colistina, em uma cepa representante de cada clone, determinado a partir da técnica de Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Adicionalmente, foram realizadas análises genotípicas a partir da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para os seguintes genes de resistência (blaKPC, blaCTX-M, blaNDM, blaIMP, blaVIM, mcr-1) e virulência (fimH, fimA, wabG, iucC, Khe, ecpA, entB, iutA, mrkD, rmpA, kfU, ybtS, allS) e experimentos fenotípicos para avaliar a capacidade de formação de biofilme (ensaio de adesão, quantificação de células viáveis e formação de biofilme) e a característica de hipermucoviscosidade (string test). O estudo evidenciou dados preocupantes quanto ao consumo de antibióticos, principalmente de cefalosporinas de amplo espectro, carbapenêmicos e polimixinas o que pode estar relacionado com a emergência de cepas de KP-KPC resistentes a colistina. No total, foram identificados cinco padrões de perfis clonais com a maioria das cepas pertencentes ao clone A (82,6%). O estudo de clonalidade evidenciou também que a maioria das infecções recorrentes foram causadas pela mesma cepa que estava previamente colonizando ou infectando, e demonstrou-se a capacidade de múltiplos clones coexistir no mesmo paciente. Entre as amostras sequenciadas (N = 4, clones A, B, C e D), foram observados diferentes sequence types (STs: ST11, ST37, ST340 e ST1484). Foi possível observar um resistoma complexo com frequências elevadas de genes de resistência e virulência, e juntamente com testes fenotípicos foi documentada a presença de cepas altamente virulentas, sendo uma também hipermucoviscosa. De modo geral, elas foram produtoras de biofilme, independentemente da resistência a colistina, perfil clonal e o sítio de isolamento, aumentando a sua persistência e dificultando a erradicação. Pela primeira vez no Brasil, foi identificado um fragmento de 3.055 pares de base inserido no gene mgrB, composto pela sequência de inserção ISEcp1 e o gene blaCTX-M-15 na cepa 40KPC (representativa do clone dominante A) o que resultou em resistência adquirida concomitantemente as cefalosporinas de amplo espectro e colistina. O sequenciamento do genoma permitiu a identificação de uma espécie caracterizada como Klebsiella quasipneumoniae subsp. similipneumoniae, altamente virulenta, hipermucoviscosa e resistente a colistina, que pode ser outro importante reservatório de genes de resistência. Os aspectos apresentados aqui, reforçam K. pneumoniae como um patógeno bem-sucedido em causar infecções, resultando na sua rápida expansão e persistência em ambientes hospitalares. A detecção rápida de amostras resistentes aos carbapenêmicos e colistina, aliados a implementação de medidas mais eficazes de controle de infecção, são de importância crucial para evitar a disseminação de clones de alto risco de KP-KPC resistentes a colistina, como evidenciados nesse estudo. The emergence of Klebsiella pneumoniae strains resistant to carbapenems and polymyxins (polymyxin B and colistin) is a threat to antimicrobial treatment. In this study, we investigated the molecular basis of colistin resistance in 23 Klebsiella pneumoniae KPC-producing strains (KPC-KP), of colonization and infection, from an outbreak that occurred in a public teaching hospital in Brazil. Whole genome sequencing (WGS) analysis was used to determine the mechanisms of resistance to colistin in a representative strain of each clone determined from the Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) technique. In addition, genotype analyzes were performed from the Polymerase Chain Reaction (PCR) for the following resistance genes (blaKPC, blaCTX-M, blaNDM, blaIMP, blaVIM and mcr-1) and virulence (fimH, fimA, wabG, khe, ecpA, entB, iutA, mrkD, rmpA, kfu, ybtS and allS) and phenotypic experiments to evaluate the biofilm formation capacity (adhesion assay, viable cell quantification and biofilm formation) and the hypermucoviscosity (string test). This study evidenced concerns regarding the use of antibiotics, mainly broad-spectrum cephalosporins, carbapenems and polymyxins, which may be related to the emergence of colistin-resistant KPC-KP strains. In total, five patterns of clonal profiles were identified with most strains belonging to clone A (82.6%). The clonality study also showed that most recurrent infections were caused by the same strain that was previously colonizing or infecting, and was demonstrated the ability of multiple clones to coexist in the same patient. Among the sequenced strains (N = 4, clones A, B, C and D) different sequence types were observed, (STs: ST11, ST37, ST 340 and ST 1484). It was possible to observe a complex resistome with high frequencies of resistance and virulence genes , and together with phenotypic tests was documented the presence of highly virulent strains, being one also hypermucoviscous. In general, the strains were biofilm producers, regardless of colistin resistance, clonal profile and isolation site, increasing their persistence and making difficult eradication. For the first time in Brazil, a fragment of 3,055 base pairs inserted in the mgrB gene, composed of the insertion sequence ISEcp1 and the gene blaCTX-M-15 in the 40KPC strain (representative of the dominant clone A) was identified, which resulted in acquired resistance concomitantly with broad-spectrum cephalosporins and colistin. The WGS allowed the identification of a species characterized as Klebsiella quasipneumoniae subsp. similipneumoniae, highly virulent, hypermucoviscous and colistin-resistant, which may be another important reservoir of resistance genes. The aspects presented here reinforce K. pneumoniae as a successful pathogen in causing infections, resulting in its rapid expansion and persistence in hospital settings. Rapid detection of carbapenem and colistin-resistant strains, together with the implementation of effective infection control measures, are crucial important in preventing the dissemination of high-risk clones of KP-KPC resistant to colistin, as evidenced in this study. Tese (Doutorado)

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O sorgo biomassa (SB) é um tipo de sorgo sensível ao fotoperíodo com alta produtividade em biomassa e maior conteúdo em polissacarídeos (celulose e hemiceluloses), tornando-se uma cultura promissora para aplicação na produção de etanol de segunda geração (etanol 2G). Neste contexto, na primeira etapa desse estudo, avaliou-se a eficiência de um extrato enzimático produzido por fermentação em estado sólido (FES) utilizando um consórcio entre os fungos Aspergillus fumigatus SCBM6 e A. niger SCBM1 na hidrólise de SB bruto e após a retirada de extrativos (SE). Após a FES, com relação à produção de hemicelulases, foram obtidos picos máximos de xilanase (375 U g-1) no 4° dia e β-xilosidase (150 U g-1) no 2° dia de co-cultivo. Para celulases, os picos máximos de produção foram observados no 1° dia de fermentação (80 U g-1) para β-glicosidase e no 6° dia (80 U g-1) para endoglucanase (CMCase) e celulase em papel de filtro (FPase) (4 U g-1). Após a hidrólise enzimática utilizando o extrato produzido pelo consórcio fúngico, a liberação de xilose e glicose aumentou em SE cerca de 10x (2,5 g.L-1 após 12 horas), indicando que a retirada de extrativos influenciou positivamente na eficiência da hidrólise e nos rendimentos em açúcares fermentescíveis. A retirada dos extrativos também representou um fator positivo para a diminuição da formação de compostos inibidores da fermentação alcóolica, como o ácido fórmico. Na segunda etapa, foi avaliado o rendimento em etanol a partir de hidrolisados de sorgo biomassa previamente submetido a três diferentes pré-tratamentos químicos (PTs): hidróxido de sódio (NaOH - 1 e 2%), ácido clorídrico (HCl - 0,34 e 1,5%) e peróxido de hidrogênio alcalino (H2O2 - 5 e 7,36%) utilizando as enzimas comerciais Celluclast 1,5 L (10FPU) e Novozym 188 (30CBU) nas hidrólises e a levedura Pichia stipitis na fermentação alcóolica. Entre os PTs usados, o PT com H2O2 a 7,36% foi o mais eficiente na remoção de lignina e preservação da fração polissacarídica. Após as hidrólises, observou-se que as concentrações de xilose se mantiveram praticamente inalteradas nos hidrolisados de SB ¨in natura¨ e SE (sem extrativos). No entanto, nos hidrolisados de sorgo pré-tratado, observou-se um grande aumento na concentração de xilose, principalmente nos hidrolisados de sorgo pré-tratado com HCl e H2O2. Esse aumento foi ainda mais expressivo nos hidrolisados de sorgo pré-tratado com HCl 0,34% e com H2O2 5%. Com relação à glicose, a amostra de sorgo pré-tratado com H2O2 foi o que favoreceu a maior liberação desse monossacarídeo após a hidrólise enzimática. Além disso, todos os hidrolisados apresentaram baixas concentrações de inibidores. Após as hidrólises, os maiores rendimentos em etanol foram obtidos nas fermentações com os hidrolisados de SB pré-tratado com HCl (0,34 e 1,5%), obtendo-se 3,84 e 3,61g.L-1 de etanol, correspondendo respectivamente a 16,15 e 14,62% de rendimento. Os resultados obtidos indicaram que o sorgo biomassa apresenta potencial para utilização como matéria prima na produção de etanol e abrem perspectivas para estudos adicionais a fim de otimizar o processo e obter rendimentos ainda mais expressivos em etanol. Sorghum biomass (SB) is a kind of sorghum sensitive to photoperiod with high productivity in biomass, and higher content in polysaccharides (cellulose and hemicelluloses), becoming a promising crop for application in the production of second generation ethanol (2G ethanol) . In this context, in the first stage of this study, the efficiency of an enzymatic extract produced by solid state fermentation (SSF) was evaluated using a consortium between the fungi Aspergillus fumigatus SCBM6 and A. niger SCBM1 in the hydrolysis of crude SB and after the removal of extractives (SE). After SSF, with respect to hemicellulase production, maximum peaks of xylanase (375 U g -1) on day 4 and β-xylosidase (150 U g -1) were obtained on 2nd day of co-cultivation. For cellulases, peaks of production were observed on the 1st day of fermentation (80 U g-1) for β-glycosidase and on 6 day (80 U g-1) for endoglucanase (CMCase) and cellulase on filter paper (FPase) (4 U g-1). After the enzymatic hydrolysis using the extract produced by the fungal consortium, the xylose and glucose release increased in SE about 10x (2.5 gL-1 after 12 hours), indicating that the withdrawal of extractives positively influenced hydrolysis efficiency and yields in fermentable sugars. The extraction of the extractives also represented a positive factor for the decrease of the formation of inhibitor compounds of alcoholic fermentation, such as formic acid. In the second stage, the ethanol yield was evaluated from hydrolysates of sorghum biomass previously submitted to three different chemical pre-treatments (PTs): sodium hydroxide (NaOH-1 and 2%), hydrochloric acid (HCl = 0.34 and 1.5%) and alkaline hydrogen peroxide (H2O2-5 and 7.36%) using the commercial enzymes Celluclast 1.5 L (10FPU) and Novozym 188 (30CBU) in the hydrolysis and the yeast Pichia stipitis in the alcoholic fermentation. Among the evaluated PTs, PT with 7.36% H2O2 was the most efficient in lignin removal and preservation of the polysaccharide fraction. After the hydrolysis, it was observed that the xylose concentrations remained practically unchanged in the hydrolysates of SB ¨in natura¨ and SE (without extractives). However, in the pre-treated sorghum hydrolysates, a large increase in xylose concentration was observed, especially in the hydrolysates of pretreated HCl and H2O2 sorghum. This increase was even more significant in sorghum hydrolysates pretreated with 0.34% HCl and 5% H2O2. Regarding glucose, the sorghum pretreated with H2O2 favored the highest release of this monosaccharide after enzymatic hydrolysis. In addition, all hydrolysates showed low concentrations of inhibitors. After hydrolysis, the highest ethanol yields were obtained in fermentations carried out with the hydrolysates of SB pretreated with HCl (0.34 and 1.5%), obtaining 3.84 and 3, 61g.L-1 ethanol, corresponding respectively to 16.15 and 14.62% yield. The results indicated that sorghum biomass presents potential for use as raw material in the production of ethanol, opening prospects for additional studies in order to optimize the process and obtain more expressive yields in ethanol. Tese (Doutorado)

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:15:38Z No. of bitstreams: 1 Daiana Cristina Silva Rodrigues Dissertacao completa.pdf: 1173916 bytes, checksum: ee3dd60c206e5d7f4f6c92e1f427e671 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:15:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Daiana Cristina Silva Rodrigues Dissertacao completa.pdf: 1173916 bytes, checksum: ee3dd60c206e5d7f4f6c92e1f427e671 (MD5) Previous issue date: 2019-04-10 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) isolated from respiratory tract secretions in Cystic Fibrosis (CF) patients has risen dramatically over the past decade. Persistent MRSA infection in these patients has been associated with more rapid decline in lung function, increased hospitalization and mortality. Molecular typing studies of MRSA chronically colonizing/infecting CF patients is still scarce. The aim of this study was to perform molecular typing in MRSA isolates from 12 pediatric patients with CF chronically colonized/infected. From the results of the previous study of our group (antimicrobial resistance profile, SCCmec types, presence/absence of lukS/F genes and PFGE pulses), 80 isolates were selected for the current study. The sequencing of the X region of the protein A gene (spa) was used for molecular typing of the 80 MRSA isolates selected. Vancomycin minimum inhibitory concentration (MIC) were determined by broth microdilution in all selected isolates. The highest rates of resistance were observed to erythromycin (62/80, 77.5%), ciprofloxacin (41/80, 51.25%) and clindamycin (27/80, 33.75%); none of the isolates were resistant to linezolid. Three SCCmec types were detected: II (14/80, 17.5%), III (7/80, 8.75%) and IV (59/80, 73.75%). Only 8.75% (7/80) of the isolates were PVL positive (all SCCmec IV). Thirty-eight PFGE pulsotypes were identified in the 80 MRSA isolates, showing high genetic diversity. The most common spa types were t002 (52.5%), t539 (15%) and t779 (8.8%). We identified a new type of spa (t18066) in three isolates. Characteristically, the spa t002 was the most distributed, detected in 10 of the 12 patients. Multidrug-resistant were observed for all typed isolates as t539, t779 and t8784. Only three spa types were mapped on the ST (Sequence Type) types using SpaServer database: t002 (ST5 or ST231), t021 (ST30, ST33 or ST55) and t318 (ST30), all were positive for SCCmec IV. These results suggest a possible presence of two epidemic clones circulating in these patients: USA800/Pediatric (ST5, SCCmec IV) and Oceania Southwest Pacific Clone - OSPC (ST30, SCCmec IV). The typed isolates showed long repetitive sequences, most with more than eight repeats in the X region of the spa gene. All of the samples were susceptible to vancomycin, and the MIC for 86% of the isolates was of 1 μg/mL. We conclude that a homogeneity of spa types was observed in the isolates per patient, demonstrating a possible persistence capacity of these lineages, which contributes to the chronicity of the colonization/infection. The study of the distribution of MRSA strains in CF patients is important for implement the strategies for dissemination control. A prevalência de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA) isolados em cultura de secreção respiratória de pacientes com Fibrose Cística (FC) aumentou na última década. A infecção persistente por MRSA nestes pacientes tem sido associada ao rápido declínio da função pulmonar, aumento da hospitalização e mortalidade. Estudos de tipificação molecular de MRSA colonizando/infectando cronicamente pacientes com FC ainda é escasso. O objetivo deste estudo foi realizar a tipificação molecular em amostras de MRSA oriundas de 12 pacientes pediátricos com FC apresentando colonização/infecção crônica. A partir dos resultados do estudo anterior do nosso grupo (perfil de resistência aos antimicrobianos, tipos de SCCmec, presença/ausência dos genes lukS/F e pulsotipos PFGE), foram selecionadas 80 amostras. O sequenciamento da região X do gene da proteína A (spa) foi realizado para tipificação molecular das amostras selecionadas. A técnica de microdiluição em caldo foi utilizada para determinar a concentração inibitória mínima (CIM) de vancomicina em todas as amostras selecionadas. Os maiores percentuais de resistência foram observados para os antimicrobianos eritromicina (62/80, 77,5%), ciprofloxacina (41/80, 51,25%) e clindamicina (27/80, 33,75%); não houve resistência à linezolida. Os seguintes tipos de SCCmec foram identificados: II (14/80, 17,5%), III (7/80, 8,75%) e IV (59/80, 73,75%). Os genes lukS/F estavam presentes em apenas 8,75% (7/80) das amostras, todas albergando o SCCmec IV. Foram identificados 38 pulsotipos pela técnica PFGE nas 80 amostras, apresentando alta diversidade genética. Nove tipos de spa foram identificados, sendo os tipos t002 (52,5%), t539 (15%) e t779 (8,8%) os mais frequentes. Identificamos um novo tipo de spa (t18066) em três amostras. O spa t002 foi o mais distribuído, presente em 10 dos 12 pacientes. Todas as amostras tipificadas como t539, t779 e t8784 foram multidroga resistentes. Foi possível prever o ST (Sequence Type) de três tipos de spa através do banco de dados do SpaServer: t002 (ST5 ou ST231), t021 (ST30, ST33 ou ST55) e t318 (ST30), todos albergando SCCmec IV. Estes resultados sugerem uma possível presença de dois clones epidêmicos circulando nestes pacientes: USA800/Pediátrico (ST5, SCCmec IV) e Oceania Southwest Pacific Clone - OSPC (ST30, SCCmec IV). As amostras tipificadas apresentaram sequências repetitivas longas, a maioria com mais de oito repetições na região X do gene spa. Não houve resistência à vancomicina, sendo a CIM de 1 µg/mL (69/80, 86%) a mais prevalente. Concluímos uma homogeneidade de distribuição de tipos de spa por paciente, demonstrando uma possível capacidade de persistência destas linhagens, o que pode contribuir para a cronicidade da colonização/infecção. O entendimento da distribuição das cepas de MRSA em pacientes com FC é importante na orientação de estratégias para o controle da disseminação.

Achatina fulica, popularmente denominado caramujo africano, é um molusco terrestre pulmonado que atualmente está na lista das 100 piores espécies invasoras do mundo, sendo encontrada em quase todos os continentes, causando desequilíbrio ambiental. O suco digestivo de Achatina fulica (SDAf) é uma fonte deenzimas muito atraente ao ponto de vista biotecnológico. Este trabalho teve como objetivo caracterizar o suco digestivo quanto a sua diversidade enzimática e induzir através de alimentação específica, a produção de enzimas de interesse, como exemplo a fosfatase alcalina, para posteriormente realizar a purificação da desta enzima pela metodologia de espumação, ou separação adsortiva por bolhas (―foaming‖), comparadamente a outras técnicas conhecidas. As quantidades de proteínas totais dos SDAf foram determinadas por quatro métodos distintos Bradford, BCA, Biureto e Lowry, sendo o último, como padrão. Foram encontradas atividades frente aos substratos polissacarídicos amilopectina de arroz, arabana de maçã, arabinogalactana de café cereja, celulose bacteriana, celulose-Kfaft de P. taeda, goma guar, fitoglicogênio de milho, hemicelulose de bagaço de cana , inulina, paredes celulares de Neurospora crassa, pectina cítrica, pululana e xiloglucana de tamarindo. A indução alimentar dos indivíduos não proporcionou diferenças significativas nos níveis enzimáticos especificamente visados quando os substratos foram inulina ou pectina. Foram encontradas elevadas atividades enzimáticas correlatas a glicosidases do tipo issacaridases frente aos substratos pNFglucosídeos. Os maiores níveis de atividades específicas foram para β – Glucosidase, β – Glucuronidase e β – Galactosidase. O mesmo foi observado para uma enzima de maior valor comercial, a fosfatase alcalina (ALP). A hidrólise com o substrato P-nitrofenil-fosfato e, neste caso, o indutor inulina na dieta, favoreceu a secreção de maior atividade enzimática. A presença da ALP no SDAf foi confirmada através de um zimograma. A purificação para a ALP com as colunas de cromatografia de troca iônica e fracionamento por precipitação de sulfato de amônio não propiciaram bons resultados, o que foi logrado através de coluna de espumação (foaming‖). Em comparação com a enzima nativa, a inclusão de saponina a 0,25 mg/mL permitiu um enriquecimento na ordem de 19%. Achatina fulica, popularly known as the African snail, is a pulmonary terrestrial mollusc that is currently on the list of the 100 worst invasive species in the world, being found in almost all continents, causing environmental imbalance. The digestive juice of Achatina fulica is a very attractive source of enzymes from a biotechnological point of view. This work aimed to characterize the digestive juice (SDAf) as to its enzymatic diversity and to induce through specific feeding, the production of enzymes of interest, for example alkaline phosphatase, to later carry out the purification of this enzyme by the foaming methodology , or foaming adsorption, compared to other known techniques. Total protein amounts of SDAf were determined by four distinct methods Bradford, BCA, Biureto and Lowry, the latter being determined as standard. The following activities were found in relation to the polysaccharide substrates: rice amylopectin, apple arabana, cherry coffee arabinogalactan, bacterial cellulose, P. taeda cellulose-Kfaft, guar gum, corn phytoglycogen, bagasse hemicellulose, inulin, Neurospora cell walls citrus pectin, pullulan, tamarind xyloglucan. However, the dietary induction of the subjects did not provide significant differences in the enzymatic levels when the substrates were inulin or pectin. High enzymatic activities correlated with glycosidases of the disaccharidases type were found against the pNF-glucoside substrates. The highest levels of specific activities were for β - Glucosidase, β - Glucuronidase and β - Galactosidase. The same was observed for a commercially available enzyme, alkaline phosphatase (ALP), to hydrolyze with the substrate pNFF. The presence of ALP in the SDAf was confirmed by a zymogram. Purification for ALP with ion exchange chromatography columns and fractionation by ammonium sulfate precipitation did not provide good results, which was achieved through a foaming column. In comparison with the native enzyme, the inclusion of saponin at 0.25 mg / mL allowed for a 19% enrichment.

FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Introdução: As infecções de corrente sanguínea (ICS) hospitalares são responsáveis por frequências significativas de morbidade e mortalidade em Unidades de Terapia Intensiva Neonatal (UTIN), resultando em hospitalização prolongada e aumento nos custos hospitalares, principalmente em neonatos de baixo peso. Objetivos: O presente estudo propôs determinar a patogênese de infecções de corrente sanguínea relacionada ao cateter (ICS-RC) causadas por Staphylococcus epidermidis utilizando a técnica de PFGE (“Pulsed Field Gel Electrophoresis”) bem como avaliar os fatores de risco para mortalidade entre os neonatos com pesos ≤ 1500 gramas e >1500 gramas. Adicionalmente, foram determinados os fatores de risco para desenvolvimento de ICS causadas por S. epidermidis utilizando estudo caso x controles pareados. Material e métodos: O estudo incluiu neonatos da UTI do Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia durante o período de Outubro de 2010 a agosto de 2012. Para o estudo da patogênese foram utilizadas amostras de S. epidermidis recuperadas do sangue, pele no sítio de inserção, canhão do cateter, assim como das mucosas da narina e intestino, a partir de 48 horas até 14 dias da utilização do Cateter ou até obtenção de cultura positiva para S. epidermidis e da ponta do cateter obtidas após sua remoção. Foi verificado a presença dos genes mecA e o ACME (Arginine Catabolic Mobile Element) por reação em cadeia da polimerase (PCR), em S. epidermidis. Resultados: No total, 125 neonatos desenvolveram ICS (27,0%), com 98 (78,4%) definidos como de natureza hospitalar, totalizando 124 episódios. A sepse precoce acometeu 20% dos neonatos com ICS com 48% de mortalidade, principalmente entre os neonatos com peso ≤ 1500 gramas. A presença de ventilação mecânica e sepse clínica foram os fatores associados com mortalidade entre os neonatos de maior peso. No estudo caso x controle pareados, todas as variáveis analisadas [Tempo de hospitalização (P 1500 grams. Methods: The study included neonates from the ICU of Hospital de Federal University of Uberlândia during the period from October 2010 to August 2012. For the study of the pathogenesis, were used samples of S. epidermidis recovered from blood, skin at the insertion site, hub, as well as the mucosa of the nostril and gut, from 48 hours to 14 days after the use of the Catheter or until obtaining a positive culture for S. epidermidis and catheter tip obtained after removal. In addition, were determined the risk factors for the development of BSI caused by S. epidermidis using case study x paired control. In addition to verifying the presence of mecA genes and ACME (Arginine Catabolic Mobile Element) by polymerase chain reaction (PCR), in S.epidermidis. Results: In total, 125 neonates developed BSI (27.0%), with 98 (78.4%) defined as hospital-type, totaling 124 episodes. Sepsis preterm affected 20% of newborns with BSI with 48% mortality, mainly in neonates weighing ≤ 1500 grams. The presence of mechanical ventilation and clinical sepsis were the factors associated with mortality among the heaviest neonates. In the case study x paired control, all variables analyzed [Hospitalization time (P

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-05T19:35:19Z No. of bitstreams: 1 Bruna Ribeiro Sued Karam Tese completa.pdf: 1646929 bytes, checksum: 385a0256c863198183c9e9be8a7a4e05 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-05T19:35:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruna Ribeiro Sued Karam Tese completa.pdf: 1646929 bytes, checksum: 385a0256c863198183c9e9be8a7a4e05 (MD5) Previous issue date: 2018-06-15 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Coagulase-negative staphylococci (SCN) are found in the skin and mucous membranes of humans and other animals, since some species are a constituent part of the normal flora of these same sites, which may constitute a reservoir for SCN. Staphyloccus haemolyticus is the second most frequent species of human blood cultures, and is frequently associated with antibiotic resistance. The present study aimed the isolation, identification, the resistance profiles to antimicrobial agentes and analysis of virulence factors of S. haemolyticus isolates. MALDI-TOF MS was used in to identify the species. The antimicrobial resistance profiles were detrmined by the disk diffusion test and MIC determination (oxacillin, vancomycin, linezolid, moxifloxacin and teicoplanin). The capacity of the biofilm formation was investigated by testing the Congo Red agar and adhesion assays abiotic surfaces (glass and polystyrene) in the presence and absence of antimicrobial in addition to the PCR icaA, fbp, atl and aap genes. The influence of exogenous enzymes on preformed biofilms was performed with Proteinase K and DNAse treatment. The lethality assays were performed using nematodes Caenorhabditis elegans. The results demonstrated that 25% of the samples were identified as S. haemolyticus. All isolates were multidrug resistance, oxacillin-resistant and vancomycin-sensitive, 32% were linezolid-resistant, 88% were moxifloxacin-resistant and 4% were teicoplanin-resistant. The presence of the icaA gene was detected in 60% of the samples, the fbp and atl genes in 96% of the isolates and the aap gene was detected in 76%. Although most of the samples showed the ability to produce slime and/or biofilm both in the absence and presence of antimicrobials, no correlation was observed with the presence of the icaA gene emphasizing the multifactor nature of the biofilm production. Treatment with Proteinase K and DNAse reduced the intensity of the biofilm formed at different levels to 72% and 60% of the samples respectively. High levels (≤ 90%) of worm mortality were observed within 5 days of infection. Both specific antimicrobial resistance mechanisms, as well as the overcoming of protective barriers, such as bacterial biofilms, need to be considered for the development of new antibacterial therapies. The increase in the number of cases of infections and the multifactorial aspects that favor the pathogenicity of S. haemolyticus should continue to be investigated, since the dissemination of multiresistant microorganisms in the hospital environment has become a growing challenge for public health. Os Staphylococcus coagulase-negativos (SCN) são encontrados na pele e mucosas de seres humanos e outros animais, já que algumas espécies são parte constituinte da microbiota normal destes mesmos sítios, e podem constituir um reservatório para SCN. Staphylococcus haemolyticus é a segunda espécie, dentre os SCN, mais isolada de hemoculturas humanas, sendo uma das que apresenta elevada resistência aos antimicrobianos. O presente estudo teve como objetivo principal, a identificação, a determinação dos perfis de resistência aos agentes antimicrobianos e análise de fatores de virulência em S. haemolyticus isoladas de sangue. A técnica de MALDI-TOF MS foi empregada na determinação da espécie e comparada com o método semi-automatizado VITEK 2. Os perfis de resistência aos antimicrobianos foram verificados através de disco-difusão e determinação da CIM (oxacilina, vancomicina, linezolida, moxifloxacina e teicoplanina). A capacidade de produção de biofilme foi investigada pelos testes do Ágar Vermelho do Congo e ensaios de aderência em superfícies abióticas (poliestireno e vidro) na presença e ausência dos antimicrobianos, além de PCR para os genes icaA, atl, fbp e aap. A influência de enzimas exógenas em biofilmes pré-formados foi realizada com o tratamento de Proteinase K e DNAse. Os ensaios de letalidade foram realizados utilizando nematódeos Caenorhabditis elegans. Os resultados demonstraram que 25% das amostras foram identificadas como S. haemolyticus. Todas as amostras foram multirresistentes, oxacilina-resistentes e vancomicina-sensíveis, 32% foram linezolida-resistentes, 88% moxifloxacina-resistente e 4% teicoplanina-resistente. A presença do gene icaA foi detectada em 60% das amostras, os genes fbp e atl em 96% das amostras e o gene aap foi detectado em 76%. Apesar da maioria das amostras ter apresentado capacidade de produzir slime e/ou biofilme tanto na ausência quanto na presença de antimicrobianos, não foi observada total correlação com a presença do gene icaA enfatizando a natureza multifatorial da produção de biofilme. O tratamento com Proteinase K e com DNAse reduziu a intensidade do biofilme formado em diferentes níveis para 72% e 60% das amostras respectivamente. Foram observados altos níveis (≤ 90%) de mortalidade de vermes em até 5 dias de infecção. Tanto os mecanismos de resistência aos antimicrobianos, como também a superação de barreiras protetoras, como biofilmes bacterianos, precisam ser considerados para o desenvolvimento de novas terapias antibacterianas. O aumento no número de casos de infecções e os aspectos multifatoriais que favorecem a patogenicidade de S. haemolyticus devem continuar sendo investigados, uma vez que, a disseminação de micro-organismos multirresistentes no ambiente hospitalar, têm se tornado um crescente desafio para a saúde pública.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:17:02Z No. of bitstreams: 1 Ana Carolina da Cruz Campos Dissertacao completa.pdf: 2252356 bytes, checksum: b400ce2fe3e5d3a6c50b76439cf6e5e9 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:17:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Carolina da Cruz Campos Dissertacao completa.pdf: 2252356 bytes, checksum: b400ce2fe3e5d3a6c50b76439cf6e5e9 (MD5) Previous issue date: 2018-03-18 Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro The metallic ions iron, cooper and zinc are essentials elements to survival of both microorganisms and hosts. To microorganisms, metallic ions take part of proteins structures and perform an important role in enzymatic activities as co-factors. However, these metals might also have a deleterious effect to cells, since in high concentrations they take part in free radical generation, act on peroxidation of membrane lipids and block action of fundamental enzymes to cellular metabolism. On a previous study, inhibition of iron capitation altered biofilm formation and adherence of enteroaggregative E. coli (EAEC) to epithelial cells. Hence, we decided to investigate the metallic ions influence in adherence of EAEC strains to biotic and abiotic surfaces. The strains used on this study had been already characterized regarding their fimbriae expression. Besides other characteristics, such as presence of iron capitation genes in strains, were considered when we evaluated the responses to metallic ions. Data showed that there is no parallel between these characteristics and the strains response to metallic ions. Nevertheless, results showed that metallic ions, especially cooper and zinc ions reduce biofilm formation in most of the tested strains. Additionally, other aspects like substrate influence biofilm formation. On this work, we observed that metallic ions interfere with biofilm formation in a distinguish way, there is a different response depending of the substrate, glass or polystyrene. We also tested if the presence of oxygen interfered with biofilm formation and it might increase or reduce biofilm in some of the strains. In addition, the strains showed increased or reduced hydrophobicity in the presence of metallic ions. Metals not only altered biofilm formation but also reduced cell viability on the biofilm. The cytotoxicity assays were performed in eukaryotic cells to verify the metals influence on cellular viability. Three cells lines were tested, HEp-2, T84 and Caco-2. The most resistant cell line, Caco-2, was chosen to adherence assays. We observed that metals modify the adherence pattern of some bacterial strains. In conclusion metallic ions interfere with EAEC pathogenesis, probably altering the surface of bacteria. O íons metálicos de ferro, cobre e zinco são elementos essências para a sobrevivência de microrganismos e de mamíferos. Para os microrganismos os íons metálicos participam da estrutura de proteínas exercendo um papel importante na atividade enzimática como co-fator. No entanto, esses metais também podem ter efeitos deletérios para as células. Uma vez que em altas concentrações participam da geração de radicais livres, atuam na peroxidação de lipídeos de membrana e bloqueiam a ação de enzimas fundamentais para o metabolismo celular. Em um estudo recente foi demonstrado que a inibição da captação de íons ferro alterou a formação de biofilmes e a aderência das cepas EAEC. Foram usados neste estudo cepas já caracterizadas quanto à expressão de fimbrias. Além disto, outras características, como a presença de genes de captação de ferro pelas cepas foram levados em conta na finalidade de se encontrar alguma relação destas características com as respostas aos íons metálicos. Nossos resultados mostraram que de fato não se tem nenhum paralelo entre essas características e a resposta das cepas aos íons metálicos. Contudo, resultados obtidos mostram que os íons metálicos principalmente os íons de cobre e zinco reduziram a formação de biofilme para a maioria das amostras testadas. Além disto, a formação de biofilme também foi influenciada por outros aspectos como o substrato. Os íons metálicos foram capazes de interferir na formação do biofilme de forma distinta. Dependendo do substrato, vidro ou poliestireno, levou a uma resposta diferente na formação de biofilme. Também foi testado se a presença de oxigênio interfere na formação do biofilme. Para algumas cepas na presença de metais e em aerobiose ocorreu aumento da formação de biofilme, enquanto para outras ocorreu redução. As cepas apresentaram também alteração na hidrofobicidade na presença dos íons metálicos. Os metais além de alterar a formação de biofilme também reduziram a viabilidade das células no biofilme. Foi realizado o teste de citoxidade das células eucarióticas para verificar a influência dos metais na viabilidade celular. Foram testados três linhagens, HEp-2, T84 e Caco-2. A mais resistente, a Caco-2, foi escolhida para os experimentos de aderência. Observamos que os metais alteraram o padrão de aderência de algumas cepas bacterianas. Todos esses resultados sugeriram que os íons metálicos podem interferir em processos da patogênese de EAEC, provavelmente alterando a superfície bacteriana.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:15:35Z No. of bitstreams: 1 Leticia Nunes Marones de Gusmao Dissertacao completa.pdf: 1330290 bytes, checksum: 2570c66c17ccc0aef2267615cb7f4054 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:15:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leticia Nunes Marones de Gusmao Dissertacao completa.pdf: 1330290 bytes, checksum: 2570c66c17ccc0aef2267615cb7f4054 (MD5) Previous issue date: 2018-02-21 Corynebacterium striatum has been associated with an increasing number of cases of healthcare-associated infections (HAI), representing an important issue, as they increase mortality and morbidity rates and prolong hospitalizations, resulting, thus, in economic and social damages.Virulence factors such as resistance to antimicrobial agents, ability to adhere to diverse surfaces and to yield biofilm, slime, hydrolytic and proteolytic enzymes may contribute to bacterial pathogenicity. We aimed to analyze, retrospectively and prospectively, the epidemiological, microbiological and virulence aspects of C. striatum strains from the Hospital of the University of the State of Rio de Janeiro - HUPE / UERJ, identified during the period of August/2009 to December/2016. At first we confirmed the efficacy (100% compatibility with 16SrRNA and rpoB gene sequencing) of the MALDI-TOF technique and the screening scheme proposed by the LDCIC/UERJ for C. striatum identification. In the other hand, the semi-automated API Coryne System has presented very low scores with the possibility of failure to identify C. striatum. Eighty nine C. striatum strains were sent from HUPE/UERJ to LDCIC for identification, with the highest number of isolates in 2011/2012 (48.31%). The general ICU and UCIPG section had the highest percentages of isolated C. striatum strains (17.98% and 13.48%). Most of the samples were isolated from the respiratory tract (51.69%) and blood (16.85%). The clonality of 18 samples were investigated by PFGE. Ten PFGE types (I to X) were identified, with eight of them (I, II, V-X) related to blood samples and catheters. Seventy two samples were submitted to the disc diffusion antimicrobial susceptibility test and 90.3% had a multidrug resistance (MDR) profile. Vancomycin was the only antimicrobial agent with 100% bacterial sensitivity. The ermX, aphA1 and cmx resistance genes were investigated by conventional PCR in four MDR samples (pulse I, II, V) and two MDS samples (pulse III and IV). All MDR samples showed amplicons for all genes whereas MDS samples were negative for all genes. All tested samples has showed slime production in the Congo Red Medium and yielded biofilm on the polyurethane catheter and polystyrene surfaces, except 2401 BR-RJ/2012-MDR strain. Ultrastructural analysis by scanning electron microscopy has demonstrated mature biofilms after 48 hours of incubation, allowing observes hollow voids and the production and accumulation of extracellular material. The results indicate that MDR and MDS C. striatum biofilm producers were responsible for severe infections, including infections in patients using invasive medical devices, at HUPE/UERJ. Our data emphasize that C. striatum should not be underestimated, neglected or dismissed as contaminants by health professionals. This infectious agent should be take into account as a pathogen related to health-care associated infections (HAI) in Brazil and efforts should be made to monitoring and elaborate strategies for the prevention, control and treatment of this corynebacteriosis. Corynebacterium striatum tem sido associado a um número crescente de casos de infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS), representando um importante agravo, uma vez que aumentam as taxas de mortalidade e morbidade e prolongam as internações acarretando prejuízos do ponto de vista econômico e social. Atributos de virulência como multirresistência a antimicrobianos, habilidade de aderir às superfícies diversas e constituir biofilme, expressão de slime e enzimas hidrolíticas e proteolíticas podem se associar e contribuir para a patogenicidade bacteriana. O presente trabalho teve como objetivo analisar retrospectiva e prospectivamente os aspectos epidemiológicos, microbiológicos e do potencial de virulência de cepas de C. striatum oriundas do Hospital da Universidade do Estado do Rio de Janeiro - HUPE/UERJ, identificadas durante o período de Agosto/2009 a Dezembro/2016. Inicialmente, confirmamos a eficácia (100% de compatibilidade com o sequenciamento dos genes 16SrRNA e rpoB) da técnica de MALDI-TOF e do esquema de triagem proposto pelo LDCIC/UERJ para a identificação de C. striatum, enquanto que o sistema semiautomatizado API Coryne apresentou escores muito baixos com possibilidade de falhas na identificação de C. striatum. No período analisado 89 amostras oriundas do HUPE/UERJ foram identificadas como C. striatum, com maior concentração de isolamentos nos anos de 2011/2012 (48,31%). Os setores de UTI geral e UCIPG foram os que apresentaram maiores percentuais de isolamento (17,98% e 13,48%). A maior parte das amostras foi oriunda do trato respiratório (51,69%) e de sangue (16,85%). Os perfis clonais de 18 amostras foram investigados por PFGE sendo identificados 10 pulsotipos (I a X), estando oito deles (I, II, V-X) relacionados a amostras de sangue e cateteres. Dentre as 72 amostras submetidas ao teste de susceptibilidade por disco-difusão, 90,3% apresentaram perfil de multirresistência, sendo a vancomicina o único antimicrobiano com 100% de sensibilidade. Para a pesquisa dos genes de resistência ermX, aphA1 e cmx por PCR convencional, foram selecionadas quatro amostras MDR (pulsotipos I, II, V) e duas amostras MDS (pulsotipos III e IV). Todas as amostras MDR apresentaram amplicons para todos os genes enquanto que as amostras MDS foram negativas para os três genes. Com exceção da amostra 2401 BR-RJ/2012-MDR, todas as amostras testadas revelaram produção de slime em Meio Vermelho do Congo e foram fortes produras de biofilme na superfície de cateter de poliuretano e em poliestireno. A análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de varredura demonstrou a formação de biofilmes maduros após 48 horas de incubação permitindo a observação de hollow voids e a produção e acúmulo de material extracelular. Os resultados indicam que C. striatum MDR e MDS produtores de biofilme são responsáveis por quadros de infecções severas de vários tipos, inclusive em pacientes fazendo uso de dispositivos médicos invasivos, no HUPE/UERJ. Nossos dados enfatizam que C. striatum não deve ser subestimado, negligenciado ou descartado como mero contaminante pelos profissionais da saúde. Esse agente deve ser incluído entre os pátogenos concernentes às infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) no Brasil e esforços devem ser empenhados no sentido de se manter o seu monitoramento e elaborar estratégias para a prevenção, controle e tratamento dessa corinebacteriose.

O aumento da sobrevida de neonatos prematuros admitidos em Unidades de Terapia Intensiva Neonatal (UTIN) está associado à elevação da ocorrência de infecções invasivas. A colonização das mãos de profissionais de saúde por micro-organismos patogênicos, capazes de expressar fatores de virulência, como Candida spp., é preocupante devido ao máximo contato entre pacientes e profissionais em UTIN. Os objetivos deste estudo foram: verificar a taxa de infecções bacterianas e fúngicas da UTIN do Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia, bem caracterizar fenotipicamente isolados de Candida spp. provenientes das mãos dos profissionais de saúde dessa unidade. Os neonatos incluídos no estudo foram acompanhados diariamente através do sistema NHSN, sendo coletadas informações como idade gestacional (IG), peso ao nascer, uso de dispositivos invasivos e de antimicrobianos, ocorrência de infecções e tempo de internação. Os isolados provenientes das mãos dos profissionais de saúde foram avaliados quanto a produção de fatores de virulência e susceptibilidade aos antifúngicos. A pesquisa de atividade hemolítica e de DNAse foi feita utilizando ágar sangue e DNAse, respectivamente. A produção de biofilme foi avaliada através da capacidade de redução do sal de sódio XTT e a avaliaçãoda susceptibilidade dos isolados aos antifúngicos foi feita através da metodologia de microdiluição em caldo. Os resultados deste estudo foram: a taxa de infecção hospitalar igual a 12/1000 pacientes-dia. IG, peso, SNAPPE>24 e uso de dispositivos como cateteres, ventilação mecânica e nutrição parenteral foram estatisticamente significativos para ocorrência de infecções bacterianas e fúngicas. O óbito foi 2,6 vezes maior naqueles neonatos com infecção fúngica, em relação aqueles com infecção bacteriana. Foram estudados 50 isolados de Candida spp. dos quais 19 foram C. parapsilosis stricto sensu, três C. metapsilosis, um C. orthopsilosis, sete C. albicans, seis C. famata, cinco C. lusitaniae, três C. krusei, dois C. kefyr, dois C. tropicalis, um C. glabrata e um C. guilliermondii. 49 isolados foram capazes de expressar pelo menos um dos três fatores de virulência pesquisados, sendo que 17 expressaram simultaneamente todos os 3 fatores. Setenta e oito por cento dos isolados foram sensíveis aos três antifúngicos. Esses resultados ressaltam a importância da vigilância epidemiológica constante e de medidas de controle efetivo de infecções na unidade e que isolados de Candida provenientes de colonização das mãos de profissionais de saúde são capazes de expressar importantes fatores de virulência. The increase in survival of preterm infants admitted to Neonatal Intensive Care Units (NICUs) is associated with an increase in the occurrence of invasive infections. The colonization of the hands of health professionals by pathogenic microorganisms capable of expressing virulence factors, such as Candida spp., Is worrisome due to the constant contact between patients and professionals in NICU. The objectives of this study were: to verify the rate of bacterial and fungal infections in a NICU of the Clinical Hospital of Federal University of Uberlândia, to characterize phenotypically isolated Candida spp. from the hands of health professionals in the neonatology department. The newborns included in the study were monitored daily through the NHSN system, with information such as: gestational age (GI), birth weight, use of invasive and antimicrobial devices, infections and length of hospital stay. Isolates from the hands of health professionals were evaluated for the production of virulence factors and antifungal susceptibility. The hemolytic activity and DNAse were investigated using blood agar and DNAse, respectively. Biofilm production was evaluated through the XTT sodium salt reduction ability and the evaluation of the susceptibility of the isolates to the antifungals was done through the broth microdilution methodology. The results of this study were: the hospital infection rate equals 12/1000 patient-days. GI, weight, SNAPPE> 24 and use of devices such as catheters, mechanical ventilation and parenteral nutrition were statistically significant for bacterial and fungal infections. Death was 2.6 times higher in those with fungal infection compared to those with bacterial infection. Fifty isolates of Candida spp. of which 19 were C. parapsilosis stricto sensu, three C. metapsilosis, one C. orthopsilosis, seven C. albicans, six C. famata, five C. lusitaniae, three C. krusei, two C. kefyr, two C. tropicalis, a C. glabrata and a C. guilliermondii. 49 isolates were able to express at least one of the three virulence factors studied, and 17 simultaneously expressed all 3 factors. Seventy-eight percent of the isolates were sensitive to the three antifungals. These results demonstrated the importance of constant epidemiological surveillance and measures of effective control of infections in the neonatology sector and that isolates of Candida from colonization of the hands of health professionals are able to express important factors of virulence. Tese (Doutorado) 2020-02-02

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:16:55Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_FINAL_PUBLICADA_Dayane_Alvarinho_de_Oliveira.pdf: 1432488 bytes, checksum: 06cc52abc8cb28b353ce09ea79aa623b (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:16:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_FINAL_PUBLICADA_Dayane_Alvarinho_de_Oliveira.pdf: 1432488 bytes, checksum: 06cc52abc8cb28b353ce09ea79aa623b (MD5) Previous issue date: 2017-07-26 The parasitism caused by Trichuris spp. Has global relevance, impacting the medical and veterinary area. The T. trichiura species infects about 795 million people, being predominant in countries with tropical climate that present precarious conditions of basic sanitation. Human infection mainly affects children in the school age group, causing impairment in their physical and cognitive development. The tricurid nematodes develop a strategy of fixation in the host that promotes perforations in epithelial mucosa and to understand the parasite/host interaction is necessary to better describe the infection establishment process, the development of the parasite and the pathophysiological evolution of this parasite. By expanding this information, the developments may be linked to the control and the search for new chemotherapeutic alternatives. In the present work we used the T. muris experimental infection model in Swiss webster mice to evaluate the changes promoted by parasitism in the chronic phase, including histopathological analyzes of the large intestine, biochemical and hematological parameters, composition and alteration in the intestinal microbiota of the mice and the analyses of the bacteria in the submucosa of the cecum. The infection developed in the animals an iron deficiency anemia, due to a strong iron deficiency, the thickening of the mucosa and submucosa due to an intense cellular infiltrate. In addition, we identified the presence of bacteria in the inner layers of the intestinal tissue. The microorganisms can be accessed the submucosa by mucosal ruptures promoted by nematode during the infection. We proposed that the tissue alterations and the intense cellular infiltrate was associated of the nematode presence and the bacteria invasion. The understanding of the bacterial invasion mechanisms and the interaction of these microorganisms with the nematode opens new frontiers in relation to the pathophysiological mechanisms of the human and veterinary trichuriasis. O parasitismo provocado por Trichuris spp. tem relevância global, impactando a área médica e veterinária. A espécie T. trichiura infecta cerca de 795 milhões de pessoas, sendo predominante em países com clima tropical que apresentam condições precárias de saneamento básico. A infecção humana afeta principalmente crianças na faixa etária escolar, causando prejuízo no seu desenvolvimento físico e cognitivo. Os nematoides tricurídeos desenvolvem uma estratégia de fixação no hospedeiro que promove perfurações na mucosa intestinal e compreender a biologia desta interação parasito/hospedeiro é necessário para melhor descrever o processo de estabelecimento da infecção, o desenvolvimento do parasito e a evolução fisiopatológica desta parasitose. Ampliando estas informações, os desdobramentos podem estar atrelados ao controle e a busca de novas alternativas quimioterápicas. No presente trabalho utilizamos o modelo de infecção experimental T. muris em camundongos suíços para avaliar as alterações promovidas pelo parasitismo em fase crônica, incluindo análises histopatológicas do intestino grosso, parâmetros bioquímicos e hematológicos, composição e alteração na microbiota intestinal dos camundongos e a análise de estruturas bacterianas na submucosa do ceco. A infecção desenvolveu nos animais uma anemia ferropriva, devido a forte carência de ferro, o espessamento da mucosa e submucosa em decorrência de um intenso infiltrado celular. Além disso, identificamos a presença de bactérias nas camadas mais internas do tecido intestinal. Estes micro-organismos possivelmente tiveram acesso à estas camadas por rupturas na mucosa epitelial do tecido intestino grosso, promovida pelo nematoide durante o desenvolvimento da infecção. Estamos propondo que as alterações teciduais e o intenso infiltrado celular observado está associado à presença do parasito e das bactérias invasoras. A compreensão deste mecanismo de invasão bacteriana e da interação destes micro-organismos com o nematoide abre novas fronteiras em relação a aos mecanismos fisiopatológicos da tricuríase humana e veterinária.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:16:52Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_FINAL_PUBLICADA_Sara_Wilis_Cussuol_Gomes.pdf: 2548614 bytes, checksum: 6e4e572d6fcf41c991083009f21e54d0 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:16:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_FINAL_PUBLICADA_Sara_Wilis_Cussuol_Gomes.pdf: 2548614 bytes, checksum: 6e4e572d6fcf41c991083009f21e54d0 (MD5) Previous issue date: 2017-05-12 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico The urinary tract infection (UTI) is a wide incidence disease and can occur at any age, being more frequent in woman. Pregnancy, urinary system malformations, immunossupression, diabetes and invasive procedures on urinary tract are some of risk factors to the development of UTI. Escherichia coli is the most common uropathogen frequently isolated in community and hospitals infections. However, Gram-positive bacilli (GPBs) are also microorganisms commonly isolated from urine culture of elderly, pregnant or individuals who have other risk factors for UTI. Until recently, these microorganisms were misclassified, underreported, and even discarded as likely contaminants. Corynebacterium urealyticum and others Corynebacterium species have been isolated as UTI responsible agents. In addition, there is great concern about strains of antimicrobial resistant GPBs and the emergence of microorganisms resistant to multiple drugs. Therefore, this study aimed to investigate the prevalance and pattern of antimicrobial susceptibilty of GPB isolated from UTI, as well as, evaluate metallo-beta-lactamase-producing and multidrug resistant GPB adhesion pattern to HEp-2 cells. Sixty-five strains of GPBs were isolated from urine samples of patients during the period from September 2015 to August 2016 in a basic unit of private health care in Nova Friburgo / RJ. UTI was more prevalent in women (94.42%), being more often among patients aged 65 to 93 years (37.5%). Mass spectrometry analysis (MALDI-TOF) identified 60 (92.3%) strains of the genus Corynebacterium sp., four (6.1%) Brevibacterium sp., and one (1.54%) Brevibacillus sp. Corynebacterium amycolatum represented 50.8% of all samples isolated in this work, followed by C. aurimucosum (20.83%), C. coyleae (4.17%), C. minutissimum (1.39%), C. propinquum (1.39%), C. striatum (1.39%), B. ravenspurgense (1.53%) and Brevibacillus agri (1.53%). The microrganisms showed more resistance to nitrofurantoin (81.5%), erythromycin (69.2%), penicillin (56.9%), clindamycin (49.2%), trimethoprim/sulfamethoxazole (52.3%), ciprofloxacin (43.1%) and ampicillin (40%). Regarding the production of metallo-beta-lactamase, four strains of C. amycolatum positive were detected through the disk diffusion technique using beta-lactam antibiotics (imipenem and ceftazidime) with metallo-beta-lactamase inhibitors (EDTA and MPA). Twelve bacilli (18.5%) showed multidrug resistance and were submited to the HEp-2 cell adhesion test. Three samples exhibited an aggregative adherence-like pattern to HEp-2 cells (AA) and nine showed localised adherence (LA). This work demonstrates the importance of recognizing Gram-positive bacilli of Corynebacterium genus as uropathogen and demonstrates the need for standardization of identification methods applicable to laboratory routine. Furthermore, reaffirms the concern with emerging antimicrobial resistance and the need for more demanding policies that limit and control the use of antibiotics. A infecção urinária (ITU) é uma doença de grande incidência e pode ocorrer em qualquer idade, sendo mais frequente em mulheres. Gravidez, malformações do sistema urinário, imunossupressão, diabetes e procedimentos invasivos no trato urinário são alguns dos fatores de risco para o desenvolvimento de ITU. Escherichia coli é o uropatógeno mais frequentemente isolado em casos de infecções comunitárias e hospitalares. Entretanto, bastonetes Gram-positivos (BGP) são também microrganismos comumente isolados em uroculturas de indivíduos idosos, grávidas ou que têm outros fatores de risco para ITU. Até recentemente, esses microrganismos eram classificados incorretamente, sub-relatados e até descartados como prováveis contaminantes. Corynebacterium urealyticum e outras espécies de Corynebacterium têm sido isoladas como agentes responsáveis pelas ITUs. Além disso, existe uma grande preocupação com cepas de BGP resistentes a antimicrobianos e com a emergência de microrganismos resistentes a múltiplos fármacos. Portanto, este estudo teve como objetivo investigar a prevalência e o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos de bastonetes Gram-positivos isolados de ITU, bem como, avaliar a produção de metalo-beta-lactamase por esses patógenos e padrões de aderência de BGP resistentes a múltiplas drogas às células HEp-2. Foram isoladas 65 cepas de BGP a partir de amostras de urina de pacientes durante o período de setembro de 2015 a agosto de 2016 em uma unidade básica de atenção a saúde privada no município de Nova Friburgo/ RJ. A ITU foi mais prevalente em mulheres (94,42%), sendo mais encontrada entre pacientes de 65 a 93 anos de idade (37,5%). A análise por espectrometria de massa (MALDI-TOF) identificou 60 cepas (92,3%) do gênero Corynebacterium, 4 (6,1%) do gênero Brevibacterium e 1 (1,54%) do gênero Brevibacillus. Corynebacterium amycolatum representou 50,8% de todas as amostras isoladas neste trabalho, seguida por C. aurimucosum (23,1%), C. coyleae (4,6%), C. minutissimum (1,53%), C. propinquum (1,53%), C. striatum (1,53%), Brevibacterium ravenspurgense (1,53%) e Brevibacillus agri (1,53%). Os microrganismos apresentaram maior resistência à nitrofurantoína (81,5%), eritromicina (69,2%), penicilina (56,9%), clindamicina (49,2%), trimetoprim/sulfametoxazol (52,3%), ciprofloxacina (43,1%) e ampicilina (40%). Em relação à produção de metalo-beta-lactamase, foram detectadas 4 cepas de C. amycolatum positivas através da técnica de difusão de disco utilizando antibióticos beta-lactâmicos (imipenem e ceftazidima) com inibidores de metalo-beta-lactamase (EDTA e MPA). Doze bastonetes (15,5 %) mostraram resistência a múltiplas drogas e foram submetidos à avaliação do padrão de aderência às células HEp-2. Três amostras exibiram um padrão de aderência agregativa (AA) e nove apresentaram aderência localizada (AL). Este trabalho demonstra a importância do reconhecimento de bastonetes Gram-positivos do gênero Corynebacterium como uropatógenos e a necessidade de padronização dos métodos de identificação aplicáveis à rotina laboratorial. Além disso, reafirma a preocupação com a resistência antimicrobiana emergente e a necessidade de políticas mais exigentes que limitem e controlem o uso de antibióticos.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:16:56Z No. of bitstreams: 1 Lorraine Herdy Heggendornn Dissertacao completa.pdf: 2060475 bytes, checksum: fcf2fc8380d13a80bcc7e95832d6d190 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:16:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lorraine Herdy Heggendornn Dissertacao completa.pdf: 2060475 bytes, checksum: fcf2fc8380d13a80bcc7e95832d6d190 (MD5) Previous issue date: 2017-04-27 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Health care associated infections have become a serious problem of public health worldwide. Corynebacterium species have been reported with increasing frequency as nosocomial pathogens, especially in immunocompromised patients. In this perspective, this study aimed to identify coryneform microorganisms isolated from patients hospitalized in a referral hospital in the mountainous region of Rio de Janeiro, determine the profile of sensitivity of these microorganisms, and evaluate these strains potential to adhesion in HEp-2 cells. Thus, 214 samples from individuals hospitalized and various clinical samples were analyzed by traditional phenotypic methods. The data indicated the presence of 09 irregular Gram-positive bacilli. The strains were isolated from the following clinical samples: bronchoalveolar fluid (06 strains), surgical wound secretion (01 strain), blood culture (01 strain), and vaginal secretion (01 strain). Conventional phenotypic characterization has not completed the identification of the isolates. The final identification was performed by Maldi-Tof technique, which identified 100% of genus and species stains. The data indicated the presence of four Corynebacterium accolens (44.45%), three Corynebacterium amycolatum (33.35%), one Corynebacterium minutissimum (11.10%), and one Corynebacterium falsenii (11.10%). Susceptibility profiles to antimicrobials were performed by disk diffusion test agar (Kirby-Bauer). The isolates exhibited heterogeneous susceptibility profiles to antimicrobials. Corynebacterium amycolatum (stains 28, 59B and 134) and Corynebacterium accolens (stain 80) showed multiresistance profiles. Two isolates (samples 28 and 134) showed imepenem resistance, and were valued of the production of metallo-beta-lactamase by disk method approach. The metallo-beta-lactamase was detected in both. To test the samples as their adhesion capacity, HEp-2 cells were submitted a period of 3 hours to infection at 37ºC. All strains were able to adhere in HEp-2 cells. The most frequent phenotype was aggregative adhesion (71%), predominant in C. amycolatum. This study provides important epidemiological data of prevalence of infections caused by corynebacteria in the mountainous region of Rio de Janeiro. It contributes to the knowledge of the antimicrobial susceptibility profile of commonly underestimated microorganisms as etiological agents of human infections. It addresses the mechanisms of adhesion involved in these infections, and highlights the need for health professionals to remain alert to the possibility of infectious by Corynebacterium spp. in different body sites, in the hospital environment, especially multidrug-resistant samples to antimicrobials commonly used in clinical routine. As infecções relacionadas à assistência à saúde tornaram-se um grave problema de saúde pública mundial. Espécies do gênero Corynebacterium têm sido relatadas com uma frequência crescente como patógenos nosocomiais, especialmente em pacientes imunocomprometidos. Nesta perspectiva, o presente estudo teve como objetivo identificar microrganismos corineformes isolados de pacientes internados, em um hospital de referência da região serrana do Estado do Rio de Janeiro, determinar o perfil de sensibilidade destes microrganismos e avaliar os padrões de aderência destas cepas em células epiteliais humanas da linhagem HEp-2. Neste sentido, 214 amostras clínicas, provenientes de indivíduos hospitalizados e de espécimes clínicos diversos foram analisadas por metodologia fenotípica tradicional. Dentre as amostras analisadas, 09 bacilos Gram-positivos irregulares (BGPIs) foram isolados. As cepas foram isoladas a partir dos seguintes espécimes clínicos: lavados broncoalveolares (06 cepas), secreção de ferida cirúrgica (01 cepa), hemocultura (01 cepa) e secreção vaginal (01 cepa). A caracterização fenotípica convencional não concluiu a identificação dos isolados estudados. A identificação definitiva das amostras foi realizada a partir da metodologia de Maldi-Tof, a qual identificou gênero e espécie em 100% dos isolados. Os dados indicaram a presença de quatro Corynebacterium accolens (44,45%), três Corynebacterium amycolatum (33,35%), um Corynebacterium minutissimum (11,10%) e um Corynebacterium falsenii (11,10%). Os perfis de susceptibilidade aos antimicrobianos foram verificados através do teste de disco-difusão em ágar (Kirby-Bauer). Os isolados exibiram perfis heterogêneos de susceptibilidade. Corynebacterium amycolatum (amostras 28, 59B e 134) e Corynebacterium accolens (isolado 80) apresentaram perfil multirresistente. Dois isolados (amostras 28 e 134) apresentaram resistência ao imepenem e foram submetidas à avaliação da produção de metalo-beta-lactamase pelo método do disco aproximação. A produção de metalo-beta-lactamase foi detectada em ambas. Para testar as amostras quanto sua capacidade de adesão foram utilizadas células epiteliais HEp-2, que foram submetidas ao período de infecção de 3 horas a 37ºC. Todas as amostras testadas foram capazes de aderir em células HEp-2. O fenótipo mais frequente foi o de adesão agregativa (71%), predominante na espécie C. amycolatum. Este estudo fornece importantes dados epidemiológicos, referentes à prevalência de infecções ocasionadas por corinebactéria na região serrana do Rio de Janeiro. Além disso, contribui para o conhecimento do perfil de susceptitibilidade antimicrobiana de microrganismos comumente subestimados como agentes etiológicos de infecções humanas. Por fim, foram abordados os mecanismos de adesão envolvidos nestas infecções e a necessidade dos profissionais da área da saúde permanecerem atentos à possibilidade de processos infecciosos ocasionados por corinebactérias em diferentes sítios e no ambiente hospitalar, sobretudo amostras multirresistentes aos antimicrobianos comumente empregados na prática clínica.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:16:53Z No. of bitstreams: 1 TESE_FINAL_PUBLICADA_Edgard_de_Freitas_Vianna.pdf: 2112429 bytes, checksum: cd95628ce91c98e3e47d66aea8183c15 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:16:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE_FINAL_PUBLICADA_Edgard_de_Freitas_Vianna.pdf: 2112429 bytes, checksum: cd95628ce91c98e3e47d66aea8183c15 (MD5) Previous issue date: 2017-03-30 Burkholderia cepacia Complex (CBc) comprises 20 closely related species that stand out as opportunistic pathogens in Cystic Fibrosis (CF) and are associated with a considerable impact on the morbimortality of these patients. Phylogenetic species and subtypes within the Burkholderia cenocepacia species vary in relation to transmissibility and virulence. Due to inconsistencies in the correct identification of CBc species by phenotypic methods, molecular methods are recommended. However, there is no universal molecular methodology that can be applied to all microorganisms, especially in clinical laboratories. In this sense, the methodology based on mass spectrometry appears as an alternative. The aim of this study was to evaluate the performance of the Matrix Associated Laser Desorption-Ionization (MALDI-TOF MS) compared to Bcc species identification by recA gene sequencing in CF patients. We analyzed 43 samples obtained from different clinical specimens from January 2014 to February 2016. A total of 18 (41.86%) samples of Burkholderia vietnamiensis, 14 (32.55%) Burkholderia cenocepacia subtype IIIB, eight (18.6%) Burkholderia cenocepacia subtype IIIA, two (4.65%) Burkholderia contaminans and one (2.32%) Burkholderia cepacia were identified by sequencing the recA gene. Identification by MALDI-TOF MS was evaluated considering prior culture in Sheep Blood Agar (SBA) and Columbia Agar Base (CAB). 81.39% of the SBA samples were identified at the genus level (log ≥1.70-1.99) and 41.86% at the species level (log ≥2.00), corresponding to 11 samples of B. vietnamiensis (61.11%), four of B. cenocepacia IIIB (28,57%) and two of B. cenocepacia IIIA (25%). Only 39.53% of the samples cultured in CAB were identified at the genus level and 16.27% in species: B. vietnamiensis (n = 4, 22.22%) and B. cenocepacia IIIB (n = 2; 14,28%). B. cepacia sample was identified from both media and the two B. contaminans samples were not identified. Performance of MALDI-TOF MS varied with the use of different culture media and the identification at the species level was less than 50% considering the cut-off points established by the manufacturer. Thus, we evaluated whether the reduction of cut-off points would increase the accuracy of the identification. With the reduction of the escore to ≥1.70-1.99 (considered as reliable identification at genus level), another three samples of B. vietnamiensis, four of B. cenocepacia IIIA and seven of B. cenocepacia IIIB were identified, corresponding to an increase of 32.55% (in relation to the escore ≥ 2.00). However, the number of samples analyzed does not allow this criterion to be used and additional studies are required. Despite the limitations of MALDI-TOF MS as a typing method, the use of bioinformatics tools to analyze the mass spectra obtained in MALDI-TOF MS allowed the clustering of 96% of the phylogenetic subtypes IIIA and IIIB of B. cenocepacia strains. We also observed the proximity of samples related to the same patient through the nodes formed in the phylogenetic tree, but the absence of comparison with a reference typing method does not allow to infer their use for epidemiological purposes. O Complexo Burkholderia cepacia (CBc) compreende 20 espécies intimamente relacionadas que se destacam como patógenos oportunistas na Fibrose Cística (FC) e estão associadas a um impacto considerável na morbimortalidade desses pacientes. As espécies e subtipos filogenéticos dentro da espécie Burkholderia cenocepacia variam entre si em relação a transmissibilidade e a virulência. Devido a inconsistências na correta identificação das espécies do CBc por métodos fenotípicos, os métodos moleculares são recomendados. Entretanto não existe uma metodologia molecular universal que possa ser aplicada para todos os micro-organismos, especialmente em laboratórios clínicos. Nesse sentido, a metodologia baseada em espectrometria de massa surge como uma alternativa. O objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho do Matrix Associated Laser Desorption-Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) comparado à identificação das espécies do CBc através do sequenciamento do gene recA em pacientes com FC. Foram analisadas 43 amostras obtidas de diferentes espécimes clínicos no período de janeiro de 2014 a fevereiro de 2016. Um total de 18 (41,86%) amostras de Burkholderia vietnamiensis, 14 (32,55%) Burkholderia cenocepacia subtipo IIIB, oito (18,6%) Burkholderia cenocepacia subtipo IIIA, duas (4,65%) Burkholderia contaminans e uma (2,32%) Burkholderia cepacia foram identificadas pelo sequenciamento do gene recA. A identificação pelo MALDI-TOF MS foi avaliada considerando o cultivo prévio em Ágar Sangue de Carneiro (ASC) e Columbia Ágar Base (CAB). 81,39% das amostras provenientes do ASC foram identificadas a nível de gênero (log ≥1.70-1.99) e 41,86% a nível de espécie (log ≥2.00), correspondendo a 11 amostras de B. vietnamiensis (61,11%), quatro de B. cenocepacia IIIB (28,57%) e duas de B. cenocepacia IIIA (25%). Apenas 39,53% das amostras cultivadas em CAB foram identificadas a nível de gênero e 16,27% em espécie: B. vietnamiensis (n=4; 22,22%) e B. cenocepacia IIIB (n=2; 14,28%). A amostra de B. cepacia foi identificada a partir de ambos os meios e as duas amostras de B. contaminans não foram identificadas. O desempenho do MALDI-TOF MS variou com a utilização de diferentes meios de cultura e a identificação a nível de espécie foi inferior a 50% considerando os pontos de corte estabelecidos pelo fabricante. Assim, avaliamos se a redução dos pontos de corte aumentaria a acurácia da identificação. Com a minoração do escore para ≥1.70-1.99 (considerado como identificação confiável a nível de gênero), foram identificadas mais três amostras de B. vietnamiensis, quatro de B. cenocepacia IIIA e sete de B. cenocepacia IIIB, correspondendo a um aumento de 32,55% (em relação ao escore ≥ 2.00). Entretanto o número de amostras analisadas não permite que esse critério seja utilizado sendo necessário estudos adicionais. Apesar da limitação do MALDI-TOF MS como método para tipagem, a utilização de ferramentas de bioinformática para análise dos espectros de massa obtidos no MALDI-TOF MS permitiu o agrupamento de 96% dos subtipos filogenéticos IIIA e IIIB de cepas B. cenocepacia. Observamos também através dos nós formados na árvore filogenética a proximidade das amostras relacionadas ao mesmo paciente, porém a ausência de comparação com um método de tipagem de referência não permite inferir a sua utilização para fins epidemiológicos.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-06T20:54:24Z No. of bitstreams: 1 Ivy Ortega Medeiros Zanon da Silva Tese completa.pdf: 7446607 bytes, checksum: 2bf44304051d01fc1a91f4dc593a32ba (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-06T20:54:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ivy Ortega Medeiros Zanon da Silva Tese completa.pdf: 7446607 bytes, checksum: 2bf44304051d01fc1a91f4dc593a32ba (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Until the last decade, Sporothrix schenkii was known as the only etiological agent of animal and human sporotrichosis. By 2007, it was described at least three other pathogenic species composing the Sporothrix schenckii complex. In Rio de Janeiro, S. schenckii sensu stricto and S. brasiliensis represent the two most relevant epidemiological species, with the last one associated with the zoonotic transmission by felines. This mode of transmission affects already all the South/Southeast regions of Brazil. One of the most relevant aspects on the study of mycosis is to understand how fungal pathogens can survive in the host, using the mechanisms of evasion against the innate immunological system. One of the most important fungicidal strategies of the host is the generation of reactive species of oxygen by the innate immune defense cells. It s known that infections caused by S. brasiliensis are usually more aggressive than the ones caused by S. schenckii s. str.. The aim of this work was to analyze and to compare the capacity of both resist against the oxidative stress. Moreover, we prospected signaling pathways that participate of this response. S. schenckii s. str. and S. brasiliensis present different susceptibilities to the oxidative stress, as S. brasiliensis prove to be more resistant to the oxidative stress caused by hydrogen peroxide and menadione. We had analyzed and compared sequences of important genes, components of signaling pathways of the transcription factor AP-1 and of the MAPK Hog1, already related to oxidative stress response in other fungi, as Candida albicans. By using in silico analyzes of the genome, we observed that S. schenckii s. str. and S. brasiliensis have an AP-1 orthologue sequence to other fungal species and also genes related to antioxidant proteins that can be regulated to AP-1. The gene encoding the AP-1 protein was sequenced and translated in silico with characteristic motifs and residues. This analysis shown that the SsAP1 (for S. schenckii s. srt.) and SbAP1 (for S. brasiliensis) amino acid sequence of AP1 presented no differences. AP-1 regulates antioxidant enzymes, and the expression and activity of SOD or catalase were also unchanged in both species after stress induced by hydrogen peroxide. Also, these two species have an orthologue sequence of Hog1, a MAPK pathway involved in stress response in fungi. Comparing the Sporothrix spp. sequences with other fungi revealed possible modifications in the aminoacid sequences of S. brasiliensis. This putative alteration might be related to the resistance phenotype against oxidative stress, demonstrated in S. brasiliensis. It was observed the phosphorylation of the TGY motif of Hog1 of S. schenckii s. str., however, no differences was detected after the oxidative stress induced by hydrogen peroxide. In S. brasiliensis, it was not observed any phosphorylation of Hog-1, despite the experimental conditions. Moreover, it was proposed a new model for the regulation of AP-1 and Hog-1 of S. schenckii and S. brasiliensis that is distinct of the ones described in the literature, with the identification of new histidine kinase-like involved in regulation of Hog1 and a 1-cys peroxiredoxin or an atypical 2-cys peroxiredoxin, involved in the regulation of AP-1. Até a última década, Sporothrix schenckii era conhecido como único agente etiológico da esporotricose. Em 2007, foi descrito que existiam pelo menos mais três espécies crípticas patogênicas formando o complexo Sporothrix schenckii. No Estado do Rio de Janeiro, Sporothrix schenckii stricto sensu e Sporothrix brasiliensis representam as duas espécies epidemiológicas relevantes, sendo a última associada à transmissão zoonótica da esporotricose por felinos, que já atinge toda a região Sul/Sudeste. Um dos aspectos relevantes nas micoses é compreender como os patógenos fúngicos podem sobreviver no hospedeiro utilizando mecanismos de evasão ao sistema imune inato. Uma das estratégias fungicidas mais importantes do hospedeiro é a geração de espécies reativas de oxigênio pelas células de defesa. Sabe-se que infecções causadas por S. brasiliensis são mais graves do que as causadas por S. schenckii str. s. O objetivo deste trabalho foi analisar e comparar a capacidade de resistência destas espécias ao estresse oxidativo. Além disso, foram prospectadas algumas das vias de sinalização que participam dessa resposta. S. schenckii str. s. e S. brasiliensis apresentam diferentes susceptibilidades ao estresse oxidativo, uma vez que S. brasiliensis mostra-se mais resistente às condições de estresse por peróxido e menadiona. Foram analisadas e comparadas sequências de genes importantes, componentes das vias de sinalização do fator de transcrição AP-1 e da MAPK Hog1, envolvidos na resposta ao estresse oxidativo em outros fungos, como Candida albicans. Por análise in silico do genoma, observou-se que tanto S. schenckii str. s. quanto S. brasiliensis têm uma sequência ortóloga à AP-1 comparado a outras espécies fúngicas e ainda, que apresentam genes relacionados com proteínas antioxidantes que podem ser reguladas por AP-1. O gene para AP-1 foi sequenciado e a tradução in silico mostrou motivos e resíduos característicos, mas não foi observada diferença na sequência do gene de S. schenckii str. s. e S. brasiliensis, sendo denominados SsAP1 e SbAP1, respectivamente. AP-1 regula enzimas antioxidantes, não sendo também evidenciada diferença na expressão ou atividade de SOD e catalase nestas espécies após o estresse com peróxido de hidrogênio. Foi encontrada uma sequência ortóloga ao gene que codifica Hog1, componente de uma via de MAPK envolvida na resposta ao estresse em fungos. A comparação das sequências de Sporothrix spp. com outros fungos revelou possíveis alterações em S. brasiliensis. Esta alteração putativa pode estar relacionada ao fenótipo de resistência ao estresse oxidativo, demonstrado em S. brasiliensis. Observou-se a fosforilação do motivo TGY de Hog1 de S. schenckii str. s., porém, sem detectar diferenças após o estresse por peróxido. Já em S. brasiliensis não foi possível observar fosforilação de Hog1 em nenhuma condição experimental. Foi proposto um modelo para a regulação de AP-1 e Hog1 em S. schenckii e S. brasiliensis, distinto dos descritos na literatura, com a identificação de uma 1-Cys tioredoxina ou uma 2-Cys peroxiredoxina atípica, envolvidas na regulação de AP-1 e novas histidina quinases-like envolvidas na regulação de Hog1.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-05T19:42:57Z No. of bitstreams: 1 Bruna Alves da Silva Pimentel Dissertacao completa.pdf: 1542549 bytes, checksum: 98a7e829ca2775f36f2222780b68570b (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-05T19:42:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruna Alves da Silva Pimentel Dissertacao completa.pdf: 1542549 bytes, checksum: 98a7e829ca2775f36f2222780b68570b (MD5) Previous issue date: 2016-11-25 Although the highest burden of Streptococcus agalactiae infections has been reported in industrialized countries, studies on the characterization and epidemiology are still limited in developing countries and implementation of control strategies remains undefined. The aim of this retrospective study was to assess the epidemiological, clinical, and microbiological aspects of S. agalactiae infections in cancer patients treated at a Reference Brazilian National Cancer Institute - INCA, Rio de Janeiro, Brazil. We reviewed the clinical and laboratory records of all cancer patients identified as having invasive S. agalactiae disease during 2010 2014. The isolates were identified by biochemical analysis and tested for antimicrobial susceptibility. A total of 263 strains of S. agalactiae were isolated from cancer patients who had been clinically and microbiologically classified as infected. S. agalactiae infections were mostly detected among adults with solid tumors (94 %) and/or patients who have used indwelling medical devices (77.2 %) or submitted to surgical procedures (71.5 %). Mortality rates (in-hospital mortality during 30 days after the identification of S. agalactiae) related to invasive S. agalactiae infections (n= 28; 31.1 %) for the specific category of neoplasic diseases were: gastrointestinal (46 %), head and neck (25 %), lung (11 %), hematologic (11 %), gynecologic (4 %), and genitourinary (3 %). We also found an increase in S. agalactiae resistance to erythromycin and clindamycin and the emergence of penicillin-less susceptible isolates. A remarkable number of cases of invasive infections due to S. agalactiae strains was identified, mostly in adult patients. Our findings reinforce the need for S. agalactiae control measures in Brazil, including cancer patients. Embora a maior carga de infecções por Streptococcus agalactiae tenham sido relatadas em países industrializados, os estudos sobre a caracterização e epidemiologia são limitados nos países em desenvolvimento, onde a implementação de estratégias de controle permanece indefinida. O objetivo deste estudo retrospectivo foi avaliar os aspectos epidemiológicos, clínicos e microbiológicos de infecções por S. agalactiae em pacientes com câncer atendidos no Instituto Nacional de Referência Nacional do Câncer - INCA, Rio de Janeiro, Brasil. Foram revistos os registros clínicos e laboratoriais de todos os pacientes com câncer identificados com doenças invasivas causadas por S. agalactiae durante 2010-2014. Os isolados foram identificados por análises bioquímicas e testados para a susceptibilidade antimicrobiana. Um total de 263 cepas de S. agalactiae foram isolados de pacientes com câncer que tinham sido clinicamente e microbiologicamente classificadas como infectadas. Infecções por S. agalactiae foram geralmente detectados entre os adultos com tumores sólidos (94%) e / ou em pacientes que usaram dispositivos médicos de demora (77,2%) ou submetidos a procedimentos cirúrgicos (71,5%). As taxas de mortalidade (mortalidade intra-hospitalar durante 30 dias após a identificação de S. agalactiae) relacionados a infecções por S. agalactiae invasivos (n = 28; 31,1%) para a categoria específica de doenças neoplásicas foram: gastrintestinal (46%), cabeça e pescoço (25%), pulmão (11%), hematológica (11%), ginecológico (4%), e genito-urinário (3%). Encontramos também um aumento na resistência do S. agalactiae à eritromicina e clindamicina e o surgimento de isolados penicilina menos susceptíveis. Um notável número de casos de infecções invasivas por cepas de S. agalactiae foram identificados, principalmente em doentes adultos. Nossos resultados reforçam a necessidade de medidas de controle de S. agalactiae no Brasil, incluindo pacientes com câncer.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-05T19:39:40Z No. of bitstreams: 1 Priscila Sousa Damasceno Miranda Dissertacao completa.pdf: 2969991 bytes, checksum: e456615ee1225b2807c09ff73ae2ce0c (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-05T19:39:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Priscila Sousa Damasceno Miranda Dissertacao completa.pdf: 2969991 bytes, checksum: e456615ee1225b2807c09ff73ae2ce0c (MD5) Previous issue date: 2016-10-26 Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Streptococcus agalactiae may cause invasive human infections that mainly affect newborns, elderly and immunocompromised individuals. S. agalactiae is also included among the most relevant etiologic agents of clinical and subclinical contagious bovine mastitis, a major problem for the dairy industry. In Brazil, a few research groups are dedicated to studying the clonal diversity, capsular typing and antimicrobial susceptibility of S. agalactiae related to human and bovine infections.The present study investigated phenotypic and genotypic features of S. agalactiaestrainsisolated from human (15 strains) and bovine subclinical mastitis (16 strains). Capsular and PFGE-typing, antimicrobial susceptibility profiles and ability of biofilm formation on abiotic surface were verified.According to the PCR assay, S. agalactiaeisolated from human belonged to capsular genotypes Ia (3 strains), II (1 strain), III (4 strains), V (5 strains) and nontypeable (1 strain). All 16 bovine S. agalactiae isolates belonged to capsular genotype II and classifiedby PFGE in A1/A2 (n=06), B1/B2 (n=06), C (n=03) and D (n=01)patterns.Presently, human strains were grouped in 14 PFGE pulse types. The antimicrobial susceptibility profiles demonstrated that human and bovine S. agalactiae strains were 100% susceptible to penicillin, ceftriaxone, levofloxacin, chloramphenicol, linezolid and vancomycin. A high resistance level to tetracycline was observed in human (n=11; 73.33%) and bovine (n=14; 87.5%). A number of four (25%) strains from bovine and one (6,25%) from humans were classified multidrug-resistant (MDR). Biofilm formation on polystyrene surface was observed only for bovine strains and was found time dependent in all opportunities. Acidic 6.5 pH markedly enhances the biofim formation for all strains tested. This study also reports that S. agalactiae produced a greater amount of biofilm when 1% glucose was addedto the culture medium.The biofilm production was independent of the PFGE-patterns and antimicrobial susceptibility profiles. Our finding suggested that biofilm production is modulated by environmental factors and the acid-enhanced biofilm provides S. agalactiae advantageous in colonizing mammary gland during mastitis development. Streptococcus agalactiae pode ocasionar infecções invasivas em humanos, principalmente em recém-nascidos, idosos e indivíduos imunocomprometidos. O S. agalactiae também é reconhecido como agente etiológico de mastite bovina clínica e subclínica, um dos maiores problemas para a indústria de laticínios. No Brasil, alguns grupos de pesquisa têm se dedicado a estudar a diversidade clonal, tipagem capsular e susceptibilidade antimicrobiana de S. agalactiae relacionadas com infecções humanas e bovinas. O presente estudo investigou as características fenotípicas e genotípicas de amostras de S. agalactiae isoladas de humanos (16 amostras) e de mastite bovina subclínica (16 amostras). Foram verificados os tipos capsulares, padrões de PFGE, perfis de susceptibilidade antimicrobiana e capacidade de formação de biofilme em superfície abiótica. De acordo com o ensaio de PCR, amostras de S. agalactiae isoladas de humanos foram identificadas como pertencentes ao genotipo capsular Ia (3 amostras), II (1 amostra), III (4 amostras), V (5 amostras) e não tipável (1 amostra). Todos os 16 isolados bovinos foram do genotipo capsular II e classificadas por PFGE em A1 / A2 (n=06), B1 / B2 (n=06), C (n=03) e D (n=01). Amostras humanas foram agrupadas em 14 pulsotipos. Os perfis de susceptibilidade aos antimicrobianos demonstraram que cepas de S. agalactiae humanas e bovinas foram 100% sensíveis à penicilina, ceftriaxona, levofloxacina, cloranfenicol, linezolida e vancomicina. Um nível elevado de resistência à tetraciclina foi observado em humanos (n =11; 73,33%) e bovinos (n = 14; 87,5%). Quatro (25%) das amostras bovinas e uma amotra (6,25%) dentre as humanas foram classificadas como multi-resistentes. Verificou-se a formação de biofilme na superfície de poliestireno para amostras humas e bovinas, apenas em amostras de bovinos, esta formação foi tempo dependente. O pH 6,5 aumentou significativamente a formação de biofilme para todas as amostras bovinas testadas. Este estudo demonstrou o aumento da produção de biofilme de S. agalactiae quando 1% de glicose foi adicionado ao meio de cultura. A produção de biofilme foi independente dos padrões de PFGE e perfis de susceptibilidade aos antimicrobianos. Nossos resultados sugerem que a produção de biofilme é modulada por fatores ambientais e a acidez fornece ao S. agalactiae vantagem na colonização da glândula mamária durante o desenvolvimento da mastite.

Submitted by Maria Cristina (library@lncc.br) on 2017-05-04T13:17:54Z No. of bitstreams: 1 Tese - LNCC - Pablo Ivan Pereira Ramos.pdf: 25881844 bytes, checksum: 3737e5c6b0b1a08ca20ed86f209a96d7 (MD5) Approved for entry into archive by Maria Cristina (library@lncc.br) on 2017-05-04T13:18:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - LNCC - Pablo Ivan Pereira Ramos.pdf: 25881844 bytes, checksum: 3737e5c6b0b1a08ca20ed86f209a96d7 (MD5) Made available in DSpace on 2017-05-04T13:18:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - LNCC - Pablo Ivan Pereira Ramos.pdf: 25881844 bytes, checksum: 3737e5c6b0b1a08ca20ed86f209a96d7 (MD5) Previous issue date: 2016-06-30 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) The emergence of clinically important bacteria presenting a wide spectrum of antibiotic resistance represents a global concern. Although bacterial resistance was reported in the literature from the beggining of antibiotic use, early in the 20th century, we currently face the threat of pan-resistance, pathogens that can escape the action of all currently available antibiotic classes. A better understanding of virulence and resistance mechanisms, as well as new therapeutic options, are of paramount importance. This thesis proposal is based on the study of Klebsiella pneumoniae Kp13, a clinical isolate obtained in 2009 during a clonal outbreak in South Brazil which had its complete genome determined by our group. This strain is multidrug resistant and presents high-level resistance against polymyxin B (MIC 32 mg L1), a \last resort" drug for the treatment of Gram-negative multidrug-resistant bacteria. Using techniques from bioinformatics, transcriptomics (RNA-seq), systems biology and molecular modeling, we sought to better understand the gene expression response in K. pneumoniae in face of changes in abiotic characteristics and polymyxin B exposure. How these factors influence the metabolic repertoire of K. pneumoniae was also object of research. We also aimed to delineate a computational strategy for priorization of metabolic pathways that could serve as new targets for therapeuticals, by integrating expression, metabolic and structural reconstruction data. In parallel, this strategy was also applied to the study of Mycobacterium tubercluosis H37Rv (Mtb), the best characterized strain of this bacteria. E orts were made to study the metabolic complement of this pathogen, identifying important pathways related to its growth and correlating to molecular targets from a structural standview. The transcriptomic analyses allowed the identi cation of novel intracellular targets (such as ArcA-ArcB) that go beyond the \classic" e ect of polymyxin B mode of action, based in membrane interaction, besides drug-induced metabolic modulation which may lead to fermentative pathways of growth. The computational strategy for whole-genome target priorization led to the nding of pathways already known as druggable, such as S-methyl 5'-adenosin, as well as pathways not previously classi ed as druggable, but which could serve as candidates for future development of therapeutical compounds. A emergência de isolados clínicos bacterianos apresentando resistência a uma ampla gama de medicamentos antibióticos representa uma preocupação global. Embora bactérias resistentes a alguns antibióticos já tenham sido relatadas na literatura médica desde o princípio do uso destas substâncias, no início do século XX, atualmente enfrentamos bactérias ditas panresistentes com capacidade de evadir à ação de todas as classes de drogas hoje disponíveis. O melhor entendimento dos mecanismos de resistência e virulência, bem como o delineamento de novas estratégias para o desenvolvimento de opções terapêuticas alternativas torna-se, portanto, imperativo. A presente proposta de tese de doutoramento tem como objeto de estudo central a bactéria Klebsiella pneumoniae Kp13, isolada no Sul do Brasil em 2009 na ocasião de um surto clonal e cujo genoma foi completamente determinado por nosso grupo. Esta cepa possui resistência multi-droga incluindo polimixina B (MIC > 32 mg L1), antibiótico considerado de último recurso no tratamento de patógenos Gram-negativos multi-resistentes. Utilizando técnicas de bioinformática, transcritômica (RNA-seq), biologia de sistemas e modelagem molecular, busca-se maior entendimento da resposta da ativação/desativação gênica de K. pneumonia frente a variações do meio e a exposição à polimixina B e como estes infuenciam no repertório metabólico exibido por esta bactéria. Ademais, objetiva-se delinear uma estratégia computacional para priorização de vias metabólicas servir como novos alvos terapêuticos para o controle deste importante patógeno, utilizando uma estratégia que integra os dados de expressão, metabólicos e da reconstrução estrutural. Em paralelo, esta estratégia foi também aplicada ao estudo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Mtb), a cepa mais bem caracterizada desta bactéria. Foi dado um foco no complemento metabólico de Mtb, realizando a reconstrução de vias metabólicas importantes ao seu crescimento, correlacionando-as com alvos proteicos do ponto de vista estrutural. A análise transcritômica permitiu identificar possíveis alvos intracelulares que vão além do efeito “clássico" de ação da polimixina, baseado em interação com a membrana externa, tais como o sistema ArcA-ArcB, al_em de modulação metabólica induzida pelo fármaco, levando ao crescimento fermentativo da bactéria. A priorização de alvos moleculares permitiu identificar vias reconhecidamente drogáveis, tais como o metabolismo de S-metil 5'-adenosina, além de vias anteriormente não identificadas como drogáveis, mas que poderiam servir como candidatos para o desenvolvimento de novos fármacos.

O desenvolvimento de tecnologias para a obtenção de energias renováveis tem recebido crescente atenção nos dias atuais. Células a combustível microbianas (CCMs) são dispositivos bioeletroquímicos que utilizam microrganismos sob condições anaeróbicas para catalisar reações redox em compostos orgânicos visando geração de energia elétrica. Pesquisas recentes estão voltadas para otimizar o desempenho e a eficiência das CCMs. Um dos desafios é a necessidade de se testar novos materiais condutores como eletrodos visando aumentar o potencial elétrico destes dispositivos. O polipirrol é um polímero orgânico condutor que possui boa condutividade elétrica, elevada área superficial, biocompatibilidade e baixo custo. Neste trabalho foi construída uma CCM de dupla câmara para a geração de energia elétrica a partir da degradação de glucose por Escherichia coli. Foram avaliados 2 tipos de eletrodos: um de grafite, normalmente utilizado em estudos com CCMs, outro de grafite modificado pela eletrodeposição de polipirrol, obtido após síntese. A diferença de potencial foi verificada utilizando um multímetro data logger ligado em série com a CCM e conectado a um computador para a aquisição de dados em tempo real. Para avaliação da formação de biofilme na superfície dos eletrodos foi utilizada a técnica de microscopia eletrônica de varredura (MEV). As CCMs apresentaram valores de densidade de potência que variaram entre 15 mW.m-2, no experimento com eletrodo de grafite e 20 mW.m-2, obtida no experimento utilizando eletrodo de grafite com polipirrol. Com a modificação da superfície de um eletrodo de grafite pela adição do polipirrol foi possível observar um incremento de atividade elétrica e aumento de área superficial do eletrodo. Em termos da eficiência da célula foi possível observar um acréscimo em termos de eficiência coulombica no sistema contendo polipirrol (17,18%) em relação ao sistema que não possuía (7,31%), o que representa um melhor aproveitamento dos elétrons do substrato que podem de fato ser convertidos em energia elétrica. Portanto, foi mostrado que o eletrodo de grafite modificado pela eletrodeposição de polipirrol pode ser uma alternativa viável e proveitosa para uso em CCMs. The development of technologies to obtain renewable energy has received increasing attention nowadays. Microbial fuel cells (MFC) are chemical devices that uses microorganisms under anaerobic conditions to catalyze redox reactions in organic compounds for electricity generation. Recent research is focused to optimize the performance and efficiency of MFCs. One challenge is the need to test new conductive materials as electrodes in order to increase the electric potential in these devices. Polypyrrole is a conductive organic polymer which presents good electrical conductivity, high surface area, low cost and also biocompatibility. In this work, a double chamber MFC was built to generate electricity from glucose degradation by Escherichia coli. We assessed two types of electrodes: a graphite one, normally used in studies with MFCs, and graphite modified by electrodeposition of polypyrrole, obtained after synthesis. The potential difference was recorded using a data logger multimeter connected in series with the MFC and connected to a computer to obtain data in real time. For evaluation of biofilm formation on the surface of the electrodes scanning electron microscopy (SEM) was carried out. The MFCs had power density values ranging from 15 MW.m-2, in the experiment using graphite electrode 20 and MW.m-2 in the experiment using graphite electrode with polypyrrole. By the modification of the graphite surface with polypyrrole it was observed an increase in electrical activity and increased surface area of the electrode. In terms of cell efficiency, it was possible to observe an increased coulombic efficiency in the system containing polypyrrole (17.18%) compared with the system that lacked (7.31%), representing an improvement in flow of electrons from the substrate that can be converted into electricity. Therefore, it was shown in this work that the graphite electrode modified by electrodeposition of polypyrrole can be a viable and profitable alternative for use in MCC.

Williams-Beuren syndrome (WBS) is caused by microdeletions in the region 7q11.23. The main clinical features of the syndrome are congenital heart disease, typical facial dysmorphisms, friendly personality and intellectual disabilities. Previous studies have shown that polymorphism in the gene encoding the enzyme responsible for conversion of T4 to T3, the deiodinase type 2 (D2) does not alter its catalytic activity, but are positively associated with neuropsychiatric disorders and intellectual impairment, bipolar disorder and depression. Later it was demonstrated that polymorphic D2 (Thr92Ala-D2) alters the expression of genes involved in oxidative stress also altered in individuals with Alzheimer's disease. Taken together, we hipostenizamos the Thr92Ala-D2 might be related to cognitive impairment in individuals with SWB. Thus, this study aimed to track the frequency of polymorphism in a group of 63 patients with SWB and correlate the presence of the polymorphism with its indicators of intellectual functioning. Participants were 4-37 years on molecular diagnosis of SWB and were matched for sex and age. The DNA from patients was obtained from the collection of buccal epithelial cells using Swab and mutation status was determined by the technique of Polymerase Chain Reaction (PCR). Intellectual performance of participants was assessed by the instruments: WASI, WISC-III or WAIS-III. 10 individuals were identified polymorphic (A / A) and 39 heterozygotes (T / A), featuring 15.88% and 61.90% of the study population, respectively. 21 patients were evaluated and the IQ values ranged from 37 to 72, characterized intellectual deficit, mild to moderate, as described in the literature. There was no significant correlation between the presence of the polymorphism and IQ patients, even when the sample was stratified according to gender. Two patients heterozygous for the polymorphism had subclinical hypothyroidism and IQ values were 42.2 and 37. We note a full IQ downward trend as there is an increase in serum levels of TSH, although no statistical significance. A Síndrome de Williams-Beuren (SWB) é causada por microdeleções na região 7q11.23. As principais características clínicas da síndrome são cardiopatia congênita, dismorfismos faciais típicos, habilidade social e deficiência intelectual. Estudos anteriores mostraram que polimorfismos no gene que codifica a enzima responsável pela transformação de T4 em T3, a Desiodase do tipo 2 (D2), não alteram sua atividade catalítica, mas estão positivamente relacionadas com transtornos neuropsiquiátricos, como deficiência intelectual, bipolaridade e depressão. Posteriormente foi demonstrado que a D2 polimórfica (Thr92Ala-D2) altera a expressão de genes envolvidos com o stress oxidativo, também alterados em indivíduos com doença de Alzheimer. Tomados em conjunto, nós hipostenizamos que a Thr92Ala-D2 poderia estar relacionada com déficit cognitivo em indivíduos com SWB. Assim, o presente estudo teve como objetivo rastrear a frequência do polimorfismo em um grupo de 63 pacientes com SWB e correlacionar a presença do polimorfismo com seus indicadores de funcionamento intelectual. Os participantes tinham de 4 a 37 anos com diagnóstico molecular de SWB e foram pareados por sexo e idade. O DNA dos pacientes foi obtido pela coleta de células do epitélio bucal utilizando Swab e a presença da mutação foi determinada pela técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR). O desempenho intelectual dos participantes foi avaliado pelos instrumentos: WASI, WISC-III ou WAIS-III. Foram identificados 10 indivíduos polimórficos (A/A) e 39 indivíduos heterozigotos (T/A), caracterizando 15,88% e 61,90% da população estudada, respectivamente. 21 pacientes foram avaliados e os valores de QI variaram entre 37 a 72, caracterizando déficit intelectual de leve a moderado, como descrito na literatura. Não houve correlação significativa entre a presença do polimorfismo e o QI dos pacientes, nem mesmo quando estratificamos a amostra de acordo com o sexo. Dois pacientes heterozigotos para o polimorfismo apresentaram hipotireoidismo subclínico e os valores de QI foram de 42,2 e 37. Notamos uma tendência de diminuição do QI total conforme há aumento nos níveis séricos de TSH, apesar de não haver significância estatística.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:16:50Z No. of bitstreams: 1 Fabrina Seger Braga Dissertacao completa.pdf: 983061 bytes, checksum: 19999a6ef0d9fb87e460323e43818e56 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:16:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fabrina Seger Braga Dissertacao completa.pdf: 983061 bytes, checksum: 19999a6ef0d9fb87e460323e43818e56 (MD5) Previous issue date: 2016-03-11 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Stenotrophomonas maltophilia is a non-fermentative Gram negative bacillus frequent in respiratory infections, especially in patients assisted in intensive care units (ICU). It is also an important pulmonary pathogen in cystic fibrosis patients (CF). It is often multidrug resistant exhibiting resistance to a broad antimicrobial spectrum. Fluoroquinolone and trimethoprim/sulfamethoxazole (TMP-SXT) are drugs of choice for the treatment of infections caused by S. maltophilia but increasing resistance has been reported. The aim of the study was to evaluate the susceptibility and the molecular mechanisms responsible for antimicrobial resistance in S. maltophilia strains obtained from CF patients assisted in two CF reference centers and hospitalized non-cystic patients (NCF) assisted in a teaching hospital in Rio de Janeiro, Brazil. A total of 226 isolates from different clinical specimens were identified using conventional methods and evaluated by the Kirby-Bauer disk diffusion method (DD) to levofloxacin, minocycline and trimethoprim/sulfamethoxazole (TMP-SXT). The minimal inhibitory concentration (MIC) of ciprofloxacin (CIP), ceftazidime (CAZ) and TMP-SXT was determined by microdilution method according to Clinical and Laboratory Standard Institute. Polymerase Chain Reaction (PCR) analysis was performed to evaluate the expression of the sul1 (190 samples; 54 CF and 138 NCF) and qnr (A. B, S) (39 samples resistant to CIP). The samples were obtained from different specimens from January 2010 to October 2014. Fifty two samples (23%) were obtained from CF patients and most of all isolated from sputum (92.3%). The majority of 174 samples (n=77%) obtained from NCF patients were isolated from secretion/aspirate tracheal (51.5%), sputum (27%) and blood (12.1%). By DD test all samples (n=52) of CF patients were susceptible to all evaluated antimicrobials. Only 8 (4.6%) S. maltophilia strains isolated from NCF patients were resistant to TMP-SXT and levofloxacin. To determine the MIC we selected samples that showed resistance to any antimicrobial in the DD test; samples isolated from blood and one isolate for each CF patients, totaling 55 samples. Using MIC determination, CIP was the antimicrobial with the highest percentage (70,9%) of resistant strains (70,6% from CF and 76,4% from NCF). The sul1 gene was detected in one sample from NCF patient with high MIC for TMP-SXT (32µg/mL). The qnr genes (A, B and S) were not identified in this study. Most strains of S. maltophilia was isolated from patients NCF. The TMP-SXT is still the best drug of choice for the treatment of infections caused by this species. However, continuous monitoring of resistance to important antibiotics and the use of molecular methods are warranted to provide appropriate antimicrobial regimens for treating S. maltophilia infections. Stenotrophomonas maltophilia é um Bastonete Gram negativo Não Fermentador da Glicose (BGNNF), frequente em infecções respiratórias especialmente em pacientes assistidos em centros de terapia intensiva (CTI). Também se destaca como um patógeno emergente em pacientes com fibrose cística (FC). É frequentemente multirresistente, exibindo resistência a um amplo espectro de antimicrobianos. Fluoroquinolonas e trimetoprima/sulfametoxazol (SXT) são os antimicrobianos de escolha para o tratamento de infecções causadas por S. maltophilia. Entretanto, o aumento na prevalência de cepas resistentes tem sido relatado. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de sensibilidade e os mecanismos moleculares responsáveis pela resistência aos antimicrobianos em S. maltophilia obtidas de pacientes com FC e pacientes sem fibrose cística (NFC) assistidos em dois centros de referência (FC) e em um hospital universitário (NFC) no Rio de Janeiro. Foram analisadas 226 amostras pelo método de difusão em ágar (DD) para levofloxacina, minociclina e SXT e determinada a concentração inibitória mínima (CIM) por microdiluição em caldo para ciprofloxacina (CIP), ceftazidima (CAZ) e SXT, conforme recomendações do Clinical and Laboratory Standart Institute. O método molecular de Reação em cadeia da Polimerase (PCR) foi utilizado para a pesquisa dos genes sul1 em 190 amostras (52 FC e 138 NFC) e qnr (A, B e S) em 39 amostras não sensíveis (resistente+intermediário) a CIP (24 FC e 15 NFC). As amostras foram obtidas de diferentes espécimes clínicos no período de janeiro de 2010 a outubro de 2014. Cinquenta de duas amostras (23%) foram obtidas de pacientes FC e a maioria isolada de escarro (92,3%). Em pacientes NFC foram isoladas 174 amostras (n=77%) sendo a maioria de secreção/aspirado traqueal (51,5%) e escarro (27%). Pelo teste de DD todas as amostras (n=52) de pacientes FC foram sensíveis aos três antimicrobianos avaliados. Apenas 8 amostras (4,6%) de pacientes NFC foram não sensíveis (6 resistentes e 2 intermediárias) a SXT e a levofloxacina. Para a determinação da CIM foram selecionadas 55 amostras. CIP foi o antimicrobiano com maior percentual de amostras resistentes (70,9%; 70,6% em FC e 76,4% em NFC). O gene sul1 foi identificado em uma amostra de paciente NFC cuja CIM para SXT foi de 32µg/mL. Os genes qnr (A, B e S) não foram identificados no presente estudo. A maioria das amostras de S. maltophilia foi isolada de pacientes NFC.O antimicrobiano SXT ainda é a melhor opção terapêutica para o tratamento de infecções causadas por esta espécie. Contudo, a constante monitorização através de testes de sensibilidade aos antimicrobianos e métodos moleculares se faz necessária.

Submitted by Ubirajara Cruz (ubirajara.cruz@gmail.com) on 2017-07-05T16:00:01Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Otavia_Martins.pdf: 1248532 bytes, checksum: 732a038ac2a908e98da415247668b37e (MD5) Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-07-05T19:22:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Otavia_Martins.pdf: 1248532 bytes, checksum: 732a038ac2a908e98da415247668b37e (MD5) Made available in DSpace on 2017-07-05T19:22:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Otavia_Martins.pdf: 1248532 bytes, checksum: 732a038ac2a908e98da415247668b37e (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 Sem bolsa Os fungos presentes no ar atmosférico são denominados anemófilos, sendo este habitat o meio de dispersão mais utilizado por esses microrganismos, que possuem a capacidade de colonizar diferentes substratos de forma singular e eficiente. Assim, dificilmente pode existir ambiente livre de contaminação fúngica. As concentrações de fungos no ambiente sofrem influências de diversos fatores, incluindo variáveis ambientais e fatores físicos que podem aumentar a quantidade de propágulos no ambiente. Os fungos anemófilos podem causar problemas como a deterioração de materiais, alergias, intoxicações e infecções. Assim, a presença desses microrganismos em laboratórios de microbiologia pode causar grandes problemas econômicos, de qualidade diagnóstica e relacionados à pesquisa, além das possibilidades de causar prejuízo à saúde das pessoas que trabalham no local. Ao fazer-se uso das normas de biossegurança, o monitoramento de fungos torna-se, então, necessário para um adequado controle ambiental, evitando assim contaminações e infecções. O objetivo deste trabalho foi realizar o isolamento e identificação da microbiota fúngica ambiental presente em nove laboratórios de ensino, pesquisa e extensão da Universidade Federal de Pelotas (UFPel) durante o período de fevereiro a novembro de 2015, abrangendo as quatro estações. A técnica utilizada foi de sedimentação em placa de Petri contendo meio Ágar Sabouraud dextrose com adição de cloranfenical. Durante o estudo foram coletadas 228 placas mensais provenientes de coletas semanais dos nove laboratórios totalizando 912 placas no final do experimento, das quais foram isoladas um total de 5101 Unidades Formadoras de Colônias (UFC). Conforme a sazonalidade, o outono foi a estação que apresentou maior número de UFC, correspondendo a 35% (1808/5101) do total encontrado, já no inverno obteve-se apenas 17,3% (884/5101). Em relação ao isolamento fúngico, o gênero Cladosporium representou 46,3% do total de UFC, seguido de Penicillium e de fungos não caracterizados quanto ao gênero, em decorrência da ausência de micélio reprodutivo, sendo então classificados como “micélio aéreo estéril”. Não houve diferença significativa entre o número de UFC encontradas nos distintos laboratórios, assim como também não houve diferença no número de UFC encontradas nos distintos ambientes pertencentes aos laboratórios. Os gêneros prevalentes foram Cladosporium e Penicillium. The fungi present in atmospheric air are called airborne, which is the dispersion medium habitat most used by these microorganisms, which have the ability to colonize different natural substrates and efficiently. Thus, there can hardly fungal contamination-free environment. Fungal concentrations in the environment are influenced by several factors, including environmental factors and physical factors that can increase the number of propagules in the environment. The airborne fungi can cause problems such as deterioration of materials, allergies, poisoning and infections. Thus, the presence of these microorganisms in microbiology laboratories can cause major economic problems, diagnostic and research related to quality, and the potential to cause harm to the health of the people working on site. When making up the use of bio-security standards, monitoring of fungi becomes then necessary for proper environmental control, thus avoiding contamination and infections. The aim of this study was the isolation and identification of the fungal microbiota present in nine teaching laboratories, research and extension of the Federal University of Pelotas (UFPel) during the period from February to November 2015, covering the four seasons. The technique used was settling in Petri dishes containing Sabouraud dextrose agar medium with added cloranfenical. During the study were collected 228 monthly cards from weeks collection of nine laboratories totaling 912 cards at the end of the experiment, which were isolated from a total of 5101 Colony Forming Units (CFU). As the seasonal, autumn was the season that had the highest number of CFU, corresponding to 35% (1808/5101) of the total found, already in winter yielded only 17.3 % (884/5101). Compared to fungal isolation, Cladosporium genre represented 46.3 % of the CFU, followed by Penicillium fungi and not characterized as gender, due to the absence of reproductive mycelium, then being classified as "sterile aerial mycelium". There was no significant difference between the number of CFU found in different laboratories, as well as there was no difference in the number of CFUs in different environments belonging to the laboratories. The prevalent genera were Cladosporium and Penicillium.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-05T18:08:16Z No. of bitstreams: 1 TESES_FINAL_PUBLICADA_Daniele_Blasquez_Olmedo.pdf: 4481233 bytes, checksum: a5b2634a237957751c2544faa5fb9433 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-05T18:08:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESES_FINAL_PUBLICADA_Daniele_Blasquez_Olmedo.pdf: 4481233 bytes, checksum: a5b2634a237957751c2544faa5fb9433 (MD5) Previous issue date: 2016-02-22 Hepatitis C virus infection (HCV) is the leading cause of chronic liver disease worldwide. The confrontation of the disease is achieved through actions with different approaches. In this sense, the development of studies to assist in the diagnostic strategy and actions that support surveillance are essential to improving its knowledge and control. The aim of this thesis was to evaluate two strategic approaches focused on the diagnosis and surveillance in HCV infection. A systematic review with meta-analysis was performed to obtain the best clinical evidence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the proximal regions the IL28B gene as sustained virologic response (SVR) predictorin patients with genotype 1 (G1), presented by the odds ratio (OR). At the same time, a routine with interviews and notification of HCV suspected cases in Pathology Service of Policlínica Piquet Carneiro was structured and then a case series study was realized to compare exposure sources between gender, using the prevalence ratio (PR). The results of the first study showed differences among patients of major versus minor alleles: rs12980275, AA x AA / AG (OR 5.34, 95% CI 1.60 to 17.82); rs8099917, TT x TG / GG (OR 3.99, 95% CI 2.99 to 5.32) and rs12979860, CC x CT / TT (OR 4.11, 95% CI 3.37- 5.02). A routine of interviews was implemented and allowed the continued reporting of HCV-cases to public surveillance system, and the low incompleteness of epidemiological data (

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:13:28Z No. of bitstreams: 1 Juliana do Outeiro Santos Benfica Tese completa.pdf: 1883475 bytes, checksum: b374f1236f3848f31df0dc758350bd20 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:13:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Juliana do Outeiro Santos Benfica Tese completa.pdf: 1883475 bytes, checksum: b374f1236f3848f31df0dc758350bd20 (MD5) Previous issue date: 2015-10-30 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The Oral Tolerance (OT) is a physiological mechanism of systemic non-inflammatory activity to a previously ingested immunogen and mediated by regulatory cells. In Bystander suppression by OT, responses to a second immunogen are regulated when it is presented along with the immunogen for which tolerance was previously established. Two strains of mice with extreme phenotypes of susceptibility (TS) and resistance (TR) to OT were developed by bidirectional genetic selection. The TS strain has a regulatory profile and, when infected with Leishmania amazonensis, develops a reduced lesion; while the TR strain develops an exacerbate lesion due to their inflammatory profile. TR mice subjected to bystander oral tolerance, that is, tolerized with ovalbumin (2mg OVA), immunized with OVA and, simultaneously infected, develop a reduced lesion. The aim of this study was to evaluate the participation of immunoregulatory cells (regulatory T lymphocytes - Tregs - and tolerogenic dendritic cells) in reducing inflammatory lesions in animals treated with oral tolerance and infected with L. amazonensis. TR mice subjected to bystander oral tolerance have increased Treg cells at the site of infection associated with reduced inflammatory lesion. Adoptive transfer of Tregs from tolerized mice (2mg OVA) to infected and immunized (OVA) TR individuals mimics the effect of bystander oral tolerance, decreasing the inflammatory lesion, suggesting the involvement of Treg cells in the bystander suppression. In addition, tolerogenic dendritic cells (DCs) were transferred from the mesenteric lymph nodes of tolerized TR or TS individuals to infected TR mice. The development of the inflammatory lesion and the percentage of Tregs (CD4+ CD25+ Foxp3+) in the infected animals were evaluated. The development of the infection was lower in TR mice that received tolerogenic DCs (from both TR as TS tolerized), compared to the ones solely infected, and being similar to the induced and infected group (bystander oral tolerance), suggesting the participation of Treg cells in bystander suppression. The tolerogenic DCs transfer also increased the percentage of Tregs in infected TR mice. Our results allow to infer that the tolerogenic DCs, possibly inducing the differentiation of Treg cells, participate in the reduction of inflammatory lesions in animals infected with L. amazonensis, as one of the mechanisms of bystander oral tolerance. A tolerância oral (TO) é um mecanismo fisiológico de resposta não-inflamatória sistêmica a um imunógeno previamente ingerido e mediado por células reguladoras. Na tolerância oral bystander, as respostas a um segundo imunógeno são reguladas quando apresentado junto ao imunógeno cuja tolerância foi previamente estabelecida. Duas linhagens de camundongos com fenótipos extremos de susceptibilidade (TS) e resistência (TR) à TO foram desenvolvidas por seleção genética bidirecional. Os animais TS têm perfil regulador e, quando infectados com Leishmania amazonensis, desenvolvem lesão reduzida; enquanto os TR, por seu perfil inflamatório, têm lesão exacerbada. Camundongos TR submetidos à tolerância oral bystander, isso é, tolerizados com ovalbumina (2 mg de OVA), imunizados com OVA e, simultaneamente infectados, têm lesão reduzida. O objetivo deste trabalho foi avaliar a participação das células imunoregulatórias (linfócitos T regulatórios Tregs - e células dendríticas tolerogênicas) na redução da lesão em animais submetidos à tolerância oral e infectados com L. amazonensis. Camundongos TR submetidos à tolerância oral bystander têm aumento das células Tregs no sítio da infecção associado à redução da lesão. A transferência de Tregs provenientes de animais tolerizados (2 mg de OVA) para TR infectados e imunizados (com OVA), mimetiza o efeito da tolerância oral bystander, diminuindo a lesão inflamatória, sugerindo a participação de células Tregs na supressão bystander. Também foram transferidas células dendríticas (DCs) tolerogênicas, provenientes dos linfonodos mesentéricos de animais TR ou TS tolerizados, para camundongos TR infectados. Foram avaliados o desenvolvimento da lesão e a proporção de células Tregs (CD4+ CD25+ Foxp3+) nos animais infectados. O desenvolvimento da infecção foi menor nos camundongos TR que receberam DCs tolerogênicas (provenientes tanto de TR quanto de TS tolerizados), comparando aos somente infectados, sendo similar aos tolerizados e infectados (tolerância oral bystander), sugerindo a participação de células Tregs na supressão bystander. A transferência de DCs tolerogênicas também aumentou a proporção de Tregs nos TR infectados. Nossos resultados permitem inferir que as DCs tolerogênicas, possivelmente induzindo a diferenciação de Tregs, participam da diminuição da lesão inflamatória em animais infectados com L. amazonensis, sendo um dos mecanismos da tolerância oral bystander.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T18:31:34Z No. of bitstreams: 1 Marcelo Duarte Sousa Dissertacao completa.pdf: 1547851 bytes, checksum: 446e3ceeaa2b76f8a7eee569780ac202 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T18:31:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcelo Duarte Sousa Dissertacao completa.pdf: 1547851 bytes, checksum: 446e3ceeaa2b76f8a7eee569780ac202 (MD5) Previous issue date: 2015-08-19 Lately very countries, like Brazil, attends a significant increase in nosocomial invasive fungal infections. Due to technological advances in medicine in the last two decades as the use of catheters, probes, and other new surgical techniques, increased significantly the quality of life of critically ill patients. Conversely invasive fungal infections have emerged as a complication in these patients. Among the various microorganisms found in the hospital environment the genus Candida is the most isolated pathogen and is associated with high morbidity and mortality. This work has already recovered 100 strains isolated from different health facilities in Rio de Janeiro in the period 2013 to 2014, the samples have been submitted chromogenic tests, germ tube, production of chlamydospores and mass spectrometry. These strains were found in various anatomical sites, where 44% of these isolates were obtained from urine culture, and the sector with the highest incidence was the intensive care unit (ICU) with 40% of isolates. The region of Niterói was the city with the highest percentage of fungal isolates (52%). The following species were identified Candida tropicalis, C. albicans, C. parapsilosis sensu stricto, C. guilliermondii, C. glabrata, C. krusei, C. dubliniensis, and C. metapsilosis. Non-albicans species showed to be more resistant to antifungal agents used in this work and amphotericin B showed to be the most effective antifungal this research mainly related to strains of C. albicans. Candida tropicalis was the most frequent species in this work overcoming Candida albicans in most industries and anatomical sites. Thus, the identification of these fungal strains is essential to locate the source of infection and monitor clinical treatment making it more assertive and thus avoiding a longer stay of patients in hospitals and decreasing spending more expressive with this type of infection Ultimamente muitos países, assim como o Brasil, assistem a um aumento significativo das infecções fúgicas nosocomiais invasivas. Devido a avanços tecnológicos na medicina nas duas últimas décadas como o uso do cateter, sondas, novas técnicas cirúrgicas e outros, aumentaram de forma expressiva a qualidade de vida de pacientes críticos. Em contrapartida, infecções fúngicas invasivas surgiram como complicação nestes pacientes. Dentre os diversos agentes etiológicos encontrados no ambiente hospitalar o gênero Candida é o patógeno mais isolado e está associado a altas taxas de morbidade e mortalidade. O presente trabalho recuperou 100 cepas já isoladas de diferentes estabelecimentos de saúde do Rio de Janeiro no período de 2013 a 2014, essas amostras foram submetidas a provas cromógenas, tubo germinativo, produção do clamidósporos, espectrometria de massas e Provas de Sensibilidade a antifúngicos. Essas cepas foram encontradas em vários sítios anatômicos, onde 44% desses isolados foram obtidos por urinocultura, e o setor com maior incidência foi Centro de Tratamento Intensivo (CTI) com 40% das amostras isoladas. A região de Niterói foi o município com maior percentual de isolados fúngicos (52%). Foramidentificadas as seguintes espécies: Candida tropicalis, C. albicans, C. parapsilosis sensu stricto, C. guilliermondii, C. glabrata,C. krusei, C. metapsilosis e C. dubliniensis. Espéciesnão-albicans apresentaram se mais resistente aos antifúngicos usados neste trabalho e a anfotericina B mostrou ser o antifúngico mais eficaz nesta pesquisa principalmente em relação às cepas de C. albicans.A Candida tropicalisfoi a espécie mais isolada neste trabalho superando a Candida albicans na maioria dos setores e nos sítios anatômicos. Sendo assim, a identificação dessas cepas fúngicas é fundamental para localizar a fonte da infecção e acompanhar o tratamento clínico tornando-o mais assertivo e assim evitando uma estada mais longa dos pacientes no ambiente hospitalar e diminuindo gastos mais expressivos com esse tipo de infecção

PROQUALI (UFJF) Embora os principais mecanismos de ação do fluconazol, itraconazol e anfotericina B estejam relacionados ao egosterol, é possível que essas drogas tenham outros efeitos nas células fúngicas. Além dos mais, a heterorresistência é considerada um mecanismo de adaptação frente a um estresse induzido por concentrações crescentes de antifúngicos no ambiente. Sendo o itraconazol um dos azólicos usados no tratamento da criptococose, o objetivo desse estudo foi avaliar a influência do estresse oxidativo e nitrosativo gerado pelos antifúngicos em células de C. gattii e sua influência no surgimento de clones heterorresistentes. Foram estudados distintos parâmetros para avaliar os estresses oxidativo e nitrosativo induzidos pelo fluconazol, itraconazol e anfotericina B em C. gattii. Já os efeitos da heterorresistência ao itraconazol foram estudados por meio de ensaios in vitro e em modelo murino. O itraconazol simultaneamente reduziu o conteúdo de ergosterol das células de C. gattii e induziu a produção de espécies reativas de oxigênio no início do tratamento, o que levou ao aumento da atividade das enzimas peroxidase e superoxidodismutase. O mesmo não aconteceu com o fluconazol. Já a anfotericina B promoveu grande estresse oxidativo e nitrosativo nas células de C. gattii, o que levou a uma elevada peroxidação lipídica e ineficiente ativação do sistema antioxidante celular. A heterorresistência ao itraconazol foi intrínseca para todas as linhagens testaddas, alterou parâmetros farmacodinâmicos, diminuiu o diâmetro celular e o tamanho da cápsula e ativação do sistema antioxidante celular. Observou-se uma correlação positiva entre a razão superfície/volume e o nível de heterorresistência ao itraconazol. Além do mais, a heterorresistência levou a maior internalização das células criptocócicas pelos macrófagos, mas também a uma maior proliferação dentro dessa célula fagocítica, o que culminou com o aumento da virulência dos clones heterorresistentes e alta carga fúngica nos pulmões e cérebro dos camundongos. Diante desses resultados, concluiu-se que o estresse oxidativo possuiu um importante papel no mecanismo de ação do itraconazol e pode ser um dos mecanismos que levam a heterorresistência e o aumento da virulência das células de C. gattii. Although the most accepted mechanisms of action of amphotericin B and azoles are related to ergosterol, it is possible that these drugs have other effects on the fungal cell. Moreover, heteroresistance is an adaptive mechanism developed by the microorganism to counteract the stress of increasing drug concentration in the environment. Since itraconazole is used in the therapy of cryptococcosis, the aim of this study was to evaluate the role of endogenous reactive oxygen species (ROS) and peroxynitrite produced by azoles and amphotericin B in the fungus C. gattii and its influence on emergence of heteroresistante clones to itraconazole. We studied distinct parameters to evaluate the effect of oxidative and nitrosative stresses induced by fluconazole, itraconazole and amphotericin B in C. gattii cells. The effects of the heteroresistance to itraconazole were studied by performing tests in vitro and in a murine model. Itraconazole reduces the level of ergosterol and led to ROS production in C. gattii cells in the early stages of the treatment, enhancing the antioxidant activity. The same did not happen with fluconazole. Amphotericin B caused lipid peroxidation in C. gattii cells through a greatly enhanced production of oxidative and nitrosative radicals with increased lipid peroxidation and inefficient ativaction of antioxidant cellular system. Heteroresistance to itraconazole was intrinsic in all strains tested and changed pharmacodynamics parameters, diminished cell and capsule sizes, reduced ergosterol content and enhanced the antioxidant system of heteroresistant clones. Indeed, heteroresistance to itraconazole led to the increased internalization of cryptococcal cells by macrophages, but also to a prominent proliferation inside these phagocytic cells, culminating in the higher virulence of heteroresistant clones. Based on these results, we conclude that oxidative bursts play an important role in the antifungal activity of itraconazole and may be one of the mechanisms that lead to heteroresistance and the increased virulence of C. gattii.

Frutos de açai (Euterpe oleracea) (FA) e uma gama de produtos derivados desse fruto são um exemplo de sucesso comercial de um produto regional genuinamente brasileiro no mercado global. Os FA sofrem fermentação espontânea durante o pós-colheita devido, principalmente, sua elevada carga microbiana e aos fatores intrínsecos e extrínsecos favoráveis. A biodiversidade da comunidade microbiana em FA e sua evolução em três origens geográficas e duas condições de fermentação foram estudadas. Métodos independente de cultivo baseados no gene 16S rRNA de quinze amostras revelaram que os filos Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes e Acidobacteria foram os mais abundantes. Ao nível do gênero, foram identificados a Massilia (taxon com mais de 50% das sequências e constante durante as 30h de fermentação), Pantoea (taxon com o maior aumento durante a fermentação), Naxibacter, Enterobacter, Klebsiella e Raoultella, formando a microbiota bacteriana dos FA. Atributos relacionados à promoção de crescimento vegetal (sideróforos) e outros compostos como, por exemplo, o poli-3-hidroxibutirato (PHB) e a violaceína podem promover a preponderância de Massilia em resposta a condições de estresse do fruto. Análises de beta diversidade demonstraram que os parâmetros de qualidade dos FA (pH, sólidos solúveis, acidez titulável e lípidos) e de análise elementar (C, N, H e razão C/N) não foram capazes de correlacionar padrões de grupos taxonômicos em FA. Este trabalho oferece novos conhecimentos e perspectivas sobre a composição da comunidade bacteriana nativa nos FA em função de sua fermentação espontânea durante o período do pós-colheita. Açai (Euterpe oleracea) fruits (AF) and a wide variety of products derived from this fruit are an example of success of a local and typically Brazilian product on the global market. The AF suffer spontaneous fermentation during postharvest due mainly to its high microbial load and the favourable intrinsic and extrinsic parameters. The biodiversity of microbial community in AF and their evolution between three geographical origins and two fermentation conditions were examined. Culture-independent methods based on 16S rRNA from fifteen samples revealed that Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes and Acidobacteria were the most abundant phyla. At genus level, were identified Massilia (taxon with more than 50 % of sequences remaining constant during the 30 h of fermentation), Pantoea (taxon with the highest increase during fermentation), Naxibacter, Enterobacter, Raoultella and Klebsiella, forming the carposphere bacterial microbiota of AF. Attributes related to plant growth promotion (siderophores) and others compounds e.g. poly-3-hydroxybutyrate (PHB) and violacein in response to stress conditions could improve the Massilia preponderance. Beta diversity showed that quality parameters of AF (pH, soluble solids, titratable acididy and lipids) and elemental analysis (C, N, H and C/N ratio) were unable to establish microbial patterns in AF. This research offers new insights and perspectives of the indigenous bacterial community composition on AF as a function of spontaneous fermentation during postharvest.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-05T19:36:36Z No. of bitstreams: 1 Rachel Leite Ribeiro Tese completa.pdf: 1382553 bytes, checksum: 8bf9e6032093c3281ac7f45bb3757519 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-05T19:36:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rachel Leite Ribeiro Tese completa.pdf: 1382553 bytes, checksum: 8bf9e6032093c3281ac7f45bb3757519 (MD5) Previous issue date: 2018-04-28 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Enterococci are widespread in the nature. In humans, as in the other animals, gastrointestinal tract, the oral cavity and the genitourinary tract. In recent decades, these microorganisms have emerged as one important of the most pathogen associated with nosocomial infections. They shows intrinsic resistance to several antimicrobial commonly used for treatment of the infections. Several potential virulence factors have been identified in enterococci, but none has been established as having a major contribution to virulence in humans, as well as some factors that has been linked to the virulence of enterococci. We analyzed 276 isolates obtained from colonization, infection, hospital diets and food handlers. The isolates were identified by conventional physiological tests for characterization at genus and species level. Antimicrobial susceptibilities were determined by the disk diffusion test method. CIM to vancomycin and teicoplanin were avayable by E-test. The biofilm production and the expression of gelatinase were also evaluated. The genes for resistance to gentamicin, vancomycin, streptomycin resistance genes as code as determinants virulence cylA, esp and fsr were investigated by PCR. The genetic polymorphism was determined by PFGE. E. faecalis was prevalent species recovered from colonization and infection (42.2% and 81.9%, respectively). E. casseliflavus (58.9%) was frequent species among the hospital diets samples. On the other hand, E. faecium (46.7%) was prevalent in food handlers. Among the colonization isolates the highest rates of resistance were observed to erythromycin (76.3%) and ciprofloxacin (53.9%). Although, >70% of infection isolates were resistant to erythromycin, tetracycline and ciprofloxacin. High level resistance to gentamicin (HLR-GE) and streptomycin (HLR-ST) were detected in 24.6% and 20.4% of the samples, respectively, and these isolates harboured the genes aac(6 )-Ie-aph(2 )-Ia and aph(2 )-Ic. Most strains of colonization (52.6%) and infection (55.7%) were multidrug resistant. High level resistance to vancomycin were detected in 5.2% of isolates harbouring vanA gene. 70.2% of the isolates were biofilm producers, were greater frequency among of infection. The expression of gelatinase was detected in 28.9% and 44.3% of colonization and infection isolates, respectively. None of the isolates recovered from the hospital diets and food handlers expressed gelatinase. In E. faecalis and E. faecium strains (n = 109) 16.5%, 51.4% and 48.6% showed amplification products related cylA, esp and fsr genes, respectively. The analysis of genetic polymorphism showed a wide diversity among the isolates belonging to the E. faecalis and E. faecium species. None prevalent profile was observed. The E. gallinarum vanc1/vanA isolates showed identical PFGE profiles. This study showed that enterococci strains isolated from diferents sources, also represents a potential risk for population, particularly those in hospital environment. Os enterococos estão amplamente distribuídos no ambiente. Nos seres humanos, compõem a microbiota do trato gastrintestinal, da cavidade oral e do trato geniturinário. Nas últimas décadas, esses microrganismos se tornaram importantes agentes etiológicos de infecções hospitalares. Uma característica marcante desses microrganismos é a resistência intrínseca a vários antimicrobianos utilizados habitualmente no tratamento de infecções, além de alguns fatores que tem sido relacionado à virulência de enterococos. Este estudo investigou a presença de enterococos em amostras de infecção e colonização de pacientes hospitalizados, profissionais de saúde, dietas hospitalares e manipuladores de alimentos. Foram analisadas 276 amostras de colonização, de quadros de infecção, dietas orais e manipuladores de alimento. Não foram recuperadas amostras dos profissionais de saúde. Todas as amostras foram submetidas a testes convencionais de caracterização do gênero e espécies. Testes de susceptibilidade aos antimicrobianos foram empregados pelo método de disco difusão, além da CIM para vancomicina e teicoplanina. A produção de biofilme e a expressão da gelatinase também foram avaliadas. Os genes de resistência a gentamicina, estreptomicina e vancomicina e os genes de virulência cylA, esp e fsr foram pesquisados pela técnica de PCR. O polimorfismo genético foi determinado por PFGE. A espécie E. faecalis foi a prevalente nas amostras isoladas de colonização e infecção (42,2% e 81,9%, respectivamente). E. casseliflavus (58,9%) foi a mais freqüente dentre as amostras das dietas hospitalares e E. faecium (46,7%) de manipuladores. Dentre as amostras de colonização as maiores taxas de resistência foram observadas para eritromicina (76,3%) e ciprofloxacina (53,9%). Dentre as amostras de infecção, >70% foram resistentes a eritromicina, ciprofloxacina e tetraciclina. Resistência a níveis elevados de gentamcina (HLR-GE) e estreptomicina (HLR-ST) foi detectada em 24,6% e 20,4% das amostras, respectivamente, e todas foram portadoras dos respectivos genes. A maioria das amostras de colonização (52,6%) e infecção (55,7%) foram multirresistentes. A taxa para resistência a níveis elevados de vancomicina foi de 5,2% e todas eram portadoras do gene vanA. Em relação a formação de biofilme, 70,2% foram produtoras, com uma maior freqüência dentre as de infecção. A expressão de gelatinase foi detectada em 28,9% e 44,3% das amostras de colonização e infecção, respectivamente. Nenhuma das amostras isoladas das dietas hospitalares e de manipuladores expressou gelatinase. Nas amostras pertencentes as espécies E. faecalis e E. faecium (n=109) 16,5%, 51,4% e 48,6% apresentaram produtos de amplificação referentes aos genes cylA, esp e fsr, respectivamente. A análise do polimorfismo genético revelou uma extensa diversidade dentre as amostras pertencentes as espécies E. faecalis e E. faecium, não acarretando um perfil eletroforético prevalente. Entretanto, foi observado um perfil único dentre as amostras de E. gallinarum resistentes a vancomicina (vanA). Este estudo mostrou que amostras de enterococos isoladas de diferentes fontes, não só de quadros infecciosos, podem representar um risco para a população, apontando para uma maior reflexão quanto ao papel desses microrganismos nas infecções humanas, particularmente no ambiente hospitalar.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:16:40Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_FINAL_PUBLICADA_Sabrina_Alves_Oliveira_Lima_Santos.pdf: 1603749 bytes, checksum: 6d75ad91652d821885a868c12ec3461d (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:16:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_FINAL_PUBLICADA_Sabrina_Alves_Oliveira_Lima_Santos.pdf: 1603749 bytes, checksum: 6d75ad91652d821885a868c12ec3461d (MD5) Previous issue date: 2015-03-31 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The Type VI Secretion System (T6SS), the latest secretion machinery described in Gram-negative bacteria, is evenly distributed among the various species of this group of microorganisms. This secretion apparatus is capable of injecting effector protein in target eukaryotic and prokaryotic cells. Studies on the role of the T6SS on microbial virulence revealed that this secretory system actively participates in the establishment of infection and contributes to the survival of bacteria within phagocytic cells. The genome of the Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain has three loci encoding apparatus of T6SS, called H1-T6SS, H2-T6SS and H3-T6SS. However, little is known about the participation of the T6SS in the pathogenesis of P. aeruginosa infections. Thus, the present study investigated the role of H1-T6SS, H2-T6SS and H3-T6SS during acute lung infections. To this end, C57/BL6 mice were infected with different doses of wild type PAO1 or mutants strains PAO1ΔH1, PAO1ΔH2, PAO1ΔH3 or PAO1ΔH1ΔH2ΔH3. After 24 hours, bronchoalveolar lavages (BALs) were collected for total leukocyte and polymorphonuclear cell counts, and for ELISA quantification of KC, the chemokine for neutrophils, and the proinflammatory cytokines IL-1β and TNF-α. In other experiments, lungs, livers, spleens and kidneys were macerated to determine the bacterial load and the occurrence of systemic dissemination of bacteria. The cytotoxicity of the T6SS on human neutrophils was determined in vitro by cell staining with propidium iodide (PI) and annexin-V followed by flow cytometry analysis. The results showed that the inactivation of the three T6SS significantly reduced the concentration of neutrophils in mice BALs when the animals were infected with 107 P. aeruginosa colony forming units. At this dose, it was observed that the median number of bacteria detected in animals infected with the T6SS mutants were lower than the numbers detected in animals infected with the parental PAO1 strain. The mutations in T6SS did not affect the systemic dissemination of bacteria. The investigation of the levels of proinflammatory cytokines showed a reduction in the median of TNF-α concentration in BALs from mice infected with the triple mutant PAO1ΔH1ΔH2ΔH3, compared to the median of the concentration in BALs from mice infected with the parental strain, although this difference was not statistically significant. Since the investigation of IL-1β and KC levels did not contribute to the elucidation of the mechanisms accounting for the reduction of neutrophil concentrations in BALs of mice infected by the triple PAO1 mutant, it was next investigated the possible role of the T6SS in the death of human neutrophils. No significant differences were detected when the different samples of infected cells were compared with each other. In conclusion, the results from this present study showed that the T6SS likely interferes in neutrophil response during mice acute pneumonia, but additional studies are needed to determine the role of this secretion mechanism in the pathogenesis of P. aeruginosa infections. O Sistema de Secreção do Tipo VI (SST6), o mais recente maquinário de secreção descrito em bactérias Gram-negativas, é amplamente distribuído entre as diversas espécies deste grupo de microrganismos. Esse aparato de secreção é capaz de injetar efetores proteicos em células alvo, eucarióticas e procarióticas. Estudos sobre o papel do SST6 na virulência microbiana revelaram que este sistema secretório participa ativamente do estabelecimento de infecções, contribuindo para a sobrevivência das bactérias no interior de fagócitos. O genoma da cepa PAO1 de Pseudomonas aeruginosa apresenta três loci que codificam aparatos de SST6, denominados de H1-SST6, H2-SST6 e H3-SST6, Porém, pouco se sabe sobre a participação do SST6 na patogênese de infecções por P. aeruginosa. Assim, o presente estudo investigou o papel de H1-SST6, H2-SST6 e H3-SST6 durante a infecção pulmonar aguda de camundongos. Para isso, camundongos C57/BL6 foram infectados com diferentes doses de bactérias da cepa selvagem PAO1 ou das cepas mutantes PAO1∆H1, PAO1∆H2, PAO1∆H3 ou PAO1∆H1∆H2∆H3. Após 24 horas, os lavados broncoalveolares (LBAs) de animais controle e infectados foram recuperados para a contagem de leucócitos totais e polimorfonucleares e para a quantificação, por ELISA, da quimiocina para neutrófilos, KC, e das citocinas pró-inflamatórias IL-1β e TNF-α. Em outros experimentos, os pulmões, fígados, baços e rins dos animais foram macerados para a pesquisa da carga bacteriana e da disseminação sistêmica das bactérias. A citotoxicidade do SST6 foi determinada, in vitro, em neutrófilos humanos, pela marcação com iodeto de propídeo (PI) e anexina-V seguida da análise em citometria de fluxo. Os resultados mostraram que a inativação dos três SST6 reduziu significativamente a concentração de neutrófilos nos LBAs quando os animais foram infectados com 107 Unidades Formadoras de Colônias de P. aeruginosa. Nesta dose, foi observado que as medianas do número de bactérias detectadas nos animais infectados com as mutantes no SST6 foram menores do que as detectadas nos animais infectados com a cepa parental PAO1. As mutações no SST6 não afetaram a disseminação sistêmica da bactéria. A pesquisa da secreção de citocinas pró-inflamatórias mostrou que, embora tenha sido observada uma redução nas medianas das concentrações de TNF-α nos LBAs de camundongos infectados com a cepa PAO1∆H1∆H2∆H3, em relação aos LBAs de camundongos infectados com a cepa parental, essa diferença não foi significativa. Como a pesquisa de IL-1β e KC não contribuiu para a elucidação dos mecanismos envolvidos na redução da concentração de neutrófilos nos LBAs dos camundongos infectados pela cepa tripla mutante, foi pesquisado o possível efeito do SST6 na morte de neutrófilos humanos. Os resultados mostraram que não houve diferenças significativas quando as diferentes amostras de células infectadas foram comparedas entre si. Em conclusão, os resultados do presente estudo mostraram que o SST6 pode interferir na resposta de neutrófilos durante a pneumonia aguda, mas estudos adicionais são necessários para determinar o papel deste mecanismo de secreção na patogênese de P. aeruginosa.

Submitted by Boris INFORMAT (boris@uerj.br) on 2021-04-26T01:16:40Z No. of bitstreams: 1 Paola Raquel Braz de Oliveira Tese completa.pdf: 3731088 bytes, checksum: 20820aa7b13b4b19c22df8088b414527 (MD5) Made available in DSpace on 2021-04-26T01:16:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paola Raquel Braz de Oliveira Tese completa.pdf: 3731088 bytes, checksum: 20820aa7b13b4b19c22df8088b414527 (MD5) Previous issue date: 2015-03-03 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Streptococcus agalactiae or group B Streptococcus (GBS) is a leading cause of invasive neonatal infection and bovine mastitis. Serotyping of GBS is important as regard epidemiological trends and vaccine development. Serotyping of GBS by latex agglutination has been the predominant typing method, but more recently genotyping has been introduced as an alternative method. For this reason, we decided to implement the PCR technique in our laboratory to typing from human and bovine strains. In addition, we analyzed two important virulence factors (laminin and pilus type 2a) and the sequence types ST-1 and ST-17 as genomic biomarkers in all GBS strains. Genotyping gave a result in all 31 GBS strains (15 human and 16 animal) using PCR method. In human strains, the serotype III (46.67%) was the most predominant, followed by serotypes Ia (20%), V (20%) and II (13.33%). However, all GBS bovine strain were genotyped as II (100%). Molecular typing by PFGE showed that GBS bovine strains were associated with two clones (A and B). The lmb virulence gene was detected in 60% human isolates and 93.75% of bovine strains, while pilus 2a was detected in 6,45% isolates. Moreover, both human and bovine strains tested produced biofilm in a model pilus 2a-independent. All strains tested presented the sequence type ST-1, but only the GBS strain 90356-líquor/III was positive for ST-17, showing that this invasive strain belongs to hypervirulent ST-17 clone. In conclusion, the PCR method facilitates the detection of DNA polymorphism in cps genes and was successfully implemented in our laboratory. Streptococcus agalactiae ou Estreptococos do grupo B (GBS) é uma das principais causas de infecção invasiva neonatal e mastite bovina. A sorotipagem dos EGB é importante no que diz respeito às tendências epidemiológicas e o desenvolvimento de vacinas. A sorotipagem de EGB por aglutinação em látex tem sido o método predominante de tipagem, porém recentemente a genotipagem foi introduzida como método alternativo. Por esta razão, decidimos implantar a técnica de PCR em nosso laboratório para a tipagem de cepas humanas e bovinas. Além disso, foram analisados dois importantes fatores de virulência (laminina e pilus tipo 2a) e as sequências tipo, ST-1 e ST-17 como biomarcadores genômicos em todas as amostras de EGB. A genotipagem apresentou resultado em todas as 31 cepas de EGB (15 humanos e 16 animais), utilizando o método PCR. Nos isolados de humanos, o sorotipo III (46,67%) foi o mais predominante, seguido pelos sorotipos Ia (20%), V (20%) e II (13,33%). No entanto, todas as cepas bovinas de EGB foram genotipadas como II (100%). A tipagem molecular por PFGE demonstrou que amostras bovinas de EGB foram associadas com dois clones (A e B). O gene de virulência LMB foi detectado em 60% dos isolados humanos e em 93,75% das amostras de origem bovina, enquanto o pilus 2a foi detectado em 6,45% dos isolados. Além disso, ambas as amostras de humanos e bovinos testadas produziram biofilme em um modelo pilus-2a independente. Todas as cepas testadas apresentaram a sequência tipo ST-1, porém apenas a amostra 90356-líquor/III de EGB foi positiva para o ST-17, mostrando que este isolado pertence a um clone invasivo hipervirulento ST-17. Em conclusão, o método de PCR facilita a detecção de polimorfismo de DNA nos genes cps e foi implantado com sucesso no nosso laboratório.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:16:47Z No. of bitstreams: 1 Andrea Fonseca Ferreira Dissertacao completa.pdf: 1106365 bytes, checksum: ced96bc5b1c316bbb27b3c52ec2d28d7 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:16:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrea Fonseca Ferreira Dissertacao completa.pdf: 1106365 bytes, checksum: ced96bc5b1c316bbb27b3c52ec2d28d7 (MD5) Previous issue date: 2014-09-11 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Aeromonads are considered potential pathogens for humans and animals. The presence of Aeromonas spp. in food shows that it s an important vehicle of infection in humans. The pathology caused by aeromonads infection is complex and involves several virulence factors, mainly the ability of adherence and invasion. Several in vitro interaction studies have used cell lineages as a model for detection of these factors. However, there is no animal model established to study Aeromonas spp. pathogenesis. The nematode Caenorhabditis elegans has been used as a model to study pathogenesis of diverse microorganisms by mimicking the process in mammals and because of its easy cultivation in laboratory. The aim of this study was to analyze the pathogenicity of Aeromonas spp. strains using Caenorhabdtis elegans as an in vivo model of infection. The synchronization, infection assays and colonization assays protocols were standardized for evaluation of virulence of Aeromonas spp. in C. elegans. Nematodes at L4 larval stage were exposed to A. caviae and A. hydrophila strains isolated from fish and left interacting till 10 days at 20°C, with daily counts of living and dead animals. Evaluation of nematodes survival level was not possible in interaction assays using two A. hydrophila strains, once many animals disappeared; remaining strains significantly reduced the survival of nematodes infected and LT50 ranged from 2 to 9 days of interaction. The process that reduced survival of nematodes infected with Aeromonas spp. probably is the mechanism of "slow killing", result of intense bacterial accumulation in the animals gut. Body morphology of infected nematodes changed, such as development and reproductive behavior, resulting in a visual change of symptomatic infection. The strains carrying genes of polar and lateral flagellin synthesis flaA and lafA showed to be the most virulent. Under fluorescence microscopy, the intense gut colonization and intestinal obstruction were observed in animals exposed to a transformed strain of A. caviae for 48 hours. This study is pioneer in the use of Caenorhabdtis elegans as an in vivo model for research of virulence of Aeromonas caviae strains. This model can be used as a biological tool to identify potentially pathogenic strains to humans and other animals. Algumas espécies de Aeromonas são consideradas patógenas para o homem e animais. A presença de Aeromonas spp. em alimentos faz com que estes sejam importantes veículos de infecções em humanos. A patologia causada por Aeromonas spp. é complexa e envolve inúmeros fatores de virulência, sobretudo a capacidade de aderência e invasão. Diversos estudos de interação in vitro têm utilizado linhagens celulares como modelo para detecção destes fatores. No entanto, não há um modelo animal bem estabelecido no estudo da patogênese de Aeromonas spp. O nematódeo Caenorhabditis elegans vem sendo utilizado como modelo de estudo da patogênese de diversos microrganismos por mimetizar esse processo em mamíferos e devido ao seu fácil cultivo em laboratório. O objetivo do presente estudo foi analisar a patogenicidade de cepas de Aeromonas spp. utilizando o nematódeo Caenorhabdtis elegans como modelo de infecção. Os protocolos de sincronização, ensaios de infecção e de colonização foram padronizados para avaliação da virulência de Aeromonas spp. em C. elegans. Os nematódeos sincronizados em estágio larval L4 foram expostos a cepas de A. caviae e A. hydrophila isoladas de peixe e foram deixados em interação por até 10 dias a 20°C, com contagem diária de animais vivos e mortos. Nos ensaios com duas cepas de A. hydrophila citotóxicas não foi possível determinar o nível de sobrevivência dos nematódeos, uma vez que muitos animais desapareceram; as demais cepas reduziram significativamente a sobrevivência dos nematódeos infectados, com LT50 variando de 2 a 9 dias de interação. O processo que levou à redução da sobrevivência dos nematódeos infectados com Aeromonas parece ser o mecanismo slow killing , resultado da observação do intenso acúmulo bacteriano no intestino do animal. A morfologia corporal dos nematódeos infectados se apresentou alterada, assim como o desenvolvimento reprodutivo e o comportamento, resultando em uma modificação visual sintomática da infecção. As cepas que albergavam genes de síntese das flagelinas polar e lateral flaA e lafA se apresentaram como as mais virulentas. Através de microscopia de fluorescência, foi observada a intensa colonização e obstrução do tubo digestivo dos animais expostos por 48 horas a uma cepa de A. caviae. Este estudo é pioneiro no emprego do nematódeo Caenorhabdtis elegans como modelo de infecção para a pesquisa in vivo da virulência de cepas da espécie Aeromonas caviae, podendo ser utilizado como mais uma ferramenta biológica na identificação de cepas potencialmente patogênicas ao homem e animais.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:17:07Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_FINAL_PUBLICADA_Elenice_Rosa_de_Aguiar_Rodrigues.pdf: 747415 bytes, checksum: 22b2d3fb8de014f2df6bc90e7b11b6de (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:17:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_FINAL_PUBLICADA_Elenice_Rosa_de_Aguiar_Rodrigues.pdf: 747415 bytes, checksum: 22b2d3fb8de014f2df6bc90e7b11b6de (MD5) Previous issue date: 2014-09-10 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Achromobacter xylosoxidans has been highlighted as an important pathogen in lung infections of patients with cystic fibrosis (CF). Phenotypic and genotypic similarity among species of the genus hampers identification and the real frequency is possibly underestimated. The proper identification is required to understand epidemiology and clinical impacts of different species of Achromobacter. This study compared the results obtained of identification of species of the genus by 16S rRNA gene, by Multilocus Sequence Typing (MLST) and by PCR for blaOXA-114-like gene. Thirty Achromobacter spp. samples were obtained from 17 patients with CF treated in two reference centers Rio de Janeiro city and belonging to 18 clones previously established by PFGE were evaluated. The 16S rRNA gene sequencing identified all samples as A. xylosoxidans. The sequencing of the amplification products of blaOXA-114-like gene revealed compatibility of 17 samples with some gene variation and were identified as A. xylosoxidans. Eleven samples were consistent with the blaOXA-258 gene, and were classified as A. ruhlandii. Two samples didn t obtain amplification. MLST analysis showed 11 samples matching four STs (2, 13, 35, 36) provided by MLST Achromobacter site. In 15 samples were characterized ten new alleles, grouped in eight new STs (198, 199, 200, 201, 202, 203, 204 and 205). Two new combinations of alleles were observed in 2 samples featuring 2 new STs (206 and 207). Two samples didn t have their STs defined. The 30 samples corresponded to 14 STs and four species of Achromobacter spp. Seventeen samples were identified as A. xylosoxidans, nine as A. ruhlandii, onde as A.dolens and one as A. insuavis. The three techniques were consistent only to identify 17 samples as A. xylosoxidans (56.6%). The identification of nine samples of A. ruhlandii were concordant in MLST, PCR and sequencing for OXA-114 techniques. A. dolens and A. insolitus were identified only by MLST. The comparison between PFGE and MLST showed that results of the two techniques aren t entirely consistent. PFGE technique characterized 18 clones while MLST identified 14 STs. Among different samples, PFGE different clones were correspondent to the same ST and some PFGE / MLST clones were unique per patient. Results of this study show that 16S rRNA sequencing was a good tool for gender characterization and PCR gene blaOXA-114 was useful for identification of two most common species in the FC (A. xylosoxidans and A.ruhlandii). However, MLST had the best performance featuring all described species. Additional studies are required to elucidate the infection dynamics and contribution of the different species of the genus Achromobacter in FC. Achromobacter xylosoxidans tem se destacado como patógeno importante nas infecções pulmonares em pacientes com Fibrose Cística (FC). A similaridade fenotípica e genotípica entre as espécies do gênero dificulta a sua identificação podendo subestimar a real frequência. A identificação adequada é necessária para compreender a epidemiologia e impacto clínico das diferentes espécies de Achromobacter. Este estudo comparou os resultados obtidos na identificação das espécies do gênero por sequenciamento do gene 16S rRNA, por Multilocus Sequence Typing (MLST) e PCR para o gene blaOXA-114-like. Foram avaliadas 30 amostras de Achromobacter spp, obtidas de 17 pacientes com FC atendidos em dois centros de referência na cidade do Rio de Janeiro, pertencentes a 18 clones previamente estabelecidos por PFGE. O sequenciamento do gene 16S rRNA, identificou as 30 amostras como A. xylosoxidans. O sequenciamento dos produtos de amplificação para o gene blaOXA-114-like revelou compatibilidade de 17 amostras com alguma variável do gene e foram caracterizadas como A. xylosoxidans. Onze amostras foram compatíveis com o gene blaOXA-258, e foram classificadas como A. ruhlandii. Duas amostras não obtiveram amplificação. A análise do MLST mostrou que 11 amostras obtiveram correspondência com quatro STs (2, 13, 35, 36) disponibilizado no Achromobacter MLST website. Em 15 amostras foram caracterizados dez novos alelos que geraram oito novos STs (198, 199, 200, 201, 202, 203, 204 e 205). Duas combinações alélicas novas foram observadas em duas amostras caracterizando dois novos STs (206 e 207). Duas amostras não tiveram seus STs definidos. As 30 amostras corresponderam a 14 STs e quatro espécies de Achromobacter spp. Dezessete amostras foram identificadas como A. xylosoxidans, nove como A. ruhlandii, uma A. dolens e uma A. insuavis. As três técnicas foram concordantes apenas na identificação de 17 amostras de A. xylosoxidans (56,6%). A identificação de nove amostras de A. ruhlandii foram concordantes nas técnicas de MLST, PCR e sequenciamento para OXA-114. A. dolens e A. insolitus foram identificados somente por MLST. A comparação entre PFGE e MLST mostrou que os resultados das duas técnicas não são totalmente concordantes. O PFGE caracterizou 18 clones enquanto o MLST identificou 14 STs. Na amostragem foram observados diferentes clones PFGE correspondendo ao mesmo ST e clones PFGE/MLST únicos por paciente. Os resultados deste estudo demonstraram que, o sequenciamento do gene 16S rRNA foi uma boa ferramenta para a caracterização do gênero e a PCR do gene blaOXA-114 foi útil para a identificação das duas espécies mais frequentes na FC (A. xylosoxidans e A.ruhlandii). Entretanto, o MLST teve o melhor desempenho caracterizando todas as espécies descritas. Estudos adicionais são necessários para elucidar a dinâmica da infecção e contribuições das diferentes espécies do gênero Achromobacter na FC.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:58:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 thesisMarianaCampeao.pdf: 13162328 bytes, checksum: ed5b7096328fd1404655a6f926f0f292 (MD5) Previous issue date: 2014-04-25 Vibrios sao bacterias amplamente distribuidas no meio aquatico e podem ser encontradas em associacao com organismos marinhos, tanto como causadores de doencas quanto como simbiontes. O advento das tecnicas de sequenciamento de nova geracao e de alto desempenho tem possibilitado o acesso cada vez mais amplo a dados genomicos microbianos, incluindo vibrios. Tal quantidade e disponibilidade de dados permitem analises in silico, que podem compreender desde caracteristicas genomicas ate fenotipicas. A taxonomia microbiana e fundamentada na abordagem polifasica, que mede as relacoes evolutivas a partir do uso de sequencias de genes, especialmente o RNAr 16S, similaridade genomica, por meio de hibridizacao de DNA, e ampla caracterizacao fenotipica. A caracterizacao fenotipica requer testes experimentais, que muitas vezes sao demorados, caros e requerem grande experiencia. Neste estudo propomos o uso de genomas para a analise da diversidade e identificacao fenotipica de vibrios. Para tanto, foram avaliadas caracteristicas basicas de vibrios (tais como tamanho do genoma, conteudo genico e posicao logenetica); analisaram-se genes unicos e suas possiveis funcoes ecologicas; e desenvolveu-se uma ferramenta prototipo para identificacao de fenotipos diagnosticos de vibrios, denominada vibriophenotyping 1.0. A logenia construida a partir do genoma minimo recuperou os diferentes generos e clados descritos na literatura para o grupo vibrio, bem como posicionou as especies consideradas irmas em relacao a um ancestral comum proximo. Os genes unicos, por sua vez, puderam ainda revelar peculiaridades entre especies irmas. Por m, o programa de identificacao fenotipica desenvolvido foi testado com genomas de linhagens tipo de vibrios e apresentou uma media de similaridade superior a 70% entre os fenotipos obtidos in vitro e in silico, sendo alcançada uma similaridade de 100% para genomas integros. Dessa forma, concluiu-se que analises do pangenoma permitem a recontrucao logenetica dentro do grupo vibrios e a identificacao de genes unicos relevantes para o papel ecologico da especie no ambiente de origem, e, ainda, que a identificacao fenotipica atraves da automatizacao por uma ferramenta computacional e possivel a partir da analise de genomas.

A lobomicose é uma infecção subcutânea crônica, granulomatosa, causada pela implantação traumática do fungo Lacazia loboi nos tecidos cutâneo e subcutâneo. Ocorre predominantemente na região Amazônica e atinge qualquer grupo populacional. Histologicamente, observa-se reação inflamatória crônica caracterizada por intensa histiocitose e fibroplasia, abundante número de macrófagos, células gigantes multinucleadas do tipo corpo estranho e presença de considerável número de células leveduriformes. Os macrófagos são células fagocíticas que participam do reconhecimento e da resposta a patógenos através da fagocitose, da apresentação de antígenos aos linfócitos T e da produção de citocinas. As células de Langerhans (LC) são um grupo de Células dendríticas (CD) derivadas da medula óssea situadas principalmente em uma camada suprabasal da epiderme. Estudos envolvendo a interação fungo-hospedeiro na doença de Jorge Lobo são escassos. Assim, Este estudo é um passo importante para o melhor entendimento da biologia e patogenia do L. loboi, e para o estudo da imunopatologia da interação patógeno versus hospedeiro desta doença emergente e pouco conhecida. O objetivo do presente trabalho foi analisar a interação in vitro entre macrófagos peritoneais não ativados e/ou LC, isolados de camundongos BALB/c, com L. loboi recém-isolado de pacientes com doença de Jorge Lobo, bem como determinar os índices de infecção, fagocitose e fusão, e medir a produção das citocinas TNF-α, IL-4, IL-6, IL-10 e IL-12. Os resultados demonstraram que L. loboi é fagocitado por macrófagos, mas não por LC. O índice de infecção na interação entre macrófagos e L. loboi foi semelhante à interação entre macrófagos, LC e L. loboi em todos os tempos analisados. A média do número de fungos por macrófago também foi praticamente igual entre as interações e ao longo do tempo, variando de 1,2 a 1,6 fungos/macrófagos. Não houve a formação de células gigantes em macrófagos cultivados ou LC cultivadas isoladamente e em nenhum dos co-cultivos. Não houve diferença significante na produção de IL-4, IL-2 e IL-10 nas interações estudadas. Os níveis de TNF-α diminuem ao longo do tempo na interação entre macrófagos e L. loboi, enquanto a adição de LC induz aumento da produção de TNF-α, principalmente após 48 horas. LC modulam negativamente a produção de IL-6 por macrófagos e L. loboi também inibem essa produção por macrófagos isoladamente ou em co-cultivo com LC. L. loboi estimulam significativamente a produção de IL-12 por macrófagos co-cultivados com LC, mas não em LC ou macrófagos isoladamente. Lobomycosis is a chronic, granulomatous, fungal infection of the skin and subcutaneous caused by the fungus Lacazia loboi. This mycosis occurs predominantly in Amazon region and affect all populations groups. Histologically, there is a chronic inflammatory reaction characterized by the intense fibroplastia and histiocytosis, abundant number of macrophages, multinucleated giant cells and presence of large numbers of yeast. Macrophages are phagocytic cells that participate in the recognition and response to pathogens through phagocytosis, antigen presentation to T lymphocytes and cytokine production. Langerhans cells (LC) are a group of dendritic cells (DC) derived from bone marrow, which are located mainly in the suprabasal layer of the epidermis. Studies on hostfungal interaction in Jorge Lobo's disease are scarce. Therefore, this study constitutes an important step towards a better understanding of L. loboi biology and pathogenesis, enabling in vitro culture of this organism endemic in Amazon region and study of their antigenic properties, as well as new therapeutic approaches. The objective of this study was to analyze the in vitro interaction between non-activated peritoneal macrophages and/or Langerhans cells isolated from BALB/c mice and L. loboi, calculating infection, phagocytosis and cellular fusion rates; also measuring the production of TNF, IL-4, IL-6, IL-10 and IL-12. Results showed that L. loboi is phagocytosed by macrophages but not by LC. Phagocytosis and infection rates in the interaction between macrophages and L. loboi was similar to interaction between macrophages, Langerhans cells and L. loboi at all times analyzed. The mean number of yeast cell per macrophage was almost equal among interactions and over time, with mean variation from 1.2 to 1.6 yeast/macrophages. No giant cells formation in coculture studied. No significant difference occurred in IL-4, Il-2 and IL-10 production between interactions studied. TNF levels decrease in interaction between macrophages and L. loboi while adding LC induces increased production of TNF-α, especially after 48 hours. LC negatively modulate IL-6 production by macrophage and L. loboi also inhibits this production by macrophages alone or cocultured with LC. L. loboi stimulated significantly IL-12 production by macrophages co-cultured with LC, but not for LC alone or macrophages.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:13:58Z No. of bitstreams: 1 TESE_FINAL_PUBLICADA_ Carolina_Diettrich_Mallet_de_Lima.pdf: 7258764 bytes, checksum: d7c49d2c8a81144a3c82f9cd31602c42 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:13:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE_FINAL_PUBLICADA_ Carolina_Diettrich_Mallet_de_Lima.pdf: 7258764 bytes, checksum: d7c49d2c8a81144a3c82f9cd31602c42 (MD5) Previous issue date: 2014-04-11 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior ExoU, a cytotoxin injected into host cytosol by the Pseudomonas aeruginosa type III secretion system, exhibits a strong proinflammatory activity characterized by an important neutrophil recruitment to the infected tissues. To evaluate the mechanisms underlying the neutrophil infiltration, we investigated the effect of ExoU on IL-8 secretion and NF-κB activation. We showed that ExoU activates NF-κB and induces IL-8 in epithelial and endothelial cells infected with P. aeruginosa. Using an animal model of acute pneumonia, we showed a significant reduction in KC secretion and neutrophil infiltration in bronchoalveolar lavage of mice treated with the NF-κB inhibitor Bay 11-7082 before infection. Subsequent studies suggested that NF-κB activation occurs not only in ExoU-injected cells but also in non-infected cells of the neighborhood, possibly indicating a wide-ranging phenomenon. We next identified the key factor of NF-κB activation by ExoU: PAF receptor, PAFR. PAFR binds to PAF molecules produced by ExoU phospholipase A2 activity and stimulates the NF-κB canonic pathway, as characterized by IKK and Akt-mediated IκBα phosphorylation and degradation and p65 nuclear translocation. Additionally, reduced ExoU-mediated p65 nuclear translocation was observed in lungs of mice PAFR-/- or treated with the PAF antagonist WEB 2086. Since NF-κB can regulate PAFR transcription, we investigated the role of ExoU, PAFR and NF-κB in PAFR expression to evaluate a potential mechanism of amplification of response to ExoU. In fact, ExoU promotes p65 occupation of the three κB sites in PAFR promoter, inducing PAFR expression. These in vitro results were confirmed by in vivo assays, since the treatment with Bay 11-7082 or WEB 2086 was able to significantly reduce PAFR expression in lungs of infected mice. NF-κB can also regulate a number of other cellular processes and, since ExoU induces oxidative stress, we evaluated the effect of ExoU in superoxide dismutase 1 (SOD1) expression. The in vitro e in vivo assays showed that ExoU PLA2 activity induces SOD1 expression, in a NF-κB-dependent mechanism. Moreover, ExoU activates the transcriptional factor Nrf2 that is also necessary to SOD1 induction. Together, our data show that ExoU activates the transcriptional factors NF-κB e Nrf2 and induces the expression of genes related to inflammatory and oxidative stress responses. Furthermore, NF-κB activation by ExoU results from the interaction between PAF produced by the infected cells and PAFR, a receptor that can be expressed by infected and non-infected cells. In these cells, NF-κB activation stimulates PAFR expression, highlighting an important mechanism of amplification of response that can affect all cells of the neighborhood. ExoU, uma citotoxina injetada diretamente no citosol hospedeiro pelo sistema de secreção de tipo III de Pseudomonas aeruginosa, exibe uma potente atividade pró-inflamatória responsável por um acentuado recrutamento de neutrófilos para os tecidos infectados. Para avaliar os mecanismos que levam à infiltração de neutrófilos, investigamos o efeito de ExoU na ativação de NF-κB e na secreção de IL-8. Os resultados mostraram que ExoU é capaz de ativar NF-κB, aumentando a expressão de IL-8 em células epiteliais e endoteliais infectadas. Estes resultados foram corroborados em um modelo murino de pneumonia aguda, que revelou uma redução significativa da secreção de IL-8 murino (KC) e da infiltração de neutrófilos no lavado broncoalveolar dos camundongos tratados com o inibidor de NF-κB, Bay 11-7082, antes da infecção com a cepa produtora de ExoU. Em estudos posteriores, observamos que a ativação de NF-κB por ExoU ocorre não apenas nas células injetadas com este fator de virulência, mas também em células vizinhas não infectadas, sugerindo um amplo alcance deste fenômeno. A pesquisa dos mecanismos moleculares de ativação de NF-κB por ExoU permitiu a identificação do fator chave deste evento: o receptor de PAF, PAFR. Em células epiteliais respiratórias, PAFR se liga ao PAF produzido pela atividade tipo fosfolipase A2 de ExoU, ativando a via canônica de NF-κB, como caracterizado pela fosforilação de IκBα por IKK e participação de Akt, pela degradação de IκBα e pela translocação nuclear de p65. Em camundongos PAFR-/- ou tratados com o antagonista de PAF, WEB 2086, também foi observada uma menor translocação nuclear de p65 durante a pneumonia pela cepa de P. aeruginosa produtora de ExoU. Como NF-κB pode regular a transcrição de PAFR, investigamos a modulação da expressão deste receptor por ExoU, PAFR e NF-κB, na tentativa de identificar um possível mecanismo de amplificação da resposta a ExoU. De fato, observamos que ExoU é capaz de promover a ocupação dos três sítios κB no promotor de PAFR por p65, induzindo a expressão deste receptor. Confirmando os resultados obtidos in vitro, ensaios in vivo mostraram que o tratamento com Bay 11-7082 ou WEB 2086 reduziu a expressão de PAFR no pulmão dos camundongos infectados pela cepa ExoU+. Além de regular a expressão de genes relacionados à inflamação, NF-κB pode particpar da regulação de diversos outros processos celulares. Como ExoU ativa o estresse oxidativo, avaliamos o efeito deste fator de virulência na modulação da expressão de superóxido dismutase 1 (SOD1). Os resultados obtidos em modelos in vitro e in vivo mostraram que a atividade PLA2 de ExoU ativa a expressão de SOD1 por um mecanismo dependente de NF-κB. Além disso, ExoU é capaz de ativar o fator transcricional Nrf2, que também é necessário à indução da expressão de SOD1. Em conjunto, nossos dados mostram que a atividade PLA2 de ExoU é capaz de ativar os fatores transcricionais NF-κB e Nrf2, estimulando a expressão de genes relacionados à inflamação e à resposta ao estresse oxidativo. Além disso, a ativação de NF-κB, por ExoU, é decorrente da interação entre o PAF produzido pelas células infectadas e PAFR, que pode ser expresso em células infectadas e não infectadas. Como a ativação de NF-κB por ExoU também estimula a expressão de PAFR, estes eventos representam um mecanismo de amplificação de resposta que afeta células vizinhas não infectadas.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-05T19:36:39Z No. of bitstreams: 1 Dilzamar Veloso do Nascimento Tese completa.pdf: 2811505 bytes, checksum: c33b76020e8029d1a42d01e4d66ef2fc (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-05T19:36:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dilzamar Veloso do Nascimento Tese completa.pdf: 2811505 bytes, checksum: c33b76020e8029d1a42d01e4d66ef2fc (MD5) Previous issue date: 2014-03-28 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The diphtheria vaccine currently used in Brazil (DTP), despite its history of high efficacy in the prevention of diphtheria, is associated with episodes of toxicity and vaccine reactogenicity in the vaccinee, resulting from the presence in the vaccine of residual proteins derived from the production process or detoxification. Strategies for the development of new vaccines more effective and economically viable against diphtheria have been the subject of intense investigation. The alternative proposed by our group is the use of the vaccine against tuberculosis (Mycobacterium bovis BCG Moreau sub strain) as a vector for the gene that encodes the 58.3 kDa fragment B of the diphtheria toxin (DTB). In our project the dtb gene was cloned into the bifunctional vector pUS977 for cytoplasmic expression and recombinant BCG (rBCG) clones, selected after transformation of BCG, were tested for expression of the DTB polypeptide and antigenicity against polyclonal antibodies anti- diphtheria toxoid by immunoblotting. The integrity and identity of the DNA sequence encoding the dtb gene carried by the plasmid construct pUS977dtbPW8 was confirmed by DNA Sequencing and Analysis of Similarity. The immunogenicity of the rBCG expressing the DTB was investigated in BALB/c mice and the results revealed a specific seroconversion (IgG). Also, infectivity and microbicidal activity were analyzed in the intracellular environment by infecting human monocytes (THP-1 cell line) with rBCG. The data obtained indicated intracellular survival within 12 days. In this context, splenocytes collected from mice at days 30 and 60 after immunization were removed and assayed for live bacteria. The results showed that rBCG persisted viable up to 60 days in the absence of selective pressure and cell viable counts did not change significantly during testing. Additionally, the rBCG subjected to six consecutive sub-cultures in vitro showed no significant difference in the ability to express the DTB, thus demonstrating the functional stability of the recombinant vaccine. The structural stability of the construct pUS977dtbPW8 was also confirmed by PCR detection of the dtb gene in rBCG colonies. Also, it was possible to have a preliminary evaluation of the neutralizing capacity of sera from mice immunized with BCGr 30 and 60 days after immunization. The cytotoxic action of diphtheria toxin, between dilutions 1/ 4 and 1/16, was neutralized by mice sera in an in vitro assay using VERO cells. Finally, in our study it was possible to evaluate the potential of BCG as a vector for expression of an antigen of Corynebacterium diphtheriae in vitro and in vivo. A vacina anti-diftérica de uso corrente no Brasil (DTP), embora de alta eficácia na prevenção da difteria, está associada com episódios de toxicidade e reatogenicidade no recipiente vacinal, resultantes de proteínas residuais derivadas do processo de produção ou detoxificação. Estratégias para o desenvolvimento de vacinas menos reatogênicas e ao mesmo tempo mais eficazes e economicamente viáveis contra a difteria têm sido alvo de intensa investigação. A alternativa proposta por nosso grupo é a utilização da vacina contra a tuberculose (Mycobacterium bovis BCG sub-cepa Moreau), como vetor do gene que codifica o fragmento B da toxina diftérica (dtb) de 58,3 kDa. Neste trabalho o dtb foi clonado no vetor micobacteriano bifuncional (pUS977) de expressão citoplasmática e os clones recombinantes (pUS977dtbPW8), após a transformação do BCG, foram testados com relação a expressão do DTB em BCG e quanto a antigenicidade frente a anticorpos policlonais anti-toxóide diftérico por Immunobloting. A integridade do gene dtb e a identidade das sequências de DNA da construção plasmidial pUS977dtbPW8 foram confirmadas por sequenciamento de DNA e análise de similaridade. A imunogenicidade do BCGr pUS977dtbPW8 expressando o DTB foi investigada em camundongos BALB/c, os resultados obtidos revelaram uma soroconversão específica (IgG). A infectividade e atividade microbicida do BCGr pUS977dtbPW8 no ambiente intracelular foi avaliada através da infecção de linhagens de células de monócitos humano (THP-1), os dados obtidos indicaram que houve sobrevivência intracelular em até 12 dias. Nesse contexto, esplenócitos dos camundongos imunizados com 30 e 60 dias foram extraídos, mostrando que o BCGr pUS977dtbPW8 persistiu até 60 dias na ausência de pressão seletiva e a viabilidade celular não sofreu alteração significativa durante o período testado. Por outro lado, o BCGr pUS977dtbPW8, quando submetido a seis sub-cultivos consecutivos in vitro não apresentou diferença significativa na capacidade de expressar o DTB, demonstrando portanto a persistência da estabilidade funcional da linhagem recombinante. A estabilidade estrutural da construção pUS977dtbPW8 também foi avaliada por PCR confirmando a presença do gene dtb em colônias do BCGr pUS977dtbPW8 . Adicionalmente, foi possível avaliar preliminarmente in vitro a capacidade soroneutralizante dos soros de camundongos imunizados com BCGr pUS977dtbPW8 após 30 e 60 dias em células VERO. A ação citotóxica da toxina diftérica entre as diluições de 1/4 e 1/16 foram neutralizadas com o pool de soros imunes com 60 dias. Finalmente, em nosso estudo foi possível avaliar o potencial da vacina BCG como vetor de expressão de um antígeno de Corynebacterium diphtheriae in vitro e in vivo.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_mariana_almeida_iglesias.pdf: 683600 bytes, checksum: 7c2d99601551e443f9b19dd649609f3f (MD5) Previous issue date: 2014-03-06 Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen that can cause listeriosis, both in humans and in animals. The contamination by this microorganism is difficult to control, given its wide dissemination and physiological adaptability, which allow its development under conditions which are usually unfavorable to other pathogenic bacteria. Therefore, this pathogen has become of concern to the food industry as well as consumers, since it is highly pathogenic, especially in relation to risk group and may be fatal in 30% of cases of listeriosis. Although any isolate of L. monocytogenes can be considered potentially pathogenic for humans, several studies suggest that this micro-organism has a heterogeneous pathogenicity of the strains, which makes it essential to know the gene expression of the pathogen can be understood that the differences in their virulence mechanisms, and how different potential pathogenicity. The present study aimed to verify the occurrence of. L. monocytogenes in slaughterhouses in southern Rio Grande do Sul, and through the isolates, assess their sensitivity to antibiotics, and perform a genotypic characterization by verifying the presence of virulence genes. L. monocytogenes occured in 6% of the samples, detected after bleeding at the point where the collect was held in the leather of the animal, and point 4 (pre-cooling after washing).Twelve isolates were obtained, which were evaluated for sensibility to 15 antimicrobials, of which 100% were susceptible to most antibiotics tested. Resistance to gentamycin (8%), ampicilin (8%), kanamycin (8%) and sulfonamide (83%) were observed in some isolated of L. monocytogenes. Intermediate susceptibility to clindamycin (60%) and erythromycin (8%) was observed, and multidrug-resistant strains were also observed. Proceeded to evaluate the presence of virulence genes (hlyA, plcA, inlA, inlB, inlC, inlJ, plcB, iap, actA, mpl and PrfA) and, through the results of PCR, it was observed that all isolates possessed the evaluated genes, also confirmed the expression of the gene of internalin A by RT-PCR, showing the potential pathogenic strains of L. monocytogenes isolated from food in southern Brazil. Listeria monocytogenes é um patógeno de origem alimentar capaz de causar listeriose, tanto em humanos como em animais. A contaminação por este micro-organismo é de difícil controle, tendo em vista sua ampla disseminação e capacidade fisiológica de adaptação, as quais permitem seu desenvolvimento sob condições que usualmente são desfavoráveis a outras bactérias patogênicas. Assim sendo, esse patógeno tornou-se motivo de preocupação para a indústria de alimentos bem como para os consumidores, uma vez que é altamente patogênica, principalmente em relação ao grupo de risco, podendo ser fatal em até 30% dos casos de listeriose. Embora qualquer isolado de L. monocytogenes possa ser considerado potencialmente patogênico para humanos, vários estudos sugerem que este micro-organismo apresenta patogenicidade heterogênea, o que torna essencial a caracterização molecular de cada isolado, bem como o conhecimento de sua expressão gênica, para que possam ser entendidas as diferenças nos seus mecanismos de patogenicidade.. Em vista do exposto, o presente estudo objetivou verificar a ocorrência de L. monocytogenes em carcaças bovinas abatidas em dois frigoríficos-matadouros do sul do Rio Grande do Sul e, a partir dos isolados, avaliar sua sensibilidade a antimicrobianos, e realizar a caracterização genotípica, através da verificação da presença de genes de virulência e da expressão da internalina A. A ocorrência de L. monocytogenes nas carcaças foi de 6%, a qual foi detectada no Ponto 1 (após a sangria) e no Ponto 4 (após a lavagem pré-resfriamento). Foram obtidos 12 isolados, os quais foram avaliados quanto a sensibilidade a 15 antimicrobianos, dos quais 100% mostraram-se sensíveis a maioria dos antibióticos testados. Resistência à gentamicina (8%), ampicilina (8%), canamicina (8%) e a sulfonamida (83%) foram observadas em parte dos isolados. Suscetibilidade intermediária foi observada para clindamicina (60%) e eritromicina (8%). Quanto aos isolados multirresistentes, dois deles apresentaram resistência a mais de um agente antimicrobiano. Procedeu-se à avaliação da presença de genes de virulência (prfA, plcA, plcB, hlya, iap, actA, mpl, inlA, inlC e inlJ) e, através dos resultados da PCR, foi possível observar que todos os isolados possuíam os genes avaliados, sendo também confirmada a expressão do gene da internalina A através da técnica de RT-PCR, evidenciando o potencial patogênico das cepas de L. monocytogenes isoladas de alimentos no sul do Brasil.

Xylanases have an important role as biocatalysts in different agroindustrial processes, such as saccharification of plant residues for the production of ethanol and bleaching of wood pulp for the production of pulp. On an industrial scale, these processes may require extreme pH or temperature, which require enzymes compatible with these conditions. Most enzymes available or showing commercial potential is synthesized by fungi or bacteria belonging to a few genera. Evaluation of rare isolation bacteria is an important strategy to expand the diversity of xylanases and their potential in terms of activity, stability and technological application. The aim of this study was to evaluate a collection of common and rare isolation soil bacteria regarding to xylanase activity and characterize the stability conditions of temperature and pH. The analyzed collection consists of 120 isolates with representatives from six phyla that were subjected to screening for xylanase activity in pure cultures and in the extracellular proteic extract (EPE). The ratio between the halos diameters of xylan hydrolysis and in the colonies on solid medium (ratio H:C), incubated at 30 ° C for up to 14 days, was used for the evaluation of cultures as a selection criteria. The effects of different sources of variation in the bacteria isolation stage (original soil, culture medium, solidifying agent, inoculum dilution and plating method and incubation time to colony appearance) and the group of bacterial isolation (rare or common) on the frequency of isolates with high xylanase activity were evaluated based on the ratio H:C. EPEs were obtained in liquid media containing xylan inoculated with the eleven isolates with highest ratios H:C. The extracts were evaluated for the specific xylanase activity at 50 °C for 1 h. Extracts of the three isolates with the highest potential for activity under this condition were evaluated for optimum activity, stability, activity at 60 oC and at pH 4.0, 5.5 and 8.0. Twenty-two isolates (25%), including eight from rare isolation, showed xylanase activity under the conditions evaluated, and found a high variability (> 230%) between these isolates. No isolation factor or rare or common isolation condition were associated with efficiency of xylanase activity in solid medium. High variability in specific xylanase activity in EPEs was also found among isolates (1500%), highlighting two rare isolates (TC119 and TC21), from Alfaproteobacteria class, and one common isolate (TC99), from Ralstoniaceae family. Extracellular xylanases from TC21 and TC119 showed high relative activity at temperatures up to 70 oC and were insensitive to pH in the range 4.0 to 8.0; however, TC99 isolate showed optimum temperature at 40 °C and low stability to temperature and pH. Extracellular xylanases from TC119 showed no cellulolytic activity. Rare isolation soil bacteria show high potential as a source of extracellular xylanases adapted to extreme pH and temperature conditions, which are required in agroindustrial processes. As xilanases apresentam papel relevante como biocatalisadores de diferentes processos agroindustriais, como a sacarificação de resíduos vegetais para a produção de etanol e o clareamento de polpas de madeira para a produção de celulose. Em escala industrial, estes processos podem requerer pH e, ou, temperatura extremos, os quais demandam enzimas compatíveis com estas condições. A maioria das enzimas disponíveis ou com potencial comercial é sintetizada de fungos ou de bactérias pertencentes a poucos gêneros. A avaliação de bactérias de isolamento raro constitui-se em estratégia importante para ampliar a diversidade de xilanases e suas potencialidades em termos de atividade, estabilidade e aplicação tecnológica. O objetivo deste trabalho foi avaliar uma coleção de bactérias do solo de isolamento comum e raro quanto à atividade de xilanases e caracterizar estas enzimas quanto à estabilidade a condições contrastantes de temperatura e pH. A coleção analisada é composta de 120 isolados com representantes de seis filos e foi submetida à seleção quanto à atividade de xilanases em culturas puras e no extrato proteico extracelular (EPE). Para a avaliação das culturas, utilizou-se como critério de seleção a relação entre os diâmetros de halos de hidrólise de xilana e das colônias em meio sólido (relação H:C), incubado a 30 oC por até 14 dias. Os efeitos de diferentes fontes de variação da fase de isolamento destas bactérias (solo de origem, meio de cultura, agente solidificante, diluição do inóculo e método de plaqueamento e tempo de incubação até surgimento de colônias) e do grupo de isolamento bacteriano (raro ou comum) sobre a frequência de isolados com alta atividade de xilanase foram avaliados com base na relação H:C. EPEs foram obtidos em meios líquidos contendo xilana inoculados com os onze isolados com maiores relações H:C. Os extratos foram avaliados quanto à atividade específica de xilanases a 50 oC, por 1 h. Os extratos dos três isolados com maior potencial de atividade sob esta condição foram avaliados quanto à temperatura ótima de atividade, estabilidade de atividade a 60 oC e a valores de pH 4,0, 5,5 e 8,0. Vinte e dois isolados (25%), incluindo oito de isolamento raro, apresentaram atividade de xilanase nas condições avaliadas, sendo encontrada uma alta variabilidade (>230%) entre estes isolados. Nenhum fator de isolamento ou a condição de isolado raro ou comum foram associadas à eficiência de atividade de xilanases em meio sólido. Alta variabilidade de atividade específica de xilanases nos EPEs também foi encontrada entre os isolados (1500%), com destaque para dois de cultivo raro (TC119 e TC21), da classe Alfaproteobacteria, e um de cultivo comum (TC99), da família Ralstoniaceae. As xilanases extracelulares de TC119 e TC21 apresentaram elevada atividade relativa em temperaturas de até 70 oC e foram pouco sensíveis ao pH na faixa de 4,0 a 8,0; entretanto, as de TC99 apresentaram temperatura ótima de 40 oC, baixa estabilidade a temperatura e pH. Xilanases extracelulares de TC119 não apresentaram atividade celulolítica. Bactérias do solo de isolamento raro apresentam alto potencial como fonte de xilanases extracelulares adaptadas a condições extremas de pH e temperatura requeridas em processos agroindustriais.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Introdução: Onicomicoses são infecções ungueais causadas por fungos, podendo ser causadas por dermatófitos, leveduras e fungos filamentosos não dermatófitos. O diagnóstico de leveduras como agente de onicomicose tem aumentado significativamente, tal evidência tem sido atribuída ao crescente número de indivíduos imunocomprometidos e transplantados, ao aumento do uso de drogas antibacterianas de amplo espectro, à fatores genéticos, tendências atópicas e ao aumento da vida média da população. O objetivo principal do trabalho foi determinar o perfil de suscetibilidade antifúngica e alguns dos fatores de virulência de leveduras causadoras de onicomicoses. Métodos e Resultados: Foram estudadas 100 amostras de raspado ungueal semeadas em Agar Sabouraud com cloranfenicol e em Agar Mycosel. A identificação e o teste de suscetibilidade antifúngica (fluconazol, anfotericina B, fluocitocina e voriconazol) foram realizados através do método automatizado Vitek 2 e visando a pesquisa dos fatores de virulência para detecção de fosfolipase e proteinase foram utilizados os meios com emulsão de ovo a 50% e o ágar BSA (Bovine Serum Albumin), respectivamente. Das 100 amostras coletadas, 57 (57%) foram positivas no exame micológico direto e 42 (42%) na cultura. Dos isolados, 29 (69%) eram Candida parapsilosis, 8 (19%) C. albicans, 3 (7,2%) C. haemulonii, 1 (2,38%) C. lusitanea e 1 (2,38%) C.tropicalis. Todas as espécies de C. albicans, C. lusitanea e C. tropicalis foram sensíveis aos antifúngicos. As espécies de C. parapsilosis apresentaram resistência em 6 (20,7%) cepas ao fluconazol, e em 3 (10,34%) ao voriconazol. C. haemulonii apresentou resistência em 1 (33,33%) cepa ao fluconazol, 1 (33,33%) a flucitosina, 1 (33,33%) ao voriconazol e 3 (100%) à anfotericina B. Os Fatores de resistência, fosfolipase e proteinase, estiveram presentes somente nas espécies de C. albicans com positividade de 87,5% e 50% respectivamente. Conclusão: A espécie C. parapsilosis é um agente emergente de onicomicose, apresentando cepas resistentes aos antifúngicos. C. haemulonii apresentou perfil multirresistente. C. albicans, ainda que sensível a todos os fármacos testados foi a única espécie que apresentou os fatores de virulência estudados.

FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico A cromoblatomicose (CBM) é uma doença causada por implantação transcutânea de várias espécies de fungos melanizados. O estado do Pará é a principal área endêmica do país, sendo Fonsecaea pedrosoi o principal agente etiológico. O tratamento desta doença não é padronizado e diversas formas de intervenção são relatadas na literatura. Por outro lado, os testes de susceptibilidade in vitro aos fármacos antifúngicos podem ajudar na escolha do esquema terapêutico e na identificação de cepas resistentes. Este trabalho tem como objetivo avaliar a susceptibilidade in vitro ao itraconazol (ITZ), ao cetoconazol, (CTZ), ao fluconazol (FCZ) e a terbinafina (TBF) em 20 isolados clínicos de Fonsecaea pedrosoi, bem como as possíveis alterações morfológicas induzidas por ITZ ou TBF na Concentração Inibitória Mínima (CIM) e em altas concentrações. Os testes de susceptibilidade foram conduzidos de acordo com as recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, documento M38-A2). As concentrações finais de ITZ, TBF e CTZ em cada teste variaram de 16 a 0.03 μg/mL e de 64 a 0.125 μg/mL para o FCZ. A CIM para cada fármaco utilizado foi obtida após cinco dias de incubação a 30°C, sendo definida como a mínima concentração do fármaco capaz de reduzir em 100% o crescimento visual do fungo quando comparado com o grupo controle. O ITZ demonstrou ser o fármaco mais efetivo in vitro contra conídios de F. pedrosoi (CIM 90= 1μg/mL). A TBF apresentou baixa atividade in vitro, com 70% das cepas apresentando CIM ≥ 0.5 μg/mL. Quando se analisa morfologicamente os conídios tratados com a CIM para ITZ observa-se um aumento no diâmetro celular, a presença de conídios em processo de divisão e formação de pequenas cadeias. Na maior concentração do teste de susceptibilidade (16 μg/mL) observou-se a irregularidade no contorno celular, o desprendimento de material pigmentado da parede celular e a vacuolização. Em 32 μg/mL e 64 μg/mL notou-se a ruptura da parede celular e conídos amorfos. Não foram observadas - em nenhuma das concentrações analisadas - alterações morfológicas significativas induzidas pela TBF. Além disso, a 5-Fluorocitosina (5-FC) e o FCZ não impediram o crescimento dos conídios, mesmo em altas concentrações. No entanto, alterações ultraestruturais foram notadas após tratamento com 5-FC 64 μg/mL. Portanto, sugere-se um comportamento morfológico diferente de conídios frente ao ITZ ou TBF durante os testes de susceptibilidade in vitro. Em síntese, dentre os fármacos estudados, ITZ apresentou a melhor atividade antifúngica in vitro, enquanto a 5-FC somente provocou alterações estruturais em hifas e conídios na mais alta concentração utilizada no estudo. Choromoblastomycosis (CBM) is a disease caused by traumatic implantation of many species of melanized fungi. The State of Pará is the major endemic area in Brazil and Fonsecaea pedrosoi is the major etiological agent. The treatment is not standardized and many forms of interventions are related in the literature. In the other hand, the in vitro susceptibility test to antifungal drugs may help in the therapeutic choice and in the identification of resistant strains. The objective of this work is to evaluate the in vitro susceptibility of 20 F. pedrosoi clinical isolates to itraconazole (ITZ), ketoconazole (KCZ), fluconazole (FCZ) and terbinafine (TBF) as well as the possible morphological alterations induced by ITZ or TBF in the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and high concentrations. The tests were performed according to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, M38-A2 document) recommendations. The final concentrations of ITZ, TBF and KCZ in each test were to 16 to 0.03 μg/mL. To FCZ the final concentrations were to 64 to 0.125 μg/mL. The MIC was defined as the lowest drug concentration that inhibit 100% the visual growth when compared to the non-treated group after five days of incubation at 30°C. ITZ proved to be the most effective drug in vitro against F. pedrosoi (CIM 90= 1μg/mL). TBF showed a low drug activity with 70% of the isolates with MIC ≥ 0.5 μg/mL. The conidia morphological analysis revealed an increasing in the diameter, an interruption of the cellular division and the formation of little chains after the treatment with ITZ in the MIC. At the high concentration used in the susceptibility test we noticed an irregular shape, a detachment of pigmented material from the cell wall and a vacuolization. Rupture in cell wall and amorphous conidia were observed at 32 μg/mL and 64 μg/mL. Significant alterations were not observed after treatment with TBF at the same concentrations. Moreover, the 5-fluorocytocise (5-FC) and FCZ do not stop the conidia growth at high concentrations. However, ultrastructure alterations were noticed after treatment with 5-FC 64 μg/mL. Thus, it is suggested a different morphological pattern after ITZ or TBF treatment during the in vitro susceptibility test. In synthesis, ITZ shown better in vitro antifungal activity while 5-FC only provoked structures alterations in the highest concentration tested.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:13:45Z No. of bitstreams: 1 TESE_FINALIZADA_Aline_da_Costa_Cruz.pdf: 2244217 bytes, checksum: 6071b19d05a2af308671f0f72e685482 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:13:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE_FINALIZADA_Aline_da_Costa_Cruz.pdf: 2244217 bytes, checksum: 6071b19d05a2af308671f0f72e685482 (MD5) Previous issue date: 2014-01-17 Meningococcal disease (MD) is still a serious public health problem and is associated with high morbidity and mortality rates worldwide. MD evokes persistent immune protection against disease in people with normal immune systems. In contrast, protection induced by meningococcal always requires booster injections of the vaccine. In Brazil, Neisseria meningitidis serogroup C (MenC) and B (MenB) have been the main causes of MD for the past years. Currently, there is no universal vaccine against serogroup B. HIV infection has been implicated as a risk factor for the mortality of meningococcal disease. One of the cornerstones of HIV treatment is the use of vaccines for immunopreventable diseases. The anti-MenC conjugated vaccine is often recommended for children and adolescents infected with HIV in Brazil and many other countries. Few studies have addressed the mechanisms by which meningococcal vaccines generate and sustain immunological memory. The aims of this study were: 1) to evaluate the response of bactericidal antibody and memory CD4 T lymphocyte against meningococcus after infection; 2) to evaluate the bactericidal antibody response and memory T cells and memory B cells against meningococcal booster after the Cuban vaccine VA-MENGOC-BC® in volunteers immunized for about 17 years; 3) to investigate the functional antibody response (bactericidal and opsonizing) after immunization with anti-MenC conjugated vaccine (CRM197) in individuals infected with HIV. After infection, 83% of patients diagnosed as having DM by latex and/or culture test, had protective titers of bactericidal antibodies, but there was no association between the titers of bactericidal antibodies and the total specific immunoglobulin concentration and an increase in frequency of TCM (median of 15%) activated mainly after stimulation with MenC strain. In pre-vaccinated volunteers, 3 of 5 subjects seroconverted 7 or 14 days after administration of the booster dose. There was a significant increase in TCM population 14 days after the booster dose but without differentiated cell activation of control groups. We observed positive response of memory B lymphocyte in most volunteers, but no correlation with bactericidal antibodies. Regarding HIV infected patients, the results showed the need for a second vaccine dose in this population since only about 15% responded to a single dose and second dose resulted in seroconversion in about 55 % of individuals. We observed a positive (r= 0,43) and significant (P= 0,0007) correlation between the opsonizing and bactericidal antibody after vaccination. No significant differences when we relate the titles of bactericidal antibodies with the absolute number of CD4 (P= 0,051) and CD4 nadir (P= 0,09) among patients who seroconverted (n= 43) or not seroconverted (n= 106) after the first dose. Thus, the results indicated that: 1) convalescent patients of DM acquire bactericidal antibodies after infection with N. meningitides; 2) in vaccinated volunteers, the booster dose of anti-MenB vaccine was not fully effective in activating the immune memory by production of bactericidal antibodies or activation of memory CD4 T lymphocyte; 3) HIV-positive patients need a booster dose of the anti-MenC conjugated vaccine. A doença meningocócica (DM) é, ainda hoje, um sério problema de saúde pública, estando associada a elevadas taxas de morbidade e letalidade no mundo. A DM evoca proteção imunológica persistente contra a doença em pessoas com sistema imunológico normal. Em contraste, a proteção induzida por vacinas meningocócicas sempre requer a administração de doses reforço (booster) da vacina. No Brasil, Neisseria meningitidis dos sorogrupos C (MenC) e B (MenB) são as principais causas de DM durante os últimos anos. Atualmente, não existe uma vacina universal contra o meningococo B (MenB). A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) tem sido apontada como um fator de risco para a mortalidade da DM. Um dos pilares do tratamento do HIV é a utilização de vacinas para doenças imuno-preveníveis. A vacina conjugada anti-MenC é frequentemente recomendada para crianças e adolescentes infectados pelo HIV no Brasil e em muitos outros países. Poucos estudos têm abordado os mecanismos pelos quais as vacinas meningocócicas geram e sustentam a memória imunológica. Os objetivos deste estudo foram: 1) avaliar a resposta de anticorpos bactericidas e de linfócito T (LT) CD4 de memória contra o meningococo após a infecção; 2) avaliar a resposta de anticorpos bactericidas e de LT CD4 de memória e linfócito B de memória (LBm) contra o meningococo após o booster da vacina cubana VA-MENGOC-BC® em voluntários imunizados há aproximadamente 17 anos; 3) investigar a resposta de anticorpos funcionais (bactericidas e opsonizantes) após imunização com a vacina conjugada anti-MenC (CRM197) em indivíduos infectados pelo vírus HIV. Após a infecção, 83% dos pacientes diagnosticados como tendo DM pelo teste de látex e/ou cultura tiveram títulos de anticorpos bactericidas protetores, mas não houve uma associação entre os títulos de anticorpos bactericidas e a concentração de imunoglobulina total específica. Houve aumento na frequência de linfócitos T de memória central (TCM) (mediana de 15%) ativados, principalmente após estímulo com a cepa MenC. Nos voluntários pré-vacinados, 3 de 5 indivíduos soroconverteram 7 ou 14 dias após a administração da dose booster. Houve um aumento importante da população TCM 14 dias após o booster, mas sem ativação celular diferenciada dos grupos controles. Observamos resposta positiva de LBm na maioria dos voluntários, mas sem correlação com os anticorpos bactericidas. Em relação aos pacientes HIV positivos, os resultados mostraram a necessidade de uma segunda dose da vacina, já que apenas 15% soroconverteram a uma única dose e a segunda dose resultou em soroconversão de cerca de 55% dos indivíduos. Observamos correlação positiva (r= 0,43) e significativa (P= 0,0007) entre os anticorpos opsonizantes e bactericidas após a vacinação. Não observamos diferenças significativas quando relacionamos os títulos de anticorpos bactericidas com o número absoluto de LT CD4 P= 0,051) e LT CD4 nadir (P= 0,09) entre os pacientes que soroconverteram (n= 43) ou não soroconverteram (n= 106) após a primeira dose. Desta forma, os resultados desta tese indicaram que: 1) os pacientes convalescentes da DM adquirem anticorpos bactericidas após infecção por N. meningitidis; 2) nos voluntários vacinados, a dose booster da vacina anti-MenB não foi plenamente eficaz em ativar a memória imunológica através da produção de anticorpos bactericidas ou ativação de LTm; 3) os pacientes HIV positivos necessitam de uma dose booster da vacina conjugada anti-MenC.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:14:06Z No. of bitstreams: 1 Rosana Helena Vicente Pereira Tese completa.pdf: 2119135 bytes, checksum: c1879bab6306ffbff95c545585a1c40f (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:14:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosana Helena Vicente Pereira Tese completa.pdf: 2119135 bytes, checksum: c1879bab6306ffbff95c545585a1c40f (MD5) Previous issue date: 2013-12-17 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The genus Achromobacter, especially A. xylosoxidans, has emerged as an important lung pathogen related to Cystic Fibrosis (CF). Species identification is hampered by phenotypic and genotypic similarity between them, which may underestimate the actual frequency and significance of different species. Factors related to virulence and antimicrobial resistance are poorly understood. The aims of this study were to compare different methodologies for identifying species of Achromobacter spp; analyze the antimicrobial resistance profiles, and study virulence attributes (types of motility and biofilm formation) in isolates from CF patients treated at two centers of reference of Rio de Janeiro. A total of 129 Achromobacter spp isolates obtained from 38 patients were analyzed. The isolates were identified by phenotypic testing, by sequencing the gene rrs and PCR for gene blaOXA-114-like intrinsic to A. xylosoxidans. The clonal relatedness was assessed by Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Phenotypic tests and sequencing identified 93.8 % (n=122) of the isolates as A. xylosoxidans, one as A. denitrificans. and seven were identified only at genus. The 122 isolates were positive for blaOXA -114-like gene. The PFGE showed 22 clonal groups. 63 isolates representative of each clonal group per patient were selected for identification by restriction analysis of amplified ribosomal DNA (ARDRA). All samples were identified: 56 (88.9 %) A. xylosoxidans, one (1.5%) A.denitrificans three A. insolitus (4.8%) and three (4.8%) A. piechaudii. The majority (n = 101) of 122 isolates of A. xylosoxidans was strong biofilm (BF) producers and showed motility of swimming type (n=118, 96.7%) and swarming (n=99, 81%). All positive isolates for swarming were also positive for swimming. There was significance between the production of BF and the types of motility, suggesting that they may favor the production of BF. Non xylosoxidans Achromobacter were mostly BF producers, with concurrence of the types of motility. Of the 122 samples of A. xylosoxidans submitted to MIC by E-test®, most were sensitive to ceftazidime, imipenem, ciprofloxacin (CIP) and trimethoprim/sulfamethoxazole (SUT), however, 46 % of the samples were not sensitive to CIP. The seven non xylosoxidans Achromobacter isolates were not susceptible to the antibiotics tested. The 129 Achromobacter spp isolates were negative for blaSPM-1, blaVIM-2 and blaKPC-2 genes. The distribution of resistance markers between the clonal groups of A. xylosoxidans isolated from patients with chronic colonization, showed that resistance to CIP and SUT were most frequent markers among clonal groups. Regardless of the molecular technique employed A. xylosoxidans was the predominant species. However, the role of emerging species cannot be excluded from this scenario, since all showed similar virulence profile of the predominant species. O gênero Achromobacter, sobretudo, A. xylosoxidans, tem se destacado como um importante patógeno pulmonar relacionado à Fibrose Cística (FC). A identificação das espécies é dificultada pela similaridade fenotípica e genotípica entre elas, o que pode subestimar a real frequência e o significado das diferentes espécies. Fatores relacionados à virulência e resistência a antimicrobianos são pouco conhecidos. O objetivo deste estudo foi comparar diferentes metodologias para a identificação de espécies de Achromobacter spp; analisar os perfis de resistência a antimicrobianos; e estudar atributos de virulência (biofilme e tipos de motilidades) em amostras isoladas de pacientes com FC, atendidos em dois centros de referência do Rio de Janeiro. Foram analisadas 129 amostras de Achromobacter spp obtidas de 38 pacientes. As amostras foram identificadas por testes fenotípicos, por sequenciamento anterior do gene rrs e por PCR para detecção do gene blaOXA-114-like, intrínseco de A. xylosoxidans. A relação clonal foi avaliada por Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE). Os testes fenotípicos e o sequenciamento identificaram 93,8% (n=122) das amostras como A. xylosoxidans, uma como A. denitrificans. e sete foram identificadas apenas em gênero. As 122 amostras foram positivas para o gene blaOXA-114-like. O PFGE mostrou 22 grupos clonais. Foram selecionadas 63 amostras, representativas de cada grupo clonal por paciente, para a identificação por Analise de Restrição de DNA ribossomal amplificado (ARDRA). Todas as amostras foram identificadas: 56 (88,9%) A. xylosoxidans, uma (1,5%) A. denitrificans, três A. insolitus (4,8%) e três (4,8%) como A. piechaudii. A maioria (n=101) das 122 amostras de A. xylosoxidans foi forte produtora de biofilme (BF) e apresentou motilidade do tipo swimming (n=118; 96,7%) e swarming (n=99; 81%). Todas as amostras positivas para swarming também foram positivas para swimming. Houve significância entre produção de BF e os tipos de motilidades, sugerindo que estes possam favorecer a produção de BF. As amostras de A. não xylosoxidans, em sua maioria, foram BF, com concomitância dos tipos de motilidades. Das 122 amostras de A. xylosoxidans submetidas à CIM por E-test®, a maioria foi sensível a ceftazidima, imipenem, ciprofloxacin (CIP) e sulfametoxazol/trimetoprim (SUT), Entretanto, 46% das amostras foram não sensíveis a CIP. As sete amostras de A. não xylosoxidans foram sensíveis aos antimicrobianos testados. As 129 amostras de Achromobacter spp foram negativas para os genes blaSPM1, blaVIM 2 e blaKPC2. A distribuição de marcadores de resistência entre os grupos clonais de A. xylosoxidans isolados de pacientes com colonização crônica, mostrou que a resistência a CIP e SUT foram os marcadores de maior ocorrência dentre os grupos clonais. Independente da técnica molecular empregada A xylosoxidans foi a espécie predominante, entretanto não é excludente o envolvimento de espécies emergentes nesse cenário, uma vez que todas mostraram perfil de virulência semelhante a espécie predominante.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:13:33Z No. of bitstreams: 1 Gessica de Araujo Rocha Tese completa.pdf: 6587241 bytes, checksum: e520972ad8117b760d9750eba6c873cd (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:13:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gessica de Araujo Rocha Tese completa.pdf: 6587241 bytes, checksum: e520972ad8117b760d9750eba6c873cd (MD5) Previous issue date: 2017-11-28 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The genus Acinetobacter, particularly the species A. baumannii, has emerged as a global public health problem, able to persist in the environment for a long time and presenting multidrug resistance to a wide range of antimicrobial. Interestingly this genus is unusual in Cystic Fibrosis (CF). One hypothesis raised by us is that the low frequency could be related, in part, with the colonization by other species of the genus, which are difficult to characterize laboratory and may be misidentified. Considering this, and the lack of wide ranging studies about the role of this microorganism in CF patients, this study aimed to identify the species of the genus Acinetobacter, to investigate the presence of resistance genes, determine the profile antimicrobial susceptibility and clonal relationship among samples obtained from CF patients treated at two centers of reference in Rio de Janeiro. Thirty-eight isolates of Acinetobacter spp. Isolated from 29 CF patients from June 2005 to March 2010, were identified by phenotypic methods and for four different molecular techniques. The profile of susceptibility to 11 antimicrobials used in clinical practice was performed by agar diffusion. Minimum Inhibitory Concentrations for tobramycin and polymyxin were determined by microdilution methods and diffusion gradient (E-test). The research β-lactamase resistance genes were performed by PCR and species genotyping was performed by PFGE. In this study, Acinetobacter spp. was more frequent in pediatric patients, with a high percentage of species A. not baumannii isolates. Of the different molecular techniques used to identification, the partial sequencing of the rpoB gene proved to be the most accurate method. Diverging from what is observed in the hospital samples, samples of CF patients in this study, including strains of A. Baumannii, showed high percentages of susceptibility to most antimicrobials, having only two multidrug resistance samples, both carry the gene blaOXA-23-like. Genes encoding CTX-M-15 and SHV-121 were first detected in A. baumannii and A. pitti isolated of patient with CF, all were resistant to cefepime or cefotaxime. There was clonal wide diversity among the samples. However, two clones of A. pittii, carrying blaCTX-M-15 and blaSHV-121, were shared by different patients in the same period. These results point to an epidemiological characteristic of this group of patients treated in reference centers included in the study, distinct from other hospitalized patients in the same centers. Alerting us to the clinical importance of the species A. not baumannii and its potential as a source of resistance genes silent transmission. O gênero Acinetobacter, particularmente a espécie A. baumannii, emergiu como um problema de saúde pública mundial, capaz de persistir no ambiente por longo tempo e de apresentar multirresistência a uma vasta gama de antimicrobianos. Curiosamente este gênero não é usual em Fibrose Cística (FC). Uma hipótese por nós levantada é que esta baixa frequência poderia estar relacionada, em parte, com a colonização por outras espécies do gênero, de difícil caracterização laboratorial e que podem ser subestimadas. Diante disto, e da ausência de estudos amplos sobre o papel deste microrganismo em pacientes com FC, este trabalho objetivou identificar as espécies do gênero Acinetobacter, investigar a presença de genes de resistência, determinar o perfil de suscetibilidade a antimicrobianos e a relação clonal entre as amostras obtidas de pacientes com FC atendidos em dois centros de referência no Rio de Janeiro. Trinta e oito amostras de Acinetobacter spp., isoladas de 29 pacientes com FC no período de junho de 2005 a março de 2010, foram identificadas por métodos fenotípicos e por quatro técnicas moleculares diferentes. O perfil de suscetibilidade a 11 antimicrobianos utilizados na prática clínica foi realizado por difusão em ágar. As Concentrações Inibitórias Minimas para tobramicina e polimixina foram determinadas pelos métodos de microdiluição e de gradiente de difusão (teste-E). A pesquisa dos genes de resistência para β-lactamase foi realizada por PCR e a genotipagem das espécies foi realizada por PFGE. Neste estudo Acinetobacter spp. foi mais frequente em pacientes pediátricos, sendo alto o percentual de espécies de A. não baumannii isoladas. Das diferentes técnicas moleculares de identificação utilizadas, o sequenciamento parcial do gene rpoB mostrou ser o método mais acurado. Discordando do que é observado nas amostras hospitalares, as amostras de pacientes com FC deste estudo, incluindo as amostras de A. baumannii, apresentaram percentuais elevados de suscetibilidade para a maior parte dos antimicrobianos testados, havendo somente duas amostras multirresistentes (MR), ambas portadoras do gene blaOXA-23-like. Os genes codificadores de CTX-M-15 e SHV-121 foram pela primeira vez detectados em A. baumannii e A. pittii de pacientes com FC, todas apresentaram resistência a cefepima ou cefotaxima. Houve uma grande diversidade clonal entre as amostras, porém, dois clones de A. pittii, portadores de genes blaCTX-M-15 e blaSHV-121, foram compartilhados por pacientes distintos no mesmo período. Estes resultados apontam para um perfil epidemiológico característico deste grupo de pacientes assistidos nos centros de referência incluídos no trabalho, distinto de outros pacientes hospitalizados nos mesmos centros. Nos alertando para a importância clínica de espécies de A. não baumannii, e do seu potencial como fonte silenciosa de transmissão de genes de resistência.

A etiologia do carcinoma epidermóide do pênis (CEP) está relacionada a múltiplos fatores de risco como a presença de prepúcio, pobre higiene, dermatites crônicas e tabagismo. Entretanto, o fator de risco mais extensivamente estudado, éa infecção pelo papiloma vírus humano (HPV). Está bem estabelecido que esteexerce um importante papel etiológico em neoplasias da cérvice uterina; entretanto, sua associação com CEP tem sido foco de debates, demonstrando-se presença viral variando entre 15% a 80% dos casos, sugerindo que apenas um subgrupo desses tumores seja causado pelo HPV. O prognóstico da doença é influenciado negativamente principalmente pela presença de metástases em linfonodos inguinais. Desta forma, a abordagem cirúrgica destes, assume importância decisiva na cura da doença. Poroutro lado, os métodos disponíveis para o estadiamento desses linfonodos são imprecisos e as linfadenectomias são acompanhadas de morbidade significativa. A descrição de outros marcadores histológicos é escassa, devido a raridade desses tumores.O objetivo do presente trabalho é avaliar a prevalência, distribuição e associação do HPV com parâmetros histológicos de pior prognóstico, no sentido de determinar seu possível valor preditivo para metástases inguinais, assim como avaliar os fatores prognósticos já descritos. Espécimes tumorais em parafina de 82 pacientes portadores de carcinoma epidermóide do pênis, foram testados para prevalência e distribuição do genótipo do HPV por PCR. O estado do HPV foi correlacionado com fatores histopatológicos e ocorrência de metástases inguinais. Foi também avaliada a influência de diversascaracterísticas histológicas tumorais, na sobrevida livre de doença inguinal em 5 anos. O seguimento variou entre 1 e 71 meses (média 20 meses). O DNA do HPV foi identificado em 60,9% da amostra, tendo maior prevalência dos tipos virais 11 e 6 (64% e 32%, respectivamente). Não houve correlação independente significativa das variáveis histológicas de pior prognóstico com o estado do HPV. A probalidade de sobrevida livre de doença inguinal em 5 anos, também não foi influenciada pelo HPV (log Rank teste=0,45). Os únicos fatores patológicos independentes para metástases inguinais foram estadiamento T≥T1b-T4 (p=0,02), invasão linfovascular (p=0,04) e fronte de invasão infiltrativa (p-0,03). O estado e a distribuição do HPV não mostrou correlação com fatores histológicos de pior prognóstico, nem mostrou importância na predição de metástases linfonodais em CEP. The etiology of squamous cell carcinoma of the penis (CEP) is related to multiple risk factors such as the presence of foreskin, poor hygiene, chronic dermatitis and smoking. However, the risk factor most extensively studied, is infection by human papilloma virus (HPV). It is well established that this plays an important etiologic role in cancers of the uterine cervix, however, its association with CEP has been the focus of debate, demonstrating viral presence ranging from 15% to 80% of cases, suggesting that only a subset of these tumors is caused by HPV. The prognosis is negatively influenced mainly by the presence of metastases in inguinal lymph nodes. Thus, the surgical aproach of them, is of vital importance in curing the disease. On the other hand, the available methods for staging these nodes are imprecise and lymphadenectomy are accompanied by significant morbidity. A description of other histological markers is scarce because of the rarity of these tumors. The objective of this study is to evaluate the prevalence, distribution and association between HPV and histological parameters of poor prognosis, in order to determine their possible predictive value for inguinal metastases, as well as prognostic factors already described. Paraffin tumor specimens from 82 patients with squamous cell carcinoma of the penis were tested for prevalence and genotype distribution of HPV by PCR. The HPV status was correlated with histopathological factors and metastatic inguinal. It was also evaluated the influence of various histological tumor factors, in lymphonodal disease free survival at 5 years. Follow-up ranged from 1 to 71 months (mean 20 months). HPV DNA was detected in 60.9% of the sample having the most prevalent viral type 11 and 6 (64% and 32%, respectively). There was no significant correlation independent of the histological variables of poor prognosis with HPV status. The probability of lymphonodal disease free survival at 5 years, was not affected by HPV (log rank test = 0.45). The only independent factors for pathological inguinal metastases were T stage ≥ T1b-T4 (p = 0.02), lymphovascular invasion (p = 0.04) and infiltrative invasive front (p=0, 03). The status and distribution of HPV showed no correlation with histological factors of poor prognosis, nor showed significance in predicting lymph node metastases in CEP.

Submitted by Boris INFORMAT (boris@uerj.br) on 2021-04-26T01:10:48Z No. of bitstreams: 1 Michelle Hantequeste Bittentourt dos Santos Tese completa.pdf: 2554834 bytes, checksum: 65a521754e2d5e9a563d82407d8de2e5 (MD5) Made available in DSpace on 2021-04-26T01:10:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Michelle Hantequeste Bittentourt dos Santos Tese completa.pdf: 2554834 bytes, checksum: 65a521754e2d5e9a563d82407d8de2e5 (MD5) Previous issue date: 2013-10-30 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Group B streptococcus (GBS) is the leading cause of neonatal sepsis and meningitis and has recently been recognized as an increasingly common cause of invasive disease in immunocompromised adults (elderly or chronic diseases). GBS produces a number of extracellular enzymes, several of which interact with the host immune system and are important for the GBS- host interaction and for the development of disease. Previous studies showed that metalloproteases are involved in several metabolic pathways in different cellular types. For this reason, we decided to investigate the possible involvement of GBS metalloproteases during cell interaction and apoptosis/necrosis induced by microorganism in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and epithelial respiratory cells line (A549). Treatment of GBS with metalloproteases inhibitors (EDTA, EGTA and PHEN) did not induce alteration on bacterial growth, but promoted changes in the expression of surface proteins, adhesive capacity and profile of intracellular survival of the pathogen. The GBS and supernatant of bacterial growth medium (conditioned medium; MC) promoted the death of HUVEC and A549 cells. However, the metalloproteases inhibitors treatment restored the cellular viability induced by GBS and MC, suggesting that GBS metalloproteases are involved in the disruption of cell barrier, promoting bacterial dissemination. This study describes for the first time apoptosis and necrosis induced by GBS and MC in HUVEC and A549 cells after 24h incubation, respectively. We also observe reduction of pro-caspase-3 after infection of HUVEC with GBS and MC, suggesting activation of caspase-3. Moreover, the over-expression of pro -apoptotic protein Bax and decrease of anti-apoptotic protein Bcl-2 levels in HUVEC show the involvement of mitochondrial apoptotic mechanism (intrinsic via). Enhanced understanding of the molecular basis of GBS pathogenesis may pinpoint novel bacterial and host molecules that can represent novel therapeutic or immunoprophylactic targets against disease caused by this foremost of neonatal pathogens. Estreptococos do grupo B (EGB) é a principal causa de sepse e meningite neonatal e tem sido recentemente reconhecido como patógeno responsável por infecções invasivas em adultos imunocomprometidos (idosos ou portadores de doenças crônicas). Os EGB produzem inúmeras enzimas extracelulares, várias das quais interagem com o sistema imune do hospedeiro e são importantes durante a interação EGB-hospedeiro, bem como para o desenvolvimento da doença. Estudos anteriores mostraram que metaloproteases estão envolvidas em várias vias metabólicas em diferentes tipos celulares. Por esta razão, nós decidimos investigar o possível envolvimento de metaloproteases de EGB durante a interação celular e apoptose/necrose induzida pelo micro-organismo em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e da linhagem de epitélio respiratório (A549). Tratamento de EGB com inibidores de metaloproteases (EDTA, EGTA e FEN) não induziu alterações no crescimento bacteriano, mas promoveu alterações na expressão de proteínas de superfície, capacidade adesiva e perfil de sobrevivência intracelular do patógeno. O EGB e o sobrenadante do crescimento bacteriano (meio condicionado; MC) promoveram a morte das células HUVEC e A549. Contudo, o tratamento com inibidores de metaloproteases restauraram a viabilidade celular induzida pelos EGB e o MC, sugerindo que metaloproteases bacteriana estão envolvidas no rompimento da barreira celular, promovendo a disseminação bacteriana. Este trabalho descreve pela primeira vez apoptose e necrose induzidas pelo EGB e MC em HUVEC e células A549 após 24h de incubação, respectivamente. Nós também observamos redução da pró-caspase-3 após infecção das HUVEC com EGB e MC, sugerindo ativação da caspase-3. Além disso, o aumento da expressão da proteína pró-apoptótica Bax e diminuição dos níveis da proteína anti-apoptótica Bcl-2 em HUVEC, demonstram o envolvimento do mecanismo apoptótico mitocondrial (via intrínseca). A melhor compreensão das bases moleculares da patogênese do EGB contribui para identificar novas moléculas bacterianas e hospedeiras que podem representar novos alvos terapêuticos ou imunoprofiláticos contra a doença causada por esse patógeno neonatal.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:17:06Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_FINAL_PUBLICADA_Ricardo_Luis_Lopes_Braga.pdf: 3825535 bytes, checksum: d70831f28a0cbae7fc9266cf98918e38 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:17:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_FINAL_PUBLICADA_Ricardo_Luis_Lopes_Braga.pdf: 3825535 bytes, checksum: d70831f28a0cbae7fc9266cf98918e38 (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) are an emerging pathotype associated with cases of acute or persistent diarrhea in children and adults in developed and emerging countries. It causes persistent diarrhea in HIV positive patients and it is the second most common cause of traveler s diarrhea. The aggregative adherence (AA) pattern characterized by arrangement in stacked brick monolayer HEp-2 (human larynx carcinoma) is related to the presence of a plasmid aggregative adherence (pAA) of 60 MDa. The hypothetical pathogenesis is represented by the heterogeneity of the category that covers a variety of putative virulence factors involved in the processes of colonization, cell adhesion and cytotoxicity. The present study aimed to investigate the ability of producing the standard AA by EAEC strains in HEp-2, Caco-2 (human colorectal adenocarcinoma) and T84 (human intestinal colon carcinoma), the correlation between AA and pAA in each strain in addition to the interaction of EAEC strains using in vitro organ culture model (IVOC). For the first two objectives were used seventeen EAEC strains (10 from children with acute diarrhea and seven from children without diarrhea). For the last were employed five EAEC strains from children with acute diarrhea. The adhesion assays were performed with strains co-incubated with cell lines under study for a period of 3 h and 6 h. Among the 17 strains EAEC 29.4%, 41.1% and 82.3% showed AA at 3 h in cell lines HEp-2, Caco-2 and T84, respectively. In 6 h, 52.9% EAEC strains exhibited AA in HEp-2 and Caco-2 and 100% strains exhibited AA in T84. As the line T84 has phenotypic characteristics of colon cells and Caco-2 of the cells of the small intestine, data suggested that EAEC may have a higher tropism for the human colon. PCR for detection of pAA showed 29.4%, 41.1% and 52.9% of the strains as pAA-positive showing the AA pattern in HEp-2, Caco-2 and T84 cells, simultaneously, in tests of 3 h. In 6 h, 47%, 52.9% and 70.5% of the strains pAA + exhibited AA pattern in HEp-2, Caco-2 and T84, respectively. The in vitro adhesion assays using cultured tissue were performed with EAEC strains co-incubated with intestinal fragments of ileum and colon over a period of 6 h. Light microscopy (LM) revealed two strains more adherent to the colon, one to the ileum and two to both. The scanning electron microscopy (SEM) showed three strains more adherent to the colon, one to the ileum and another to both. Bacterial aggregates on the epithelium or overlapping the mucus were observed by LM and SEM. LM assays also showed morphological changes such as cellular extrusion, structural disorganization and destruction of the villi. The results showed that the line T84 proved to be more susceptible to aggregative pattern formation, as well as the adherence of strains AA / pAA +, which was ratified by the higher degree of adherence to the colonic mucosa in the IVOC. Finally, data indicated that these models are more effective for elucidating the pathogenicity of these strains. Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patotipo emergente associado a casos de diarreia aguda ou persistente em crianças e adultos de países desenvolvidos e em desenvolvimento. É causador da diarreia persistente em pacientes HIV positivos e a segunda causa mais comum de diarreia dos viajantes. Seu padrão de aderência agregativo (AA) caracterizado pelo arranjo em tijolos empilhados em monocamada de células HEp-2 (carcinoma de laringe humana), está relacionado com a presença de um plasmídeo de aderência agregativa (pAA) de 60 MDa. A hipotética patogenia é representada pela heterogeneidade da categoria que abrange diversos fatores putativos de virulência envolvidos nos processos de colonização, adesão celular e citotoxicidade. O presente estudo teve como objetivos investigar a habilidade de produção do padrão AA pelas cepas EAEC nas linhagens HEp-2, Caco-2 (adenocarcinoma colo-retal humano) e T84 (carcinoma de cólon intestinal humano), a correlação entre AA e pAA em cada linhagem e analisar a interação de cepas EAEC utilizando modelo de cultura de órgão in vitro (IVOC). Para os dois primeiros objetivos foram utilizadas dezessete cepas EAEC, sendo 10 provenientes de crianças com diarreia aguda e sete de crianças sem diarreia. Para o último foram empregadas cinco cepas EAEC de crianças com diarreia aguda. Os ensaios de aderência foram realizados com as cepas co-incubadas com as linhagens celulares em estudo por um período de 3 e 6 horas. Entre as 17 cepas EAEC 29,4%, 41,1% e 82,3% apresentaram AA em 3 horas nas linhagens celulares HEp-2, Caco-2 e T84, respectivamente. Em 6 horas, 52,9% exibiram AA em HEp-2 e Caco-2 e 100% exibiram AA em T84. Como a linhagem T84 apresenta características fenotípicas das células do cólon e Caco-2 das células do intestino delgado, nossos resultados sugerem que EAEC pode apresentar maior tropismo pelo cólon humano. Para a pesquisa do pAA foi realizado uma reação em cadeia de polimerase (PCR). Observamos que 29,4%, 41,1% e 52,9% das cepas pAA+ apresentaram padrão AA em HEp-2, Caco-2 e T84, simultaneamente, nos testes de 3 horas. Em 6 horas, 47%, 52,9% e 70,5% das cepas pAA+ exibiram padrão AA em HEp-2, Caco-2 e T84, respectivamente. Os ensaios de aderência em tecido cultivado in vitro foram realizados com as cepas co-incubadas com fragmentos intestinais de íleo e cólon por um período de 6 horas. A microscopia de luz (ML) duas cepas foram mais aderentes ao cólon, uma ao íleo e duas a ambos. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) três cepas foram mais aderentes ao cólon, uma ao íleo e outra a ambos. A ML e MEV foram observados agregados bacterianos sobre o epitélio ou sobreposto ao muco. A ML ainda foi observada alterações morfológicas como extrusão celular, desorganização estrutural e destruição das vilosidades. Os resultados evidenciaram que a linhagem T84 mostrou ser mais suscetível a formação do padrão agregativo, bem como à aderência de cepas AA/pAA+, o que foi ratificado pelo maior grau de aderência a mucosa colônica no IVOC. Nossos dados indicam que estes modelos são mais eficazes para a elucidação da patogenicidade dessas cepas.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:16:33Z No. of bitstreams: 1 Orlando Carlos da Conceicao Neto Dissertacao completa.pdf: 1453970 bytes, checksum: ac0be66aa446c8d4274cfbf8c0aa00df (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:16:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Orlando Carlos da Conceicao Neto Dissertacao completa.pdf: 1453970 bytes, checksum: ac0be66aa446c8d4274cfbf8c0aa00df (MD5) Previous issue date: 2013-03-14 The Burkholderia cepacia complex (BCC) is a group of 17 closely related species that are associated with pulmonary deterioration and increased mortality in patients with Cystic Fibrosis (CF). These species differ from each other in prevalence, clinical status and virulence. Little is known about the profile of antimicrobial resistance. Once the infection, the therapeutic approach and the control measures currently adopted are based on BcC, without considering each particular species. The aim of this study was to determine the prevalence of BcC species in patients from two reference centers in Rio de Janeiro, as well as establishing antimicrobial resistance profiles and assess the molecular diversity among them. One hundred samples of BcC isolates from 38 CF patients from January 2010 to February 2012 were identified by phenotypic methods and by sequencing the recA gene. The MIC for amikacin, aztreonam, ceftazidime, trimethoprim /sulfamethoxazole and tobramycin were determined by microdilution species and genotyping was carried out by PFGE with the enzyme SpeI. B. vietnamiensis (44%) was the most prevalent species, followed by B. cenocepacia IIIA (36%), B. multivorans (10%), B. cenocepacia IIIB (1%) and B. stabilis (1%). Five percent of the samples were not identified. B. vietnamiensis was identified in over half of patients (58.3%). There were differences in susceptibility profiles among BcC species. B. cenocepacia IIIA showed the highest rates of antimicrobial resistance, particularly to trimethoprim/ sulfamethoxazole (80.5%), primary antimicrobial used to treat infections caused by BcC. Samples with MDR profiles were observed for all species, highlighting the profile A, simultaneously resistant to five antibiotics, observed in 58.8% of B.cenocepacia IIIA samples. The analysis of genetic polymorphism showed that despite B. vietnamiensis was the most prevalent species, the occurrence of nine clonal groups suggests that these strains acquisition has taken place from a common environmental source. For B. cenocepacia IIIA, 52.9% of the samples were assigned to the same clonal group (BcA), shared among nine patients treated at a single referral center. Eighty percent of these samples also showed resistance to all antimicrobials tested. The data show that, even with the use of molecular techniques, the identification of BcC on species level is difficult; that B. cenocepacia IIIA is characterized by higher levels of resistance to other species and that the cross transmission between individuals points to the need for the establishment of BcC surveillance in reference centers. O Complexo Burkholderia cepacia (CBc) é um grupo de 17 espécies intimamente relacionadas que estão associadas à deterioração pulmonar e aumento da mortalidade em pacientes com Fibrose Cística (FC). Essas espécies variam entre si em relação à prevalência, quadros clínicos e virulência. Pouco é conhecido em relação ao perfil de resistência aos antimicrobianos. Uma vez estabelecida a infecção, a abordagem terapêutica e as medidas de controle atualmente adotadas são baseadas no CBc, sem considerar cada espécie em particular. O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência das espécies do CBc em pacientes atendidos em dois centros de referência no Rio de Janeiro, bem como estabelecer perfis de resistência a antimicrobianos e avaliar a diversidade molecular entre as espécies. Cem amostras do CBc isoladas de 38 pacientes com FC no período de janeiro de 2010 a fevereiro de 2012 foram identificadas por métodos fenotípicos e pelo sequenciamento do gene recA. As CIMs para amicacina, aztreonam, ceftazidima, trimetoprim/sulfametoxazol e tobramicina foram determinadas por microdiluição e a genotipagem das espécies foi realizada por PFGE com a enzima SpeI. B. vietnamiensis (44%) foi a espécie mais prevalente, seguida de B. cenocepacia IIIA (36%), B. multivorans (10%), B. cenocepacia IIIB (1%) e B. stabilis (1%). Cinco por cento das amostras não foram identificadas. B. vietnamiensis foi identificada em mais da metade dos pacientes (58,3%). Foram observadas diferenças no perfil de susceptibilidade entre as espécies do CBc. B. cenocepacia IIIA foi a espécie que apresentou as maiores taxas de resistência aos antimicrobianos, sobretudo para trimetoprim/ sulfametoxazol (80,5%), principal antimicrobiano utilizado no tratamento de infecções causadas pelo CBc. Amostras com perfis MDR ocorreram em todas as espécies, destacando-se o perfil A, resistente simultaneamente aos cinco antimicrobianos, observado em 58,8% das amostras de B.cenocepacia IIIA. A análise do polimorfismo genético mostrou que, apesar de B. vietnamiensis ter sido a espécie mais prevalente, a ocorrência de nove grupos clonais sugere que a aquisição dessas cepas tenha se dado a partir de uma fonte ambiental comum. Para B. cenocepacia IIIA, 52,9% das amostras foram atribuídas a um mesmo grupo clonal (BcA), compartilhado entre nove pacientes atendidos em um mesmo centro de referência. Oitenta por cento dessas amostras apresentaram ainda resistência a todos os antimicrobianos testados. Os dados mostram que, mesmo com o emprego de técnicas moleculares, é difícil a identificação do CBc em nível de espécie; que B. cenocepacia IIIA é caracterizada por índices de resistência superiores às outras espécies e que a transmissão cruzada entre os indivíduos aponta para a necessidade do estabelecimento de medidas de vigilância do CBc nos centros de referência.