Achromobacter xylosoxidans species indentification of samples isolated in cystic fibrosis: comparison between techniques Multilocus Sequence Typing, PCR for blaOXA-114 gene and 16S rRNA gene

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:17:07Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_FINAL_PUBLICADA_Elenice_Rosa_de_Aguiar_Rodrigues.pdf: 747415 bytes, checksum: 22b2d3fb8de014f2df6bc90e7b11b6de (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:17:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_FINAL_PUBLICADA_Elenice_Rosa_de_Aguiar_Rodrigues.pdf: 747415 bytes, checksum: 22b2d3fb8de014f2df6bc90e7b11b6de (MD5) Previous issue date: 2014-09-10 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Achromobacter xylosoxidans has been highlighted as an important pathogen in lung infections of patients with cystic fibrosis (CF). Phenotypic and genotypic similarity among species of the genus hampers identification and the real frequency is possibly underestimated. The proper identification is required to understand epidemiology and clinical impacts of different species of Achromobacter. This study compared the results obtained of identification of species of the genus by 16S rRNA gene, by Multilocus Sequence Typing (MLST) and by PCR for blaOXA-114-like gene. Thirty Achromobacter spp. samples were obtained from 17 patients with CF treated in two reference centers Rio de Janeiro city and belonging to 18 clones previously established by PFGE were evaluated. The 16S rRNA gene sequencing identified all samples as A. xylosoxidans. The sequencing of the amplification products of blaOXA-114-like gene revealed compatibility of 17 samples with some gene variation and were identified as A. xylosoxidans. Eleven samples were consistent with the blaOXA-258 gene, and were classified as A. ruhlandii. Two samples didn t obtain amplification. MLST analysis showed 11 samples matching four STs (2, 13, 35, 36) provided by MLST Achromobacter site. In 15 samples were characterized ten new alleles, grouped in eight new STs (198, 199, 200, 201, 202, 203, 204 and 205). Two new combinations of alleles were observed in 2 samples featuring 2 new STs (206 and 207). Two samples didn t have their STs defined. The 30 samples corresponded to 14 STs and four species of Achromobacter spp. Seventeen samples were identified as A. xylosoxidans, nine as A. ruhlandii, onde as A.dolens and one as A. insuavis. The three techniques were consistent only to identify 17 samples as A. xylosoxidans (56.6%). The identification of nine samples of A. ruhlandii were concordant in MLST, PCR and sequencing for OXA-114 techniques. A. dolens and A. insolitus were identified only by MLST. The comparison between PFGE and MLST showed that results of the two techniques aren t entirely consistent. PFGE technique characterized 18 clones while MLST identified 14 STs. Among different samples, PFGE different clones were correspondent to the same ST and some PFGE / MLST clones were unique per patient. Results of this study show that 16S rRNA sequencing was a good tool for gender characterization and PCR gene blaOXA-114 was useful for identification of two most common species in the FC (A. xylosoxidans and A.ruhlandii). However, MLST had the best performance featuring all described species. Additional studies are required to elucidate the infection dynamics and contribution of the different species of the genus Achromobacter in FC. Achromobacter xylosoxidans tem se destacado como patógeno importante nas infecções pulmonares em pacientes com Fibrose Cística (FC). A similaridade fenotípica e genotípica entre as espécies do gênero dificulta a sua identificação podendo subestimar a real frequência. A identificação adequada é necessária para compreender a epidemiologia e impacto clínico das diferentes espécies de Achromobacter. Este estudo comparou os resultados obtidos na identificação das espécies do gênero por sequenciamento do gene 16S rRNA, por Multilocus Sequence Typing (MLST) e PCR para o gene blaOXA-114-like. Foram avaliadas 30 amostras de Achromobacter spp, obtidas de 17 pacientes com FC atendidos em dois centros de referência na cidade do Rio de Janeiro, pertencentes a 18 clones previamente estabelecidos por PFGE. O sequenciamento do gene 16S rRNA, identificou as 30 amostras como A. xylosoxidans. O sequenciamento dos produtos de amplificação para o gene blaOXA-114-like revelou compatibilidade de 17 amostras com alguma variável do gene e foram caracterizadas como A. xylosoxidans. Onze amostras foram compatíveis com o gene blaOXA-258, e foram classificadas como A. ruhlandii. Duas amostras não obtiveram amplificação. A análise do MLST mostrou que 11 amostras obtiveram correspondência com quatro STs (2, 13, 35, 36) disponibilizado no Achromobacter MLST website. Em 15 amostras foram caracterizados dez novos alelos que geraram oito novos STs (198, 199, 200, 201, 202, 203, 204 e 205). Duas combinações alélicas novas foram observadas em duas amostras caracterizando dois novos STs (206 e 207). Duas amostras não tiveram seus STs definidos. As 30 amostras corresponderam a 14 STs e quatro espécies de Achromobacter spp. Dezessete amostras foram identificadas como A. xylosoxidans, nove como A. ruhlandii, uma A. dolens e uma A. insuavis. As três técnicas foram concordantes apenas na identificação de 17 amostras de A. xylosoxidans (56,6%). A identificação de nove amostras de A. ruhlandii foram concordantes nas técnicas de MLST, PCR e sequenciamento para OXA-114. A. dolens e A. insolitus foram identificados somente por MLST. A comparação entre PFGE e MLST mostrou que os resultados das duas técnicas não são totalmente concordantes. O PFGE caracterizou 18 clones enquanto o MLST identificou 14 STs. Na amostragem foram observados diferentes clones PFGE correspondendo ao mesmo ST e clones PFGE/MLST únicos por paciente. Os resultados deste estudo demonstraram que, o sequenciamento do gene 16S rRNA foi uma boa ferramenta para a caracterização do gênero e a PCR do gene blaOXA-114 foi útil para a identificação das duas espécies mais frequentes na FC (A. xylosoxidans e A.ruhlandii). Entretanto, o MLST teve o melhor desempenho caracterizando todas as espécies descritas. Estudos adicionais são necessários para elucidar a dinâmica da infecção e contribuições das diferentes espécies do gênero Achromobacter na FC.