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Colloidal structures are crucial components in biological systems and provide a vivid and seemingly infinite source of inspiration for the design of functional bio-inspired materials. They form multi-dimensional confinements and shape living matter, and transport and protect bioactive molecules in harsh biological environments such as the stomach. Recently, colloidal nanostructures based on natural antimicrobial peptides have emerged as promising alternatives to conventional antibiotics. This contribution summarizes the recent progress in the understanding and design of these bio-inspired antimicrobial nanomaterials, and discusses their advances in the form of dispersions and as surface coatings. Their potential for applications in future food and healthcare materials is also highlighted. Further, it discusses challenges in the characterization of structure and dynamics in these materials.

Psoriasis is a common, chronic inflammatory skin disease typically appearing as erythematous plaques or papules covered with silvery-white scales. Skin changes are normally not life-threatening, nevertheless they are stigmatizing and can put a heavy burden on the patients’ lives. Since sole topical treatment is often not successful, systemic medication is increasingly applied. In Germany, fumaric acid esters (FAE) are the most commonly prescribed first-line systemic treatment for moderate to severe psoriasis. The development of psoriasis appears to be of an immunological origin. Distinct changes on the T-cellular level have been reported for psoriasis. Although the licenced FAE formulation Fumaderm is approved since 1994, the impact of the main active substance dimethyl fumarate (DMF) and its metabolite monomethyl fumarate (MMF) is still not fully elucidated. Thus, the aim of the present study was to investigate the effects of FAE on distinct T cell subsets in patients with psoriasis using the highly sensitive ELISPOT analysis. For this purpose, 15 patients were treated with FAE and based on the secretion of their marker cytokines IFN-γ-, IL-17-, IL-5- and IL-10 after ex vivo activation of peripheral blood mononuclear cells, T helper (Th1), Th17, Th2 and regulatory T cells were followed over a period of up to 12 weeks. FAE-therapy led to an improvement of clinical symptoms in most patients based on the Physician Global Assessment (PGA). The early treatment process was accompanied by a decrease of T cells. A significant reduction was determined for all T cell subsets after stimulation of PBMC with T cell-specific anti-CD3/CD28 beads and the mitogen phytohemagglutinin (PHA), except for PHA-stimulated IL-10-secreting cells. Interestingly, especially IFN-γ-secreting Th1 cells were reduced, while FAE did not seem to induce immunosuppressive IL-10-secreting T cells in vivo. In addition to the ex vivo data during the early course of treatment, in vitro experiments with DMF, MMF and fumaric acid (FA) were performed with PBMC of patients and healthy controls. Here, DMF, but neither MMF nor FA, led to a significant, dose-dependent reduction of all examined T cell frequencies. The discrepancy between the rapid metabolism of DMF in vivo and its distinct effects in vitro, which exceed those of the in vivo active MMF, underlines the need for further research. Another aim of the study was to compare the frequencies of cytokine-secreting cells in patients and healthy controls. Whereas no differences were detected after non-specific cell stimulation (anti-CD3, PHA und anti-CD3/CD28-beads), stimulation with the putative psoriasis-specific autoantigen LL37 induced proinflammatory T cells exclusively in the patient cohort. Performing the ELISPOT assay, LL37-specific T cells were found in 37.5% of the examined patients with psoriasis (LL37-responders). In the control cohort only an anti-inflammatory IL-10-response to LL37 was observed. Furthermore, a tendency towards more severe psoriasis was found in the LL37-responders in comparison to the non-responders, thus confirming the role of LL37 as an autoantigen at least in a subset of patients with psoriasis. Taken together, the results of this study indicate an early reduction of T cells during FAE-treatment. Moreover, the data suggest that the clinical efficacy of FAE in the treatment of psoriasis is mediated by a decrease in Th1- and Th17 cells, and not by an induction of IL-5- and IL-10-secreting T cells. Based on the in vitro data, the observed reduction in T cell frequencies might rather be caused by DMF than its metabolite MMF., Bei Psoriasis handelt es sich um eine häufige, typischerweise chronisch verlaufende, entzündliche Hauterkrankung, die circa 2% der Gesamtbevölkerung betrifft. Die Hautveränderungen sind durch erythematöse, scharf begrenzte Plaques oder Papeln gekennzeichnet, die von silbrig-weißen Schuppen bedeckt sind. Während die Erkrankung in der Regel nicht lebensbedrohlich ist, sticht eine hohe psychische Belastung der Patienten durch Stigmatisierung hervor. Da sich die Symptome mithilfe einer topischen Therapie oft nicht ausreichend kontrollieren lassen, werden zunehmend systemische Medikamente verordnet. In Deutschland gehören Fumarsäureester (FAE) zu den häufigsten verschriebenen First-Line-Systemtherapeutika für die Behandlung der Psoriasis. Bisherige Forschungsergebnisse zu den Pathomechanismen der Psoriasis deuten auf immunologische Prozesse, insbesondere auf ein Mitwirken von T-Zellen, hin. Obwohl FAE mit dem Präparat Fumaderm bereits 1994 zur Behandlung der moderaten bis schweren Psoriasis zugelassen wurden, konnte der Einfluss des Hauptwirkstoffs Dimethylfumarat (DMF) und seines in vivo Metaboliten Monomethylfumarat (MMF) auf verschiedene T-Zellpopulationen nicht vollständig geklärt werden. Mithilfe der vorliegenden Studie wurden daher die Effekte von FAE auf T-Zellen bei Patienten mit Psoriasis mithilfe des ELISPOT-Verfahrens (enzyme-linked immunospot assay), einer äußerst sensitiven Methode zur Bestimmung von Zellfrequenzen anhand ihrer Zytokinsekretion, weitergehend untersucht. Hierfür wurde bei 15 Patienten mit Psoriasis eine FAE-Therapie eingeleitet und über einen Beobachtungszeitraum von bis zu 12 Wochen die Frequenzen von T-Helfer (Th) 1-, Th17-, Th2- und regulatorischer T(reg)-Zellen anhand ihrer Markerzytokine IFN-γ-, IL-17-, IL-5- und IL-10 in ex vivo aktivierten peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) gemessen. Die FAE-Therapie führte innerhalb dieses Zeitraums bei der Mehrheit der untersuchten Patienten zu einer Symptomverbesserung mit Verringerung des fünfstufigen Physician Global Assessment (PGA). Die Therapie wurde frühzeitig von einem Rückgang der zytokinsezernierenden T-Zellen begleitet. So ergab die vorliegende Studie einen signifikanten Abfall von allen untersuchten T-Zellpopulationen nach Stimulation mit T-Zell-spezifischen anti-CD3/CD28-beads sowie für sämtliche mit dem Mitogen Phytohämagglutinin (PHA) stimulierten PBMC in Ausnahme der IL-10-sezernierenden Zellen. Es wurde insbesondere ein Abfall der IFN-γ-sezernierenden Th1-Zellen beobachtet. Eine Induktion von immunsuppressiv wirksamen, IL-10-sezernierenden T-Zellen unter der Therapie mit FAE wurde ex vivo nicht nachgewiesen. Um den Einfluss des jeweiligen Wirkstoffs auf die verschiedenen T-Zellsubpopulationen zu testen, wurde zusätzlich zu den longitudinal erhobenen ex vivo Daten PBMC von Patienten und gesunden Kontrollen in vitro entweder mit DMF, MMF oder Fumarsäure (FA) behandelt. Im Unterschied zu MMF und FA zeigte dabei DMF in beiden Kohorten einen signifikanten, dosisabhängigen Abfall sämtlicher untersuchter T-Zellfrequenzen. Diese Ergebnisse verdeutlichen weiteren Forschungsbedarf angesichts des ungeklärten Widerspruchs zwischen dem rasanten Metabolismus von DMF zu MMF in vivo und den ausgeprägten in vitro Effekten von DMF, welche die Wirkung des in vivo aktiven MMF deutlich übertreffen. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit bestand in dem Vergleich der Frequenzen von zytokinsezernierenden T-Zellen zwischen der Patienten- und der Kontrollkohorte. Während nach antigenunspezifischer Stimulation (anti-CD3, PHA und anti-CD3/CD28-beads) keine signifikanten Unterschiede detektiert werden konnten, wurde nach Verwendung des potenziellen Psoriasis-spezifischen Autoantigens LL37 ausschließlich in der Patientenkohorte eine Induktion pro-inflammatorischer T-Zellen beobachtet. Mithilfe des ELISPOT-Verfahrens wurden bei 37,5% der untersuchten Psoriasispatienten LL37-spezifische T-Zellen detektiert. In der Kontrollkohorte (gesunde Probanden) wurde hingegen ausschließlich eine anti-inflammatorische IL-10-Antwort beobachtet. Eine Subanalyse unter den LL37-Respondern der Patientenkohorte zeigte zudem Hinweise auf eine ausgeprägtere Krankheitsschwere der Psoriasis gegenüber den Patienten ohne LL37-spezifische T-Zellen (LL37-Non-Responder). Die Rolle von LL37 als ein Autoantigen in einer Subgruppe von Patienten mit Psoriasis konnte somit bestätigt werden. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Studie, dass FAE frühzeitig zu einer Reduktion verschiedener T-Zellsubpopulationen im peripheren Blut führen. Die Daten deuten darauf hin, dass in vivo insbesondere die Abnahme von Th-1- und Th-17-Zellen und weniger eine Induktion von IL-5- oder IL-10-sezernierenden T-Zellen für die klinische Verbesserung durch eine FAE-Therapie verantwortlich ist. Anhand der in vitro Daten lässt sich ein Rückgang dieser T-Zellsubpopulationen eher auf DMF als auf MMF zurückführen.

Der menschliche Darm beherbergt eine Vielzahl von Mikroorganismen. Neben seiner Funktion als Schutzschicht gegen Pathogene, muss er gleichzeitig eine exzessive Immunantwort gegen Kommensale verhindern. Eine entscheidende Rolle in der Verteidigung spielen antimikrobielle Peptide (AMPs), die aufgrund ihres kationischen Charakters spannungsabhängige Kanäle auf der Oberfläche von Mikroorganismen ausbilden und diese zerstören. Neben den „klassischen AMPs“ konnten weitere antimikrobiell aktive Polypeptide, wie z.B. Mitglieder der Histonfamilie isoliert werden. Histone sind basische Proteine, die als Bestandteil des Chromatins für die Verpackung der DNA verantwortlich und Ort posttranslationeller Modifikationen sind. Man unterscheidet fünf Familien, die Kernhistone H2A, H2B, H3 und H4 sowie das Linkerhiston H1. Extrazellulär zeigen Histone eine starke antimikrobielle Wirkung gegen ein breites Spektrum von Mikroorganismen, wobei der Mechanismus der Histontoxizität bisher wenig aufgeklärt ist. Wird die antimikrobielle Schutzschicht des Darms geschwächt, z.B. durch eine verminderte Expression antimikrobiell wirksamer Peptide, können Mikroorganismen in die Mukosa eindringen und zu Entzündungsreaktionen führen. Dieser Prozess konnte bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED), wie Morbus Crohn (MC) und Colitis ulcerosa (CU), in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden. Es war das Ziel der vorliegenden Arbeit die Rolle der Histone bei der Symptomausprägung der CED zu untersuchen. Im ersten Teil wurde eine systematische Analyse des Transkriptoms (Q-PCR) und Translatoms (Western Blots) der Kernhistone in Kolongeweben durchgeführt. Bei der Genexpression zeigte sich in entzündeten MC-Geweben eine tendenzielle Erhöhung der Histone, die bei H2A und H2B sogar signifikant ausfiel. Die Quantifizierung auf Proteinebene ergab eine extreme Streuung der Expressionsstärke bei allen Kernhistonen, unabhängig von der untersuchten Gruppe. Signifikante Unterschiede waren nicht zu erkennen. H2B war im Trend in der Entzündung erniedrigt. Nach der systematischen Analyse wurde im zweiten Teil der Fokus auf isolierte His-tone aus humanem Kolongewebe gelegt. Im Vorfeld wurden verschiedene Methoden zur Isolierung der Histone verglichen. Dazu wurden die extrahierten Histone durch Fraktionierungen per RP-HPLC und Massenanalyse mit MALDI-TOF-MS überprüft. Durchflusszytometrische Untersuchungen ergaben, dass die antimikrobielle Aktivität der isolierten Histone aus verschiedenen Darmgeweben und Mukus bei verschiedenen Mikroorganismen keine Unterschiede zwischen gesunden Kontrollen und CED-Patienten zeigten. Lediglich bei S. aureus ließ sich eine signifikant erhöhte Histonaktivität in entzündetem CU-Gewebe erkennen. Die Wirkung der extrahierten Histone scheint stammspezifisch zu sein und lässt eine höhere Aktivität gegen die getesteten grampositiven Spezies erkennen. Mit Hilfe immunhistologischer Färbungen konnten erwartungsgemäß extrazelluläre Histone im Mukus nachgewiesen werden. Mit Hilfe von ELISAs wurden im Mukus die Proteinkonzentrationen von H2A und H2B bestimmt und eine leichte Erhöhung der Histonproteine in CU-Gewebe beobachtet. Im letzten Teil der Arbeit wurden mittels durchflusszytometrischer Vitalitätstests die Wechselwirkungen zwischen rekombinanten Histonen, sowohl untereinander als auch mit anderen AMPs, untersucht. Dabei zeigte sich in allen Fällen eine stamm-spezifische Steigerung der antimikrobiellen Aktivität der Histone. Häufig traten sy-nergistische Effekte auf. Durch elektromikroskopische Aufnahmen konnte die Wir-kungsweise der Histone gegen verschiedene Bakterien visualisiert und eine Ver-klumpung der Bakterien sowie ein massiver Verlust der Zellintegrität beobachtet werden. Veränderungen des Transkriptoms und des Translatoms der Histone sowie der an-timikrobiellen Histonaktivität bei CED-Patienten hätten als pathologische Defekte der Erkrankungen gewertet werden können. Solche Effekte konnten in dieser Arbeit jedoch nicht bestätigt werden. Aufgrund ihrer enormen antimikrobiellen Aktivität spielen Histone aber trotzdem eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Mikroorga-nismen im Kolon. Ob Histone ein therapeutisches Potenzial besitzen und inwieweit sie als neue Antibiotika eingesetzt werden können, müssen weiterführende Studien zeigen. Diese Arbeit konnte das starke, mit klassischen AMPs durchaus vergleichba-re, Potenzial der Histone gegen die verschiedensten Erreger bestätigen und auf diese Weise Anregungen für nachfolgende Studien bringen. The human intestine harbours a multitude of microorganisms. In addition to its func-tion as a protective layer against pathogens, it has to prevent an excessive immune answer against commensales simultaneously. Antimicrobial Peptides (AMPs) with their cationic character are playing an essential role in protection, because they are able to form voltage dependent channels on the surface of microorganism, which kill pathogens. In addition to the classical AMPs more antimicrobial active polypeptides, such as members of the histone family, were isolated. Histones are alkaline proteins, which are components of the chromatine. They are foremost responsible for packaging the DNA and for posttranslational modifications. Five different families can be differentiated: the core histones H2A, H2B, H3 and H4, as well as the linker histone H1. While extracellular histones show strong antimicrobial activity against a broad spectrum of microorganisms, the mechanism of their toxicity has not yet been sufficiently determined. If the antimicrobial protection layer of the intestine is weakened, due to a diminished expression of AMPs for instance, microorganisms can penetrate the mucosa and trigger inflammations. These findings have been confirmed in different tissues of patients with inflammatory bowel diseases (IBD), such as Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC). The aim of this work is to determine whether histones play a role in IBD. In the first part a systematic analysis of the transcriptome (Q-PCR) and the transla-tome (Western Blotting) of the core histones of colonic tissue was performed. In tis-sues of patients with CD gene expression data showed generally an increase of his-tones. In the cases of H2A and H2B the increase was significant. The quantification on the protein level offered an extreme variance of the expression of all core histones, irrespective of the analysed group. Significant differences were not detected. However, in trend H2B was lower in inflammation. After the systematic analysis, histones were then isolated of human colonic tissue. Before the extracted histones were fractionated via RP-HPLC and screened via MALDI-TOF-MS, different methods for the isolation of histones had been compared. The antimicrobial activity of the isolated histones of different intestinal tissues and mucus showed no differences between healthy controls and patients with IBD in flow cytometric tests. A significant increase of the histone activity in inflamed tissues of UC was only detected against S. aureus. The impact of the extracted histones seems to be strain-specific and higher against gram-positive species. As expected, extracel-lular histones could be detected in the mucus by immunehistological staining. Through ELISAs, protein concentrations of H2A and H2B were determined in the mucus and thus a slight increase of the histone proteins in UC was observed. In the last part of this work, the interactions of recombinant histones among them-selves and with other AMPs were analysed by flow cytometric viability assays. A strain-specific increase of the antimicrobial activity of histones among themselves and with AMPs was found. Thereby synergistic effects occurred frequently. The in-teractions of histones against several bacteria were visualised by electron microscope images and furthermore an agglutination of the microorganisms as well as a massive loss of cell integrity were detected. Variantions of the histones’ transcriptome and the translatome, as well as variations of the antimicrobial activity of histones in CED would have been evaluated as patho-logic defects. However, in this work such effects could not been confirmed. Because of their enormous antimicrobial activity histones still play an important role in the protection against microorganisms in the colon. Further studies have to show, if his-tones possess a therapeutic potential, and if they can be used as new antibiotics. This work was able to verify the strong potential of histones against different pathogens, which is absolutely comparable with the potential of classic AMPs, and could pro-mote inspiration for subsequent studies.

Mikroorganismen, wie Bakterien, Pilze und Viren, besiedeln kontinuierlich den menschlichen Organismus. Neben einer effektiven Barriere durch die Epithelschichten und teilweise mit Mukusschichten spielen in der Verteidigung antimikrobielle Peptide (AMPs) eine zentrale Rolle. Ein wichtiges AMP ist das humane β-Defensin 1, welches im Gegensatz, zu einigen anderen De-fensinen, ubiquitär von allen Epithelien produziert wird. Nach Reduktion der drei Disulfidbrü-cken erzielt das Peptid gegen viele anaeroben, aber auch gegen aerobe Bakterien eine toxische Wirkung. Die oxidierte Form (hBD1ox) zeigte eine spezifischere Aktivität auf Gram-negative Bakterien, darunter Escherichia coli (E. coli). Aufgrund der immer größer werdenden Anzahl an multiresistenten Keimen und dem daraus resultierendem Bedarf an neue Strategien für neue antimikrobiell aktive Substanzen, wurde hier der Wirkmechanismus beider Redoxformen ge-nauer untersucht. In dieser Arbeit konnten zwei Redoxproteine DsbA und DsbB im bakteriellen Periplasma identifiziert werden, welche essentiell für die Aktivität von hBD1ox sind. Dagegen wurde der Einfluss weiterer Proteine in der Außenmembran, Cytosol, sowie im Flagellum für die hBD1ox Aktivität ausgeschlossen. Ein weiterer Nachweis der Abhängigkeit des Redoxkomplex zeigte die Verwendung einer „Rescue“-Mutante, welche beide Redoxproteine auf einem externen Plasmid enthält, wodurch die Sensitivität auf hBD1 hergestellt wurde. Dies bestätigt, dass das DsbA/DsbB System eine notwendige Komponente für die antimikrobielle Aktivität von hBD1ox darstellt. Zusätzlich zeigten Bakterien ohne DsbA/DsbB System, im Gegensatz zum Wildtyp, eine geringere Anzahl an Membranvesikeln auf der bakteriellen Oberfläche, was mit einer niedrigeren Stressreaktion assoziiert ist. Durch eine Immunogold Färbung wurde hBD1ox in E. coli WT spezifisch im Periplasma lokalisiert. Dagegen konnte hBD1ox in der Mutante auch im Cytosol diffundieren. Es konnte somit gezeigt werden, dass hBD1ox mit DsbA und DsbB interagieren kann. Dies lässt die Hypothese zu, dass sich hBD1ox im Periplasma ansammelt und zusammen-lagert, was schließlich die Zelllyse induziert. Darüber hinaus konnte hier gezeigt werden, dass nur die reduzierte Form (hBD1red) Membran-schäden an Bakterien verursacht. Überraschenderweise zeigte die Rasterelektronen-mikroskopie nach der Behandlung mit hBD1red eine bisher noch unbekannte Netzstruktur, welche die Bakterien umgibt. Ein hier etablierter Transmigrationsassay zeigte, dass diese Netzstruktur die Diffusion und Verbreitung der Bakterien zusätzlich zu der antimikrobiellen Aktivität verhindern kann. Im Gegenteil zu anderen Defensinen, wie z .B HD6, ist die Aminosäure Cystein in der hBD1-Sequenz für die antimikrobielle Aktivität nötig und für die Netzbildung essentiell. Dies konnte durch einen Austausch mit einem Cystein-Analogon, welcher die Netzbildung verhindert, gezeigt werden. Zusätzlich wurde ein bakterieller Abwehrmechanismus von hBD1ox identifiziert, bei diesem bakterielle Proteasen in der Lage sind das hBD1red zu fragmentieren. Dadurch zeigt sich eine schwächere antimikrobielle Aktivität. Jedoch konnte die Netzbildung trotz des Proteaseverdaus nachgewiesen werden. Hier wurde zum ersten Mal gezeigt, dass ein Peptid mehrere Strategien besitzen kann, um antimikrobiell aktiv sein zu können. Dies dient für ein besseres Verständnis über die Wirkmechanismen von AMPs und könnte bei der Entwicklung neuer Strategien im Kampf gegen multiresistente Keime.

Entgegen der bisherigen allgemeinen Datenlage, dass hBD-1 in Epithelzellen konstant exprimiert wird, konnte die vorliegende Studie erstmals zeigen, dass EMD die Expression von hBD-1 in HaCaT-Zellen reguliert., The present study shows a significant inhibition of hBD-1 gene expression in HaCaT kreatinocytes following treatment with EMD.

Fazit: Es ist bekannt, dass die Induktion der AMP-Expression sehr komplex ist und über verschiedene Mechanismen geschehen kann. Diese Komplexität bietet eine Grundlage zur Diskussion der unterschiedlichen Ergebnisse dieser Arbeit. So sind Psoriasin, RNase 7, hBD-2 und hBD-3, die wichtige Rollen spielen in der Pathogenese der Psoriasis an der Haut, nicht in der Synovialis von Psoriasis-Arthritis exprimiert, dafür aber die AMP S100 A8, S100 A9, HNP1-3 und LL-37. Diese neuen Erkenntnisse zur differentiellen Expression von AMP bei Psoriasis der Haut und der Gelenke können für weitere Untersuchungen in der Zukunft wegweisend sein. Ein Ziel könnte beispielsweise die Hemmung proinflammatorisch wirksamer AMP als mögliche neue therapeutische Intervention sein oder die Entwicklung neuer Screeningmarker oder Marker für das Therapiemonitoring. Für S100 A8/A9 beispielsweise wurde kürzlich ein direkter Zusammenhang zwischen Serumkonzentration und Krankheitsaktivität der Psoriasis-Arthritis nachgewiesen und zwar unabhängig vom Hautbefall, was die Relevanz dieser AMP für die Psoriasis-Arthritis unterstreicht. OBJECTIVES: This study tested the hypothesis that a differential innate immune antimicrobial peptide (AMP) profile was evident between the skin and joints in psoriasis and psoriatic arthritis (PsA) and that PsA synovitis may have a distinct AMP pattern compared to other arthropathies. METHOD: Twenty-two cases had knee biopsies [10 PsA, eight rheumatoid arthritis (RA), and four osteoarthritis (OA)]. Lesional and non-lesional skin biopsies in psoriasis and control tissue were also obtained (n = 4 each). Immunohistochemistry with semi-quantitative scoring of both synovium and skin was performed using the following panel of AMPs: S100 A8, S100 A9, human neutrophil peptides 1-3 (HNP1-3), human β-defensins 2 and 3 (hBD-2 and hBD-3), cathelicidin LL-37, psoriasin (S100 A7), and ribonuclease 7 (RNase 7). RESULTS: Similar expression of S100 A8, S100 A9, and HNP1-3 was detectable in PsA and RA synovium but only in the synovium sublining layer (SSL). No expression of psoriasin, RNase 7, hBD-2, and hBD-3 could be detected in the synovial tissue of PsA, RA, or OA. All psoriasis skin samples exhibited broad expression of all investigated AMPs, with strong keratinocyte expression. CONCLUSIONS: Given that some AMPs, especially hBD-2, are genetically linked to psoriasis and are only expressed in the skin, these findings show how differential AMP expression in innate immune responses may contribute to disease heterogeneity between PsA and psoriasis and provides a genetic basis for the non-progression of psoriasis subgroups to PsA.

Bislang war die Mastzelle (MZ) den meisten Menschen ausschließlich als leidige und potentiell lebensgefährdende Allergiezelle bekannt. In den letzten Dekaden erlangte sie jedoch in der Wissenschaftswelt zunehmend große Aufmerksamkeit durch ihre vielseitigen und bis dato noch unbekannten physiologischen Funktionen. Man begann zu begreifen, dass die MZ nicht nur für pathologische Vorgänge verantwortlich zu machen ist, sondern ebenso in enormem Umfang physiologische Prozesse unseres Körpers unterstützt. Die Aktivierung von MZ in gewebsregeneratorischen Prozessen wurde dargelegt, und 2007 gelang es, die Bedeutung dieser Zellen innerhalb der kutanen Wundheilung aufzuzeigen. Immunologisch sind sie zudem in der Lage einer induzierten Sepsis oder bakteriellen Hautinfektionen, beispielsweise durch Pseudomonas aeruginosa ausgelöst, entgegenzuwirken, um hier nur zwei Beispiele zu nennen. In dieser Arbeit wurde unter Zuhilfenahme eines MZ-defizienten Hautinfektionsmodells die reelle und ubiquitär im Krankenhausalltag vertretene Situation der bakteriell infizierten Hautwunde untersucht. Dabei gelang der Nachweis eines deutlich verzögerten Wundheilungsverlaufs in MZ-defizienten KitW/KitW-v–Mäusen nach lokaler Infektion mit dem Bakterium Pseudomonas aeruginosa(PA). Mittels MZ- Rekonstitution wurde der Beweis der tatsächlichen MZ-Abhängigkeit geführt. Zudem konnte gezeigt werden, dass MZ zu einer herabgesetzten Bakterienlast in mit PA infizierten Wunden beitragen. Die in vivo gewonnenen Daten stützend, vermindern MZ ebenso in Ko-Kultur die Überlebensrate dieses Bakteriums. Als möglicher Mechanismus der bakteriellen Eliminierung konnte die MZ- Degranulation auf den Stimulus PA hin in vitro jedoch ausgeschlossen werden. Daher wurde das Expressionsverhalten antimikrobieller Peptide durch MZ auf RNA-Ebene untersucht. Bestimmte Peptide zeigten nach PA- und LPS-Stimulation veränderte Expressionsmuster, so beispielsweise Tryptase 1 und Cathepsin G, zwei von MZ produzierte Proteasen, welche in der Literatur mit der Abwehr bakterieller Infektionen assoziiert werden. Somit konnte im Rahmen dieser Dissertation der Einfluss der MZ nicht nur isoliert im Kontext der kutanen Wundheilung oder bakteriellen Abwehr betrachtet, sondern erstmalig auch das komplexe Zusammenspiel dieser beiden Szenarien als Ganzes untersucht werden. Mastzellen bekämpfen bakterielle Infektionen, was wiederum zu einer verbesserten Wundheilung führt. Es wurden in dieser Arbeit bekannte physiologische MZ-Funktionen bestätigt, wobei ebenso neue, weitreichende Erkenntnisse gewonnen werden konnten., Asking people what to generally associate with mast cells (MC), their first and often only response will be “allergies” or maybe even “anaphylactic reaction”. But there is certainly way more to these extraordinary cells. By realizing that, our knowledge exponentially grew on very different aspects of MC functions within the past few decades. MCs are no longer only associated with pathological, but also with a variety of physiological processes. Apart from demonstrating the cardinal role of MCs in the regeneration of tissue, a publication in 2007 underlined the importance of MCs in cutaneous wound healing. Considering very different functional aspects, MCs are nowadays also known to play an important immunological role in the defense against bacterial infections, so proven in induced sepsis models and in the process of certain bacterial skin infections, such as Pseudomonas aeruginosa infections, just to mention two. Using inter alia a MC-deficient mouse model, this work the first time investigates an ubiquitous clinical situation of bacterially infected skin wounds. A significantly delayed wound closure was observed in MC- deficient KitW/KitW-v– mice after local infection with Pseudomonas aeruginosa(PA). MC reconstitution was used to prove true MC dependency. Furthermore it could be shown that MCs are capable of lowering the bacterial load in PA infected wounds. Transferring these findings into an in vitro setting by co-culturing MC and PA, the bacterial survival rate was significantly lowered in the presence of MCs. Though MC degranulation after stimulation with PA as a possible mechanism of eliminating bacteria was to be excluded, other possible mechanisms were investigated. So the up- or downregulation of antimicrobial peptides (AMP) by MCs was analyzed on an mRNA- expression level via quantitative realtime- PCR. It could be shown that the expression levels of certain MC derived substances, so Tryptase-1 and Cathepsin G, two proteases produced by MCs, which we find associated with bacterial infection in the literature, were altered. To resume, this work not only focuses on the relevance of MC in the context of cutaneous wound infections or isolated on bacterial defense mechanisms. It is rather the first time investigations were carried out to combine these to settings to understand them in an omnipresent, every day clinical scenario. MCs combat bacterial infections, which actually leads to an improved wound healing. In this thesis known physiological MC functions were validated and broad knowledge was gained to expand the global understanding of these magnificent cells.

Im Projekt Sterihealth haben Forscher von sieben Fraunhofer-Instituten einen effektiven, schnellen und sicheren Hygienesicherungsprozess entwickelt. Damit lassen sich keimfrei verpackte Medizinprodukte bereitstellen.

Dermcidin-abgeleitete Peptide werden in den ekkrinen Schweißdrüsen konstitutiv exprimiert und in den Schweiß sezerniert. Diese Peptide unterscheiden sich in Länge, Nettoladung und einigen konnte eine antimikrobielle Aktivität gegen pathogene Bakterien nachgewiesen werden. Mit Hilfe des anionischen DCD-1L sollte der antimikrobielle Wirkmechanismus, der zum bakteriellen Zelltod führt, genauer untersucht werden. Im Rahmen dieser Arbeit sowie in vorhergehenden Arbeiten konnte eine Interaktion des Peptids mit der bakteriellen Zelloberfläche beobachtet werden, wobei die Oberflächenstruktur gestört wird. Die Interaktion zwischen DCD-1L und bakteriellen Phospholipiden oder DCD-1L in membranimitierenden Umgebungen (TFE, Detergenzien) führten zu einer strukturellen Veränderung des Peptids. DCD-1L bildete dabei eine amphipathische alpha-helikale Struktur aus und orientierte sich parallel zur Membrannormalen in Lipidsystemen aus POPG oder DMPC/DMPG (1:1). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass DCD-1L oligomere Strukturen in membranimitierenden Umgebungen sowie in Anwesenheit von Phospholipiden ausbildet, welche durch Zn2+ stabilisiert wurden. Auch eine Steigerung der antimikrobiellen Aktivität von DCD-1L gegen S. aureus 113 WT konnte in vitro durch die Zugabe von divalenten Kationen erzielt werden. Des Weiteren konnte in elektrophysiologischen Messungen DCD-1L eine spannungsabhängige porenbildende Aktivität in DPhPC-Phospholipidlayern nachgewiesen werden. Die Leitfähigkeit verhielt sich sigmoidal und wurde durch den pH-Wert beeinflusst, wobei keine Ionenselektivität gemessen werden konnte. Anhand der erzielten Ergebnisse kann ein Modell zur Wirkungsweise von DCD-1L erstellt werden. Die initiale Interaktion zwischen DCD-1L und den Phospholipiden der bakteriellen Membran erfolgt wahrscheinlich über elektrostatische Kräfte oder über Salzbrücken. Dabei führt der Kontakt von DCD-1L mit der Zielmembran zur Ausbildung einer amphipathischen alpha-Helix, welche sich parallel zur Membran orientiert. Beim Erreichen einer Schwellenkonzentration kommt es zur Oligomerisierung der Peptide und zur Permeabilisierung der Membran. Dermcidin-derived peptides are constitutively expressed in human eccrine sweat glands and secreted into the sweat. These peptides differ in length, net charge and some of them have an antimicrobial activity against pathogens. The antimicrobial activity of DCD-1L, which leads to bacterial cell death, was investigated in detail. In this study as well as in previous work we observed an interaction of the peptide with the bacterial surface, whereby the surface structure was disturbed. The interaction between DCD-1L and bacterial phospholipids or DCD-1L in membrane-imitating environments (TFE, detergents) induced a structural change of the peptide. DCD-1L changed its disordered conformation to an amphipathic alpha-helical structure and was aligned in plane of the lipid bilayer consisting of POPG or DMPC/DMPG (1:1). In addition, DCD-1L formed oligomeric structures which are stabilized by Zn2+ in membrane-imitating environments as well as in the presence of phospholipids. The antimicrobial activity of DCD-1L against S. aureus 113 WT was increased by divalent cations. In single channel conductance measurements it was shown, that DCD-1L was able to form voltage-dependent ion channels in DPhPC bilayers, which were pH-dependent without an ion selectivity. With these data it is possible to develop a model for the mode of action of DCD-1L. The initial interaction between DCD-1L and the phospholipids of the bacterial membrane take place by electrostatic interactions or by salt bridges. The interaction induces an amphipathic alpha-helical structure and the peptide is aligned in plane of the membrane. After reaching a concentration dependent threshold the peptide will oligomerize and permeabilize the membrane.

Insgesamt ist die Suche nach neuen Therapieansätzen essentiell, um die Sterblichkeit nach einer Meningitis zu senken und mögliche Folgeschäden zu reduzieren und zu verhindern. Hierbei können Erkenntnisse zu den AP einen wichtigen Beitrag liefern. Das Thema der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich deshalb mit der Expression und Funktion der AP im ZNS. Folgende Fragestellungen wurden bearbeitet: • Können im LCS und Serum AP nachgewiesen werden? • Besitzt LCS eine antimikrobielle Aktivität? Sind daran AP beteiligt? • Welchen Anteil besitzen die Gliazellen an der Expression und Sekretion von AP? • Besitzen die Überstände von Gliazellen eine antimikrobielle Aktivität? Sind daran AP beteiligt? • Welche Signaltransduktionswege in den Gliazellen sind an der Expression der AP beteiligt?

γδ T-Lymphozyten stellen eine numerisch kleine T-Zellsubpopulation dar, deren Funktionen Zytokinproduktion, Zytotoxizität, Antigenpräsentation, Produktion von AMPs, Erkennung von PAMPs durch Mustererkenungsrezeptoren und regulatorische Wirkung umfassen. Aufgrund der Verteilung von γδ T-Zellpopulationen in verschiedenen Geweben des Menschen war eine differentielle Chemokinrezeptorexpression zu vermuten und konnte in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Dabei wurde die Expression von CCR4 als ein charakteristisches Merkmal für Vδ1 vs. Vδ2 γδ T-Zellen identifiziert. Desweiteren konnte ein differentielles Expressionsmuster von CCR6 und CCR9 mit den Lokalisationen von γδ T-Zellen aus Blut, Synovialflüssigkeit und Darmgewebe korreliert werden. Zur schnellen Erkennung von Pathogenen verfügen γδ T-Zellen neben dem T-Zellrezeptor auch über Mustererkennungsrezeptoren wie TLRs. Vorhergehende Studien hatten zudem erste Hinweise auf eine Expression des Mustererkennungsrezeptors NOD2 beschrieben. Die Expression des NOD2-Proteins in γδ T-Zellen konnte erstmalig in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden. Weiterhin wurden über den TZR aktivierte γδ T-Zellen mit dem NOD2-Liganden MDP-LD im Vergleich mit dessen MDP-DD-Isomer stimuliert. Hochrein isolierte γδ T-Zellen zeigten eine verstärkte Freisetzung von CCL3/MIP-1α und IFN-γ, während in PBMZ befindliche γδ T-Zellen eine schwächere Proliferation nach Stimulation mit MDP-LD vs. MDP-DD aufwiesen. Nach Aktivierung setzen γδ T-Zellen Zytokine wie IFN-γ, TNF-α und CCL5/RANTES, aber auch antimikrobielle Peptide wie LL-37 frei. In der vorliegenden Arbeit wurden γδ T-Zellen mit dem Überstand adhärent wachsender Ps. aeruginosa stimuliert um die nachfolgende Expression von Zytokinen und AMPs zu untersuchen. Dabei konnte eine induzierbare Expression der Zytokine IFN-γ und CCL20/MIP-3α festgestellt werden. Eine ebenfalls stimulierbare antimikrobielle Aktivität von γδ T-Zellen ließ sich z.T. auf die Produktion und/oder Freisetzung von Granulysin, Granzym B, HBD-1 und Elafin zurückführen. In der vorliegenden Arbeit wurden Aspekte von γδ T-Lymphozyten im Hinblick auf ihre Lokalisation und die Erkennung und Bekämpfung von Pathogenen näher untersucht. Die vorliegenden Ergebnisse haben somit einen Beitrag zu einem tieferen Verständnis der Bedeutung von humanen γδ T-Zellen in der frühen Immunantwort erbracht. γδ T cells represent a numerical small T cell subset displaying functional activity including cytokine production, cytotoxicity, antigen presentation, production of antimicrobial peptides, recognition of PAMPs by pattern recognition receptors and regulatory functions. According to the distribution of γδ T cell subsets in different human tissues, a differential expression of chemokine receptors was expected and could be confirmed in the present study. The expression of CCR4 was identified as a characteristic feature of Vδ1 vs. Vδ2 γδ T cells. Furthermore, a differential expression pattern of CCR6 and CCR9 was correlated with the localizations of γδ T cells from blood, synovial fluid and intestine. For rapid recognition of pathogens, γδ T cells are equipped with not just the T cell receptor, but with pattern recognition receptors including TLRs. Additionally, previous studies had described preliminary evidences for an expression of the pattern recognition receptor NOD2. In the present study, the expression of the NOD2-protein was described for the first time. Furthermore, T cell receptor activated γδ T cells were treated with the NOD2-ligand MDP-LD in comparison to the MDP-DD-isomer. Stimulated with MDP-LD vs. MDP-DD, highly purified γδ T cells showed a stronger release of CCL3/MIP-1α and IFN-γ, while γδ T cells within peripheral mononuclear blood cells exhibited an attenuated proliferation. After activation, γδ T cells release cytokines such as IFN-γ, TNF-α and CCL5/RANTES as well as antimicrobial peptides like LL-37. In the present study, γδ T cells were stimulated by the supernatant of adherent Ps. aeruginosa in order to investigate the consecutive expression of cytokines and antimicrobial peptides. An inducible expression of the cytokines IFN-γ and CCL20/MIP-3α was observed. The similarly inducible antimicrobial activity of γδ T cells was attributed partly to the production and/or release of granulysin, granzyme B, human β-defensin 1 and elafin. In the present study, aspects of γδ T lymphocytes concerning their localization and the recognition of and the defense against pathogens were examined. The presented results have contributed to a deeper insight into the early immune response of human γδ T cells.

Die soziale Amöbe Dictyostelium discoideum lebt als ursprünglicher Phagozyt im Waldboden, wo sie sich von Bakterien ernährt. Bei Nahrungsknappheit aggregieren die Amöben und durchlaufen einen Entwicklungszyklus, an dessen Ende ein Fruchtkörper mit Dauerstadien steht. Das einzige bisher charakterisierte antimikrobielle Effektormolekül ist das Amöbenlysozym AlyA (Müller et al., 2005). Im Genom der Amöbe sind jedoch 33 Amoebapore-like peptides (Apls) mit jeweils einer SAPLIP-Domäne und 14 Lysozyme kodiert, die beim Abtöten der internalisierten Bakterien beteiligt sein können. In dieser Arbeit wurden weitere antimikrobielle Proteine untersucht. Die Lysozyme DdLysEh1 – 3 und Apl B2 wurden als Protein in axenisch kultivierten Amöben nachgewiesen. Offenbar ist dazu Apl B2 proteolytisch aus einem Vorläuferprotein mit mehreren SAPLIP-Domänen herausgeschnitten worden. Des Weiteren wurden das Lysozym AlyC und die Apls E1, E2 und D in Dictyostelium-slugs, einem mobilen Stadium im Entwicklungszyklus, identifiziert. Für eine funktionale Analyse der Apls wurden die anionischen Proteine Apl B2 und Apl D rekombinant in einem prokaryotischen System hergestellt und gereinigt. Für rApl D wurde die Sekundärstruktur untersucht und die Tertiärstruktur modelliert. Das Protein wies mit 78,7 % hohe Anteile an α-helikalen Strukturelementen auf. Die modellierte Tertiärstruktur ähnelte der Struktur von Saposin A und zeigte die für SAPLIP-Proteine charakteristische Faltung eines globulären Proteins mit vier α-Helices und drei intramolekularen Disulfidbrücken. Die Proteine rApl B2 und rApl D zeigten im Mikrosuszeptibilitätstest keine antimikrobielle Aktivität gegen Escherichia coli oder Bacillus megaterium, wobei die maximal eingesetzte Proteinkonzentration für rApl B2 bei 5 μM und rApl D bei 50 μM lag. Allerdings permeabilisierten beide Proteine die Membran der gram-positiven B. megaterium-Bakterien bei leicht azidischen pH-Werten. Die Membranen der gram-negativen Bakterien E. coli und verschiedener Klebsiella pneumoniae-Stämme sowie der Hefe Saccharomyces cerevisiae und D. discoideum selbst wurden nicht permeabilisiert. Beide Proteine zeigten bei niedrigen pH-Werten eindeutige porenbildende Aktivität gegen Liposomen, wobei die Aktivität von rApl D an eine korrekte Faltung geknüpft war. Damit sind die beiden Proteine rApl B2 und rApl D neben dem Lysozym AlyA die einzigen in Dictyostelium discoideum charakterisierten antimikrobiellen Effektormoleküle und führen zu einem besseren Verständnis der intrazellulären Vorgänge beim Abtöten internalisierter Mikroorganismen. As a soil-dwelling phagocyte the social amoeba Dictyostelium discoideum thrives on internalised bacteria. Upon depletion of microbial food resources the amoebae aggregate and undergo various stages of a developmental cycle resulting in a fruiting body with amoeba cysts. The only antimicrobial protein characterised so far is the amoeba lysozyme AlyA (Müller et al., 2005). Genome analysis revealed a multifarious family of 33 potential amoebapore-like peptides (Apls) with a SAPLIP-domain each. Additionally, the genome harbours genes potentially coding for 14 lysozymes, which all may be involved in the killing of internalised microorganisms. Within this thesis further antimicrobial proteins were characterised. The lysozymes DdLysEh1 – 3 and Apl B2 were identified in protein extracts from axenically cultivated amoebae. Apparently, Apl B2 has been released from a multi-domain precursor molecule. Additionally, the lysozyme AlyC and the Apls E1, E2 and D were identified in Dictyostelium slugs, a mobile stage of the developmental cycle. To access the protein function the anionic proteins Apl B2 and Apl D were recombinantly expressed in a prokaryotic system and purified. The secondary structure of Apl D was analysed and its tertiary structure modelled. Apl D showed a high percentage of α-helical elements (78,7 %). The tertiary structure of rApl D was similar to Saposin A and showed the characteristic SALIP fold of a globular protein with four α-helices and three intramolecular disulphide bridges. The proteins rApl B2 and rApl D displayed no antimicrobial activity against Escherichia coli or Bacillus megaterium at a maximum concentration of 5 μM for rApl B2 and 50 μM for rApl D. The proteins permeabilised the membrane of the gram-positive bacterium B. megaterium. The membrane integrity of the gram-negative bacteria E. coli, various Klebsiella pneumoniae-strains and the yeast Saccharomyces cerevisiae as well as D. discoideum itself was unaltered. Both proteins revealed potent pore-forming activity against liposomes at slightly acidic pH values. The activity of rApl D relies on a correct folding of the protein. Together with AlyA the proteins rApl B2 and rApl D are the only antimicrobial molecules in Dictyostelium discoideum known so far and the findings will lead to a better understanding of the intracellular killing of microorganisms.

Bacterial meningitis is the most severe and frequent infection of the central nervous system with a very high mortality rate and an adverse neurological outcome of the survivors. Antimicrobial peptides are an evolutionarily conserved component of the innate immune system of many species. Among others they play an important role in combating bacterial infection of the CNS. Treatment with antimicrobial peptides as adjuvant drugs could be a possible form of therapy after infections in the central nervous system (CNS). Antimicrobial peptides are expressed by glial cells, which play an important role in the innate immune system. The aim of this research was to investigate the antimicrobial protein psoriasin after a bacterial or viral infection in the CNS. The expression and function of psoriasin in glial cells were examined, because it was characterized insufficiently. Here it was shown the induction of psoriasin expression in the central nervous system after bacterial and viral stimuli. We used a pneumococcal meningitis in vivo model that revealed a S100A15 expression in astrocytes and meningeal cells. These results were confirmed by a cell based in vivo assay using primary rat glial and meningeal cell cultures. We investigate the S100A15 expression in glial and meningeal cells after a viral infection. In the next step the immunmodulatory functions of psoriasin were proofed. Microglia cells treated with recombinant psoriasin change their phenotype to an enlarged shape. Furthermore microglia and meningeal cells, treated with recombinant Psoriasin, showed an activation of the ERK signal transduction pathway. This study demonstrates that this activation of ERK depends on RAGE, the receptor for advanced glycation end products. An activation of astrocytes after a bacterial stimulation or a treatment with psoriasin occurred via the NFκB signaling pathway. This research indicates an occurrence of Psoriasin in CNS. Astrocytes and meningeal cells are able to express psoriasin after an infection in the CNS. But psoriasin has also immunmodulatory functions in the CNS. A possible involvement of Psoriasin as an antimicrobial protein that modulates the innate immune system after bacterial or viral stimuli was shown.

Obwohl es zunehmend klinische Evidenz gibt, dass probiotische oder kommensale Bakterien wichtig für die Infektionsabwehr pathogener Mikroorganismen sind, besteht über die zugrundeliegenden biologischen Mechanismen Unklarheit. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass kommensale und pathogene Staphylokokken in primären humanen Keratinozyten die antimikrobiellen Peptide/Proteine HBD-3 und RNase7 unterschiedlich stark induzieren konnten. Dazu aktivierten sie verschiedene Signalwege. S. epidermidis führte nur zu einer geringen Induktion von HBD-3 und RNase7, welche über die TLR2/NFkappaB- und EGFR-Signalwege vermittelt wurde. S .aureus führte hingegen zu einer starken Erhöhung der HBD-3 und RNase7 Expression, die jedoch unabhängig von den genannten Signalwegen erfolgte. Stattdessen war dieses Pathogen in der Lage, den NFkappaB Signalweg zu hemmen, indem der NFkappaB-Inhibitor Ikappab vermehrt exprimiert wurde. Kommensale Staphylokokken waren in der Lage, diese Inhibition des NFkappaB-Signalweges aufzuheben. Dies führte zu einer Amplifikation der antimikrobiellen Antwort der primären humanen Keratinozyten. Somit können die von beiden Staphylokkenspezies aktivierten Signalwege synergistisch zusammenwirken und zu einer verbesserten Infektionsabwehr führen. Im Verlauf dieser Arbeit wurde ein epikutanes Hautinfektionsmodell in der Maus etabliert, um die in vitro erhobenen Daten in vivo zu überprüfen. Zunächst konnte gezeigt werden, dass S. aureus die Induktion antimikrobieller Peptide in der Haut der Mäuse bewirkt. Zusätzlich konnten, in Abhängigkeit von einer vorherigen Schädigung der Haut, Unterschiede in der Kolonisierung der Haut beobachtet werden. So führte eine Schädigung der Haut durch „Tapestripping“ zu verlängerter Persistenz der Bakterien, bei gleichzeitig stark erhöhter Expression antimikrobieller Peptide. Die Arbeit leistet einen wichtigen Beitrag zur Aufklärung der Mechanismen, mit der die Haut zwischen kommensalen und pathogenen Mikroorganismen unterscheiden kann. Die Fähigkeit von kommensalen Bakterien die angeborene Immunantwort zu verstärken trägt dazu bei, schädliche Mikroorganismen von der gesunden Haut fernzuhalten. Erst bei Schädigungen der epithelialen Barriere durch Verwundung oder Entzündungsreaktionen kommt es zu einer Kolonisierung bzw. Infektion mit Pathogenen. Es ist sicherlich denkbar, wirksame Komponenten kommensaler Bakterien therapeutisch, zur Steigerung der Abwehrreaktion, bei Infektionen der Haut einzusetzen. Little is known about the impact of different microbial signals on skin barrier organ function and the interdependency between resident microflora and pathogenic microorganisms. This study shows that commensal and pathogenic staphylococci differ in their ability to induce expression of antimicrobial peptides/proteins (AMPs) and activate different signaling pathways in human primary keratinocytes. Whereas secreted factors of skin commensals induce expression of the AMPs HBD-3 and RNase7 in primary human keratinocytes via Toll-like receptor (TLR)-2, EGFR, and NF-kappaB activation, those of pathogenic staphylococci suppress NF-kappaB activation. Interestingly, commensal bacteria are able to amplify the innate immune response of human keratinocytes to pathogens by increased induction of AMP expression and abrogation of NF-kappaB suppression, suggesting that the two activation pathways can act in a synergistic way. These data indicate that commensal and pathogenic microorganisms evolved specific mechanisms to modulate innate immunity of the skin. Experimental mouse models of bacterial skin infections that have been described show that pathogenic microorganisms can readily invade the epidermis and dermis to produce localized infections. In this study an epicutaneous mouse skin infection model was established to determine how the level of barrier disruption by tape-stripping correlates with persistence of Staphylococcus aureus skin colonization. Furthermore, the antimicrobial peptide response of murine skin to S. aureus colonization in a physiologic setting was analyzed. It was shown that previous cutaneous damage favours S. aureus persistence leading to cutaneous colonization and induction of high levels of antimicrobial peptides. So this model will be useful to confirm the in vitro results in murine skin. This study contributes insights into mechanisms of discrimination between commensal and pathogenic staphylococci in the skin. The ability of commensal bacteria to amplify the innate immunity response of the skin towards pathogens is one mechanism to keep the surface of the skin free from pathogens. But cutaneous damage like wounding or inflammation facilitates colonization and infection with pathogens. Therapeutic use of commensal components activating innate immunity may be an interesting strategy to fight skin infections with pathogens.

Infection, ischemia, critical-size bone defects or destruction of vessel are possible reasons for delayed or lacked healing of bone defects. The involved soft tissue disruption and failure of repair mechanisms lead also to healing complications. Platelet rich plasma (PRP), prepared from thrombocyte concentrate, can serve as a bioactive source of autologous growth factors and antimicrobial substances. It covers a broad spectrum in various therapeutic approaches. The Nrf2-system protects cells against oxidative stress given by ischamia and tissue destruction during fracture or tendon rupture. Nrf2 binds to the antioxidant response element (ARE) in the promoter region of genes coding for antioxidative enzymes. The role of thrombocytes in the regulation of ARE-activity, expression of Nrf2 and the target genes of Nrf2 in bone and tendon are not investigated so far. Furthermore, there are not sufficient studies dealing with in vivo and in vitro effects of platelet action on musculoskeletal cells. This study demonstrates an antimicrobial activity of PRP against various pathogens using disk-diffusion test. The detection of human beta defensin-2 and -3 (hBD-2 and -3) in platelets is a novel aspect in this dissertation. Both antimicrobial peptides were detected using proteinbiochemical methods like western blot, immuncytochemistry and ELISA. The participation of these peptides in antimicrobial activity of PRP was investigated by standard disk diffusion tests. The detection of osteoinductive proteins like BMP-2 and -4 in biological relevant amounts in plateles may also be important for the healing potential. In addition, the cell proliferation of osteoblast and tenocytes during the treatment with platelet released growth factors (PRGF) was determined by CyQuant and BrdU cell proliferation assay. Cell Titer Blue® cell viability assays showed also an increase of cell viability after addition of PRGF to the cells. More ever PRGF leads to an increase in vascular endothelial growth factor (VEGF) in osteoblast. The result of Dual Luciferase Assay showed that PRGF leads to an up-regulation of ARE in both cells. Additionally, PRGF increased the expression of the Nrf2 target genes encoding for antioxidant proteins like HO-1, TXNRD1 and NQO1 in osteoblasts. In summary PRGF play an important role in defens agains bacterial pathogens. They include the antimicrobial peptides hBD-2 and -3 and have an antimicrobial potential. They contain the osteoinductive proteins BMP-2 and -4 and promote endogenous expression and exogenous supplementation of VEGF. In addition, PRGF boosted the defence of osteoblast and tenocyte against oxidative stress. These results show that platelet concentrate may be beneficial for the healing process of fractures and tendon ruptures. Long-term in vitro experiments and in vivo expriments should be carried out in order to investigate the molecular mechanismus of thrombocyte concentrate on fracture and tendon healing. In the near future we are planning in vivo studies (10674G1) to verify these in vitro effects.

Die Granulomatose mit Polyangiitis (GPA) ist eine multifaktorielle Autoimmunerkrankung. Literaturhinweise deuten auf eine gestörte sinunasale Barriere. Die Untersuchung der Einflussfaktoren einer solchen Störung war das Ziel dieser Arbeit. In der nasalen Mukosa wurden 10 differentiell exprimierte Transkripte identifiziert sowie S. aureus intraepithelial nachgewiesen. Im Überstand nasaler Epithelzellen waren die Konzentrationen von G-CSF erhöht und von IL-8 erniedrigt. Nasale Epithelzellen sekretieren nach S. aureus-Stimulation weniger IL-8 und hBD3. Ergo zeigt sich eine vielschichtige nasale Barrierestörung bei der GPA: Reduzierte IL-8-, hBD3- und Lysozym-Konzentrationen sowie geringere Expression von Mustererkennungs-Rezeptoren ermöglichen eine Veränderung der mikrobiellen Flora der nasalen Mukosa und begünstigen eine Besiedlung mit S. aureus. Die Resultate eröffnen ein besseres Verständnis der komplexen Pathomechanismen der GPA sowie Perspektiven für neue Therapie-Optionen. The granulomatosis with polyangiitis (GPA) is a multifactorial autoimmune disease. Evidence from literature suggests an impaired sinonasal barrier. The study of the factors that influence such interference was the goal of this work. In the nasal mucosa, 10 differentially expressed transcripts were identified and S. aureus was demonstrated intraepithelial. In the supernatant of nasal epithelial cells the concentration of G-CSF was increased while IL-8 was decreased. Nasal epithelial cells secrete after S. aureus stimulation less IL-8 and hBD3. A complex nasal barrier dysfunction in GPA is shown: reduced IL-8, hBD3 and lysozyme concentrations and lower expression of pattern recognition receptors allow a change in the microbial flora of the nasal mucosa and promote colonization with S. aureus. These results allow a better understanding of the complex pathophysiology of the GPA and opens up perspectives for novel therapeutic options.

The aim of the study was to detect the potency of the novel insect antimicrobial peptides Et-AMP1 and Et-AMP2 derived from drone fly Eristalis tenax to engineer disease resistance in the model plant Arabidopsis thaliana against the fungal pathogen grey mold Botrytis cinerea and the bacterial pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000. For the first antimicrobial peptide (Et-AMP1), a protocol for the production of recombinant protein in E. coli expression system was established by inserting the sequence for mature Et-AMP1 peptide in frame downstream of the pEXp5-CT/Topo expression vector. The recombinant protein was evaluated in vitro as to its effects on the devastating phytopathogen Fusarium culmorum by using spore germination inhibition assays. Results of this assay exhibited a weak effect with an inhibition percentage about 10.5% against this plant pathogenic fungus with the maximum concentration of produced recombinant protein (0.9 μM). Both antimicrobial peptides (Et-AMP1 and Et-AMP2) were introduced into Arabidopsis plants via Agrobacterium-mediated transformation. After the production of transgenic Arabidopsis plants, in vitro antifungal assays were carried out by using T3 plants for evaluating their resistance against the fungal pathogens B. cinerea and the bacterial pathogen P. syringae. Our results show that Et-AMP1 transgenic plants did not exhibit resistance against B. cinerea. In contrast, these plants were more resistant to P. syringae, especially lines 5, 3, 7 and 2. On the other hand, the Et-AMP2 transgenic plants were resistant both to B. cinerea and P. syringae. Lines 1, 5 and 4 reduced significantly the necrotic lesion size caused by B. cinerea pathogen. Lines 1, 2 and 5 were more resistant to P. syringae infection. Subsequently, further research is required to identify the potential of Et-AMP1 and Et-AMP2 for plant protection approaches. Diese Studie soll die Potenziale der neuartigen antimikrobiellen Peptide Et-AMP1 und Et- AMP2 von der Mistbiene Eristalis tenax untersuchen, um Resistenz gegen das pilzliche Pathogen Botrytis cinerea (Grauschimmel) und das bakterielle Pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato Stamm DC3000 in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana zu erzeugen. Zuerst wurde für das antimikrobielle Peptid Et-AMP1 ein Protokoll für die Produktion von rekombinanten Protein in dem E. coli Expressionssystem durch Insertion der Et-AMP1-Sequenz in den Expressionsvektor pEXp5-CT/Topo erstellt. Der Effekt dieses rekombinanten Proteins wurde in vitro gegen den phytopathogenen Pilz Fusarium culmorum in einem Sporenkeimungs-Hemmungstest evaluiert. Die Ergebnisse dieses Tests zeigen eine schwache Hemmung (ca 10,5%) der Sporenkeimung durch 0,9 μM dieses Proteins. Arabidopsis-Pflanzen wurden mit den Sequenzen beider antimikrobielle Peptide (Et- AMP1 und Et-AMP2) mittels Agrobacterium tumefaciens transformiert. Danach wurde mit den transgenen Pflanzen (T3-Generation) in vivo-Assays zur Ermittlung ihrer Resistenz gegen das Pilzpathogen B. cinerea und den bakteriellen Erreger P. syringae durchgeführt. Et-AMP1 transgenen Pflanzen zeigten keine erhöhte Resistenz gegen B. cinerea, im Gegensatz dazu wurde eine deutliche Resistenzsteigerung gegen P. syringae vor allem in den transgenen Linien 5, 3, 7 und 2 festgestellt. Die Et-AMP2 transgenen Pflanzen waren resistenter gegen B. cinerea und P. syringae im Vergleich zu den Wildtyp-Pflanzen. Die transgenen Linien 1, 5 und 4 zeigten eine signifikante Verringerung der nekrotischen Läsionen, die von B. cinerea verursacht werden. Die Linien 1, 2 und 5 waren außerdem resistenter gegen P. syringae. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um das Potenzial der Peptide Et-AMP1 und Et- AMP2 für Pflanzenschutzansätze zu ermitteln.

Potatoes are grown on approximately 19 million hectares worldwide. Following maize, rice and wheat potato is the world’s fourth most important crop in terms of production volume. Phytophthora infestans cause huge losses in cultivated potato worldwide. The objective of this work was to generate P. infestans specific single chain antibody fragments (scFv) and genetically fuse them to antifungal peptides (AFP) in order to establish transgenic potato plants that are resistant against P. infestans by expressing the AFP-scFv fusion protein. To generate suitable scFvs two strategies were used. On the one hand spleen cells of mice that have been hyperimmunized with cell wall fragments of P. infestans were fused with myeloma cells. This approach yielded twelve P. infestans specific monoclonal antibodies (mAb). On the other hand scFv libraries constructed from splenic lymphocytes of chicken and mice hyperimmunized with P. infestans cell wall fragments were subjected to phage display panning resulting in the isolation of four scFvs. The mAbs, their corresponding scFvs and the scFvs selected by phage display were analyzed by immunoblot and concerning their reactivity towards P. infestans as well as members of the asco-, basidio- and oomycetes. Immunofluorescence microscopy was applied to localize the antibody-antigen complexes on the pathogen. Focusing on the aim of this thesis scFvPi102.2 derived from mAbPi102.2 was the most promising scFv. Cross reactivity tests revealed that the IgG1 was specific for oomycetes. Both, mAbPi102.2 and scFvPi102.2, demonstrated highest reactivity towards P. infestans in comparison to the other IgG1 antibodies or scFvs. The corresponding epitope could be detected on the surface of sporangia, germ tube and appressoria of the intact pathogen. As mAbPi102.2 had no inhibitory effect on the growth of P. infestans, the scFvPi102.2 was genetically fused to several AFPs. The reactivity of the bacterially in E. coli and transiently in N. tabacum produced AFP-scFv fusion proteins was confirmed by ELISA. Growth inhibition of Phytophthora nicotianae could be observed on tobacco leaves transiently transformed with AFP-scFv fusions. The transgenes D4E1 scFvPi102.2 und GR7 scFvPi102.2 were stably integrated into the genome of the S. tuberosum varieties Gala and Pirol. Leaves of three transgenic potato lines remained 100 % disease free when inoculated with P. infestans in comparison to the completely infected wild type. The results of the present study demonstrate that the development of AFP-scFv fusions and the expression of these fusion proteins in transgenic potato plants is a promising possibility to control P. infestans.

Antimicrobial peptides (AMPs) and mucins are components of the airway secretions and both contribute to the innate host defense system of the lung. Antimicrobial peptides (AMPs) are effector molecules of the innate immune system, which lyse microbial cells by interaction with biomembranes. Besides their direct antimicrobial function, they have multiple roles as mediators of inflammation. The principal families of AMPs expressed in the lung are the defensins and the cathelicidins. One of the prominent physical features of AMPs is their strong positive charge at neutral pH. Mucins are macromolecular molecules with high molecular masses and belong to another class of proteins within the airway secretions. Their heavily glycosylated side chains containing sialic acid and N-acetylgalactosamine-6-sulfate determine the strong negative charge of the molecule. It was the aim of the study to investigate whether the cathelicidin LL-37 interacts with mucins and whether this interaction influences the conformation and antimicrobial activity of the AMP. The binding of mucins to the cathelicidin LL-37 coated to multiwell plates was confirmed using a lectin based assay. Circular dichoismus spectroscopy showed the adoption of an alpha-helical conformation of LL-37 in the presence of mucins. Mucin decreased the antimicrobial activity of LL-37 against Pseudomonas aeruginosa and Streptococcus pneumoniae, tested in antimicrobial assays. To investigate whether LL-37 is bound to mucins in airway secretions from human subjects, spontaneous sputum collected from cystic fibrosis patients were analyzed. Mucin and LL-37 were both measured at high concentrations in samples of patients with cystic fibrosis. The most important finding of the present study is that the AMP LL-37 binds to mucins and that this interaction inhibits the antimicrobial activity of the peptide. A number of pulmonary diseases, as chronic obstructive pulmonary disease (COPD) or cystic fibrosis, for example, are characterized by increased amounts of airway mucus and decreased host defense leading to more susceptibility to pulmonary infections. It is possible that the mechanism described in the present study contributes to the less effective host defense in theese deseases., Der Respirationstrakt steht in engem Kontakt mit seiner Umwelt und potentiellen Pathogenen. Der für die mechanische Reinigung bedeutende mukoziliäre Apparat besteht aus dem Flimmerepithel und viskösen Sekreten, in denen Fremdkörper gebunden und durch Schlag der Zilien in Richtung Oropharynx transportiert werden. Der makromolekulare Hauptbestandteil des Mukus der Atemwege sind Muzine, hochmolekulare, anionische Proteine mit stark glykosylierten Seitenketten, die aufgrund ihrer Ladung und komplexen Struktur leicht verschiedene Substanzen binden können. Bei der lokalen Immunabwehr des Respirationstrakts spielen antimikrobielle Peptide (AMPs) eine wichtige Rolle. AMPs sind niedermolekulare, kationische Oligo- bis Polypeptide, die über ihre Interaktion mit Biomembranen die Lyse eines breiten Spektrums mikrobieller Zellen herbeiführen. Darüber hinaus fungieren sie als Entzündungsmediatoren, Induktoren von Angiogenese und Wundheilung und chemotaktische Faktoren. In den Atemwegen werden zwei Familien von antmikrobiellen Peptiden exprimiert: Die Defensine und die Cathelizidine. Das humane Cathelizidin LL-37/hCAP-18 liegt in seiner biologisch aktiven Form in einer alpha-helikalen Konformation vor, abhängig von seiner Konzentration sowie pH und Salzgehalt des Puffers. Bei neutralem pH ist es stark positiv geladen. Das Ziel dieser Arbeit war, die Interaktion des kationischen Cathelizidins LL-37 mit hochmolekularem anionischen Muzin sowie deren Auswirkungen auf die Sekundärstruktur und die antimikrobielle Funktion des Peptids zu untersuchen. Da beide Proteine in den die Bronchialschleimhaut bedeckenden Flüssigkeiten vorkommen und gegensätzlich geladen sind, ist eine elektrostatische Wechselwirkung zwischen ihnen anzunehmen. Mit einem Enzym-linked Lektinsorbent Assay (ELLA) und nativer Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) konnte die elektrostatische Bindung von LL-37 an Muzin nachgewiesen werden. Der Einfluss von Muzin auf die Sekundärstruktur von LL-37 wurde mittels Zirkulardichroismus-Messungen analysiert. Hier zeigte sich, dass die Anwesenheit von Muzin eine alpha-helikale Konformation des Peptids induziert. Anschließend wurden antimikrobielle Assays gegen Pseudomonas aeruginosa und Streptococcus pneumoniae durchgeführt, um die antimikrobielle Aktivität des Peptids in Gegenwart von Muzin zu untersuchen. Hierbei zeigte sich eine signifikante Inhibition der antimikrobiellen Aktivität von LL-37 in Abhängigkeit der Konzentrationen des Glykoproteins. In Sputumproben von Patienten mit Zystischer Fibrose lagen stark erhöhte Konzentrationen sowohl von LL-37 als auch von Muzinen vor, was darauf hindeuted, dass LL-37 auch in vivo an muzinhaltige Atemwegsflüssigkeiten gebunden vorliegt. Bei der Abwehr der Atemwege handelt es sich um ein komplexes, feinreguliertes System, zu dessen Funktionsfähigkeit das Verhältnis der einzelnen Komponenten zueinander von entscheidender Bedeutung ist. So wirkt sich ein Ungleichgewicht von antimikrobiellen Peptiden und Muzinen in den Atemwegssekreten mit Überwiegen der Muzine nachteilig auf die antimikrobielle Aktivität der AMPs aus. Vermutlich werden durch elektrostatische Kräfte die relevanten kationischen Gruppen des AMPs an das Muzin gebunden und stehen damit nicht mehr für die Interaktion mit Mikroorganismen zur Verfügung. Klinische Relevanz hat die Interaktion von LL-37 und Muzinen dann, wenn das Gleichgewicht dieser beiden Proteine in den Atemwegsflüssgkeiten - z.B. zu Gunsten der Muzine - verschoben ist. Dies ist der Fall bei entzündlichen und chronischen Erkrankungen der Atemwege, die mit einer gestörten mukoziliäre Clearance einhergehen, wie die COPD oder die Zystischen Fibrose. Gleichzeitig liegt bei diesen Erkrankungen eine erhöhte Anfälligkeit gegenüber respiratorischen Infekten vor. Das gestörte Verhältnis von AMPs und Muzinen könnte die Prädisposition gegenüber Infektionen der Atemwege begünstigen.

Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion der antimikrobiellen Peptide LL-37/hCAP18 und CRAMP während einer bakteriellen Infektion der Lunge zu untersuchen. Zunächst wurde festgestellt, dass CRAMP, genauso wie LL-37/hCAP18, bei einer Infektion des Respirationstrakts von Mäusen in erhöhten Konzentrationen im Atemwegssekret vorliegt. Die Expression von CRAMP konnte in Epithelzellen, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten nachgewiesen werden. Um die antimikrobielle Aktivität von CRAMP in vivo nachzuweisen, wurden Mäuse, bei denen das Gen für CRAMP zerstört ist (KO), infiziert und der Verlauf der Infektion mit Wildtyp (WT) Tieren verglichen. Es konnte allerdings kein Unterschied in der Klärung einer akuten bakteriellen Infektion der Lunge nachgewiesen werden. Deswegen wurden als nächstes die immunmodulatorischen Funktionen von LL-37 und CRAMP untersucht. Es zeigte sich, dass LL-37 und CRAMP die Zytokinabgabe von neutrophilen Granulozyten, Makrophagen und Dendritischen Zellen durch LPS hemmt. Der Einfluss von LL-37 auf die Aktivierung von Dendritischen Zellen wurde daraufhin weiter untersucht. Es zeigte sich, dass LL-37 auch die Aktivierung durch die TLR2 und TLR5 Liganden, LTA und Flagellin, nicht jedoch die durch Zytokine hervorgerufene Aktivierung hemmt. Dendritische Zellen wurden in ihrer Zytokinabgabe, Expression von costimulatorischen Molekülen und ihrer Fähigkeit naive T-Zellen zu aktivieren gehemmt. Um die Bedeutung dieser Funktionen in vivo nachzuweisen, wurden CRAMP KO und WT Mäuse in zwei Sepsismodellen verglichen. In beiden Modellen hatten CRAMP KO Mäuse eine erhöhte Letalität. Bei einem chronischen P. aeruginosa Infektionsmodell der Lunge zeigte sich jedoch ein überraschender Phänotyp der CRAMP KO Mäuse: Sie waren in der Lage die Bakterien schneller aus ihren Lungen zu klären als WT Mäuse. Um dies zu erklären, wurden neutrophile Granulozyten und Makrophagen aus WT und CRAMP KO Mäusen isoliert und auf ihre Aktivierbarkeit durch LPS untersucht, wobei jedoch kein Unterschied festgestellt werden konnte. Die beobachteten Effekte stammen daher von dem bei einer Infektion abgegebenem CRAMP, das Immunzellen hemmt, um so die Gefahr einer Sepsis zu minimieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die Cathelizidine LL-37/hCAP18 und CRAMP weit reichende immunmodulatorische Funktionen besitzen und bei einer bakteriellen Infektion nicht auf ihre antimikrobielle Funktion beschränkt sind. Die durchgeführten Infektionsversuche legen sogar nahe, dass die antimikrobielle Aktivität von CRAMP bei Klärung einer bakteriellen Infektion der Lunge keine wesentliche Rolle spielt. Dagegen konnte die immunmodulatorische Funktion von CRAMP bei Sepsis und chronischer Lungeninfektion in vivo nachgewiesen werden., This dissertation comprises different aspects of acute and chronic bacterial infection of the lung with special interest in innate immunity and the role of antimicrobial peptides. In the in vitro part, the influence of the antimicrobial peptides LL-37 and CRAMP on the activation of different immune cells isolated from mouse and human by TLR ligands were analyzed. It was found that LL-37 and CRAMP inhibit the activation of macrophages, neutrophils and dendritic cells by TLR2, 4 and 5 ligands. In addition, CRAMP knockout mice were analyzed in a pulmonary infection model with Pseudomonas aeruginosa. By comparing different parameters of inflammation between KO and WT mice, it was found that CRAMP KO mice possess a surprising advantage in combating a bacterial infection of the lung. The results show that CRAMP, known as antimicrobial peptide, also functions as a negative regulator of inflammation.

Die COPD gilt bezüglich Klinik und Epidemiologie als die bedeutendste und gravierendste Langzeitkomplikation eines langjährigen Nikotinabusus. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob diese Entzündung bereits bei jungen, klinisch noch gesunden Rauchern zu finden ist. Hierzu wurden Nichtraucher als gesunde Kontrollen rekrutiert und mit einer Stichprobe von gesunden Rauchern bezüglich des Diffentialzellbildes, mehrerer Zytokine sowie des antimikrobiellen Peptids LL-37 verglichen, COPD is a severe illness concerning airways. We tried to find out whether inflammation already exists in the airways of young healthy smokers and compared the results with those of young healthy non-smokers.

Obwohl Epithelien der Atemwege, des Verdauungstraktes und der Haut sind mit einer Flora aus apathogenen und fakultativ pathogenen Mikroorganismen besiedelt sind, kommt es nur selten zu Infektionen. Die Epithelzellen der Haut können antimikrobielle Peptide und proinflammatorische Zytokine produzieren, deren Synthese über Rezeptoren induziert wird, die in der Lage sind mikrobielle Faktoren zu erkennen. Extrazelluläre Proteasen mikrobieller Herkunft sind Faktoren, die von Epithelzellen erkannt werden, da diese Protease-aktivierbare Rezeptoren (PARs) exprimieren. Anhand der Induktion des Ca2+-Influxes und der Stimulation der mRNA-Expression von proinflammatorischen Zytokinen und antimikrobiellen Peptiden konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Keratinozyten von verschiedenen mikrobiellen Proteasen aktiviert werden. Die Proteasen Pseudolysin (LasB) und Protease IV von Pseudomonas aeruginosa induzieren die mRNA-Expression proinflammatorischer Zytokine und antimikrobieller Peptide in Epithelzellen.

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0\. TITELBLATT UND INHALTSVERZEICHNIS 1\. EINLEITUNG 3 1.1. TRADITIONELLE ANTIBIOTIKA & ANTIBIOTIKARESISTENZ 3 1.2. ANTIMIKROBIELLE PEPTIDE: ENTDECKUNG & VORKOMMEN 4 1.3. KLASSIFIZIERUNG DER ANTIMIKROBIELLEN PEPTIDE 7 1.4. WIRKMECHANISMEN ANTIMIKROBIELLER PEPTIDE 8 1.5. FRAGE- UND ZIELSTELLUNG DER ARBEIT 14 2\. ERGEBNISSE 17 2.1. SYNTHESE & CHARAKTERISIERUNG DER HEXAPEPTIDE 17 2.2. BIOLOGISCHE AKTIVITÄTEN 19 2.3. CD-SPEKTROSKOPIE 22 2.4. HYDROPHOBIZITÄTSPARAMETER 25 2.5. FARBSTOFFFREISETZUNG AUS VESIKELN 29 2.6. BINDUNG AN LIPID A 32 2.7. ZELLPERMEABILISIERUNG VON ESCHERICHIA COLI-ZELLEN 34 3\. MATERIAL & METHODEN 39 3.1. MATERIALIEN 39 3.2. PEPTIDSYNTHESE & CHARAKTERISIERUNG 39 3.3. BIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 41 3.3.1. ANTIMIKROBIELLE AKTIVITÄT 41 3.3.2. ZELLPERMEABILISIERUNGSVERSUCH 42 3.3.3. HÄMOLYTISCHER TEST 42 3.4. BIOPHYSIKALISCHE UNTERSUCHUNGEN 43 3.4.1. CIRCULARDICHROISMUS MESSUNGEN 43 3.4.2. BINDUNGSUNTERSUCHUNGEN 43 3.4.3. FARBSTOFFFREISETZUNGSVERSUCHE 44 4\. DISKUSSION & EPILOG 46 4.1. DISKUSSION 46 4.2. EPILOG 54 5\. LITERATURVERZEICHNIS 56 6\. ANHANG 67 6.1. LISTE DER VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN 67 6.2. AMINOSÄUREN / ÜBERSICHT 68 6.3. LIPID- / CHOLESTERINSTRUKTUREN 69 6.4. CHEMISCHE STRUKTUR VON EINEM LIPOPOLYSACCHARID 70 6.5. ZUSAMMENFASSUNG / SUMMARY 71 6.5.1. ZUSAMMENFASSUNG 71 6.5.2. SUMMARY 71 6.6. PUBLIKATIONEN 73 6.6.1. ARTIKEL 73 6.6.2. SYMPOSIUMSBEITRÄGE 73 6.7. CURRICULUM VITAE 74 6.8. DANKSAGUNG 76 6.9. EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG 77, Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit Struktur-Wirkungsbeziehungen von R-/W-reichen antimikrobiellen Hexapeptiden, welche von der Sequenz RRWWRF abgeleitet waren. Studien an Gram-positiven und �negativen Bakterien haben gezeigt, dass die cyclischen Analoga im Vergleich zu den linearen Peptiden eine hohe antimikrobielle Aktivität besaßen bei gleichzeitiger moderater Lyse der Erythrocyten. Farbstofffreisetzungsversuche aus Liposomen, welche die Lipidkomposition der Cytoplasmamembran der jeweiligen Zellspezies repräsentierten, zeigten, dass die Peptide in der Lage waren, neutrale und stark negativ geladene Lipiddoppelschichten zu permeabilisieren. Diese Befunde korrelierten mit den Ergebnissen aus den biologischen und biophysikalischen Untersuchungen, und es konnte geschlussfolgert werden, dass die antimikrobiellen Aktivitäten gegen Bacillus subtilis und die Hämolyse aufgrund von Peptid-Membraninteraktionen zu Stande kamen. Obwohl eine hohe Aktivität gegen Gram-negative Bakterien beobachtet werden konnte, zeigten Permeabilisierungsstudien an entsprechenden Liposomen keine Lyse durch die Peptide. Ergebnisse der Permeabilisierungsstudien in vivo ließen erkennen, dass es zu einer Permeabilisierung der äußeren und nur in sehr geringem Umfang der inneren Membran kommt. Alle Ergebnisse zusammengenommen zeigten deutlich, dass die antimikrobielle Aktivität der untersuchten Peptide Strukturdeterminanten folgt. Dabei ist die Ausbildung einer amphipathischen Struktur, wie sie durch NMR-Messungen bestätigt wurde, essentiell für die antimikrobielle Wirkung., In the present thesis the structure-function relationships of R-/W-rich antimicrobial hexapeptides that were derived from the lead sequence RRWWRF were investigated. Studies revealed that cyclic analogues were more active against Gram-positive and Gram-negative bacteria than the corresponding linear analogues, but displayed at the same time only moderate haemolytic activity. Dye release experiments with liposomes representing the phospholipid composition of the target bilayer of each cell species demonstrated permeabilizing activity of the hexapeptides towards neutral and highly negatively charged phospholipid bilayers. From the correlations with the data from the biological and biophysical experiments it is concluded that the observed antimicrobial activity against Bacillus subtilis and the haemolytic effect are based on peptide membrane interactions. Even though very high antimicrobial activity against Gram-negative cells was observed, no permeabilization of the corresponding liposomes by the peptides could be demonstrated. Permeability studies in vivo showed strong permeabilization of the outer and only weak permeabilization of the inner membrane. Taken together the studies indicate that antimicrobial activity is strongly determined by peptide structure. Furthermore, the formation of an amphipathic structure, as revealed by NMR-studies, is essential for the antimicrobial acticity of the hexapeptide analogues.

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