Amphipathische Hexapeptide - Interaktion mit Membranen

0\. TITELBLATT UND INHALTSVERZEICHNIS 1\. EINLEITUNG 3 1.1. TRADITIONELLE ANTIBIOTIKA & ANTIBIOTIKARESISTENZ 3 1.2. ANTIMIKROBIELLE PEPTIDE: ENTDECKUNG & VORKOMMEN 4 1.3. KLASSIFIZIERUNG DER ANTIMIKROBIELLEN PEPTIDE 7 1.4. WIRKMECHANISMEN ANTIMIKROBIELLER PEPTIDE 8 1.5. FRAGE- UND ZIELSTELLUNG DER ARBEIT 14 2\. ERGEBNISSE 17 2.1. SYNTHESE & CHARAKTERISIERUNG DER HEXAPEPTIDE 17 2.2. BIOLOGISCHE AKTIVITÄTEN 19 2.3. CD-SPEKTROSKOPIE 22 2.4. HYDROPHOBIZITÄTSPARAMETER 25 2.5. FARBSTOFFFREISETZUNG AUS VESIKELN 29 2.6. BINDUNG AN LIPID A 32 2.7. ZELLPERMEABILISIERUNG VON ESCHERICHIA COLI-ZELLEN 34 3\. MATERIAL & METHODEN 39 3.1. MATERIALIEN 39 3.2. PEPTIDSYNTHESE & CHARAKTERISIERUNG 39 3.3. BIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 41 3.3.1. ANTIMIKROBIELLE AKTIVITÄT 41 3.3.2. ZELLPERMEABILISIERUNGSVERSUCH 42 3.3.3. HÄMOLYTISCHER TEST 42 3.4. BIOPHYSIKALISCHE UNTERSUCHUNGEN 43 3.4.1. CIRCULARDICHROISMUS MESSUNGEN 43 3.4.2. BINDUNGSUNTERSUCHUNGEN 43 3.4.3. FARBSTOFFFREISETZUNGSVERSUCHE 44 4\. DISKUSSION & EPILOG 46 4.1. DISKUSSION 46 4.2. EPILOG 54 5\. LITERATURVERZEICHNIS 56 6\. ANHANG 67 6.1. LISTE DER VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN 67 6.2. AMINOSÄUREN / ÜBERSICHT 68 6.3. LIPID- / CHOLESTERINSTRUKTUREN 69 6.4. CHEMISCHE STRUKTUR VON EINEM LIPOPOLYSACCHARID 70 6.5. ZUSAMMENFASSUNG / SUMMARY 71 6.5.1. ZUSAMMENFASSUNG 71 6.5.2. SUMMARY 71 6.6. PUBLIKATIONEN 73 6.6.1. ARTIKEL 73 6.6.2. SYMPOSIUMSBEITRÄGE 73 6.7. CURRICULUM VITAE 74 6.8. DANKSAGUNG 76 6.9. EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG 77
Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit Struktur-Wirkungsbeziehungen von R-/W-reichen antimikrobiellen Hexapeptiden, welche von der Sequenz RRWWRF abgeleitet waren. Studien an Gram-positiven und �negativen Bakterien haben gezeigt, dass die cyclischen Analoga im Vergleich zu den linearen Peptiden eine hohe antimikrobielle Aktivität besaßen bei gleichzeitiger moderater Lyse der Erythrocyten. Farbstofffreisetzungsversuche aus Liposomen, welche die Lipidkomposition der Cytoplasmamembran der jeweiligen Zellspezies repräsentierten, zeigten, dass die Peptide in der Lage waren, neutrale und stark negativ geladene Lipiddoppelschichten zu permeabilisieren. Diese Befunde korrelierten mit den Ergebnissen aus den biologischen und biophysikalischen Untersuchungen, und es konnte geschlussfolgert werden, dass die antimikrobiellen Aktivitäten gegen Bacillus subtilis und die Hämolyse aufgrund von Peptid-Membraninteraktionen zu Stande kamen. Obwohl eine hohe Aktivität gegen Gram-negative Bakterien beobachtet werden konnte, zeigten Permeabilisierungsstudien an entsprechenden Liposomen keine Lyse durch die Peptide. Ergebnisse der Permeabilisierungsstudien in vivo ließen erkennen, dass es zu einer Permeabilisierung der äußeren und nur in sehr geringem Umfang der inneren Membran kommt. Alle Ergebnisse zusammengenommen zeigten deutlich, dass die antimikrobielle Aktivität der untersuchten Peptide Strukturdeterminanten folgt. Dabei ist die Ausbildung einer amphipathischen Struktur, wie sie durch NMR-Messungen bestätigt wurde, essentiell für die antimikrobielle Wirkung.
In the present thesis the structure-function relationships of R-/W-rich antimicrobial hexapeptides that were derived from the lead sequence RRWWRF were investigated. Studies revealed that cyclic analogues were more active against Gram-positive and Gram-negative bacteria than the corresponding linear analogues, but displayed at the same time only moderate haemolytic activity. Dye release experiments with liposomes representing the phospholipid composition of the target bilayer of each cell species demonstrated permeabilizing activity of the hexapeptides towards neutral and highly negatively charged phospholipid bilayers. From the correlations with the data from the biological and biophysical experiments it is concluded that the observed antimicrobial activity against Bacillus subtilis and the haemolytic effect are based on peptide membrane interactions. Even though very high antimicrobial activity against Gram-negative cells was observed, no permeabilization of the corresponding liposomes by the peptides could be demonstrated. Permeability studies in vivo showed strong permeabilization of the outer and only weak permeabilization of the inner membrane. Taken together the studies indicate that antimicrobial activity is strongly determined by peptide structure. Furthermore, the formation of an amphipathic structure, as revealed by NMR-studies, is essential for the antimicrobial acticity of the hexapeptide analogues.