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Der Verlust an Myokardgewebe nach einem Herzinfarkt kann schwerwiegende Komplikationen wie Arrhythmien und Herzinsuffizienz zur Folge haben. Besonders Letztere stellt aufgrund ihrer hohen Morbidität und Mortalität nach wie vor ein großes Problem für die Patientenversorgung dar. Im Gegensatz zum Menschen kann der Zebrafisch verlorengegangene Kardiomyozyten durch endogene Proliferationsmechanismen wiederherstellen. Der Transkriptionsfaktor T-box transcription factor 20 (Tbx20) spielt dabei eine wichtige Rolle bei der Kontrolle dieser Prozesse. Seine genauen Funktionen und nachgeschalteten Signalwege sind allerdings noch nicht ausreichend verstanden, um daraus neue Therapieansätze erforschen und ableiten zu können. Ziel dieses Projektes war daher die Aufklärung der von Tbx20 bei der Kardiomyozytenproliferation regulierten Signalkaskaden. Dazu wurde im ersten Teil der Arbeit eine induzierbare transgene Tbx20-Überexpressions-Zebrafischlinie mithilfe des konstruierten Vektors Tol2pA2-ON-tbx20 generiert. Dieser besteht aus einem Tol2- sowie TetOn-System, wobei Letzteres unter der Kontrolle eines cardiac myosin light chain 2 (cmlc2)-Promotors steht. Mittels Zugabe des Antibiotikums Doxycyclin kann so ein weiterer bidirektionaler Promotor ausschließlich herzspezifisch aktiviert werden. Infolgedessen werden sowohl die Sequenz von tbx20 als auch die des fluoreszierenden Proteins green fluorescent protein (GFP) abgelesen. Unter Fluoreszenzmikroskopie zeigten sich nach Injektion des Vektors lediglich bei induzierten Embryonen GFP-Signale und damit eine erhöhte tbx20-Expression im Herzen. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)-Analysen mit 72 hours post fertilization (hpf) alten Embryonen registrierten ebenso eine verstärkte Expression. Diese ersten Analysen deuteten somit auf eine gute Funktionalität des Systems hin. Mithilfe des Tol2-Systems konnte anschließend das Konstrukt effektiver in die Keimbahn integriert und so eine Fischlinie bis zur F2-Generation aufgezogen werden. Parallel erfolgten erste Untersuchungen an den Embryonen, da bereits bei einem Teil Veränderungen am Herzen nach Induktion detektiert wurden. Die charakteristische S-Form des Herzens sowie der Klappenapparat waren hierbei stark beeinträchtigt, ebenso zeigte sich der Vorhof massiv dilatiert. Das fractional shortening (FS) war zugleich erhöht. Die Auffälligkeiten könnten mit einer verstärkten Tbx20-Expression erklärt werden, zumal auch diese ähnlich zu einem Knockout die Kardiogenese stören kann. Im zweiten Teil erfolgte die Identifikation von transkriptionell regulierten Genen in der Tbx20-defizienten Fischlinie weiches herz (whz) mittels Ribonukleinsäure-Sequenzierungs (RNASeq)- und qPCR-Analysen. Dabei wurde ankyrin repeat domain 1b (ankrd1b) genauer untersucht, da dieses in den whz-Mutanten signifikant herunterreguliert war. Das Gen ist Teil der muscle ankyrin repeat protein (MARP)-Familie und stellt einen entscheidenden Faktor in der Organisation der Sarkomerstruktur von Muskelzellen, aber auch in der Kardio- sowie Pathogenese von Herzerkrankungen dar. Ein Morpholino-vermittelter Knockdown in Wildtypen zeigte zudem ähnliche phänotypische Veränderungen wie die Tbx20-Mutante weiches herz. Interessanterweise wurden dagegen bei einer herzspezifischen Überexpression von Tbx20 mithilfe Tol2pA2-ON-tbx20 ebenso verminderte messenger Ribo-nukleinsäure (mRNA)-Level von ankrd1b beobachtet. Dazu ist bekannt, dass Tbx20 nicht nur bei einem Knockout, sondern auch bei einer Überexpression vergleichbare phänotypische Veränderungen hervorruft. Ferner interagieren laut Literatur beide Gene mit ähnlichen Transkriptionsfaktoren und Signalkaskaden, was auf eine Regulation von ankrd1b durch Tbx20 hindeuten könnte. Zusammenfassend wurde im Rahmen der vorliegenden Dissertation eine neue Tbx20-Überexpressions-Fischlinie generiert, die zahlreiche Anwendungen für zukünftige Experimente eröffnet. Erste Untersuchungen zeigten auf, dass die Aktivität von Tbx20 während der Kardiogenese streng reguliert sein muss. Daneben konnte ankrd1b als mögliches differentiell reguliertes Gen identifiziert werden. Seine nach-folgenden Analysen deuteten dabei auf eine wichtige Rolle sowohl während des embryonalen Herzwachstums als auch in den Tbx20 kontrollierten Signalwegen hin.

Kardiomyopathie ist ein Sammelbegriff für eine heterogene Gruppe an Herzmuskelerkrankungen, die mit einer elektrischen und/oder mechanischen Dysfunktion einhergehen. Es sind multiple Ätiologien und Pathomechanismen bekannt, wobei genetische Ursachen eine zentrale Rolle spielen. Die beiden häufigsten Formen stellen die Dilatative Kardiomyopathie (DCM) und die Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) dar. In beiden Fällen können Mutationen in Genen, die für bedeutende Bestandteile der Herzmuskelzellen codieren, ursächlich für die Erkrankung sein. Eine dieser Komponenten ist das Protein Nexilin. Bei Patienten mit DCM oder HCM wurden Mutationen in dem codierenden Gen NEXN identifiziert. Auch experimentelle Versuche am Zebrafisch zeigten die Entwicklung eines DCM-ähnlichen Phänotyps durch einen Nexilin-Knockdown. Als Grundlage für eine weitere Erforschung des Proteins Nexilin wurde im Rahmen dieser Arbeit eine stabile Nexilin-Knockout-Zebrafischlinie generiert. Unter Anwendung des von Bakterien abgeleiteten Genmodifikationssystem CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR-associated protein 9) konnten erfolgreich Mutationen im für Nexilin codierenden Gen induziert werden. Diese Mutationen führten über eine Leserahmenverschiebung zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation vermutlich mit Degradierung des fehlerhaften Proteins, was in einem verminderten beziehungsweise aufgehobenen Nachweis von Nexilin im Western Blot sichtbar wurde. Trotz dieses Mangels an Nexilin zeigten die betroffenen Fische keine morphologischen oder funktionellen Auffälligkeiten im Vergleich zu Wildtypfischen wie sie bei den Knockdown-Versuchen zuvor beobachtet worden waren. Diese Diskrepanz zwischen einem pathologischen Phänotyp eines Knockdown-Fisches und einem unauffälligen oder anderen Phänotyp des entsprechenden Knockout-Fisches wird auch von anderen Arbeitsgruppen für verschiedenste Gene beschrieben. Mehrere Erklärungsansätze sind dabei in Betracht zu ziehen. Als aktuell wahrscheinlichste Ursache für den fehlenden Phänotyp der hier generierten Nexilin-defizienten Fische ist die Aktivierung genetischer Kompensationsmechanismen anzusehen. So kann durch einen Gen-Knockout die Expression anderer Gene kompensatorisch angepasst werden. Diesbezüglich sind nun weitere Untersuchungen wie die Analyse des gesamten Proteoms der Knockout-Fische nötig. Dennoch sollte auch die Spezifität der Morpholinos für die Knockdown-Versuche durch Anwendung in der neuen Knockout-Linie überprüft werden, um Off-Target-Effekte als Ursache des beobachteten DCM-Phänotyps auszuschließen. Die Generierung einer weiteren Zebrafischlinie, einer transgenen Nexilin-Linie, scheiterte. Mit Hilfe eines Multisite-Vektors sollte die Expression eines Nexilin-GFP-Fusionsproteins induziert werden. Da die Eizellen lediglich eine geringe Toleranz gegenüber der Konzentration der Injektionslösung zeigten, ergibt sich der Verdacht auf eine toxische Wirkung des Vektors oder durch eine erhöhte Nexilin-Konzentration, wobei bereits zuvor eine Störung der myokardialen Differenzierung durch Nexilin-Überexpression beschrieben worden ist. Zur weiteren funktionellen Charakterisierung von Nexilin wurde ein Fokus dieser Arbeit auf die Validierung bekannter und die Ermittlung unbekannter Interaktionspartner von Nexilin mit Hilfe eines Zellkultursystems gelegt. Dabei konnte die Interaktion zwischen Nexilin und Aktin bestätigt und die Vermutung einer stabilisierenden Funktion von Nexilin auf das Aktinzytoskelett gestellt werden. Nach Behandlung mit Cytochalasin D, einer hemmenden Substanz der Aktinpolymerisation, wiesen Nexilin-transfizierte Zellen im Gegensatz zu nicht-Nexilin-transfizierten Zellen ein weitgehend erhaltenes Aktinzytoskelett auf. Zudem lieferten ein extern durchgeführter Yeast-two-Hybrid-Screen sowie eine Koimmunpräzipitation Hinweise, dass die Proteine Glomulin und CTNNBL1 (Catenin beta like protein 1) mögliche unbekannte Interaktionspartner von Nexilin darstellen. Diesbezüglich sind weitere Schritte zur Verifikation und zur Ermittlung der tatsächlichen biologischen Relevanz erforderlich. Die gewonnen Erkenntnisse und Hypothesen stellen eine Basis für eine weitere Charakterisierung von Nexilin dar, was letztlich zum weiteren Verständnis über die Pathomechanismen von Kardiomyopathien beitragen kann.

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021; Aachen : RWTH Aachen University 1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme (2021). = Dissertation, RWTH Aachen University, 2021, The examination and identification of hormone active substances has great economical and also political relevance. Chemicals, plant protection products and biocides identified as so-called endocrinedisruptors (ED) are produced in great amounts and released to the environment. Following EU authorization processes they are handled under hazard based assessment. Moreover, pharmaceutical hormones for human or veterinary use can interact directly with the hormone system at very low concentrations. By wastewater and surface run-off the ED substances can enter the aquatic environment and thus can be a threat for fish populations. The aim of this work was to examine different biological parameters characterizing an endocrine active impact on the sexual endocrine system of zebrafish following an exposure to ED substances. The first part of this thesis aimed to analyse the sensitivity of indicative parameters, i.e. biomarkers, with focus on receptor mediated and enzyme modulated mechanisms. Effect concentrations of both indicative and population relevant endpoints derived from short term and long term studies, respectively, were compared. The data obtained was used to close data gaps for less studied endocrine modes of action. In a next step, the use of these results within a tiered testing approach to identify hormone active substances in fish was discussed. The results were considered within a proposal for a new testing guideline within the OECD framework to analyse the endocrine impacts in an extended one generation reproduction test using zebrafish(Danio rerio) as test species. The proposed test design considers an existing test protocol with Japanese medaka (Oryzias latipes) and is intended to be placed in the OECD guideline developing program. The aim of the second part of this thesis was to assess the effect of a pulsed exposure to an EDsubstance. An important aspect of endocrine modes of action can be the distance between exposure to an ED substance and the final manifestation of an effect. Two fish life cycle tests were performed. A first study under continuous exposure aimed to get information on the intrinsic toxicity while in a second study a static approach was performed to deliver information on effects after a very short (pulsed) exposure. By comparison of continuous and pulsed application, exposure related effect thresholds and sensitive windows of exposure were identified. Based on the studies described in this thesis, but furthermore using historical data from Fraunhofer IME and literature data, the most relevant and sensitive windows of exposure and effect manifestation were identified and ranked according to their population relevance. The effect concentrations obtained for the lipoprotein vitellogenin and the sex steroide 11-ketotestosterone in blood plasma were in good compliance with effect levels derived for population relevant parameters. Within a tiered testing approach to identify an impact of endocrine active compounds in fish, the significance and value of biomarker responses could be confirmed. Apical endpoints were identified considering their relevance for fish populations. These are life stage specific survival rates, generation time, reproduction capacity and finally sex ratio. Considering the time until an effect becomes evident after a pulsed exposure to an ED compound, the parameters could moreover be ranked. Life stage specific mortalities can occur already shortly after a single exposure pulse. Sub-lethal effects can become evident in a delay of growth. If this delay is lasting it will finally prolong the time until maturation and can delay the total generation time. More sustainable are impacts on reproduction capacity as survival of population essentially depends on it. If the exposure results in an alteration and significant shift of sex ratio in a fish group, the final impact is irreversible and means most and sustainable adverse consequences for the affected fish population. To find an appropriate test strategy for identification of an ED substance affective to fish populations, it has to be considered that depending on the mode of action there can be a gap between the sensitive time period where exposure occurs and the time point an effect becomes evident. For most of the modes of action assessed, an exposure of the sexual development induced effects with relevance for fish population. This refers to Estrogen receptor (ER) ���agonists and ���antagonists, to Androgen receptor (AR) ���agonists and finally to Aromatase inhibitors. For AR ���antagonists and inhibitors of the basic steroid synthesis, not enough data was available to identify the sensitive exposure window. Effects with population relevance were found in terms of a reduction of reproduction capability (ER -agonists and ���antagonists, AR-antagonists, Inhibitors of basic steroid synthesis), or became evidentby a shift in sex ratio (ER ���antagonists, AR ���agonists and aromatase inhibitors). A delay in development in terms of reduced growth and a delay of the time to first spawning were observed for ER ���agonists. The indicative parameters vitellogenin and 11-keto testosterone showed corresponding sensitivity compared to the affected sensitive population relevant endpoints for most of the mode of actions assessed. However, for AR ���agonists the vitellogenin response was less sensitive by several concentration steps, i.e. one order of magnitude, compared to the most sensitive apical endpoint. For the AR -Antagonist, the steroide 11-keto testosterone was more sensitive than vitellogenin. To find an appropriate definite test to identify an ED substance with impact on fish populations, the sensitivity of the different parameters has to be considered. Fish life cycle tests (FLCT) are able to record all population relevant and indicative parameters. However, these studies are cost and time consuming. If the available data pool already allows to derive information on endpoint sensitivity for a test substance, the test strategy can be adapted. If it can be expected that e.g. sex ratio will be affected, a more focussed test can be sufficient, e.g. a fish sexual development test (FSDT).For the future assessment of hazard or risk of ED substances to the environment it will be necessary to derive mechanistic data to find explanation for the effect observed. Beside the well known and described ED modes of action (i.e. enzyme and receptor interactions), the challenge will be to interpret the recorded effects for new substance classes as there are often related to different steps of steroid synthestis. Tailored test methods have to be developed and has to be integrated in the current assessment strategies for EDs., Published by RWTH Aachen University, Aachen

Das Krankheitsbild Diabetes Mellitus gewann in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung und die Zahl der Erkrankten steigt stetig. Infolgedessen gewinnt auch die Forschung an Entstehung und Heilung dieses Krankheitsbildes an Aufmerksamkeit. Insbesondere Zebrafischembryonen, die in frühen Stadien der Entwicklung eine Regeneration zerstörter Insulin-produzierender β-Zellen leisten können, geraten hierbei immer wieder in den Fokus. Zur zuverlässigen Zerstörung von β-Zellen standen Morpholino Oligonukleotide oder eine bestimmten Zebrafischlinie, die die Ablation von β-Zellen durch das Antibiotikum Metronidazol ermöglicht, zur Wahl. Mithilfe der Messung von insulin-positiven Flächen in der in situ-Hybridisierung für insulin bei Zebrafischembryonen wurde gezeigt, dass das Verwenden von Morpholino Oligonukleotiden zwar zur Zerstörung von β-Zellen eingesetzt werden kann, jedoch der Alternative der Zerstörung von β-Zellen mittels der transgenen Fischlinie ins:CFP-NTR und Metronidazol unterliegt. Die Anpassung des vorbekannten Protokolls zur Zerstörung von β-Zellen mithilfe der transgenen Fischlinie ins:CFP-NTR und dem antibakteriellen Medikament Metronidazol war erfolgreich. Mithilfe FACS (fluorescence-activated cell sorting) konnten aus Zebrafischembryonen dieser transgenen Fischlinie β-Zellen für weitere Untersuchungen aussortiert werden. Die vier zur Untersuchung auf die Regenerationsmechanismen der β-Zellen ausgewählten Kandidatengene Cysteine Rich Hydrophobic Domain 1 (chic1), ​​Prodynorphin (pdyn), Sortilin-related VPS10 Domain containing receptor 2 (sorcs2) und R-Spondin 4 (rspo4) zeigten in den in situ-Hybridisierungen in verschiedenen Stadien des Zebrafischembryonen Parallelen zur bisher veröffentlichten Literatur, aber keine Expression im Pankreas. Auch die Untersuchung von Prodynorphin (pdyn) und R-Spondin 4 (rspo4) bei 5 dpf (days post fertilization) alten Zebrafischembryonen nach Regeneration der β-Zellen zeigte keinen Unterschied zu den Kontrollen. Die vier Kandidatengene scheinen also keine wesentliche Rolle bei der β-Zell-Entwicklung und Regeneration im Zebrafischembryo spielen. Mittels der Amplex Red Glukose Messung konnte eine suffiziente Methode zur Messung von Glukose-Spiegeln im Zebrafisch etabliert werden und ein Unterschied bei Embryonen mit ablatierten β-Zellen im Vergleich zu den Kontrollen nachgewiesen werden.

Kardiovaskuläre Erkrankungen, wie die ischämische Herzkrankheit, sind weltweit die führenden Todesursachen. Dadurch stellt die kardiale Forschung auf molekularer Ebene ein höchst interessantes und wichtiges Gebiet für eine mögliche regenerative Medizin dar. So könnten neue kausale Therapien zu einer Regeneration der Herzmuskelzellen nach Myokardinfarkt führen. Die zugrundeliegenden Mechanismen einer möglichen Herzregeneration und die beteiligten Signalwege sind bis jetzt noch nicht völlig geklärt. Das Ziel dieser Arbeit ist es, weitere Einblicke in potenziell relevante Signalwege für Proliferation und Regeneration am Modell des Zebrafischs zu erhalten. Es weisen mehrere Indikatoren auf einen Zusammenhang von spen und kardiovaskulären Erkrankungen hin. Deshalb sollte der Einfluss eines Funktionsverlusts von spen, einem Bestandteil des Notch Signalwegs, auf das Zebrafischherz in dieser Doktorarbeit in in vivo Experimenten untersucht werden. Hierzu wurde mittels Morpholino Injektion ein Knock-down für beide Zebrafisch spen Gene generiert und mutante spen TILLING Linien genutzt. Es folgte die Analyse der Zebrafischembryonen dieser beiden reverse genetics Methoden und die detaillierte Charakterisierung der resultierenden kardialen Phänotypen in Bezug auf Myokardzellzahl und Proliferation. Daneben sollte die Wirkung eines Funktionsverlusts von Spen auf Notch Zielgene untersucht werden.

Die Langerhans Zell Histiozytose ist eine seltene Erkrankung die vor allem Kinder betrifft. Eine Besonderheit ist, dass die Schwere der Krankheit variiert. Es gibt Fälle mit einzelnen Läsionen die von selbst ausheilen, bis zu schweren multisystemischen Fällen die auch trotz Behandlung letal enden. Lange Zeit wurde angenommen, dass die LCH aus Langerhans Zellen entsteht und eine Art Autoimmunerkrankung ist. Moderne Methoden ermöglichten die Entdeckung von Mutationen im MAPK-Signalweg, welche dazu führten die LCH als neoplastische Erkrankung zu klassifizieren. Am häufigsten wurde die Mutation BRAFV600E gefunden, welche auch schon aus anderen Krebserkrankungen bekannt ist. Trotz jahrelanger Forschung ist die Ursprungszelle der LCH bis dato unbekannt. Es wird vermutet das der Zeitpunkt der Mutation entscheidend für die Schwere des Verlaufs der Erkrankung ist. Einige vermuten den Ursprung in einem Abschnitt der Hämatopoese, wobei eine Mutation in früheren Vorläufern, den hämatopoeitschen Stammzellen, zu schweren Verläufen und eine Mutation in späteren ausdifferenzierten Zellen zu wenig gefährlichen Erkrankungen führt. Ziel dieses Experimentes ist die Etablierung eines LCH Modells, um die Ursprungszelle der LCH zu identifizieren, die Krankheit besser zu erforschen und um neue Therapiemöglichkeiten zu finden. Als Modellsystem wird der Zebrafisch (Danio rerio) verwendet, da dieser einige Vorteile gegenüber anderen Versuchstieren bietet und sich als gutes Modellsystem für hämatopoetische Erkrankungen eignet. Hierfür wurde ein BRAFV600E-GFP Expressionsystem kloniert und transgene Zebrafischlinien erstellt die BRAF unter verschiedenen Bedingungen exprimieren. Durch Kreuzversuche kann BRAFV600E so in spezifischen Zellen exprimiert und durch das gekoppelte GFP beobachtet werden. Die Erstellung der Expressionssysteme und der transgenen Zebrafischlinien war erfolgreich. Die zellspezifische Expression des Onkogen BRAFV600E und der Wildtyp Variante in Zebrafischen unter Kontrolle von Gal4, beziehungsweise der Cre-Rekombinase funktioniert und es konnte festgestellt werden, dass die mutierte Variante bei Überexpression einen eindeutigen Phänotyp zeigt, was für ein funktionales humanes BRAF-Protein spricht. Die ersten Kreuzversuche werden zeigen ob die LCH aus den hämatopoetischen Stammzellen entsteht, oder doch aus Vorläufern aus dem Dottersack. Es wird sich ebenfalls zeigen ob der Zebrafisch ein geeignetes Modellsystem für die Langerhans Zell Histiozytose ist und so bei der Entdeckung von neuen Therapiemöglichkeiten von Nutzen sein kann. Langerhans cell histiocytosis is a rare disease that mainly affects children. It is a peculiarity that the severity of the disease varies. There are cases with single lesions that heal on their own and severe multisystemic cases that end fatally despite treatment. For a long time, it was assumed that LCH originates from Langerhans cells and is a kind of autoimmune disease. Modern methods made it possible to discover mutations in the MAPK pathway, which led to the classification of the LCH as a neoplastic disease. The BRAFV600E mutation, which is also known from other types of cancer, was found most frequently. Despite years of research, the origin cell of the LCH is still unknown. It is assumed that the time of the mutation is decisive for the severity of the course of the disease. Some suspect the origin in a section of hematopoiesis, whereby a mutation in earlier precursors, the hematopoietic stem cells, leads to severe courses and a mutation in later differentiated cells leads to less dangerous diseases. The aim of this experiment is to establish an LCH model to identify the cell of origin of the LCH, to better research the disease and to find new therapeutic options. The zebrafish (Danio rerio) is used as the model system because it offers several advantages over other experimental animals and is suitable as a good model system for hematopoietic diseases. For this purpose, a BRAFV600E-GFP expression system was cloned and transgenic zebrafish lines were created which express BRAF under different conditions. Through cross-tests, BRAFV600E can be expressed in specific cells and observed through the coupled GFP. The creation of the expression systems and the transgenic zebrafish lines were successful. The cell-specific expression of the oncogene BRAFV600E and the wild-type variant in zebrafish under the control of Gal4 or the Cre-recombinase works and it was found that the mutant variant shows a clear phenotype in the case of overexpression, which speaks for a functional human BRAF protein. The first cross-tests will become apparent whether the LCH arises from the hematopoietic stem cells or from precursors from the yolk sac. It will also become apparent whether the zebrafish is a suitable model system for Langerhans cell histiocytosis and can thus be useful in discovering new therapeutic options.

Mithilfe von GWA-Studien konnten zwei neue Kandidatengene, OLFML2B und NOS1AP, identifiziert werden, die in einer Assoziation mit Veränderungen des QT-Intervalls stehen. Sowohl ein SQTS als auch ein LQTS geht mit einer Zunahme an kardiovaskulärer Morbidität und Mortalität (SCD und SIDS) einher. Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen eine der häufigsten Todesursachen in der heutigen Zeit dar. Über die Pathologie und den zugrundeliegenden Ursachen von SCD und SIDS ist bisher noch wenig bekannt. Zielsetzung dieser Arbeit war es, die neu entdeckten Kandidatengene OLFML2B und NOS1AP unter dem entwicklungsbiologischen Aspekt des Herzens im Zebrafisch zu untersuchen, um weitere Erkenntnisse über ihre Funktionen zu erhalten. Zunächst soll mittels in situ Hybridisierung die Lokalisation der Genexpression ermittelt werden. Danach sollte ein Morpholino-vermittelter Knock-down der Gene folgen, mit dem Ziel, die entstandene Pathologie hinsichtlich seiner Herzfrequenz und Rhythmus, dem fractional shortening und auf histologischer Ebene zu charakterisieren. Außerdem sollten die im OLFML2B gefundenen Mutationen als mRNA in die befruchtete Eizelle injiziert werden und Auswirkungen der Expression der potentiell pathologischen Variationen auf die Herzentwicklung beschrieben werden.

Die dilatative Kardiomyopathie (DCM) stellt eine schwere kardiale Erkrankung dar und ist die häufigste Ursache einer Herztransplantation im Kindes- und Erwachsenenalter. Währenddessen multiple Faktoren zur Entstehung der DCM beitragen können spielt insbesondere die genetische Prädisposition eine entscheidende Rolle. Mittels Morpholino Oligomer-vermitteltem Gen-knockdown wurde die biologische Funktion des DCM-Kandidatengens spen im Modellorganismus Zebrafisch analysiert. Der Verlust der Funktion des transkriptionellen Regulators spen resultiert im Zebrafisch in der Entstehung eines schweren Herzinsuffizienz- und Arrhythmie-Phänotyps, welcher mit einer verminderten Expression von connexin 43 einhergeht. Interessanterweise phänokopiert der connexin 43-knockdown den spen-Kardiomyopathie Phänotyp. Zusammenfassend lässt sich hieraus die Hypothese ableiten, dass spen im Zebrafisch ein Regulator der Expression von connexin 43 im Herzen und hierdurch von essentieller Bedeutung für eine physiologische kardiale Funktion ist.

Die systematische Identifikation von krankheitsassoziierten Mutationen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen ist wegen ihres klinischen Stellenwertes ein wichtiges Forschungsziel. Der Zebrafisch hat sich hierfür als Modellorganismus etabliert, im Speziellen durch seine Homologie in der Physiologie und den molekularen Signalwegen zum Säugermodell/Menschen. Auf der Suche nach neuen genetischen Ursachen von Herzrhythmusstörungen wird in dieser Arbeit die Zebrafischlinie hiphop (ax18a) in Morphologie, Herzdynamik und Genetik charakterisiert. Die hiphop Linie zeigt ein charakteristisches Arrhythmiesyndrom mit resultierender Herzinsuffizienz bei erhaltener Herzstruktur. Die spezielle Herzrhythmusstörung ist gekennzeichnet durch einen verlangsamten Grundrhythmus (Bradykardie) mit kombinierten Arrhythmievarianten, die in unterschiedlicher Penetranz auftreten. Die Varianten umfassen den Sinusblock, den Atrioventrikularblock und die Bradyarrhythmie und gleichen in ihrem Auftreten dem humanen Sick-Sinus-Syndrom. Die hiphop Mutation wurde in einem ATPase Gencluster auf Chromosom 1 lokalisiert und mittels positioneller Klonierung konnten 5 open reading frames (ORF) identifiziert werden. Das Zielgen wurde durch den Gen-knock-down der jeweiligen ORFs evaluiert, wobei der atp1a1a.1 knock down eine Phänokopie der hiphop Mutation erzielt. Das atp1a1a.1 Gen codiert für die Alphauntereinheit der Natrium-Kalium-Pumpe und hat eine hohe Homologie zur humanen ATP1A1. Die Natrium-Kalium-Pumpe ist essenziell zum Erhalt des Ruhemembranpotentials jeder Zelle und ist obligat an der Elektrophysiologie der Herzkontraktion beteiligt. Direkte Hemmung der Na-K-Pumpe mittels Ouabain phänokopiert die hiphop Arrhythmie und aktivierende, sympathomimetische Substanzen wie Adrenalin therapiert die hiphop Arrhythmie. Somit konnte erstmals gezeigt werden, dass die atp1a1a.1 Mutation der Natrium-Kalium-Pumpe zu einem spezifischen Arrhythmiesyndrom führt, welches dem humanen Sick-Sinus-Syndrom gleicht.

Der Zebrafisch ist ein exzellenter Modellorganismus zur Beschreibung und Untersuchung von Krankheitsmodellen sowie für die Anwendung von molekulargentischen Einflüssen. FHL 1opathien sind Muskelekrankungen beim Menschen, die zu den Myofibrillären Myopathien gezählt werden. Deren zugrundeliegenden Mechanismen sollen in der vorliegenden Arbeit am Zebrafisch dargestellt werden. Die Funktionen der FHL 1 Orthologe werden hierfür aufgezeigt. Des weiteren wird die Mutation C224W, welche sich beim Menschen als krankheitsverursachend herausgestellt hat genauer charakterisiert. Letztlich werden aus verschiedenen Mutationen sowie dem Wildtyp transgene Zebrafischlinien generiert.

Conventionally, neuronal development is regarded to follow a stereotypic sequence of neurogenesis, migration, and differentiation. We demonstrate that this notion is not a general principle of neuronal development by documenting the timing of mitosis in relation to multiple differentiation events for bipolar cells (BCs) in the zebrafish retina using in vivo imaging. We found that BC progenitors undergo terminal neurogenic divisions while in markedly disparate stages of neuronal differentiation. Remarkably, the differentiation state of individual BC progenitors at mitosis is not arbitrary but matches the differentiation state of post‐mitotic BCs in their surround. By experimentally shifting the relative timing of progenitor division and differentiation, we provide evidence that neurogenesis and differentiation can occur independently of each other. We propose that the uncoupling of neurogenesis and differentiation could provide neurogenic programs with flexibility, while allowing for synchronous neuronal development within a continuously expanding cell pool.

Genome-wide association studies have identified >50 common variants associated with kidney function, but these variants do not fully explain the variation in eGFR. We performed a two-stage meta-analysis of associations between genotypes from the Illumina exome array and eGFR on the basis of serum creatinine (eGFRcrea) among participants of European ancestry from the CKDGen Consortium (nStage1: 111,666; nStage2: 48,343). In single-variant analyses, we identified single nucleotide polymorphisms at seven new loci associated with eGFRcrea (PPM1J, EDEM3, ACP1, SPEG, EYA4, CYP1A1, and ATXN2L; PStage1

cattering within biological samples limits the imaging depth and the resolution in microscopy. We present a prior and regularization approach for blind deconvolution algorithms to correct the influence of scattering to increase the imaging depth and resolution. The effect of the prior is demonstrated on a three-dimensional image stack of a zebrafish embryo captured with a selective plane illumination microscope. Blind deconvolution algorithms model the recorded image as a convolution between the distribution of fluorophores and a point spread function (PSF). Our prior uses image information from adjacent z-planes to estimate the unknown blur in tissue. The increased size of the PSF due to the cascading effect of scattering in deeper tissue is accounted for by a depth adaptive regularizer model. In a zebrafish sample, we were able to extend the point in depth, where scattering has a significant effect on the image quality by around 30  μm.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein genetischer Screen nach Thymusmutanten im Zebrafisch durchgeführt, um Gene zu identifizieren, die für die Thymusentwicklung von Bedeutung sind. Um Thymusmutanten zu isolieren, wurden mit Hilfe von ENU-mutagenisierten Fischen whole mount in situ Hybridisierungen mit einer rag1-AS-Sonde an gynogenetisch diploiden F2-Gelegen durchgeführt. Dabei konnten die drei Mutanten briesle, minibries und briessche isoliert werden. Anhand weiterer in-situ-Hybridisierungen mit spezifischen Markern und Methoden der Histologie wurden die Mutanten bezüglich der Ursache des Phänotyps charakterisiert. Dabei wurden die Aspekte der Temperatursensitivität, der Entwicklung des Schlundendoderms, der T-Zellentwicklung, der Entwicklung der Neuralleistenzellen und der Skelettbildung näher untersucht. Der weitere Fortgang der Arbeit bestand darin, über die genetische Kartierung anhand von Pool- und Einzelembryoanalysen die Mutationen einer Kopplungsgruppe (LG) zuzuordnen und den Bereich, in welchem die Mutationen liegen, zu bestimmen. Durch die Ergebnisse der Kopplungsanalysen konnte die Überlebensfähigkeit von Mutantenembryonen der briesle- und minibries-Mutante überprüft werden. Mit Hilfe der Kartierungsergebnisse konnte für beide Mutanten je ein Kandidatengen ermittelt werden, für briesle das Gen Cathepsin L und für minibries das Gen pim1. Beide Gene wurden aus Mutanten-DNA genomisch amplifiziert und die Sequenz der Exons und der Exon-Intron-Grenzen überprüft.

Innerhalb dieser Doktorarbeit wurden verschiedene Aspekte der Analyse komplexer Genome untersucht. Zunächst wurde die Anwendbarkeit verschiedener, auf Hybridisierung beruhender Techniken für das genetische Kartieren in den Genomen von Zebra- und Medakafisch getestet. Diese sollten ein effizientes Kartieren mit einer hohen genetischen Auflösung erlauben. Die einfachste Möglichkeit Marker zu generieren, die durch Hybridisierung kartiert werden können, ist die IRS-PCR. Diese PCR-Technik nutzt die im Genom eingestreuten repetitiven Elemente aus, um die nicht repetitive Frakton des Genoms zu amplifizieren, die zwischen zwei dieser Elemente liegt. Dieses komplexe PCR- Produkt wurde kloniert und etwa 1000 individuelle Klone einer rund 16.000 Klone umfassenden Marker-Bibliothek wurden auf kleine ´Southern´-blots hybridisiert, die IRS-PCR-Produkte verschiedener Zebrafischstämme enthielten. Die Klone, die auf den Southernblots einen +/- -Polymorphismus zeigten, wurden anschließend auf "Kartierungsfilter" hybridisiert, die IRS-PCR-Produkte von vier verschiedenen Kreuzungen enthielten. Bei dieser Vorgehensweise traten zwei Schwierigkeiten auf: Zum einen wurden aufgrund einer gewissen Redundanz der Marker-Bank wiederholt die gleichen Klone analysiert. Dieses Problem konnte teilweise gelöst werden, indem die gesamten Marker-Bank durch ´Oligo- fingerprinting´ analysiert wurde, und Klone mit ähnlichen ´fingerprints´ in Clustern zusammengefaßt, und dann repräsentative Klone verschiedener Cluster untersucht wurden. Das größere Problem war jedoch der hohe Grad an Variabilität innerhalb der Zebrafisch-Stämme, so daß schließlich nur 30% der Marker, die zuvor als polymorph identifiziert wurden, auf der Karte plaziert werden konnten. Insgesamt konnten aber dennoch rund 80 verschiedene Marker auf einer der Referenz-Kreuzungen ausgewertet werden, und 50 davon zeigten genetische Kopplung zu wenigstens einem weiteren Marker. Im Medakafisch wurde diese Strategie ebenfalls, jedoch mit einer Kombination von Primern, die für drei verschiedene repetitive Elemente komplementär sind, getestet. Aus der 3800 Klone umfassenden Marker-Bank wurden hundert potentielle Marker auf Southern blots getestet. Die Rate an polymorphen Markern lag mit 30 % mehr als doppelt so hoch wie im Zebrafisch. Darüber hinaus waren 50 % der als polymorph identifizierten Marker auch auf einer F2-Kreuzung zweier verschiedener Populationen polymorph. Dies zeigt, daß im Medakafisch die Stämme genetisch gut getrennt und innerhalb eines Stammes relativ homozygot sind. Um weitere genetische Marker zu finden, die außerdem eine gleichzeitige Verknüpfung von genetischen Kartierungsdaten und genomischen Klonen erlaubten, wurde für den Medakafisch eine modifizierte AFLP-Methode entwickelt. Nach Hybridisierung von Amplikons, die aus zwei verschiedenen Medakafischstämmen generiert wurden, auf eine Cosmid-Bank, wurden 80 Klone isoliert, die ein differentielles Hybridisierungsmuster aufwiesen. Aus 20 % der so identifizierten Cosmide ließ sich eine Probe isolieren, die sich auf einer F2-Geschwister-Kreuzung kartieren ließ. Ein weiterer Aspekt bei der Untersuchung komplexer Genome ist die vergleichende Sequenzanalyse. Dadurch können Einblicke in Genomevolution und -organisation gewonnen werden. Innerhalb dieser Arbeit wurde ein 40 kb großer Klon aus einer Amphioxus-Cosmid-Bank sequenziert, mit verschiedenen Exon-Vorhersage-Programmen (Grail, GenScan, Mzef) untersucht und mit zwei öffentlichen (Genbank, Swissprot) und einer internen (Amphioxus-EST) Sequenzdatenbanken verglichen. Dabei konnte unter anderem ein Gen der Aldo- Keto-Reduktase-Familie identifiziert werden. Es konnte ferner gezeigt werden, daß sich genomische Sequenzanalyse und EST-Projekte komplementieren., During the work for this thesis several aspects of the analysis of complex genomes were explored. Firstly, the applicability of different hybridisation based approaches for genetic mapping was tested in the genomes of zebrafish and medakafish. Such approaches should allow efficient mapping of new markers to a high resolution. IRS-PCR is the simplest possibility to generate markers that can be mapped by hybridisation. It takes advantage of interspersed repetitive sequences in the genome to amplify a set of unique DNAs between two of such elements. The PCR-products were cloned and more than 1000 individual clones of a 16 thousand clone containing marker library were tested for polymorphism on small southern blots of complex IRS-PCR product of different Zebrafisch strains. The markers identified polymorphic were subsequently hybridised on mapping filters onto which IRS-PCR-products of individuals of four different mapping crosses were spotted. Two major difficulties were found with this approach: Because of the redundancy of the library clones were tested repeatedly. This problem could be overcome by analysing the whole marker library by oligo-fingerprinting and grouping the clones with similar fingerprints in clusters. Representatives of different clusters were then used as hybridisation probes and sequenced. The major problem, however, was the high degree of variability within the zebrafish strains. Because of this less than 10 % of the markers that were identified polymorphic on Southern blots were informative on a reference cross and could be placed on a map. Despite of the encountered problems around 80 markers could be scored on one of the reference crosses, and 50 of those showed linkage to at least one further clone. The size of the genetic map of the Zebrafish estimated from these experiments is around 2700 cM and thus very close to the size determined from other laboratories (2635 cM). The same strategy was also tested for the Medakafish, however with a combination of primers, specific for three different repetitive elements. From the 3800 clone medaka library hundred clones were tested on Southern blots. The rate of polymorphic markers was almost 30% and compared to the zebra fish more than twice as high. Moreover 15 % of the makers previously identified polymorphic were informative on an F2-intercross of different strains. This indicates a much higher genetic distance between the different strains than in the Zebrafish. In order to generate further markers that could simultaneously be linked to genomic clones a modified AFLP-technique was developed. After differential hybridisation of two amplicons generated from different strains on a cosmid library 80 clones with a differential hybridisation pattern could be identified. It was possible to isolate a probe from 20 % of the cosmids, and more than 50% could be mapped on a F2-intercross. A further aspect of the analysis of complex genomes is the comparative sequence analysis. By comparison of genomic sequences of different species it is possible to get insights into gemone evolution and -organisation. Within this work a 40 kb clone of an amphioxus cosmid-library was sequenced, analysed with different exon prediction programs and the deduced protein sequence was compared with two public and one in house sequence database. This has led to the identification of a gene of the aldo- keto reductase family as well as further exons which gave a significant database match to known genes. Furthermore it could be demonstrated that genomic sequence analysis and EST projects complement each other well.

The continence preserving procedures, even with small margins, have better curative results than amputation of the rectum. Nevertheless marginal continent resections have to take a defective continence into account. In clinical practice this is tolerated. A reason for the reduction of continence is the loss of the corpus cavernosum recti. Comparative anatomical investigations in Brachydanio, a fish species that is transparent in its larva stage, lead to the conclusion, that the rectum remains an abdominal organ even though it is situated in the lesser pelvis. Thus it is strictly separated from the totally differently developed pelvic organ of the urogenital system. This is also proven by the separate anlages of the lymph nodes, lymph and blood vessels. Concerning the continence organ it is referred to the formal sex difference. The female closure mechanism is weaker and more primitive. We could follow this principle back to the Latimeria. For this reason, after deep continent resections, women always are more subject to incontinence, and have to wear nightly pads, at times. We have operated on 328 patients during 1-1-1978 to 2-22-1989. Their curative rates relate to these considerations.