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Phytochrome sind Rotlicht-/Dunkelrotlicht (R/FR)-revertierbare Photorezeptoren, die eine zentrale Rolle in der Licht-regulierten pflanzlichen Entwicklung spielen. Der aktivierte Rezeptor transloziert in den Zellkern, interagiert dort mit diversen Signaltransduktions-Komponenten, was zu differenzieller Genregulation führt. Verschiedene Evidenzen belegen allerdings zweifelsfrei, dass es zusätzlich einen Phytochrom-Signalweg im Cytoplasma gibt. Beispielsweise werden Rotlicht-Phototropismus und -polarotropismus im Laubmoos Physcomitrella patens durch Phytochrom (hauptsächlich phy4) vermittelt, was eine Genregulations-basierte Signaltransduktion ausschließt, da die Richtungsinformation dabei zwangsläufig verloren geht. Das Richtungssignal wird an das Aktin-Cytoskelett weitergeleitet, welches während der Reaktion massiv umorganisiert wird und somit als Effektor der polaren Wachstumsantwort gilt. In einem vorherigen Dissertationsprojekt konnte mittels Yeast-Two-Hybrid (Y2H)- und Split-YFP-Methoden eine R-induzierte bzw. in planta Interaktion von phy4 mit dem Blaulichtrezeptor Phototropin an der Plasmamembran (PM) demonstriert werden. Der gestörte R-Photo- und Polarotropismus einer Phototropin-Triple-Mutante belegt die physiologische Relevanz der Photorezeptor-Co-Aktion. In dieser Arbeit wurde ein ex vivo Co-Immunopräzipitations-Assay etabliert und erfolgreich angewendet, um die Interaktion mit einer unabhängigen Methode zu demonstrieren. Der Fokus der Doktorarbeit lag auf der Identifikation und Charakterisierung von phy4-Interaktionspartnern, die am cytoplasmatischen phy4-Signalweg beteiligt sein könnten. Dazu wurde ein Y2H-cDNA-Library Screen mit photoaktivem Volllängen-Holophytochrom als Bait durchgeführt und in R selektiert, um vorwiegend Pfr-spezifische Interaktoren zu erfassen. 70 von 4 x 105 gescreenten Hefeklonen konnten dabei isoliert und nach Sequenzierung in silico bzgl. funktioneller Domänen und Homologen in anderen Pflanzen analysiert werden. Nach Eliminierung identischer Sequenzen verblieben 60 Kandidaten plus vier Weitere aus einem vorhergehenden Screen, denen auf Basis der in silico Analysen und umfangreicher Literaturrecherche mögliche Funktionen zugeordnet wurden. Etwa zwei Drittel der Kandidaten konnten ausgeschlossen werden, da sie wahrscheinlich Metabolismus-, Transkriptions/Translations-, Stress- oder Phytohormon-assoziierte Funktionen ausüben und daher für cytoplasmatisches Phytochrom-Signalling von geringerer Relevanz sind. Ausnahmen bilden hier der eukaryotische Initiationsfaktor 5A (eIF-5A) und Elongationsfaktor 1alpha (EF1alpha), die wohl duale Funktionen in Translation und Cytoskelett-Organisation im Cytoplasma haben. Interessanterweise hat ein Drittel der Interaktoren mögliche Funktionen in Signaltransduktion oder posttranslationaler Modifikation, Cytoskelett-Assoziation oder als Membranproteine. Die recht große Gruppe der Signaltransduktions-Proteine ist divers und enthält klassische Signalproteine (z.B. ein Pirin und ein 14-3-3 Protein), Proteine mit Protein-Protein-Interaktionsdomänen (PRL1 mit WD40-Domäne, ein Zinkfinger (ZF)- und ein Kelch-Repeat-Protein) und Enzyme (diverse (Ca2+-abhängige) Ser/Thr-Kinasen, und ein P-Loop-Protein mit Sulfotransferase-Domäne). Insgesamt wurden 19 Kandidaten ausgewählt und zunächst als Volllängen CDS aus Physcomitrella cDNA amplifiziert um saubere Prey-Konstrukte herzustellen. Diese wurden anschließend mit Holo-phy4-Baits in einem semiquantitativem Y2H-Wachstums-Assay kombiniert und in Dunkelheit (D), kontinuierlichem R (Rc) bzw. gepulstem R (Rp) bzw. in Rp + FRp selektiert. Dabei konnten 18 putative Interaktionspartner verifiziert werden. Meist fand R-induziertes oder R-verstärktes und FR-revertierbares Wachstumsverhalten statt, so dass entsprechende Interaktoren als Holophytochrome Interacting Proteins (HIPs) bezeichnet wurden. In planta Expression von HIP-Fluoreszenzprotein-Fusionen und fluoreszenzmikroskopische Untersuchung ohne bzw. mit R-Vorbehandlung zeigte, dass alle analysierten HIPs eine cytoplasmatische und ggf. zusätzlich eine nukleäre Lokalisation aufwiesen. Somit sind diese HIPs vermutlich in diesen Kompartimenten funktional. Es konnte in keinem Fall eine differentielle Lokalisation nach R beobachtet werden. Split-YFP-Analysen in D und R konnten in der Tat 12 HIPs auch in planta als phy4 Interaktoren bestätigen. Die HIP-phy4-Interaktionen fanden in der Regel in Cytoplasma und ggf. zusätzlich im Kern statt, wobei 14-3-3/HIP14, EF1alpha/HIP13 und eIF-5A/HIP12 ein Cytoskelett-ähnliches Interaktionsmuster aufwiesen. Das ZF-Protein (HIP3), eine putative Ser/Thr-Proteinkinase (HIP7) und eine putative Intramembran-Serin-Protease (HIP9) interagierten ausschließlich nach R mit phy4, was für eine Pfr-spezifische Interaktion und ggf. phy4-induzierte Aktivierung sprechen könnte. Zukünftig werden physiologische Untersuchungen von HIP-Knockouts Aufschluss über die physiologische Relevanz der HIPs im Phytochrom-Signaltransduktionsweg geben.

Phytochrome sind Rotlicht-/Dunkelrotlicht (R/FR)-revertierbare Photorezeptoren, die eine zentrale Rolle in der Licht-regulierten pflanzlichen Entwicklung spielen. Der aktivierte Rezeptor transloziert in den Zellkern, interagiert dort mit diversen Signaltransduktions-Komponenten, was zu differenzieller Genregulation führt. Verschiedene Evidenzen belegen allerdings zweifelsfrei, dass es zusätzlich einen Phytochrom-Signalweg im Cytoplasma gibt. Beispielsweise werden Rotlicht-Phototropismus und -polarotropismus im Laubmoos Physcomitrella patens durch Phytochrom (hauptsächlich phy4) vermittelt, was eine Genregulations-basierte Signaltransduktion ausschließt, da die Richtungsinformation dabei zwangsläufig verloren geht. Das Richtungssignal wird an das Aktin-Cytoskelett weitergeleitet, welches während der Reaktion massiv umorganisiert wird und somit als Effektor der polaren Wachstumsantwort gilt. In einem vorherigen Dissertationsprojekt konnte mittels Yeast-Two-Hybrid (Y2H)- und Split-YFP-Methoden eine R-induzierte bzw. in planta Interaktion von phy4 mit dem Blaulichtrezeptor Phototropin an der Plasmamembran (PM) demonstriert werden. Der gestörte R-Photo- und Polarotropismus einer Phototropin-Triple-Mutante belegt die physiologische Relevanz der Photorezeptor-Co-Aktion. In dieser Arbeit wurde ein ex vivo Co-Immunopräzipitations-Assay etabliert und erfolgreich angewendet, um die Interaktion mit einer unabhängigen Methode zu demonstrieren. Der Fokus der Doktorarbeit lag auf der Identifikation und Charakterisierung von phy4-Interaktionspartnern, die am cytoplasmatischen phy4-Signalweg beteiligt sein könnten. Dazu wurde ein Y2H-cDNA-Library Screen mit photoaktivem Volllängen-Holophytochrom als Bait durchgeführt und in R selektiert, um vorwiegend Pfr-spezifische Interaktoren zu erfassen. 70 von 4 x 105 gescreenten Hefeklonen konnten dabei isoliert und nach Sequenzierung in silico bzgl. funktioneller Domänen und Homologen in anderen Pflanzen analysiert werden. Nach Eliminierung identischer Sequenzen verblieben 60 Kandidaten plus vier Weitere aus einem vorhergehenden Screen, denen auf Basis der in silico Analysen und umfangreicher Literaturrecherche mögliche Funktionen zugeordnet wurden. Etwa zwei Drittel der Kandidaten konnten ausgeschlossen werden, da sie wahrscheinlich Metabolismus-, Transkriptions/Translations-, Stress- oder Phytohormon-assoziierte Funktionen ausüben und daher für cytoplasmatisches Phytochrom-Signalling von geringerer Relevanz sind. Ausnahmen bilden hier der eukaryotische Initiationsfaktor 5A (eIF-5A) und Elongationsfaktor 1alpha (EF1alpha), die wohl duale Funktionen in Translation und Cytoskelett-Organisation im Cytoplasma haben. Interessanterweise hat ein Drittel der Interaktoren mögliche Funktionen in Signaltransduktion oder posttranslationaler Modifikation, Cytoskelett-Assoziation oder als Membranproteine. Die recht große Gruppe der Signaltransduktions-Proteine ist divers und enthält klassische Signalproteine (z.B. ein Pirin und ein 14-3-3 Protein), Proteine mit Protein-Protein-Interaktionsdomänen (PRL1 mit WD40-Domäne, ein Zinkfinger (ZF)- und ein Kelch-Repeat-Protein) und Enzyme (diverse (Ca2+-abhängige) Ser/Thr-Kinasen, und ein P-Loop-Protein mit Sulfotransferase-Domäne). Insgesamt wurden 19 Kandidaten ausgewählt und zunächst als Volllängen CDS aus Physcomitrella cDNA amplifiziert um saubere Prey-Konstrukte herzustellen. Diese wurden anschließend mit Holo-phy4-Baits in einem semiquantitativem Y2H-Wachstums-Assay kombiniert und in Dunkelheit (D), kontinuierlichem R (Rc) bzw. gepulstem R (Rp) bzw. in Rp + FRp selektiert. Dabei konnten 18 putative Interaktionspartner verifiziert werden. Meist fand R-induziertes oder R-verstärktes und FR-revertierbares Wachstumsverhalten statt, so dass entsprechende Interaktoren als Holophytochrome Interacting Proteins (HIPs) bezeichnet wurden. In planta Expression von HIP-Fluoreszenzprotein-Fusionen und fluoreszenzmikroskopische Untersuchung ohne bzw. mit R-Vorbehandlung zeigte, dass alle analysierten HIPs eine cytoplasmatische und ggf. zusätzlich eine nukleäre Lokalisation aufwiesen. Somit sind diese HIPs vermutlich in diesen Kompartimenten funktional. Es konnte in keinem Fall eine differentielle Lokalisation nach R beobachtet werden. Split-YFP-Analysen in D und R konnten in der Tat 12 HIPs auch in planta als phy4 Interaktoren bestätigen. Die HIP-phy4-Interaktionen fanden in der Regel in Cytoplasma und ggf. zusätzlich im Kern statt, wobei 14-3-3/HIP14, EF1alpha/HIP13 und eIF-5A/HIP12 ein Cytoskelett-ähnliches Interaktionsmuster aufwiesen. Das ZF-Protein (HIP3), eine putative Ser/Thr-Proteinkinase (HIP7) und eine putative Intramembran-Serin-Protease (HIP9) interagierten ausschließlich nach R mit phy4, was für eine Pfr-spezifische Interaktion und ggf. phy4-induzierte Aktivierung sprechen könnte. Zukünftig werden physiologische Untersuchungen von HIP-Knockouts Aufschluss über die physiologische Relevanz der HIPs im Phytochrom-Signaltransduktionsweg geben.

Die einzellige Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ist ein vielseitiger Modellorganismus sowohl in der Grundlagenforschung als auch für biotechnologische Anwendung. Für die genetische Veränderung wurden verschiedene Methoden entwickelt, jedoch ist die gezielte Modifikation kerncodierter Gene immernoch sehr schwierig. In dieser Arbeit wird eine Strategie vorgestellt, die es ermöglicht, kerncodierte Gene in Chlamydomonas gezielt mit sequenzspezifischen Zinkfinger-Nukleasen zu verändern. Das COP3-Gen, welches den lichtaktivierbaren Ionenkanal Kanalrhodopsin-1 codiert, diente hierbei als Zielsequenz der für die Deletion hergestellten Zinkfinger-Nukleasen. Um eine Charakterisierung der ZFNs zu ermöglichen, wurde ein Modelstamm generiert, der ein inaktiviertes Markergen enthält. Die Inaktiverung erfolgte hierbei durch Insertion der COP3-ZFN Zielsequenz. Die Transformation dieses Modellstamms mit ZFN codierender Plasmid-DNA und einem Reparatur-Template ermöglichte die Wiederherstellung der Markeraktivität und eine Selektion Antibiotika-resistenter Kolonien. Wenn in diesen Experimenten zusätzlich ein COP3 veränderndes Template benutzt wurde, enthielt 1% der analysierten Klone ein mutiertes COP3-Gen. Der Chlamydomonas Augenfleck ist ein lichtsensitives Organell mit entscheidender Funktion für die phototaktische Orientierung der Alge. Eine Deletionsmutante des Blaulicht-Photorezeptors Phototropin zeigte in Experimenten eine veränderte Regulation der lichtabhängigen Augenfleckgröße. Durch Komplementierung der Phototropin-Dysfunktion konnte der lichtabhängige Regulationsprozess wiederhergestellt werden. Die Expression der Phototropin-Kinasedomäne führte zu einer lichtunabhängigen Reduktion der Augenfleckfläche. Interessanterweise führte auch die Expression der N-terminalen LOV-Domänen zu einer geänderten Regulation des Augenflecks und der Phototaxis. Dies deutet, zusätzlich zur Lichtregulation der Kinasedomäne, auf eine zelluläre Signalfunktion der LOV-Domänen hin., The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii is a versatile model for fundamental and biotechnological research. A wide toolset for genetic manipulation has been developed for this alga, but specific modification of nuclear genes is still not routinely possible. Here we present a nuclear gene targeting strategy for Chlamydomonas that is based on the application of zinc-finger nucleases (ZFNs). Initially, we designed a set of ZFNs for targeting the COP3 gene that encodes the light-activated ion channel channelrhodopsin-1. To evaluate the designed ZFNs, we constructed a model strain by inserting a non-functional selection marker interspaced with a short COP3 target sequence into the nuclear genome. Upon co-transformation of this recipient strain with the engineered ZFNs and a DNA repair template, we were able to restore marker activity and select antibiotic resistant clones with active nucleases. In cases where cells were co-transformed with a modified COP3 template, 1% of these clones contained a modified COP3 locus as well. The eyespot of Chlamydomonas is a light-sensitive organelle important for phototactic orientation of the alga. Here we found that eyespot size is downregulated in light. In a strain in which the blue light photoreceptor phototropin was deleted, the light regulation of the eyespot size was affected. We restored this dysfunction in different phototropin complementation experiments. Complementation with the phototropin kinase fragment reduced the eyespot size, independent of light. Interestingly, overexpression of the N-terminal LOV-domains alone also affected eyespot size and phototaxis, suggesting that aside from activation of the kinase domain, they fulfill an independent signaling function in the cell. We propose that phototropin is a light regulator of phototaxis that desensitizes the eyespot when blue light intensities increase.

Der Augenfleckapparat ist das photorezeptive Zellorganell für lichtabhängige Bewegungsreaktionen in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii. Mit seiner Hilfe nimmt die Zelle sowohl die Richtung des Lichts als auch dessen Intensität und Qualität wahr. Über eine bisher noch nicht detailliert untersuchte lichtgesteuerte Signalkaskade vom Augenfleck bis in die Geißeln reguliert dieser Organismus sowohl phototaktische als auch photophobische Antworten. Sieben der insgesamt 202 im Augenfleckproteom identifizierten Proteine wurden in der vorliegenden Arbeit näher analysiert: die Photorezeptoren ChR1, ChR2 und Phototropin, die Calcium-bindenden Proteine ChrCaS und C_20380, ein Protein mit Sequenzhomologien zum cyanobakteriellen MCP und das Häm-bindende Protein SOUL3. Subzelluläre Fraktionierungen ergaben, dass die ChRs, C_20380, MCP und SOUL3 spezifisch im Augenfleckapparat angereichert sind. ChrCaS war hauptsächlich in der Thylakoid- und Chloroplastenhüllmembranfraktion nachweisbar. Auch für Phototropin konnten die massenspektrometrischen Befunde bestätigt werden: bei identischer Proteinbeladung war es gegenüber dem Rohextrakt in der Augenfleckfraktion angereichert. Mittels Auftrennung über lineare Glycerolgradienten wurde für alle hier untersuchten Proteine dokumentiert, dass diese Ca2+-unabhängig Komplexe ausbilden. Ein Nachweis direkter Interaktionen zwischen den einzelnen Proteinen konnte jedoch noch nicht erbracht werden. Funktionelle Analysen wurden mit ChrCaS, MCP und Phototropin durchgeführt. Durch Überexpressionsmutanten, die über einen Zeitraum von mindestens neun Monaten stabil transformiert werden konnten, wurde ein Einfluss von ChrCaS und MCP auf die phototaktischen Eigenschaften von C. reinhardtii nachgewiesen. Die Mutanten zeigten bei schwachem Weißlicht zunächst eine analog dem Wildtyp positive Phototaxis. Im Gegensatz zum Wildtyp verhielten sich diese Stämme jedoch nach etwa 15 min negativ phototaktisch. Für die ChrCaS-Mutanten konnte eine umgekehrte Proportionalität zwischen dem Überexpressionslevel und dem Grenzwert von positiver nach negativer Phototaxis aufgezeigt werden. Das negative phototaktische Verhalten bei höheren Lichtintensitäten war dagegen sowohl für die MCP- als auch für die ChrCaS-überexprimierenden Stämme ungestört. Diese Befunde deuten darauf hin, dass beide Proteine maßgeblich an Adaptationsphänomenen und damit an der Regulation der Orientierung der phototaktischen Bewegung (positiv oder negativ bezüglich der Lichtquelle) beteiligt sein könnten. Des Weiteren wurde über eine Phototropin-Knockout-Mutante und eine weitere Mutante, die die C-terminale Kinase-Domäne des Phototropin überexprimierte, die Beteiligung dieses Photorezeptors an der Regulation des ChR1-Gehalts und der Augenfleckgröße belegt. In der Kinase-Überexpressionsmutante war diese Regulation unabhängig vom Licht. Im Gegensatz dazu wurde der ChR2-Gehalt durch Phototropin jedoch nicht kontrolliert. Auch in verschiedenen ChR1-Knockout-Mutanten blieb der ChR2-Level verglichen zum Wildtyp unverändert. In der vorliegenden Arbeit konnte somit erstmals eine spezifische Verbindung des Blaulicht-Rezeptors Phototropin auf verschiedenen Ebenen zur Phototaxis von C. reinhardtii aufgezeigt werden. The eyespot apparatus of the green algae Chlamydomonas reinhardtii is the photoreceptive organelle for movement reactions regulated by light. Via the eyespot, the cell can sense the direction, intensity and quality of light. Thereby the eyespot is a central organelle for regulating phototactic and photophobic responses. Light dependent signalling cascades from the eyespot to the flagella leading to these responses are not yet fully understood. 202 proteins were identified in the eyespot proteome. Seven of them were analyzed in detail in this study: the photoreceptors ChR1, ChR2 and phototropin, the calcium-binding proteins ChrCaS and C_20380, one protein with sequence homologies to a cyanobacterial MCP and the heme-binding protein SOUL3. For the ChRs, C_20380, MCP and SOUL3, subcellular fractionations demonstrated a specific enrichment in the eyespot apparatus. ChrCaS was mainly detected in the fraction enriched in thylakoid membranes and chloroplast envelopes, but it was also present in significant amounts in the eyespot. For phototropin, mass spectrometric results could be confirmed: based on an identical protein loading, it was enriched in the eyespot fraction compared to crude extract. The solubilized eyespot fraction was also separated by linear glycerol gradients. Western analyses of the fractions demonstrated that all analyzed proteins form complexes of higher molecular mass. This complex formation was independent of Ca2+. However, evidence for direct interactions between the selected proteins is still missing. Functional analyses were done for ChrCaS, MCP and phototropin. Using overexpression mutants, which were transformed stable for at least nine months, an influence of ChrCaS and MCP on the phototactic behaviour of C. reinhardtii was observed. At low light intensities, the mutant strains showed initially a similar positive phototaxis as the wild type. However, in contrast to wild type cells, these strains displayed a negative phototactic behaviour after 15 min. The ChrCaS overexpression level was found to be inversely proportional to the threshold from positive to negative phototaxis. Interestingly, the negative phototactic behaviour at higher light intensities was not affected in the MCP and ChrCaS mutant strains. These results suggest for both proteins an important role in adaptational phenomena and thus in regulation of orientation of phototactic movement (positive or negative regarding the light source). Furthermore, using a phototropin knockout mutant and another mutant overexpressing the phototropin C-terminal kinase domain, evidence for the participation of this photoreceptorin regulating the ChR1 level and the eyespot size was obtained. As expected, this regulation was independent of light in the kinase overexpression mutant strain. In contrast, the ChR2 level was not controlled by phototropin. Additionally, it was demonstrated in different ChR1 knockout strains that the ChR2 level was unchanged, too. Thus, a specific link between the blue light photoreceptor phototropin and ChR1, the primary photoreceptor for phototactic responses, as well as the eyespot could be demonstrated for the first time in the course of this thesis.