Functional characterization of selected proteins from the eyespot apparatus of Chlamydomonas reinhardtii (Chlorophyceae)

Der Augenfleckapparat ist das photorezeptive Zellorganell für lichtabhängige Bewegungsreaktionen in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii. Mit seiner Hilfe nimmt die Zelle sowohl die Richtung des Lichts als auch dessen Intensität und Qualität wahr. Über eine bisher noch nicht detailliert untersuchte lichtgesteuerte Signalkaskade vom Augenfleck bis in die Geißeln reguliert dieser Organismus sowohl phototaktische als auch photophobische Antworten. Sieben der insgesamt 202 im Augenfleckproteom identifizierten Proteine wurden in der vorliegenden Arbeit näher analysiert: die Photorezeptoren ChR1, ChR2 und Phototropin, die Calcium-bindenden Proteine ChrCaS und C_20380, ein Protein mit Sequenzhomologien zum cyanobakteriellen MCP und das Häm-bindende Protein SOUL3. Subzelluläre Fraktionierungen ergaben, dass die ChRs, C_20380, MCP und SOUL3 spezifisch im Augenfleckapparat angereichert sind. ChrCaS war hauptsächlich in der Thylakoid- und Chloroplastenhüllmembranfraktion nachweisbar. Auch für Phototropin konnten die massenspektrometrischen Befunde bestätigt werden: bei identischer Proteinbeladung war es gegenüber dem Rohextrakt in der Augenfleckfraktion angereichert. Mittels Auftrennung über lineare Glycerolgradienten wurde für alle hier untersuchten Proteine dokumentiert, dass diese Ca2+-unabhängig Komplexe ausbilden. Ein Nachweis direkter Interaktionen zwischen den einzelnen Proteinen konnte jedoch noch nicht erbracht werden. Funktionelle Analysen wurden mit ChrCaS, MCP und Phototropin durchgeführt. Durch Überexpressionsmutanten, die über einen Zeitraum von mindestens neun Monaten stabil transformiert werden konnten, wurde ein Einfluss von ChrCaS und MCP auf die phototaktischen Eigenschaften von C. reinhardtii nachgewiesen. Die Mutanten zeigten bei schwachem Weißlicht zunächst eine analog dem Wildtyp positive Phototaxis. Im Gegensatz zum Wildtyp verhielten sich diese Stämme jedoch nach etwa 15 min negativ phototaktisch. Für die ChrCaS-Mutanten konnte eine umgekehrte Proportionalität zwischen dem Überexpressionslevel und dem Grenzwert von positiver nach negativer Phototaxis aufgezeigt werden. Das negative phototaktische Verhalten bei höheren Lichtintensitäten war dagegen sowohl für die MCP- als auch für die ChrCaS-überexprimierenden Stämme ungestört. Diese Befunde deuten darauf hin, dass beide Proteine maßgeblich an Adaptationsphänomenen und damit an der Regulation der Orientierung der phototaktischen Bewegung (positiv oder negativ bezüglich der Lichtquelle) beteiligt sein könnten. Des Weiteren wurde über eine Phototropin-Knockout-Mutante und eine weitere Mutante, die die C-terminale Kinase-Domäne des Phototropin überexprimierte, die Beteiligung dieses Photorezeptors an der Regulation des ChR1-Gehalts und der Augenfleckgröße belegt. In der Kinase-Überexpressionsmutante war diese Regulation unabhängig vom Licht. Im Gegensatz dazu wurde der ChR2-Gehalt durch Phototropin jedoch nicht kontrolliert. Auch in verschiedenen ChR1-Knockout-Mutanten blieb der ChR2-Level verglichen zum Wildtyp unverändert. In der vorliegenden Arbeit konnte somit erstmals eine spezifische Verbindung des Blaulicht-Rezeptors Phototropin auf verschiedenen Ebenen zur Phototaxis von C. reinhardtii aufgezeigt werden. The eyespot apparatus of the green algae Chlamydomonas reinhardtii is the photoreceptive organelle for movement reactions regulated by light. Via the eyespot, the cell can sense the direction, intensity and quality of light. Thereby the eyespot is a central organelle for regulating phototactic and photophobic responses. Light dependent signalling cascades from the eyespot to the flagella leading to these responses are not yet fully understood. 202 proteins were identified in the eyespot proteome. Seven of them were analyzed in detail in this study: the photoreceptors ChR1, ChR2 and phototropin, the calcium-binding proteins ChrCaS and C_20380, one protein with sequence homologies to a cyanobacterial MCP and the heme-binding protein SOUL3. For the ChRs, C_20380, MCP and SOUL3, subcellular fractionations demonstrated a specific enrichment in the eyespot apparatus. ChrCaS was mainly detected in the fraction enriched in thylakoid membranes and chloroplast envelopes, but it was also present in significant amounts in the eyespot. For phototropin, mass spectrometric results could be confirmed: based on an identical protein loading, it was enriched in the eyespot fraction compared to crude extract. The solubilized eyespot fraction was also separated by linear glycerol gradients. Western analyses of the fractions demonstrated that all analyzed proteins form complexes of higher molecular mass. This complex formation was independent of Ca2+. However, evidence for direct interactions between the selected proteins is still missing. Functional analyses were done for ChrCaS, MCP and phototropin. Using overexpression mutants, which were transformed stable for at least nine months, an influence of ChrCaS and MCP on the phototactic behaviour of C. reinhardtii was observed. At low light intensities, the mutant strains showed initially a similar positive phototaxis as the wild type. However, in contrast to wild type cells, these strains displayed a negative phototactic behaviour after 15 min. The ChrCaS overexpression level was found to be inversely proportional to the threshold from positive to negative phototaxis. Interestingly, the negative phototactic behaviour at higher light intensities was not affected in the MCP and ChrCaS mutant strains. These results suggest for both proteins an important role in adaptational phenomena and thus in regulation of orientation of phototactic movement (positive or negative regarding the light source). Furthermore, using a phototropin knockout mutant and another mutant overexpressing the phototropin C-terminal kinase domain, evidence for the participation of this photoreceptorin regulating the ChR1 level and the eyespot size was obtained. As expected, this regulation was independent of light in the kinase overexpression mutant strain. In contrast, the ChR2 level was not controlled by phototropin. Additionally, it was demonstrated in different ChR1 knockout strains that the ChR2 level was unchanged, too. Thus, a specific link between the blue light photoreceptor phototropin and ChR1, the primary photoreceptor for phototactic responses, as well as the eyespot could be demonstrated for the first time in the course of this thesis.