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Pharmacotherapy has made massive advances: what began with herbs and fungi led to synthetic pills that interfered ever more precisely with receptors and metabolic pathways. Finally, antibodies against specific proteins became part of our therapeutic armamentarium. But none of these measures get to the heart of the matter: The latest revolutionary chapter in pharmacotherapy uses organ-specific nucleotides, short RNAsequences that intervene in pathogenic metabolic pathways even before proteins are formed and sometimes exert a very targeted effect over surprisingly long periods of time. In cardiovascular medicine, this pharmacotherapy of the future is mainly used in the treatment of lipometabolic disorders. RNAinterference technology involving the modified small interfering RNAtherapeutic inclisiran against the messenger RNAof proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) couples the therapeutic RNAwith N-acetylgalactosamine in order to achieve liver-specific silencing of the protein formation of PCSK9 by binding to the asialoglycoprotein receptors on the surface of hepatocytes. Thus, a marked and consistent reduction of PCSK9 and LDLcholesterol levels in plasma can be achieved over more than 6 months. Other developments use antisense oligonucleotides (ASOs) against angiopoietin-like protein 3 (ANGPTL3) or apolipoprotein C-III(apoC-III) to specifically lower triglyceride levels, and the ISIS-APO(a) Rx ASO, massively reduces (>70%) the formation of lipoprotein (a). These new RNA-targeted therapeutics have key advantages, such as a long duration of action, which relates to patient compliance, the specificity of their action in certain cells or organs and metabolic pathways, and they allow for the first time an effective treatment of hypertriglyceridaemia and the mostly genetically determined elevated levels of lipoprotein (a). Large randomised clinical trials testing the effect of these new nucleic acids on cardiovascular events such as myocardial infarction and death are currently underway, including in Switzerland, and will further determine the efficacy and safety of these new drugs. This will certainly herald a new era in the treatment of various cardiovascular diseases.

Small RNAs gene regulation was first discovered about 20 years ago. It represents a conserve gene regulation mechanism across eukaryotes and is associated to key regulatory processes. In plants, small RNAs tightly regulate development, but also maintain genome stability and protect the plant against pathogens. Small RNA gene regulation in plants can be divided in two canonical pathways: Post-transcriptional Gene Silencing (PTGS) that results in transcript degradation and/or translational inhibition or Transcriptional Gene Silencing (TGS) that results in DNA methylation. In this review, we will focus on the model plant Arabidopsis thaliana. We will provide a brief overview of the molecular mechanisms involved in canonical small RNA pathways as well as introducing more atypical pathways recently discovered.

Su(var)-Gene identifizieren epigenetische Faktoren, die am Aufbau von Heterochromatin und bei Prozessen zur Stilllegung von Genen in Drosophila melanogaster von besonderer Bedeutung sind. Sie kodieren für Proteine die Bestandteile des Chromatins modifizieren und oftmals eine funktionell evolutionäre Konservierung aufweisen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Su(var)2-1 Gen, welches ein dominanter Suppressor für das In(1)wm4h-PEV-Rearrangement ist, molekular untersucht und charakterisiert. Su(var)2-1 Mutationen besitzen ein breites Spektrum an phänotypischen Effekten, wie weiblicher Sterilität, Hyperacetylierung von Histonen, letaler Wechselwirkung mit Y-Heterochromatin und Butyrat-Empfindlichkeit. Su(var)2-1 kodiert für ein neues Chromatinprotein mit einer EWG Domäne (NLS- bzw. DNA-Binde und Dimerisationsdomäne) sowie einem C2H2-Zink-Finger-Motiv. Mapping- und Komplementationsanalyse mit isolierten Mutanten lassen auf eine komplexe Proteinfunktion von SU(VAR)2-1 beim Chromatinaufbau in der frühen Embryogenese von Drosophila melanogaster schließen. Dabei spielt die Regulation der Acetylierung, in Abhängigkeit von SU(VAR)2-1, eine zentrale Rolle. Besonders wichtig erscheint SU(VAR)2-1 bei der Etablierung einer normalen Oogenese in Drosophila melanogaster zu sein, da durch einen Verlust von SU(VAR)2-1 die späten Stadien der Oogenese nicht ausgebildet werden und dieses in homozygoten Weibchen zu einer weiblichen Sterilität führt., Su(var) genes identify epigenetic factors that are of particular importance in the construction of heterochromatin and in gene silencing processes in Drosophila melanogaster. These epigenetic factors that modify the components of chromatin often show up an evolutionary conserved functionality. In the present work the epigenetic factor Su(var)2-1 as a dominant suppressor for In(1)wm4h-PEV rearrangement has been molecularly analyzed and characterized. Su(var)2-1 mutations possess a broad spectrum of phenotypic effects, such as female sterility, hyperacetylation of histones, lethal interaction with Y heterochromatin and butyrate sensitivity. Su(var)2-1 encodes a novel chromatin protein with an EWG domain (NLS or DNA binding and dimerization domain) and a C2H2 zinc finger motif. Mapping and complementation analyzes with isolated mutants suggest a complex protein function of SU(VAR)2-1 in chromatin assembly in early embryogenesis of Drosophila melanogaster. The regulation of acetylation depending on SU(VAR)2-1 plays a central role in early chromatin assembly. SU(VAR) 2-1 also appears to be an important factor for the establishment of normal oogenesis in Drosophila melanogaster since the loss of SU(VAR)2-1 does not complete the late stages of oogenesis and the homozygous females show sterility in consequence.

The cellular protein SPOC1 (survival time-associated PHD [plant homeodomain] finger protein in ovarian cancer 1) acts as a regulator of chromatin structure and the DNA damage response. It binds H3K4me2/3-containing chromatin and promotes DNA condensation by recruiting corepressors such as KAP-1 and H3K9 methyltransferases. Previous studies identified SPOC1 as a restriction factor against human adenovirus (HAdV) infection that is antagonized by E1B-55K/E4-orf6-dependent proteasomal degradation. Here, we demonstrate that, in contrast to HAdV-infected cells, SPOC1 is transiently upregulated during the early phase of human cytomegalovirus (HCMV) replication. We show that the expression of immediate early protein 1 (IE1) is sufficient and necessary to induce SPOC1. Additionally, we discovered that during later stages of infection, SPOC1 is downregulated in a glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β)-dependent manner. We provide evidence that SPOC1 overexpression severely impairs HCMV replication by repressing the initiation of viral immediate early (IE) gene expression. Consistently, we observed that SPOC1-depleted primary human fibroblasts displayed an augmented initiation of viral IE gene expression. This occurs in a multiplicity of infection (MOI)-dependent manner, a defining hallmark of intrinsic immunity. Interestingly, repression requires the presence of high SPOC1 levels at the start of infection, while later upregulation had no negative impact, suggesting distinct temporal roles of SPOC1 during the HCMV replicative cycle. Mechanistically, we observed a highly specific association of SPOC1 with the major immediate early promoter (MIEP), strongly suggesting that SPOC1 inhibits HCMV replication by MIEP binding and the subsequent recruitment of heterochromatin-building factors. Thus, our data add SPOC1 as a novel factor to the endowment of a host cell to restrict cytomegalovirus infections. IMPORTANCE Accumulating evidence indicates that during millennia of coevolution, host cells have developed a sophisticated compilation of cellular factors to restrict cytomegalovirus infections. Defining this equipment is important to understand cellular barriers against viral infection and to develop strategies to utilize these factors for antiviral approaches. So far, constituents of PML nuclear bodies and interferon gamma-inducible protein 16 (IFI16) were known to mediate intrinsic immunity against HCMV. In this study, we identify the chromatin modulator SPOC1 as a novel restriction factor against HCMV. We show that preexisting high SPOC1 protein levels mediate a silencing of HCMV gene expression via a specific association with an important viral cis -regulatory element, the major immediate early promoter. Since SPOC1 expression varies between cell types, this factor may play an important role in tissue-specific defense against HCMV.

Huntington's disease (HD) is an autosomal-dominant inherited neurodegenerative disorder, characterized by motor, psychiatric and cognitive symptoms for which as yet no causal treatment is available. It has a prevalence of 1 : 10 000 in Germany. Its cause is a mutation in the Huntington gene (CAG-repeat). The mutation induces a polyglutamine expansion in the huntingtin protein (HTT). Mutant HTT (mHTT) has cytotoxic properties, aggregates in the cell and leads to complex pathophysiological disturbances ending in cell death. This review explains the principles of gene silencing which suppresses transcription and translation of huntingtin. One way to achieve gene silencing is the use of antisense oligonucleotides (ASO) that bind to pre-mRNA. Since August 2015, a first clinical trial with ASO (study drug: IONIS-HTTRx) in early manifest HD patients is in progress (NCT02519036). Results from this study could lead to a first causal treatment option in HD.Bei der Huntington-Erkrankung handelt es sich um eine bisher nicht kausal behandelbare neurodegenerative Erkrankung, die mit motorischen, psychiatrischen und kognitiven Symptomen einhergehen kann.Die Ursache der in Deutschland mit einer Häufigkeit von etwa 1:10 000 auftretenden, autosomal-dominant vererbten Erkrankung, ist eine Mutation im Huntingtin-Gen (CAG-Expansion). Diese führt zu einer Polyglutamin-Expansion im Huntingtin-Protein (HTT). Das so veränderte HTT (mHTT) hat eine zytotoxische Wirkung, ist schlecht löslich, neigt zur Aggregation in der Zelle und löst eine komplexe pathophysiologische Kaskade aus, an deren Ende eine gestörte Zellfunktion und schließlich der Zelltod stehen. In dem vorliegenden Artikel wird das Prinzip des Gene Silencing erklärt, mit dem Transkription bzw. Translation des Huntingtins gehemmt werden können. Ein Ansatz, der zu einer Suppression der Translation führt, ist der Einsatz von Antisense Oligonukleotiden (ASO), welche an prä-mRNA andocken. Eine erste klinische Studie bei frühmanifesten Huntington-Patienten wird seit August 2015 mit ASO (Studiensubstanz: IONIS-HTTRx) durchgeführt (NCT02519036). Auch wenn Ergebnisse noch abgewartet werden müssen, könnte die Studie den Weg zu einer ersten kausalen Therapie der Huntington-Erkrankung ebnen.

Die Arteriosklerose und ihre Folgeerkrankungen sind für über 50% aller Todesfälle weltweit verantwortlich. Erkrankungen wie z.B. arterielle Hypertonie, Hyperlipidämie und Diabetes mellitus sind als Risikofaktoren eindeutig belegt und etabliert. Seit Jahrzehnten bestehen kontroverse Meinungen bezüglich der Beteiligung des CRP an der Arteriosklerose. Ist es ein reiner Risikomarker ohne direkten Einfluss oder doch ein kausaler Spieler, d.h. ein Risikofaktor. Mehrere Studien bestätigten einen hohen prädiktiven Wert für zukünftige kardiovaskuläre Ereignisse bei erhöhten hsCRP-Werten im oberen Drittel des Normbereichs. Trotz Indizien konnte eine kausale Beteiligung bisher aber nicht zweifelsfrei nachgewiesen werden. So konnte CRP gemeinsam mit Komplement in den Wänden arteriosklerotischer Läsionen nachgewiesen werden. CRP ist weiterhin in der Lage Komplement zu aktivieren welches wiederum durch Freisetzung von Chemokinen zur Proliferation von SMC führen kann. Ein weiterer Hinweis für eine mögliche kausale Beteiligung des CRP an der Arteriosklerose ist seine Eigenschaft, die Schaumzellbildung aus Monozyten, durch Opsonierung des LDLs zur besseren Aufnahme, zu fördern. In dieser Arbeit wurde versucht, eine hepatische CRP-Synthese-Hemmung über den Knockdown der Proteinkinase C zu erreichen. Aufgrund der vielfältigen und noch nicht vollständig bekannten Wirkungen bzw. Interaktionen des CRPs erschien eine Hemmung der Synthese in der Leber am sinnvollsten und einfachsten durchführbar. Die Beteiligung der Proteinkinase C an der Synthese des C-reaktiven Proteins ist bekannt. Mit Hilfe der Methode der RNA-Interferenz zum Knockdown der PKC-Isoformen δ und ε sollte ihre Beteiligung am Syntheseweg eruiert und ein möglicher medikamentöser Ansatzpunkt untersucht werden. Als Zellreihe dienten HepG2-ABEK14-Zellen. Sie sind eine stabil mit einem 1kbp CRP Promotorkonstrukt und dem Luciferase Gen transfizierte Hepatoma-Zelllinie. Es zeigte sich in den Versuchen eine signifikant verminderte Aktivität der CRP-Promoter-Aktivität in HepG2-ABEK14-Zellen nach Gen-silencing der Proteinkinasen δ und ε. Dieser vielversprechende medikamentöse Ansatz muss weiter untersucht werden. Es ist bekannt, dass Thrombin in der akuten Phase vermehrt gebildet wird und evtl. eine stimulierende Wirkung auf die CRP-Synthese hat. Durch die bereits kommerziell verfügbaren Thrombininhibitoren wäre hier ein interessanter Ansatzpunkt gegeben. Nach Stimulation mit Thrombin wurde in den HepG2-ABEK14-Zellen keine signifikante Steigerung der CRP-Promoteraktivität erreicht. Eine medikamentöse Hemmung von Thrombin zur Senkung der CRP-Spiegel erscheint damit nicht sinnvoll zu sein. Es ist jedoch zu beachten, dass die Versuche an einer mit CRP-Luziferase stabil transifizierte Hepatom-Zelllinie durchgeführt wurden. Diese sind PHH in Struktur, Form, Syntheseapparat und Eigenschaften sehr ähnlich, jedoch nicht identisch. Auch bestehen Unterschiede der HepG2-ABEK14-Zellen und PHH gegenüber den Leberzellen in vivo. Es müssen weitere Studien erfolgen, die diese Unterschiede berücksichtigen.

Adenoviren gelten allgemein als Verursacher milder gastrointestinaler und respiratorischer Infektionen sowie von Infektionen der Konjunktiven. In jüngerer Zeit haben sie jedoch zunehmend als Pathogene an Bedeutung gewonnen. So wurden Adenoviren beispielsweise als Verursacher der viralen Myokarditis isoliert. Des Weiteren ist eine Vielzahl von Fällen berichtet worden, in denen Infektionen mit Adenoviren bei immunsupprimierten Patienten, darunter häufig Kinder, zu fulminanten Verläufen mit nicht selten letalem Ausgang führten. Dennoch gibt es bisher keine suffiziente, allgemein anwendbare anti- adenovirale Therapie. Das posttranskriptionelle Gen-Silencing mittels RNA- Interferenz (RNAi) konnte in den letzten Jahren als potenter und vielversprechender Ansatz zur antiviralen Therapie etabliert werden. Dabei vermitteln kurze doppelsträngige RNA-Moleküle, die small interfering RNAs (siRNAs), im Zytoplasma die Bindung ihrer sequenzhomologen Ziel-mRNA und die darauffolgende enzymatische Spaltung. An vielen Beispielen wurde bereits gezeigt, dass sich virale Infektionen durch den Einsatz von synthetisch hergestellten siRNAs oder den verwandten shRNAs (short-hairpin RNAs) effizient inhibieren lassen. Darunter auch bedeutende humanpathogene Viren wie das Hepatitis C Virus, das Hepatitis B Virus oder das HI-Virus. In der vorliegenden Arbeit wurde in vitro untersucht inwieweit sich die Infektion mit Adenovirus Typ 5 durch siRNAs gegen die adenoviralen Gene E1A, Hexon und IVa2 inhibieren lässt. Initial wurde dazu unter vier verschiedenen gegen jedes Zielgen vorliegenden synthetischen siRNAs die effizienteste evaluiert und weiteren Analysen zugeführt. Die sequenzspezifische Wirkung der siRNAs konnte in einem nächsten Schritt nachgewiesen werden. In der vergleichenden Untersuchung der siRNAs zeigten die siRNAs gegen die späten adenoviralen Gene, siHexon und siIVa2, ein deutlich stärkeren inhibitorischen Effekt auf die adenovirale Replikation als die siRNA gegen das frühe Gen E1A, vor allem da sie bereits in niedriger Dosierung effizient wirkten. Kombinationen von siHexon und siIVa2 zeigten zwar additive Effekt, führten jedoch bei dosisäquivalentem Einsatz nicht zu einer verstärkten Inhibierung der adenoviralen Replikation im Vergleich mit Einzelkomponenten. Überraschenderweise konnten bei Betrachtung des zytopathischen Effekts hingegen nur die Kombinationen aus siE1A und siHexon bzw. siIVa2 die Adenovirus vemittelte Zelllyse effizient inhibieren und einen zytoprotektiven Effekt demonstrieren. Eine Kombination aus den siRNAs gegen das frühe Gen E1A und den siRNAs gegen die späten Gene Hexon bzw. IVa2 ist folglich in Bezug auf den anti-adenoviralen Effekt insgesamt überlegen gegenüber der einzelnen Applikation der siRNAs., Adenoviruses are generally referred to as mild pathogens for they are commonly known as causative agents of mild respiratory infections of the upper airways, common gastrointestinal infections or conjunctivitis. Anyhow in younger times Adenoviruses gained a certain attention by having been determined as one of the main pathogens to cause viral myocarditis as well as having been reported to induce severe infections of liver and lung in the immunocompromised patient often taking a fulminant course and leading to subsequent death. Nevertheless there is currently no curative and specific pharmaceutical approach to treat Adenovirus infection. Gene Silencing by RNA Interference (RNAi) however has been shown to be a potent tool in treatment of viral infections as has been proven in principle for example for HC-, HB- and HI-Virus. The goal of the present thesis therefore was to examine the potential of RNAi-mediated inhibition of Adenovirus 5 infection by the use of small interfering RNAs (siRNAs) targeting both early (E1A) and late (IVa2 and Hexon) adenoviral genes. Several of the initially analyzed siRNAs directed against E1A, IVa2 and Hexon showed a distinct antiviral activity. Further investigations were performed to select the most effective siRNAs against each target. In a next step comparative analysis was conducted. The siRNAs against late adenoviral genes proved to be more effective in inhibiting adenoviral replication than silencing of the E1A early gene. A combination strategy involving downregulation of any two or all three of the targeted viral genes did not result in an enhanced inhibition of adenoviral replication compared to the single siRNA approaches targeting the late genes. However protection against adenovirus mediated cytotoxicity could only be achieved by combining siRNAs against either of the two late genes with the siRNA against the E1A early gene. Thus, an enhanced anti-adenoviral efficiency of RNAi-based inhibition strategies can be achieved by co-silencing of early and late adenoviral genes with down regulation of E1A as a crucial factor.

Upregulation of mouse double minute 4 (MDM4) is a frequent event in human hepatocellular carcinoma (HCC) but the underlying molecular mechanisms are poorly characterized. In this study a potential role of the phosphoinositide-3-kinase/v-AKT murine thymoma viral oncogene homolog/mammalian target of rapamycin (PI3K/AKT/mTOR) cascade was investigated in the regulation of MDM4 in HCC. Inhibition of the PI3K-AKT and/or mTOR pathways lowered MDM4 protein levels in HCC cells. Mechanistic protection from proteasomal degradation resulted from de-ubiquitination by ubiquitin-specific protease 2a and AKT-mediated phosphorylation of MDM4, thus increasing MDM4 protein levels. These findings were corroborated in a chimeric AKT mouse model. Upregulation of PI3K/AKT/mTOR signaling may result from overexpression of the eukaryotic elongation factor 1A2 (EEF1A2). Finally, a strong association between the expression of EEF1A2, phosphorylated AKT and MDM4 was observed in human HCC samples. Strong activation of the EEF1A2/PI3K/AKT/mTOR/MDM4 signaling pathway was observed in HCC patients with short survival suggesting that targeting this axis might be a promising approach in a subset of HCC patients.

The availability of three genomes from smut fungi differing in mating, TE load, and genome defense mechanisms, allowed a comparative analyses and a discussion on evolutionary forces shaping them. A complex balance of selective forces seems at play. A bipolar mating system in Ustilago hordei promotes selfing, advantageous for successful niche occupation but favoring accumulation of repetitive DNA, including TEs. TE activity may have caused genome variations necessary for these obligate parasites under high host selection pressures. Higher TE activity is balanced by genome defenses through recombination, RNAi, methylation and RIP mutagenesis. In tetrapolar U. maydis, lacking silencing and possibly methylation mechanisms, reduced inbreeding potential favors removal of repetitive DNA, presumably by its highly-efficient recombination system.

Gastrointestinal stromal tumors (GIST) are the most common mesenchymal tumors in the digestive tract. In up to 90% of cases, they are characterized by activating mutations in the KIT or the PDGFRA gene. GIST represent a paradigm for successful targeted treatment with tyrosine kinase inhibitors (TKI). Since the approval of the TKI imatinib in 2002 the survival of patients with metastatic GIST has tripled. The next logical step was the concept of using imatinib in an adjuvant approach, which was recently shown to increase overall survival significantly. In both settings, the mutational status has high predictive implications. In detail, GIST with KIT exon 11 mutations show the best response rates with partial remission rates of up to 80%. In KIT exon 9 mutations, a doubled daily dose of 800 mg imatinib is now standard. The PDGFRA exon 18 mutation D842V has been shown to lead to primary resistance. The treatment strategy in GIST is driven by their molecular characterisation. Further research has increased our knowledge on resistance mechanisms in solid tumors against TKI. The number of patients with secondary resistance due to acquired KIT mutations is increasing with treatment duration. Strategies to address this situation are the introduction of novel pathway inhibitors targeting different levels of signal transduction pathways, such as the mTOR/Akt pathway, the RAS/RAF pathway, histone deacetylation, among others. Among the GIST without mutations in the common hot spot regions of KIT and PDGFRA, the so-called wildtype GIST, further genomic subgroups have been identified. One such subgroup carries inactivating germline mutations in the genes encoding succinate dehydrogenase B, C, or D. They are associated with the occurrence of paragangliomas, so-called Carney-Stratakis syndrome. Most frequently, these GIST are located in the stomach, showing an epithelioid phenotype and a multinodular growth pattern. They preferentially occur in young females and often show lymph node metastases, the latter being very unusual in sporadic GIST. In sporadic Carney's triad additional pulmonary chondromas are observed and there are no SDH mutations. Another small subgroup of sporadic GIST present with BRAF mutations as an alternative genomic event. Finally, very rare kindreds with germline mutations in either KIT or PDGFRA have been described who develop multiple GIST and depending on the mutational subtype mastocytosis, hyperpigmentation and/or dysphagia. In summary, the molecular characterisation of GIST has revolutionized their treatment due to increasing knowledge about the high relevance of predictive molecular typing in solid tumors.

Molecular hepatocarcinogenesis represents a step-wise process which in most cases is associated with a well-defined chronic liver disease. By meta-analysis of classical comparative genomic hybridization (CGH) data an oncogenetic progression model could be generated (1q gain→ 8q gain → 4q loss → 16q loss → 13q loss). Array-based CGH allows the identification of etiology-dependent and independent genomic alterations. The Mouse Double Minute homologue 4 (MDM4) was shown to act as an oncogene of 1q32.1 gains in human hepatocellular carcinoma (HCC). Integration of genomic and epigenomic data facilitated the identification of tumor suppressor gene candidates in human HCC. For instance, Polo-like kinase 3 (PLK3) is frequently inactivated via promoter hypermethylation in combination with a loss of the second allele at 1p34.1. Both MDM4 overexpression and methylation-dependent inactivation of PLK3 represent potential targets for future therapeutic approaches.

Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) are the 6th most common cancers worldwide. While the incidence of larynx-hypopharynx carcinoma decreases, actually an increase in oropharyngeal squamous cell carcinoma (OSCC) is observed. Classical risk factors for HNSCC are smoking and alcohol. Though, it was shown recently for 25 to 60% of OSCC, to be associated with an infection by oncogenic human papilloma virus (HPV). The development of "common" head-neck-tumors is substantially enhanced by an accumulation of genetic changes, which lead to an inactivation of tumor suppressor genes or to an activation of proto-oncogenes. A more or less uniform sequence of different DNA-damages leads to genetic instability. In this context, an early and frequent event is deletion on the short arm of chromosome 9, which results in inactivation of the p16-gene. On the contrary, for HPV-induced carcinogenesis, expression of the viral proteins E6 and E7 is most important, since E6 and E7 lead to inactivation of the cellular tumor-suppressor-proteins p53 and Rb. The process of natural transoral infection is not yet clear. However, as a matter of fact peroral HPV-infection is not seldom and in most cases such an infection heals completely and uneventfully. Smoking seems to increases the probability for developing an HPV-associated tumor. The association of HNSCC with HPV can be proven with established methods in clinical diagnostics. In addition to classical prognostic factors, diagnosis of an HPV-association may become important for future therapies. Prognostic relevance of HPV probably surmounts many known risk-factors, for instance regional metastasis. Until now, no other molecular markers are established in clinical routine. Future therapy concepts may vary for the two subgroups of patients, especially patients with HPV-associated OSCC may take advantage of a less aggressive postoperative treatment. Finally an outlook will be given on possible target-aimed therapies, of which so far only antibodies against EGF-receptors are established in clinical practice.

Atrial fibrillation represents the most common form of clinical arrhythmia in daily routine. However, current therapeutic options are still limited and a better understanding of the underlying molecular mechanisms is expected to contribute to the development of new therapeutic strategies. The scientific field of microRNA research has received a lot of attention in recent years, especially regarding cardiovascular research. This article gives a brief overview of the most recent developments in microRNA research in the field of atrial fibrillation and atrial remodelling processes. Furthermore, the clinical perspective of microRNAs as new therapeutic targets and as potential biomarkers is discussed.

Paramecium tetraurelia possesses more actin isoforms than most other cells. With monospecific antibodies against actin subfamily 4 members, we could label cleavage furrow, nascent food vacuoles, oral apparatus, cilia, cell surface and macronucleus. Expression as green fluorescent protein- (GFP-) fusion protein now allowed us to localize more stringently actin4, e.g., in the macronucleus, particularly when enhanced with anti-GFP antibodies. Posttranscriptional gene silencing of actin4 resulted in disturbances at sites where actin4 has been localized. Cell division was impaired already early on, occasionally resulting in deformed cells. Both micro- and macronuclear development during vegetative cell fission were disturbed. Over longer periods, actin4 silencing entailed reduced phagocytotic activity, paralleled by accumulation of “acidosomes” (late endosomes) near the cytopharynx where they normally fuse with nascent phagosomes. In addition, near the cell surface, extensively misshapen “terminal cisternae” (early endosomes) occurred. In deformed cells, both constitutive endocytosis and stimulated trichocyst exocytosis were impaired. Thus, actin4 exerts pleiotropic effects at widely different sites of the Paramecium cell and disturbances generally coincide with sites where actin4 is normally enriched. Evidently the loss of actin4 cannot easily be compensated for by any other of the large number of actin isoforms occurring in a Paramecium cell.

We have recently characterized ITIH5 as a new extracellular matrix protein that exhibits clear expression loss in a variety of human tumour entities, including breast cancer. The aim of the present study was to decipher the molecular cause of ITIH5 expression loss in breast cancer and to learn more about the possible role of this molecule in cancer diseases. ITIH5 protein expression was found to be strongly reduced in 42% of invasive breast carcinomas-interestingly, with significant association with poor patient outcome. ITIH5 promoter methylation was frequently detected in breast cell lines and in primary carcinomas (40%), and it was functionally correlated with loss of ITIH5 mRNA expression. Moreover, ITIH5 promoter methylation was also significantly associated with poor clinical patient outcome and also with the occurrence of lymph node and distant metastases. In conclusion, we propose that ITIH5 may represent a novel metastasis repressor in human breast cancer. Both ITIH5 protein expression and ITIH5 promoter methylation may serve as prognostic biomarkers, thereby helping improve clinical patient outcome.

Molecular targets of known risk factors for the development of urological tumors, such as age, smoking, and adiposity, have not yet been elucidated. Hypermethylation of CpG islands in promoters can lead to silencing of gene expression and has frequently been detected in tumors. Age-dependent accumulation of methylation of gene promoters has been observed in various normal tissues and is discussed as a common risk factor for carcinogenesis.Here we describe the RASSF1A tumor suppressor gene as exhibiting an age-dependent promoter methylation in normal kidney tissue, which is additionally affected by the risk factors of anthracosis and adiposity. Furthermore, we found significantly increased methylation of the RASSF1A promoter when comparing peripheral versus central zone prostatic tissue samples.Preliminary expression analysis indicates that RASSF1A could be involved in early tumorigenesis. Our results support the hypothesis that age and other lifestyle-dependent factors may influence promoter methylation of specific genes, possibly serving as future individual tumor risk markers.

Die Expression von Genen, die Zellwachstum und -proliferation regulieren, ist bei Krebserkrankungen verändert oder mutiert und führt zu unkontrollierter Zellzyklus-Progression. Zu den potentesten Wachstumsregulatoren zählen sowohl TGF-β1 als auch p21 und c-myc. TGF-β1 (Transforming Growth Factor beta 1) reguliert in Assoziation mit seinem Bindungsprotein sLTBP-4 (»short form« des Latent TGF-β Binding Protein 4), das als wichtigster Modulator der TGF-β1-Bioverfügbarkeit gilt, verschiedenste Funktionen in epithelialen Zellen, wobei seine antiproliferative und somit tumorsuppressive Wirkung eine Hauptfunktion darstellt. Ein Mangel an TGF-β1 führt sowohl zu einer reduzierten Expression des tumorsuppressiven CDKI (Cyclin-abhängigen Kinaseinhibitoren) p21, als auch zu einer vermehrten Expression des Protoonkogens c-myc. Beide Mechanismen bedingen sich gegenseitig, sind somit prokanzerogen und induzieren eine verstärkte und ungehemmte Proliferation epithelialer Zellen. In einem in vitro-Modell mit der epithelialen Zelllinie HEK293T wurde in der vorliegenden Arbeit mittels quantitativer Expressionsanalyse untersucht, inwiefern p21 und c-myc in Zellen mit einer modulierten LTBP-4-Expression einer differentiellen Expression unterliegen. Ziel war hierbei das nähere Verständnis der Korrelation des TGF-β1-Bindungsproteins LTBP-4 mit dem CDKI p21 und dem Protoonkogen c-myc in der Karzinogenese epithelialer Zellen. Im Rahmen der molekularbiologischen Untersuchungen wurde zunächst das Genesilencing sowie die Überexpression des sLTBP-4-Gens in HEK293T-Zellen etabliert. Die Ergebnisse der proteinbiochemischen Untersuchungen ergänzten auf qualitativer Basis den molekularbiologischen, quantitativen Nachweis einer erfolgreichen sLTBP-4-Überexpression in HEK293T Zellen. In diesen Zellen wurde das sL4-V5-Fusionsprotein regelmäßig detektiert, was eine erfolgreiche Translation dokumentiert. In den folgenden qPCR-Analysen unterlagen die Gene TGF-β1, p21 und c-myc im vorliegenden in vitro - Modell des sLTBP-4-knock-down entgegen den Erwartungen keiner Expressionsregulation. In sLTBP-4-überexprimierten Zellen wurde eine vermehrte Genexpression von TGF-β1 und p21 sowie eine verminderte c-myc-Expression wie erwartet festgestellt. Die Ergebnisse zeigen somit eine Wechselbeziehung der untersuchten Zielgene im sLTBP-4-Überexpressionsmodell und verdeutlichen deren Expressionskorrelation in der Karzinogenese epithelialer Tumoren., The expression of genes regulating cell growth and proliferation, such as TGF-β1, p21, and c-myc, can be altered or modified in the process of carcinogenesis in epithelial tumors and therefore results in uncontrolled cell cycle progression. TGF-β1 (transforming growth factor beta 1) in association to its binding protein sLTBP-4 (»short form« of latent TGF-β binding protein 4) which is an important modulator of TGF-β1-bioavailability regulates different functions in epithelial cells. Its antiproliferative and therefore tumorsuppressive effects represent a major cellular function. A reduced availability of TGF-β1 results in reduced expression of tumorsuppressive CDKI`s (cyclin dependent kinase inhibitors), in particular p21, as well as in augmented expression of protooncogenes, in particular c-myc. Both mechanisms depend on each other, are procancerogenic and induce enhanced and unarrested proliferation of epithelial cells. In the present project it was analyzed using an in vitro model with the epithelial cell line HEK293T, wether p21 and c-myc in cells with altered LTBP-4-expression undergo a differential expression pattern themselves. The aim of this project was to get a closer insight into the correlation of the TGF-β binding protein LTBP-4 with the CDKI p21 and the protooncogene c-myc during the carcinogenic process of epithelial cells. Gene silencing as well as transient overexpression of the sLTBP-4-gene in HEK293T cells was established under in vitro conditions. The quantitative molecular biological proof of sLTBP-4 overexpression in HEK293T cells through qPCR inquisition was supported by western blot analysis. These proteinbiochemical investigations completed the qPCR survey on a qualitative basis. The sL4-V5 fusion protein was regularly detected, which documents a successful translation. The following qPCR analysis showed contrary to the expectations that there was no regulation of expression of the genes TGF-β1, p21, and c-myc in the model of sLTBP-4-knock-down. Further on it was expected to detect an enhanced gene expression of TGF-β1 and p21, as well as a reduced expression of c-myc in sLTBP-4-overexpressed cells. In this case the analysis showed an upregulation of TGF-β1- as well as p21-expression and a slightly reduced expression of the c-myc-gene. The results of this study indicate a correlation of the tested target genes in the model of sLTBP-4-overexpression and clarify their interdependency in the process of carcinogenesis in epithelial neoplasia.

The RNAi method plays a great role in target validation in drug discovery. However its usage for toxicology has not been systematically investigated. The aim of this work was to evaluate the RNAi-method for toxicological mechanistic studies and to demonstrate the impact of gene-silencing on biochemical cellular endpoints. SiRNAs were selected by a computer-supported algorithm. Efficient and reproducible delivery of siRNAs to the target cells in vitro was achieved by electroporation. The molecular knockdown of the target was monitored by mRNA- and protein expression or protein activity between 24 and 144 hours after treatment. SiRNAs were tested in vitro before application in vivo. Intraperitoneal administration of siRNA was evaluated versus hydrodynamic injection into the tail vein as a method for in vivo targeting of the liver. The following enzymes were targeted by RNAi in cell culture: ATP synthase in HepG2, farnesylpyrophosphate-synthase (FPPS) in human kidney (HK-2) cells and caspase-3 in rat primary hepatocytes. In all experiments, RNAi decreased mRNA levels and protein expression or enzymatic activities, which demonstrates the successful gene silencing. The silencing of the mitochondrial F1-ATP synthase β-subunit had no significant influence on the survival and energy metabolism of HepG2-cells. Although Oligomycin B-treatment resulted in ATP depletion and loss of mitochondrial membrane potential, the silencing did not sensitise the cells towards Oligomycin B- or Diclofenac-induced alterations of mitochondrial functions and cytotoxicity. Silencing of ATP synthase in HepG2 cells resulted in a similar transcriptional signature as Diclofenac treatments in vivo, suggesting a potential link between ATP synthase and Hepcidin, BiP and ALAS-1 by co-regulation. The FPPS silencing resulted in tendentially increased cytotoxicity of Zoledronic Acid, but had no influence on the prenylation status of small GTPases. The caspase-3/-7 inhibitor Ac-DEVD-CHO inhibited SDZ-IMM 125-mediated apoptosis. Specific gene silencing of caspase-3 resulted in reduction of SDZ IMM125-induced caspase-activation, while silencing of caspase-7 had no influence in this regard. The threshold effect of gene silencing was assessed by comparing caspase-3 silencing with the chemical caspase-inhibitor Ac-DEVD-CHO on caspase-3 activities and potential cytoprotective effects. The effect of caspase-3 silencing was equivalent to the activity of 1 μM inhibitor. The inhibitor-mediated protection on SDZ-IMM125-induced cytotoxicity was exclusively achieved at higher inhibitor concentrations, indicating that the achieved silencing effect was not sufficient for cytoprotection. In general, siRNAs have higher specificity compared to enzyme inhibitors. Chemical inhibitors are less specific and can influence enzymatic activities quantitative, in many cases irreversible and fast, thus interfering directly with the targeted pathways. SiRNAs differ in this respect, since decreases in protein expression are incomplete, only transient and slow over a period, during which cells can adapt by compensatory mechanisms and by which primary effects can be masked. Gene silencing in the liver of CD-1-mice by means of hydrodynamic injection of non-complexed chemically stabilised siRNA was possible and decreased CYP2E1 protein expression significantly. Single or repeated high-dose intraperitoneal injection of siRNAs did not lead to significant effects on either mRNA- or protein level. Further research on stability and efficient delivery of siRNAs to the target cell is inevitable before in vivo gene silencing by means of siRNAs can be applied in mechanistic toxicology. In conclusion, in vitro siRNA application is a universal and suitable specific method, which can be used in many mechanistic toxicological studies as a tool for pathway analysis and target validation. The level of inhibition achieved by application of chemical inhibitors cannot be attained by means of siRNA-mediated gene silencing. In vivo gene silencing can be achieved, but the invasive hydrodynamic method of siRNA application is not suitable for animal toxicity testing. The delivery of siRNA to specific target organs needs significant improvement. Die RNAi–Methode spielt eine grosse Rolle in der Wirkstoffentwicklung bei der Validierung eines pharmakologischen Ziels. Die Anwendbarkeit in der Toxikologie wurde noch nicht systematisch untersucht. Das Ziel dieser Arbeit ist die Evaluierung der RNAi-Methode für mechanistisch-toxikologische Studien und den Einfluss von posttranskriptioneller Genunterdrückung auf biochemisch-zelluläre Endpunkte zu zeigen. Die siRNAs wurden mit Hilfe eines computerunterstützten Algorithmus ausgewählt. Effiziente und reproduzierbare Einschleusung der siRNA in vitro wurde durch Elektroporation erreicht. Die molekulare Reduktion der Expression des Zielgens wurde auf mRNA- und Proteinexpressionslevel oder auf Proteinaktivitätsebene zwischen 24 und 144 Stunden nach Behandlung überwacht. Die siRNAs wurden in vitro getestet bevor sie in vivo angewandt wurden. Als Methode zum Erreichen der Leber in vivo wurde die intraperitoneale Gabe von siRNAs gegenüber hydrodynamischer Injektion in die Schwanzvene evaluiert. Auf folgenden Enzyme wurde mit RNAi in der Zellkultur abgezielt: ATP-Synthase in HepG2, Farnesylpyrophosphat-Synthase (FPPS) in humanen Nierenzellen (HK-2) und Caspase-3 in Primärhepatozyten der Ratte. In allen Experimenten war RNAi in der Lage, das mRNA- und Proteinexpressions- oder Proteinaktivitäts-Niveau zu reduzieren, wodurch die erfolgreiche Genunterdrückung gezeigt werden konnte. Die Unterdrückung der mitochondrialen ATP- Synthase β-Untereinheit hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Überlebensrate und den Energiestoffwechsel von HepG2-Zellen. Obwohl Oligomycin B-Behandlung zu ATP- Depletion und Verlust des mitochondiralen Membranpotentials führte, war keine Sensitivierung der Zellen gegenüber Oligomycin B- oder Diclofenac-induzierten Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials oder Zytotoxizität zu beobachten. Die Genunterdrückung der ATP-Synthase in HepG2-Zellen führte zu einer ähnlichen transkriptionellen Signatur wie Diclofenac-Behandlung in vivo, so dass eine mögliche Verbindung zwischen ATP-Synthase und Hepcidin, BiP und ALAS-1 durch Koregulation nahegelegt wird. Die Genunterdrückung von FPPS führte zu tendenziell erhöhter Zytotoxizität von Zoledronsäure, hatte aber keinen Einfluss auf den Prenylierungsstatus der kleinen GTPasen. Der Caspase-3/7-Inhibitor Ac-DEVD-CHO verhinderte SDZ IMM125-vermittelte Apoptose. Spezifische Genunterdrückung von Caspase-3 führte zur Reduktion der SDZ IMM125-induzierten Caspaseaktivität, während die Unterdrückung von Caspase-7 in dieser Hinsicht keinen Einfluss hatte. Die Effektschwelle des Genunterdrückung wurde durch Vergleich zwischen Caspase-3-silencing und Behandlung mit dem chemischen Caspase-Inhibitor Ac-DEVD-CHO auf Ebene der Caspase-3-Aktivität und der zytoprotektiven Wirksamkeit bestimmt. Der Effekt von Caspase-3-Unterdrückung war equivalent zur Wirkung von 1 μM Inhibitor. Die inhibitorvermittelte Schutzwirkung im Hinblick auf die Zytotoxizität wurde ausschliesslich bei höheren Inhibitorkonzentrationen erreicht, wodurch gezeigt wurde, dass die erreichte Genunterdrückung für zytoprotektive Wirkungen nicht ausreichend war. SiRNAs haben verglichen mit Enzyminhibitoren generell eine höhere Spezifität. Chemische Inhibitoren sind weniger spezifisch und können enzymatische Aktivitäten vollständig, in manchen Fällen irreversibel und schnell beeinflussen, so dass sie direkten Einfluss auf die zu untersuchenden Signalwege haben. SiRNAs unterscheiden sich in dieser Hinsicht, da die Abnahme des Proteins nicht vollständig, nur transient und langsam über eine Periode hinweg erfolgt, innerhalb welcher sich die Zellen durch kompensatorische Mechanismen anpassen und Primäreffekte maskiert werden können. Hydrodynamische Einschleusung von nicht-komplexierter siRNA in die Leber von CD-1-Mäusen war möglich und reduzierte die CYP2E1-Proteinexpression signifikant. Ein- oder mehrfache hochdosierte intraperitoneale Gabe von siRNA führte weder auf mRNA- noch auf Proteinebene zu signifikanten Effekten. Weitere Untersuchungen im Hinblick auf Stabilität und effiziente Einschleusung von siRNAs ist unvermeidlich, bevor siRNAs in vivo in der mechanistischen Toxikologie angewandt werden können. Zusammenfassend kann ausgesagt werden, dass die Anwendung von siRNAs in vitro eine universelle und spezifische Methode darstellt, welche in vielen mechanistisch-toxikologischen Studien als Werkzeug zur Signalweganalyse und zur Validierung von Zielproteinen eingesetzt werden kann. Die Stärke der enzymatischen Inhibition, die mit Hilfe eines chemischen Inhibitors erreicht werden kann, ist durch siRNA-vermittelte Genunterdrückung nicht zu erreichen. Genunterdrückung in vivo kann erreicht werden, doch die invasive hydrodynamische Methode ist nicht geeignet für Toxizitätsprüfungen im Tier. Die Einschleusung von siRNA in spezifische Zielorgane benötigt signifikante Verbesserung.

The enormous progress made by research of the human genome is mainly driven by newly established or improved methods for the analysis of nucleic acids and proteins. Among the methods that have gained a wide-spread use within a comparably short time are fluorescence in situ hybridization (FISH), polymerase chain reaction (PCR) including methods for quantitative PCR, and the use of short interfering RNA (siRNA) molecules aimed at gene silencing. The increasing significance of the analysis of secondary modifications of nucleic acids and proteins (genomic imprinting by DNA methylation, posttranslational protein modification) is reflected by an increasing use of mass spectrometry for the analysis and characterization of these biomolecules. Overall, in the future the research into the human genome and the interpretation of data will further benefit from these and other refined tools.

The inactivation of the tumor suppressor gene p16 plays an important role in the development of malignant tumors. P16 loss can result from point mutations, loss of heterozygosity (LOH) or methylation of the promoter region.A total of 67 samples of tumor tissue from squamous cell carcinomas of the oral cavity, the pharynx and the larynx were analysed for an inactivation of p16. The samples were obtained during surgery. In all cases there was a curative intention. Point mutations were detected by DNA sequencing. Methylation of the promotor region was explored with a methylation-specific PCR. A microsatellite analysis of the tumor tissue was used to search for LOH.The results of the molecularbiological investigations were correlated to the known clinical prognostic parameters (tumor stadium, grading, patho-histological differentiation, local and regional recurrence) after a follow-up period of approximately 3 years. Methylation of the promotor region and LOH were the main mechanisms of p16 inactivation encountered in this study. Point mutations presented as rare events. The methylation of the promotor region appeared frequently parallel with an LOH. An inactivation of p16 did not have any statistical influence on the tumor dependent survival, the lymphatic spread, the number and time delay of local and regional recurrences. Patients with an inactivated p16 gene by promotor methylation appeared to have a slightly lower tendency for local and regional recurrences.The inactivation of the tumor suppressor gene p16 plays a role in the carcinogenesis of squamous cell carcinomas of the oral cavity, the pharynx and the larynx. There is no influence on the tumor dependent prognosis. Tumors with an inactivated p16 gene tend to have a lower recurrence rate.

Das Himbeerringflecken Nepovirus (RpRSV) ist eines der Viren, welches in den Komplex der Reisigkrankheit an Reben involviert ist. Es existieren zwei verschiedene Stämme von RpRSV: den ?grapevine? ? Stamm (RpRSV-g) und den in Deutschland bedeutenderen ?cherry? ? Stamm (RpRSV-ch). Beide Stämme haben zwei RNA Stränge (RNA1 und RNA2). Beide Stränge haben ein Genom gebundenes Protein am 5' Ende und sind am 3' Ende polyadenyliert. Die RNA Stränge haben ein großes offenes Leseraster flankiert von einer 5' und 3' nicht kodierenden Region. Die offenen Leseraster kodieren für ein großes Polyprotein, welches proteolytisch in kleinere funktionelle Proteine gespaltet wird. Die Ziele der Arbeit waren die Herstellung von RpRSV resistenten Unterlagsreben sowie die genauere Charakterisierung von RpRSV. Die Strategie der Virusresistenz war die Herstellung eine Genkonstruktes, welches ein ?Gene Silencing? der Virusgene induzieren sollte. Nicotiana benthamiana wurde hierzu als Testsystem verwendet. Da keine RpRSV Sequenzdaten existierten, wurden beide Stämme von RpRSV sequenziert. Die RpRSV Stämme wurden in Chenopodium quinoa vermehrt. Die virale RNA wurde isoliert, doppelsträngige cDNA synthetisiert, kloniert und sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden intensiv miteinander verglichen. Eine Sequenz der 3' nicht kodierenden Region der RNA2 von RpRSV-ch wurde für die Herstellung eines Genkonstruktes ausgewählt. Mit der Sequenz wurde ein ?inverted repeat?, separiert von einem pflanzlichen Intron, hergestellt. Dieses Konstrukt wurde unter der Kontrolle eines 35S Promotors in die Transformationsvektoren pPZPnptII und pPZPbar kloniert. Nicotiana benthamiana wurden mittels Agrobakterien vermittelter Transformation transformiert. Die T2 Generationen der regenerierten transgenen Pflanzen wurden hinsichtlich ihrer RpRSV ? Resistenz getestet. Weiterhin wurden ?full length? Klone der RNA1 und RNA2 von RpRSV-g hergestellt. Hierzu wurde die doppelsträngige cDNA beider RNA Stränge unter der Kontrolle eines 35S Promotors kloniert. Mit den Klonen wurden erfolgreiche Infektionsexperimente durchgeführt in Chenopodium quinoa durchgeführt. The Raspberry Ringspot Nepovirus (RpRsV) is one of the viruses responsible for the fanleaf disease of grapevine. Two different serological strains of RpRSV exist: the grapevine strain (RpRSV-g) and the cherry strain (RpRSV-ch), which occurs in Germany and Switzerland. RpRSV has two RNAs (RNA1 and RNA2). Both have a genome-linked protein at the 5' ends and are polyadenylated at the 3' ends. RNA1 and RNA2 have one open reading frame flanked by 5' and 3' non-coding regions. The ORFs encode for one large polyprotein which is proteolytically cleaved in smaller functional proteins. The aims of the work were to produce RpRSV grapevine plants and the closer characterisation of RpRSV. The strategy was to create a gene construct, which should induce a gene silencing against the viruses in the grapevine rootstocks. Nicotiana benthamiana was chosen as a test system for the constructs. Because there was no sequence data available both strains were sequenced. The RpRSV strains were propagated in Chenopodium quinoa. The viral RNAs were purified, cDNA synthesized, cloned and sequenced. The sequences were compared and multiple alignments were performed. A sequence from the RNA2 3' non-coding region of RpRSV-ch was selected for the gene construct. An inverted repeat of this sequence was generateted, separated by a plant intron sequence. This construct under the control of a 35S promotor was cloned in the transformation vectors pPZPnptII (antibiotic resistance) and pPZPbar (herbicide resistance). Agrobacterium mediated transformation of Nicotiana benthamiana has been carried out. The T2 generation of the regenerated transgenic tobacco lines were tested for RpRSV resistance. Furthermore full-length clones of the RNA1 and RNA2 of RpRSV-g were produced. Therefore the full-length ds cDNA of both RNA strains were cloned under the control of a 35S promotor. Infection experiments in Chenopodium quinoa with the full clones have successfully been carried out.

Nach stabiler Integration von Transgenen kommt es häufig zu Veränderungen in der Expression der Transgene bis hin zur vollständigen Geninaktivierung. In den meisten Forschungsarbeiten über Inaktivierung von Genen in höheren Pflanzen wurde in diesem Zusammenhang in der Regel das Vorhandensein von homologen DNA-Sequenzen beobachtet. Diese Homologien und das damit einhergehende "gene silencing" betraf entweder die ins pflanzliche Genom eingebrachten Fremdgene selbst, wenn mehrere Kopien ins Genom integriert wurden, oder endogene Gene, wenn zusätzlich homologe Sequenzen ins Genom integriert wurden. Nur in wenigen Fällen wurde der Verlust oder die Reduktion der Genexpression nach der Integration einer Kopie der Fremd-DNA beschrieben. Basierend auf diesen Forschungsstand wurden für die Generationsanalyse Pflanzen ausgewählt, die jeweils nur eine Kopie der T-DNA integriert hatten. Für die Untersuchungen zur Stabilität und Expression von zwei Transgenen in mehreren aufeinanderfolgenden Selbstungsgenerationen wurden Samen von zwei unabhängigen transgenen Vicia narbonensis-Linien verwendet. Die transgenen Linien wurden durch Agrobakterien vermittelte Transformation mit dem Agrobakterium tumefaciens-Stamm C58CI, der das kointegrative Plasmid pGV3850Hygro enthielt, hergestellt. Das Plasmid trägt ein in höheren Pflanzen aktives Hygromycinphosphotransferasegen (HPT-Gen) mit dem CaMV 35S-Promotor und ein Nopalinsynthasegen (NOS-Gen) mit vorgeschaltetem NOS-Promotor. Im Laufe der ersten Untersuchungen zur Kosegregation der Expression der beiden Transgene zeigte sich, daß einige Nachkommen beider Linien einen Verlust der Expression des HPT-Gens aufwiesen, während das NOS-Gen über alle untersuchten Generationen in beiden Linien stabil exprimiert wurde. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit galt die besondere Aufmerksamkeit dem Phänomen des "gene silencing" und den in diesem Zusammenhang beobachteten DNA-Methylierungen. Mit Hilfe der Bisulfit-Modifikation der DNA wurden vergleichende Analysen zum Methylierungsstatus der vorgeschalteten Promotoren und einer 200bp-Sequenz der 5'-Enden beider Strukturgene durchgeführt. Insbesondere wurde der Einfluß von starken Temperaturdifferenzen während der Entwicklung der Pflanzen auf die Expression der beiden Fremdgene untersucht. Im Zusammenhang mit dem "gene silencing" des HPT-Gens von Pflanzen, welche unter klimatisierten Gewächshausbedingungen kultiviert wurden, konnten Hypermethylierungen innerhalb des 35S-Promotors beobachtet werden. Erstaunlicherweise fand sich jedoch keine Korrelation zwischen der Inaktivierung des HPT-Gens und Hypermethylierungen innerhalb der 35S-Promotorsequenz bei Pflanzen, welche im nicht klimatisierten Gewächshaus starken Temperaturschwankungen und hohen Temperaturen ausgesetzt waren. Unabhängig davon, ob das HPT-Gen stabil exprimiert oder inaktiviert wurde, zeigten alle Pflanzen beider Linien Hypermethylierungen innerhalb der 35S-Promotorregion und der analysierten Sequenz des HPT-Gens. Diese Ergebnisse weisen daraufhin, daß DNA- Methylierungen nicht allein die Ursache von Geninaktivierungen sind, sondern daß andere Faktoren maßgeblich beteiligt sein müssen., Insertion of foreign DNA into plant genomes frequently results in the identification of transgenic plants with silenced transgenes. This stable but potentially reversible loss of gene activity resembles epigenetic changes. In most studies of genetically transformed plants, transgene inactivation has been correlated with multiple (complete or incomplete) copies of the transgene. The expression of single-copy transgene loci may also be negativly influenced, e.g. by chromosomal location. In order to study the presence and the inheritance of genes introduced into the grain legume Vicia narbonensis, the progeny of two independent homozygous transgenic lines that were obtained by transformation with Agrobacterium-strain C58CI carrying the plasmid pGV3850Hygro was analysed. This cointegrate vector contains the coding sequence for the hygromycin-phosphotransferase gene (HPT-gene) driven by the CaMV 35S promoter, and the nopaline-synthase gene (NOS-gene) driven by the nos-promoter. Initial transformants harbouring a single copy integration of the T-DNA and the progeny of two such clones was analysed in detail. The transgenes were inherited in the first generation according to Mendelian laws. During self-pollination prozesses, homozygous sublines were obtained and further characterised. In order to follow the transmission of the two foreign genes for a long period, biochemical and molecular analyses were performed up to the seventh generation. To examine the influence of environmental effects, plants were grown up in glasshouses with and without air-condition (high temperatur stress). Methylation-analyses at the 35S promoter and the HPT-gene of plants with silenced HPT-gene which were raised in air-conditioned glasshouses showed hypermethylation within the 35S promoter sequenz. Surprisingly, no correlation was found between hypermethylation within the promoter region and gene silencing in plants grown up under high temperatur stress in non-airconditioned glasshouses. All these plants regardless whether the HPT-gene was inactivated or not showed hypermethylation at the 35S promoter and the analysed HPT sequence. This results indicates that DNA methylation alone is not required for gene inactivation.