Molecular analysis of the Raspberry Ringspot Nepovirus (RpRSV) and establishing of a construct for the induction of a RpRSV resistance in vine

Das Himbeerringflecken Nepovirus (RpRSV) ist eines der Viren, welches in den Komplex der Reisigkrankheit an Reben involviert ist. Es existieren zwei verschiedene Stämme von RpRSV: den ?grapevine? ? Stamm (RpRSV-g) und den in Deutschland bedeutenderen ?cherry? ? Stamm (RpRSV-ch). Beide Stämme haben zwei RNA Stränge (RNA1 und RNA2). Beide Stränge haben ein Genom gebundenes Protein am 5' Ende und sind am 3' Ende polyadenyliert. Die RNA Stränge haben ein großes offenes Leseraster flankiert von einer 5' und 3' nicht kodierenden Region. Die offenen Leseraster kodieren für ein großes Polyprotein, welches proteolytisch in kleinere funktionelle Proteine gespaltet wird. Die Ziele der Arbeit waren die Herstellung von RpRSV resistenten Unterlagsreben sowie die genauere Charakterisierung von RpRSV. Die Strategie der Virusresistenz war die Herstellung eine Genkonstruktes, welches ein ?Gene Silencing? der Virusgene induzieren sollte. Nicotiana benthamiana wurde hierzu als Testsystem verwendet. Da keine RpRSV Sequenzdaten existierten, wurden beide Stämme von RpRSV sequenziert. Die RpRSV Stämme wurden in Chenopodium quinoa vermehrt. Die virale RNA wurde isoliert, doppelsträngige cDNA synthetisiert, kloniert und sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden intensiv miteinander verglichen. Eine Sequenz der 3' nicht kodierenden Region der RNA2 von RpRSV-ch wurde für die Herstellung eines Genkonstruktes ausgewählt. Mit der Sequenz wurde ein ?inverted repeat?, separiert von einem pflanzlichen Intron, hergestellt. Dieses Konstrukt wurde unter der Kontrolle eines 35S Promotors in die Transformationsvektoren pPZPnptII und pPZPbar kloniert. Nicotiana benthamiana wurden mittels Agrobakterien vermittelter Transformation transformiert. Die T2 Generationen der regenerierten transgenen Pflanzen wurden hinsichtlich ihrer RpRSV ? Resistenz getestet. Weiterhin wurden ?full length? Klone der RNA1 und RNA2 von RpRSV-g hergestellt. Hierzu wurde die doppelsträngige cDNA beider RNA Stränge unter der Kontrolle eines 35S Promotors kloniert. Mit den Klonen wurden erfolgreiche Infektionsexperimente durchgeführt in Chenopodium quinoa durchgeführt. The Raspberry Ringspot Nepovirus (RpRsV) is one of the viruses responsible for the fanleaf disease of grapevine. Two different serological strains of RpRSV exist: the grapevine strain (RpRSV-g) and the cherry strain (RpRSV-ch), which occurs in Germany and Switzerland. RpRSV has two RNAs (RNA1 and RNA2). Both have a genome-linked protein at the 5' ends and are polyadenylated at the 3' ends. RNA1 and RNA2 have one open reading frame flanked by 5' and 3' non-coding regions. The ORFs encode for one large polyprotein which is proteolytically cleaved in smaller functional proteins. The aims of the work were to produce RpRSV grapevine plants and the closer characterisation of RpRSV. The strategy was to create a gene construct, which should induce a gene silencing against the viruses in the grapevine rootstocks. Nicotiana benthamiana was chosen as a test system for the constructs. Because there was no sequence data available both strains were sequenced. The RpRSV strains were propagated in Chenopodium quinoa. The viral RNAs were purified, cDNA synthesized, cloned and sequenced. The sequences were compared and multiple alignments were performed. A sequence from the RNA2 3' non-coding region of RpRSV-ch was selected for the gene construct. An inverted repeat of this sequence was generateted, separated by a plant intron sequence. This construct under the control of a 35S promotor was cloned in the transformation vectors pPZPnptII (antibiotic resistance) and pPZPbar (herbicide resistance). Agrobacterium mediated transformation of Nicotiana benthamiana has been carried out. The T2 generation of the regenerated transgenic tobacco lines were tested for RpRSV resistance. Furthermore full-length clones of the RNA1 and RNA2 of RpRSV-g were produced. Therefore the full-length ds cDNA of both RNA strains were cloned under the control of a 35S promotor. Infection experiments in Chenopodium quinoa with the full clones have successfully been carried out.