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Non-small cell lung cancer (NSCLC) patients whose tumors display activating mutations of the epidermal growth factor receptor (EGFR) are treated in the first line with tyrosine kinase inhibitors (TKIs) of this receptor, including osimertinib. After an initial response, the tumors almost invariably relapse, as a result of the emergence of subpopulations of resistant clones, which can be already present before the onset of the treatment. Our group recently developed CRISPR-barcoding, a novel approach to recapitulate and investigate oncogenic mutations in a context that mimics intratumor heterogeneity. Using cell models generated through this approach, we performed a small-molecule screen and identified the multikinase inhibitor sorafenib for its capacity to prevent the amplification of NSCLC cells insensitive to EGFR inhibition. During my thesis, we showed that, in combination with osimertinib, sorafenib decreases the selective advantage of EGFR-TKI resistant cells, while preserving the response of sensitive cells. Sorafenib acts independently of MAPKs through a complex mechanism involving early inhibition of MAPK interacting kinases 1/2 catalytic activity and STAT3 phosphorylation. At later time points, this compound induces down-regulation of the pro-apoptotic factor MCL-1 and promotes EGFR degradation by the lysosomes. Using NSCLC established lines and patientderived cells, we showed that sorafenib can prevent the emergence of cell subpopulations containing different types of resistance mutations identified in patients, including EGFRC797S, KRAS-G12D, BRAF-V600E, PIK3CA-E545K, or the amplification of other receptor tyrosine kinases, such as MET and HER2. We confirmed these results in vivo using NSCLCCRISPR-barcoding models, which revealed that the osimertinib-sorafenib combination can substantially delay tumor progression. Together, my studies support a new therapeutic strategy to prolong NSCLC response to EGFR-TKIs by abolishing the selective advantage of resistant cells, thus resulting in a global inhibition of drug-induced clonal evolution., Les patients atteints de cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC) avec mutations activatrices de l'epidermal growth factor receptor (EGFR) sont traités en première ligne avec des inhibiteurs de l’activité tyrosine kinase (TKIs) de ce récepteur, tels que l’osimertinib.Malheureusement, après une phase initiale de réponse, presque invariablement les patients rechutent, suite à l'émergence de sous-populations de clones résistants, souvent déjà présents avant le début du traitement. Notre équipe a récemment mis au point une nouvelle stratégie basée sur CRISPR/Cas9 pour récapituler et étudier l'hétérogénéité intratumorale, que nous avons appelée CRISPR-barcoding. En utilisant des modèles cellulaires générés par cette approche, nous avons réalisé un criblage de petites molécules, qui nous a permis d’identifier l’inhibiteur multikinase sorafenib pour sa capacité à prévenir l’amplification des cellules de CBNPC insensibles aux EGFR-TKIs.Dans mes travaux de thèse, nous avons montré que, en combinaison avec l’osimertinib,le sorafenib réduit l’avantage sélectif des cellules résistantes à l’inhibition d’EGFR, tout en préservant la réponse des cellules sensibles. Le sorafenib agit par un mécanisme complexe et indépendant des MAPKs, qui implique l’inhibition précoce de l’activité catalytique des MAPK interacting kinases 1/2 et de la phosphorylation du facteur de transcription STAT3. A des stades plus tardifs, ce composé provoque une réduction de l’expression du facteur anti-apoptotique MCL-1 et promeut la dégradation de l’EGFR par les lysosomes. En utilisant des lignées cellulaires et des patient-derived cells de CBNPC, nous avons montré que le sorafenib empêche l’émergence de sous-populations contenant différentes mutations identifiées chez les patients, telles que EGFR-C797S, KRAS-G12D, BRAF-V600E, PIK3CA-E545K, ou l’amplification d’autres récepteurs à activité tyrosine kinase, comme MET et HER2. Nous avons pu confirmer ces résultats in vivo dans des modèles CRISPR-barcoding de CBNPC, qui ont révélé que la combinaison osimertinib-sorafenib retarde fortement la progression tumorale. En conclusion, mes travaux de thèse proposent une nouvelle approche thérapeutique, quivise à prolonger la réponse du CBNPC aux EGFR-TKIs en prévenant l’évolution clonale induite par le traitement via l’abolition de l’avantage sélectif des cellules résistantes.

Chronic myeloid leukemia (CML) is a rare myeloproliferative neoplasm whose prognosis has been transformed since the 2000s by tyrosine kinase inhibitors (TKI). The dramatic increase in patients' life expectancy has led to an increase in the prevalence of CML. CML has become a chronic disease that requires daily TKI treatment for several years, but which is compatible with a normal life span for the majority of patients. TKI are expensive treatments that, taken over the long term by an increasing number of patients, increase the economic burden of the disease. TKI have side effects that affect patients' quality of life. In France, however, there is little data on the prevalence of CML, on the economic burden and quality of life.The National Health Data System (Système National des Données de Santé, SNDS) is a health care claims database that covers 98,8% of the French population and contains exhaustive data on health cares reimbursed by the Health Insurance. We built and validated an algorithm identifying patients with CML in the SNDS, based on their healthcare consumption and estimated the prevalence of the disease on December 31st, 2014. On the population identified by the algorithm, we estimated the cost of TKI in 2013 and 2014 from a health insurance perspective. We also conducted a survey in CML patients to collect their quality of life data using generic (EuroQol EQ-5D-3L), cancer-specific (EORTC-QLQ-C30) and CML-specific (EORTC-QLQ-CML-24) questionnaires. Utility values in CML patients were assessed using the French EQ-5D-3L value set.The algorithm identified 10,789 patients with CML in France in 2014, corresponding to a crude prevalence of the disease of 16.3 per 100,000 inhabitants [95% confidence interval 16.0-16.6]. In the 10,158 prevalent CML patients in 2013, the reimbursement for TKI amounted to €238 million, all insurance schemes combined. This amount increased to €247 million for the 10,789 patients prevalent in 2014. In 2014, imatinib accounted for about 55% of TKI reimbursements, followed by nilotinib (22%) and dasatinib (22%). The quality of life in CML patients was significantly impaired compared to the general population of the same sex and age, mainly in the dimensions of social functioning, role functioning and cognitive functioning. Fatigue, dyspnea and pain were the symptoms with the highest deviation from general population norms. The mean utility score (standard deviation) was 0.72 (0.25) for patients in chronic phase and 0.84 (0.21) for patients in remission without treatment.Beyond the epidemiological, clinical and economic results, this work demonstrates that using a database such as the SNDS for research is feasible, relevant but also complex in rare diseases such as CML.; La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une hémopathie maligne rare dont le pronostic a été transformé à partir des années 2000 par les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK). L’augmentation spectaculaire de l’espérance de vie des patients a conduit à une augmentation de la prévalence de la LMC. D’une maladie mortelle à moyen terme, la LMC est devenue une maladie chronique nécessitant la prise quotidienne d’ITK pendant plusieurs années. Les ITK sont des traitements onéreux qui, pris au long cours par un nombre croissant de patients, augmentent le fardeau économique de la maladie. Ces traitements ne sont pas dénués d’effets secondaires qui peuvent altérer la qualité de vie des patients. En France, il existe cependant peu de données sur la prévalence, la qualité de vie et les coûts induits par la maladie.Le Système National des Données de Santé (SNDS) est une base de données médico-administratives couvrant 98,8% de la population française et contenant les données exhaustives de consommation de soins remboursés par l’Assurance Maladie. Nous avons construit et validé un algorithme d’identification des patients ayant une LMC dans le SNDS à partir de leur consommation de soins et estimé la prévalence de la maladie au 31 décembre 2014. Sur la population de patients identifiés par l’algorithme, nous avons estimé le coût des ITK en 2013 et en 2014 en adoptant la perspective de l’Assurance Maladie. Nous avons complété ce travail par une enquête transversale réalisée en 2018 auprès de patients atteints de LMC pour recueillir leurs données de qualité de vie à l’aide d’un questionnaire générique (EuroQol EQ-5D-3L), d’un questionnaire spécifique au cancer (EORTC-QLQ-C30) complété par son module spécifique à la LMC (EORTC-QLQ-CML-24).L’algorithme a identifié 10 789 patients ayant une LMC en France au 31 décembre 2014, correspondant à une prévalence brute de la maladie de 16,3 pour 100 000 habitants [intervalle de confiance à 95% 16,0-16,6]. Pour la population prévalente de 10 158 patients atteints de LMC en 2013, le montant total des ITK remboursés par l’Assurance Maladie était de 238 millions d’euros, tous régimes confondus. Ce montant s’élevait à 247 millions d’euros pour les 10 789 patients prévalents en 2014. En 2014, l’imatinib représentait environ 55% de ce montant, suivi par le nilotinib (22%) et le dasatinib (22%). La qualité de vie des patients ayant une LMC est sensiblement altérée par rapport à celle de la population générale de même sexe et de même âge avec une altération de la fonction sociale, du niveau d’activité et de la fonction cognitive. La fatigue, la dyspnée et la douleur sont des symptômes marqués. La valeur moyenne d’utilité (écart-type) était de 0,72 (0,25) pour les patients en phase chronique et de 0,84 (0,21) pour les patients en rémission sans traitement.Au-delà des résultats épidémiologiques, cliniques et économiques, ce travail démontre la faisabilité, la pertinence mais aussi la complexité de l’utilisation d’une base de de données telle que le SNDS pour étudier des pathologies rares comme la LMC.

Chronic myeloid leukemia (CML) is a rare myeloproliferative neoplasm whose prognosis has been transformed since the 2000s by tyrosine kinase inhibitors (TKI). The dramatic increase in patients' life expectancy has led to an increase in the prevalence of CML. CML has become a chronic disease that requires daily TKI treatment for several years, but which is compatible with a normal life span for the majority of patients. TKI are expensive treatments that, taken over the long term by an increasing number of patients, increase the economic burden of the disease. TKI have side effects that affect patients' quality of life. In France, however, there is little data on the prevalence of CML, on the economic burden and quality of life.The National Health Data System (Système National des Données de Santé, SNDS) is a health care claims database that covers 98,8% of the French population and contains exhaustive data on health cares reimbursed by the Health Insurance. We built and validated an algorithm identifying patients with CML in the SNDS, based on their healthcare consumption and estimated the prevalence of the disease on December 31st, 2014. On the population identified by the algorithm, we estimated the cost of TKI in 2013 and 2014 from a health insurance perspective. We also conducted a survey in CML patients to collect their quality of life data using generic (EuroQol EQ-5D-3L), cancer-specific (EORTC-QLQ-C30) and CML-specific (EORTC-QLQ-CML-24) questionnaires. Utility values in CML patients were assessed using the French EQ-5D-3L value set.The algorithm identified 10,789 patients with CML in France in 2014, corresponding to a crude prevalence of the disease of 16.3 per 100,000 inhabitants [95% confidence interval 16.0-16.6]. In the 10,158 prevalent CML patients in 2013, the reimbursement for TKI amounted to €238 million, all insurance schemes combined. This amount increased to €247 million for the 10,789 patients prevalent in 2014. In 2014, imatinib accounted for about 55% of TKI reimbursements, followed by nilotinib (22%) and dasatinib (22%). The quality of life in CML patients was significantly impaired compared to the general population of the same sex and age, mainly in the dimensions of social functioning, role functioning and cognitive functioning. Fatigue, dyspnea and pain were the symptoms with the highest deviation from general population norms. The mean utility score (standard deviation) was 0.72 (0.25) for patients in chronic phase and 0.84 (0.21) for patients in remission without treatment.Beyond the epidemiological, clinical and economic results, this work demonstrates that using a database such as the SNDS for research is feasible, relevant but also complex in rare diseases such as CML.; La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une hémopathie maligne rare dont le pronostic a été transformé à partir des années 2000 par les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK). L’augmentation spectaculaire de l’espérance de vie des patients a conduit à une augmentation de la prévalence de la LMC. D’une maladie mortelle à moyen terme, la LMC est devenue une maladie chronique nécessitant la prise quotidienne d’ITK pendant plusieurs années. Les ITK sont des traitements onéreux qui, pris au long cours par un nombre croissant de patients, augmentent le fardeau économique de la maladie. Ces traitements ne sont pas dénués d’effets secondaires qui peuvent altérer la qualité de vie des patients. En France, il existe cependant peu de données sur la prévalence, la qualité de vie et les coûts induits par la maladie.Le Système National des Données de Santé (SNDS) est une base de données médico-administratives couvrant 98,8% de la population française et contenant les données exhaustives de consommation de soins remboursés par l’Assurance Maladie. Nous avons construit et validé un algorithme d’identification des patients ayant une LMC dans le SNDS à partir de leur consommation de soins et estimé la prévalence de la maladie au 31 décembre 2014. Sur la population de patients identifiés par l’algorithme, nous avons estimé le coût des ITK en 2013 et en 2014 en adoptant la perspective de l’Assurance Maladie. Nous avons complété ce travail par une enquête transversale réalisée en 2018 auprès de patients atteints de LMC pour recueillir leurs données de qualité de vie à l’aide d’un questionnaire générique (EuroQol EQ-5D-3L), d’un questionnaire spécifique au cancer (EORTC-QLQ-C30) complété par son module spécifique à la LMC (EORTC-QLQ-CML-24).L’algorithme a identifié 10 789 patients ayant une LMC en France au 31 décembre 2014, correspondant à une prévalence brute de la maladie de 16,3 pour 100 000 habitants [intervalle de confiance à 95% 16,0-16,6]. Pour la population prévalente de 10 158 patients atteints de LMC en 2013, le montant total des ITK remboursés par l’Assurance Maladie était de 238 millions d’euros, tous régimes confondus. Ce montant s’élevait à 247 millions d’euros pour les 10 789 patients prévalents en 2014. En 2014, l’imatinib représentait environ 55% de ce montant, suivi par le nilotinib (22%) et le dasatinib (22%). La qualité de vie des patients ayant une LMC est sensiblement altérée par rapport à celle de la population générale de même sexe et de même âge avec une altération de la fonction sociale, du niveau d’activité et de la fonction cognitive. La fatigue, la dyspnée et la douleur sont des symptômes marqués. La valeur moyenne d’utilité (écart-type) était de 0,72 (0,25) pour les patients en phase chronique et de 0,84 (0,21) pour les patients en rémission sans traitement.Au-delà des résultats épidémiologiques, cliniques et économiques, ce travail démontre la faisabilité, la pertinence mais aussi la complexité de l’utilisation d’une base de de données telle que le SNDS pour étudier des pathologies rares comme la LMC.

Pazopanib and sunitinib are tyrosine kinase inhibitors (TKI) approved for the treatment of various cancers. They are taken orally for a long time and are extensively metabolized in the liver by cytochromes P450. They are associated with serious hepatotoxicity and drug-drug interactions that may be related to their metabolites, including the formation of reactive metabolites. Using a biomimetic chemical catalytic system, composed of a metalloporphyrin and a single oxygen atom donor, reactive aromatic aldehydes were characterized for the first time for these two TKI. They were also detected in human liver microsomal incubations, considered as a reliable model of hepatic metabolism, and in plasma samples of patients treated with pazopanib or sunitinib. The reactivity of these aromatic aldehydes with amines has been demonstrated in vitro since adducts on lysine side chains of human proteins, CYP3A4 and albumin, have been detected. These results lead to consider the involvement of pazopanib and sunitinib reactive aldehydes in the onset of hepatotoxicity and drug-drug interactions in vivo. In order to monitor the drug to metabolite ratio on suspicion of drug-drug interaction or noncompliance, an UPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of pazopanib and its hydroxylated and N-desmethyl metabolites in plasma has been developed and validated. The study of relationships between metabolite plasma levels and the occurrence of toxicities in pharmacokinetic studies will also be possible., Le pazopanib et le sunitinib sont des inhibiteurs de tyrosine kinases (ITK) indiqués dans le traitement de différents cancers. Ils s'administrent par voie orale au long cours et sont fortement métabolisés au niveau hépatique par les cytochromes P450. Ils sont associés à une hépatotoxicité sévère et à la survenue d'interactions médicamenteuses qui pourraient être liées à leurs métabolites, notamment à la formation de métabolites réactifs. En utilisant un système catalytique chimique biomimétique, composé d'une métalloporphyrine et d'un donneur d'atome d'oxygène, des aldéhydes aromatiques réactifs ont été caractérisés pour la première fois pour ces deux ITK. Ils ont aussi été détectés dans des incubations de microsomes hépatiques humains, un modèle validé de métabolisme hépatique, et dans des prélèvements plasmatiques de patients traités par pazopanib ou sunitinib. La réactivité de ces aldéhydes aromatiques vis-à-vis des amines a été mise en évidence in vitro sous la forme d'adduits avec les chaînes latérales des résidus lysine de protéines humaines, le CYP3A4 et l'albumine. Ces résultats conduisent à considérer l'implication des métabolites aldéhydes réactifs du pazopanib et du sunitinib dans l'hépatotoxicité et la survenue d'interactions médicamenteuses in vivo. Afin de réaliser un suivi du ratio métabolique en cas de suspicion d'interaction médicamenteuse ou d'inobservance, une méthode UPLC-MS/MS pour la (semi)-quantification simultanée du pazopanib et de ses métabolites hydroxylés et N-déméthylé dans le plasma a été développée et validée. Elle permettra aussi d'étudier les relations entre les concentrations plasmatiques en métabolites et la survenue de toxicités au cours d'études pharmacocinétiques.

Pazopanib and sunitinib are tyrosine kinase inhibitors (TKI) approved for the treatment of various cancers. They are taken orally for a long time and are extensively metabolized in the liver by cytochromes P450. They are associated with serious hepatotoxicity and drug-drug interactions that may be related to their metabolites, including the formation of reactive metabolites. Using a biomimetic chemical catalytic system, composed of a metalloporphyrin and a single oxygen atom donor, reactive aromatic aldehydes were characterized for the first time for these two TKI. They were also detected in human liver microsomal incubations, considered as a reliable model of hepatic metabolism, and in plasma samples of patients treated with pazopanib or sunitinib. The reactivity of these aromatic aldehydes with amines has been demonstrated in vitro since adducts on lysine side chains of human proteins, CYP3A4 and albumin, have been detected. These results lead to consider the involvement of pazopanib and sunitinib reactive aldehydes in the onset of hepatotoxicity and drug-drug interactions in vivo. In order to monitor the drug to metabolite ratio on suspicion of drug-drug interaction or noncompliance, an UPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of pazopanib and its hydroxylated and N-desmethyl metabolites in plasma has been developed and validated. The study of relationships between metabolite plasma levels and the occurrence of toxicities in pharmacokinetic studies will also be possible.; Le pazopanib et le sunitinib sont des inhibiteurs de tyrosine kinases (ITK) indiqués dans le traitement de différents cancers. Ils s'administrent par voie orale au long cours et sont fortement métabolisés au niveau hépatique par les cytochromes P450. Ils sont associés à une hépatotoxicité sévère et à la survenue d'interactions médicamenteuses qui pourraient être liées à leurs métabolites, notamment à la formation de métabolites réactifs. En utilisant un système catalytique chimique biomimétique, composé d'une métalloporphyrine et d'un donneur d'atome d'oxygène, des aldéhydes aromatiques réactifs ont été caractérisés pour la première fois pour ces deux ITK. Ils ont aussi été détectés dans des incubations de microsomes hépatiques humains, un modèle validé de métabolisme hépatique, et dans des prélèvements plasmatiques de patients traités par pazopanib ou sunitinib. La réactivité de ces aldéhydes aromatiques vis-à-vis des amines a été mise en évidence in vitro sous la forme d'adduits avec les chaînes latérales des résidus lysine de protéines humaines, le CYP3A4 et l'albumine. Ces résultats conduisent à considérer l'implication des métabolites aldéhydes réactifs du pazopanib et du sunitinib dans l'hépatotoxicité et la survenue d'interactions médicamenteuses in vivo. Afin de réaliser un suivi du ratio métabolique en cas de suspicion d'interaction médicamenteuse ou d'inobservance, une méthode UPLC-MS/MS pour la (semi)-quantification simultanée du pazopanib et de ses métabolites hydroxylés et N-déméthylé dans le plasma a été développée et validée. Elle permettra aussi d'étudier les relations entre les concentrations plasmatiques en métabolites et la survenue de toxicités au cours d'études pharmacocinétiques.

The characterization of malignant tumour growth and the understanding of resistance mechanisms to treatment in cancer is of utmost importance for the discovery of novel “druggable” targets. Efficient genetic screening, now even more possible with the convergence of CRISPR-Cas9 gene editing technology, next-generation sequencing and bioinformatics, is an important tool for deciphering novel cellular processes, such as resistance to treatment in cancer. Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder characterised by the t(9;22) genetic abnormality, which encodes the driver of CML, the BCR-ABL1 fusion protein. Imatinib mesylate, a tyrosine kinase inhibitor, specifically eliminates CML cells by targeting and blocking the kinase activity of this protein, yet, as for all targeted therapies in cancer, resistance to treatment exists. In order to discover alternative BCR-ABL1 independent mechanisms of imatinib resistance, we utilized the genome-scale CRISPR knock-out library GeCKO v2 to screen for imatinib sensitising genes in vitro on K562 cells. We revealed genes that seem essential for imatinib induced cell death, such as pro-apoptotic genes (BIM, BAX) or MAPK inhibitor SPRED2. Specifically re-establishing apoptotic capabilities in BIM knock-out (KO) cells with BH3-mimetics, or inhibiting MAP-kinase signalling in SPRED2 KO cells with MEK inhibitors restores sensitivity to imatinib, overcoming resistance phenotypes. In this work, we discovered previously identified pathways (apoptosis, MAP-kinase signalling) and novel pathways that modulate response to imatinib in CML cell lines, such as the implication of the Mediator complex, mRNA processing and protein ubiquitinylation. Targeting these specific genetic lesions with combinational therapy can overcome resistance phenotypes and paves the road for the use of precision oncology., La caractérisation des tumeurs malignes et la compréhension des mécanismes de résistance aux traitements anticancéreux sont essentielles pour la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques. Les criblages génétiques, devenus encore plus puissants avec la technologie d’édition du génome CRISPR-Cas9, le séquençage nouvelle génération et la bioinformatique, sont des outils formidables pour décrypter de nouveaux mécanismes cellulaires, dont la résistance au traitement. La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un syndrome myéloprolifératif qui est caractérisé par l’anomalie génétique t(9;22). Cette aberration chromosomique est à l’origine du gène de fusion BCR-ABL1 qui code l’oncogène du même nom responsable de la prolifération anarchique des cellules. L’imatinib mesylate, un inhibiteur de tyrosine kinase, élimine de manière spécifique les cellules leucémiques en ciblant et en bloquant l’activité kinase de cette protéine. Malheureusement, comme pour tout type de thérapie ciblée, une résistance au traitement survient chez certains patients. Afin de repérer des nouvelles voies de résistance à cet inhibiteur de tyrosine kinase, nous avons effectué un criblage génétique avec la librairie « genome-scale CRISPR knock-out » (GeCKO v2) in vitro dans la lignée cellulaire K562. Nous avons découvert plusieurs gènes qui semblent être essentiels pour la réponse au traitement par imatinib, tels que les facteurs pro-apoptotiques BIM et BAX, ou le répresseur de la voie des MAPK, SPRED2. Le rétablissement spécifique de l’apoptose dans les cellules BIM knock-out (KO) par des BH3-mimétiques, ou l’inhibition ciblée de la voie MAPK dans la lignée SPRED2 KO sensibilise de nouveau les lignées résistantes. Dans ce travail, nous avons découvert des mécanismes de résistance déjà connus (l’apoptose, la voie MAPK…) mais nous avons également démontré l’implication de voies peu connues telles que le complexe Mediator, la maturation de ARNm et l’ubiquitinylation de protéines. Spécifiquement cibler ces lésions génétiques avec des thérapies ciblées combinées peut permettre de surmonter les phénotypes de résistance et ouvre la porte à l’utilisation de l’oncologie de précision.

The characterization of malignant tumour growth and the understanding of resistance mechanisms to treatment in cancer is of utmost importance for the discovery of novel “druggable” targets. Efficient genetic screening, now even more possible with the convergence of CRISPR-Cas9 gene editing technology, next-generation sequencing and bioinformatics, is an important tool for deciphering novel cellular processes, such as resistance to treatment in cancer. Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder characterised by the t(9;22) genetic abnormality, which encodes the driver of CML, the BCR-ABL1 fusion protein. Imatinib mesylate, a tyrosine kinase inhibitor, specifically eliminates CML cells by targeting and blocking the kinase activity of this protein, yet, as for all targeted therapies in cancer, resistance to treatment exists. In order to discover alternative BCR-ABL1 independent mechanisms of imatinib resistance, we utilized the genome-scale CRISPR knock-out library GeCKO v2 to screen for imatinib sensitising genes in vitro on K562 cells. We revealed genes that seem essential for imatinib induced cell death, such as pro-apoptotic genes (BIM, BAX) or MAPK inhibitor SPRED2. Specifically re-establishing apoptotic capabilities in BIM knock-out (KO) cells with BH3-mimetics, or inhibiting MAP-kinase signalling in SPRED2 KO cells with MEK inhibitors restores sensitivity to imatinib, overcoming resistance phenotypes. In this work, we discovered previously identified pathways (apoptosis, MAP-kinase signalling) and novel pathways that modulate response to imatinib in CML cell lines, such as the implication of the Mediator complex, mRNA processing and protein ubiquitinylation. Targeting these specific genetic lesions with combinational therapy can overcome resistance phenotypes and paves the road for the use of precision oncology., La caractérisation des tumeurs malignes et la compréhension des mécanismes de résistance aux traitements anticancéreux sont essentielles pour la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques. Les criblages génétiques, devenus encore plus puissants avec la technologie d’édition du génome CRISPR-Cas9, le séquençage nouvelle génération et la bioinformatique, sont des outils formidables pour décrypter de nouveaux mécanismes cellulaires, dont la résistance au traitement. La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un syndrome myéloprolifératif qui est caractérisé par l’anomalie génétique t(9;22). Cette aberration chromosomique est à l’origine du gène de fusion BCR-ABL1 qui code l’oncogène du même nom responsable de la prolifération anarchique des cellules. L’imatinib mesylate, un inhibiteur de tyrosine kinase, élimine de manière spécifique les cellules leucémiques en ciblant et en bloquant l’activité kinase de cette protéine. Malheureusement, comme pour tout type de thérapie ciblée, une résistance au traitement survient chez certains patients. Afin de repérer des nouvelles voies de résistance à cet inhibiteur de tyrosine kinase, nous avons effectué un criblage génétique avec la librairie « genome-scale CRISPR knock-out » (GeCKO v2) in vitro dans la lignée cellulaire K562. Nous avons découvert plusieurs gènes qui semblent être essentiels pour la réponse au traitement par imatinib, tels que les facteurs pro-apoptotiques BIM et BAX, ou le répresseur de la voie des MAPK, SPRED2. Le rétablissement spécifique de l’apoptose dans les cellules BIM knock-out (KO) par des BH3-mimétiques, ou l’inhibition ciblée de la voie MAPK dans la lignée SPRED2 KO sensibilise de nouveau les lignées résistantes. Dans ce travail, nous avons découvert des mécanismes de résistance déjà connus (l’apoptose, la voie MAPK…) mais nous avons également démontré l’implication de voies peu connues telles que le complexe Mediator, la maturation de ARNm et l’ubiquitinylation de protéines. Spécifiquement cibler ces lésions génétiques avec des thérapies ciblées combinées peut permettre de surmonter les phénotypes de résistance et ouvre la porte à l’utilisation de l’oncologie de précision.

According to the International Agency for Research on Cancer, cancer is the first cause of death in France with about 150 000 deaths estimated in 2012. This disease is characterized by anarchistic and uncontrolled proliferation of cells that escape control mechanisms. Currently, the anticancer drugs target mainly the cancerous cells that overexpress proteins, such as growth factor receptors with tyrosine kinase activity.Our work is mainly carried on four of these receptors: EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), VEGFR (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor), PDGFR (Platelet-Derived Growth Factor Receptor) and c-Kit receptor. Several heterocycles (quinazoline, benzotriazine, thienopyrimidine) differing by their aniline or aryloxy moiety in C-4 position were designed, synthesized and evaluated. Among these products, the 4-aryloxyquinazolines substituted by aminoalkoxy chains in C-7 position have the characteristic to be potent inhibitors of VEGFR, PDGFR and c-kit receptor with high anti-angiogenic potency. Simultaneously, 2-aminoquinazoline derivatives were designed. These compounds substituted by various anilines in C-4 position showed interesting antiproliferative activity through their intercalation between the pairs of DNA bases., Avec près de 150 000 décès estimés en 2012 d’après l’Agence internationale pour la Recherche sur le Cancer, le cancer représente la première cause de mortalité en France. Cette maladie est caractérisée par la prolifération anarchique et incontrôlée de certaines cellules de l’organisme qui échappent aux mécanismes de contrôle. A l’heure actuelle, les thérapies anticancéreuses visent principalement ces cellules tumorales en agissant sur des protéines qu’elles surexpriment, telles que les récepteurs aux facteurs de croissance à activité tyrosine kinase.Nos travaux se sont essentiellement portés sur quatre de ces récepteurs : l’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), le VEGFR (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor), le PDGFR (Platelet-Derived Growth Factor Receptor) et le récepteur c-Kit. Plusieurs hétérocycles azotés (quinazoline, benzotriazine, thiénopyrimidine) se différenciant par leur motif anilino ou aryloxy en position 4 ont été conçus, synthétisés et évalués pharmacologiquement. Parmi ces produits, les 4-aryloxyquinazolines substituées en position 7 par des chaînes aminoalkoxy se sont révélées être de puissants inhibiteurs des récepteurs VEGFR, PDGFR et c-Kit présentant un fort pouvoir anti-angiogénique. En parallèle de ces travaux, des dérivés de type 2-aminoquinazoliniques ont été conçus. Ces composés substitués par différentes anilines en position 4 ont montré un pouvoir antiprolifératif intéressant grâce à leur intercalation entre les paires de bases de l’ADN.

Medullary thyroid carcinoma (MTC) accounts for 5-8% of all thyroid cancers and occurs as either a sporadic form or in a familial context (25% of cases). Mutations which activate the RET proto-oncogene, encoding a tyrosine kinase receptor, are responsible for familial forms and are also detected in one-third of sporadic tumors. MTC patients with local disease may be cured after initial surgery, but persistent or recurrent disease occurs in half of cases, and distant metastases are the major cause of tumor related death. Up to now there is no effective systemic treatment and new therapeutic strategies are needed for locally advanced or metastatic MTC patients. The constitutive activation of RET is crucial in MTC pathogenesis and led to the development of small compounds targeting its tyrosine kinase activity (TKI). Gaining an understanding of how cancer cells respond to drugs is challenging to improve clinical use of these new therapeutic agents. In this context, we aimed to characterize molecular mechanisms of action of sunitinib and vandetanib, two TKIs currently evaluated in MTC patients. Our results, in in vitro as well as in vivo MTC models based on the RETC634W TT cell line, demonstrate that sunitinib and vandetanib has similar antiproliferative, antitumoral and antiangiogenic properties. Using the Reverse Phase Protein Array (RPPA) large-scale technology, we identified major signalling pathways inhibited after TKIs’ treatment. Expression microarrays allowed us to investigate signaling pathways modified after sunitinib and vandetanib treatment and to show that TKIs’ treatment induced major changes in the expression of genes involved in tissue invasion and metastasis. We identified encoding secreted proteins as candidate soluble biomarkers of response and, among them, we demonstrated that metastatic MTC patients presented increased serum levels of IL-8 and TGF-2. Three modalities for determining early responses to targeted agents in MTC patients were evaluated. First, a sensitive mass spectrometry assay was developed for the quantitation of vandetanib, and applied in MTC patients, showing a potential relationship between toxic side-effects and vandetanib serum levels and suggesting that therapeutic drug monitoring may be a useful tool for MTC patients’ follow-up. Then, candidate biomarkers were investigated in MTC patients underlying the potential use of IL-8 as prognostic marker. Finally, using doppler imaging in xenografted mice model, we confirmed the utility of imaging techniques in clinical evaluation of TKI’s response.; Le cancer médullaire de la thyroïde (CMT), qui représente 5 à 8% des cancers de la thyroïde, est issu de la transformation maligne des cellules C du parenchyme thyroïdien. Ce cancer, sporadique dans 70 à 80% des cas et familial pour les 20 à 30% restants, est essentiellement lié à des anomalies du proto-oncogène RET, codant un récepteur à activité tyrosine kinase. La fréquence élevée des mutations activatrices de RET ont permis d’identifier ce récepteur comme une cible thérapeutique majeure. Si la chirurgie est le traitement de référence pour les formes localisées, les formes localement avancées ou métastatiques, de pronostic plus péjoratif étaient avant le développement des thérapies moléculaires ciblées, dans une impasse thérapeutique. La meilleure compréhension de la biologie des tumeurs a permis le développement de ces thérapies plus rationnelles et plus spécifiques, en particulier des inhibiteurs d’activité tyrosine kinase (ITK). L’optimisation de leur utilisation en clinique nécessite de mieux comprendre leurs mécanismes d’action.Dans ce contexte, les objectifs de cette thèse ont été à la fois cognitifs et cliniques, visant à améliorer la compréhension de la réponse moléculaire à deux ITKs, le sunitinib et la vandetanib,dans le CMT, et à identifier de nouveaux biomarqueurs de suivi thérapeutique. Dans un premier temps, nous avons montré les effets antiprolifératifs, antitumoraux et antiangiogéniques du sunitinib et du vandetanib dans un modèle de CMT muté RETC634W, mettant en évidence des profils d’activité proches entre les deux inhibiteurs. Puis, les principales voies de signalisation mises en jeu lors de la réponse à ces ITKs ont été explorées par Reverse-Phase Protein Array(RPPA). Par une approche transcriptomique haut-débit menée sur des modèles précliniques, les principales fonctions cellulaires impliquées dans la réponse au sunitinib et au vandetanib ont été identifiées. Le rôle de gènes participant à l’invasion tissulaire et au pouvoir métastatique a été mis en évidence. De nouveaux biomarqueurs potentiels de réponse au vandetanib et au sunitinib, tels que l’IL-8 et le TGF-2 dont les taux sériques sont significativement plus élevés chez les patients atteints de CMT, ont été identifiés. Enfin, l’intérêt de trois approches méthodologiques dans lesuivi de la réponse antitumorale chez les patients a été évalué. Ainsi, le développement d’une méthode de dosage du vandetanib par spectrométrie de masse a permis de suggérer un lien entre des taux sériques élevés et l’apparition de toxicités sévères. L’évaluation de biomarqueurs dans le sérum de patients traités par le vandetanib a souligné l’intérêt de l’IL-8 comme marqueur pronostic potentiel dans cette pathologie. Enfin les résultats préliminaires, évaluant la réponse au sunitinib par échographie doppler sur un modèle préclinique de souris xénogreffées, ont confirmé l’intérêt de l’imagerie fonctionnelle dans ce domaine.

Medullary thyroid carcinoma (MTC) accounts for 5-8% of all thyroid cancers and occurs as either a sporadic form or in a familial context (25% of cases). Mutations which activate the RET proto-oncogene, encoding a tyrosine kinase receptor, are responsible for familial forms and are also detected in one-third of sporadic tumors. MTC patients with local disease may be cured after initial surgery, but persistent or recurrent disease occurs in half of cases, and distant metastases are the major cause of tumor related death. Up to now there is no effective systemic treatment and new therapeutic strategies are needed for locally advanced or metastatic MTC patients. The constitutive activation of RET is crucial in MTC pathogenesis and led to the development of small compounds targeting its tyrosine kinase activity (TKI). Gaining an understanding of how cancer cells respond to drugs is challenging to improve clinical use of these new therapeutic agents. In this context, we aimed to characterize molecular mechanisms of action of sunitinib and vandetanib, two TKIs currently evaluated in MTC patients. Our results, in in vitro as well as in vivo MTC models based on the RETC634W TT cell line, demonstrate that sunitinib and vandetanib has similar antiproliferative, antitumoral and antiangiogenic properties. Using the Reverse Phase Protein Array (RPPA) large-scale technology, we identified major signalling pathways inhibited after TKIs’ treatment. Expression microarrays allowed us to investigate signaling pathways modified after sunitinib and vandetanib treatment and to show that TKIs’ treatment induced major changes in the expression of genes involved in tissue invasion and metastasis. We identified encoding secreted proteins as candidate soluble biomarkers of response and, among them, we demonstrated that metastatic MTC patients presented increased serum levels of IL-8 and TGF-2. Three modalities for determining early responses to targeted agents in MTC patients were evaluated. First, a sensitive mass spectrometry assay was developed for the quantitation of vandetanib, and applied in MTC patients, showing a potential relationship between toxic side-effects and vandetanib serum levels and suggesting that therapeutic drug monitoring may be a useful tool for MTC patients’ follow-up. Then, candidate biomarkers were investigated in MTC patients underlying the potential use of IL-8 as prognostic marker. Finally, using doppler imaging in xenografted mice model, we confirmed the utility of imaging techniques in clinical evaluation of TKI’s response.; Le cancer médullaire de la thyroïde (CMT), qui représente 5 à 8% des cancers de la thyroïde, est issu de la transformation maligne des cellules C du parenchyme thyroïdien. Ce cancer, sporadique dans 70 à 80% des cas et familial pour les 20 à 30% restants, est essentiellement lié à des anomalies du proto-oncogène RET, codant un récepteur à activité tyrosine kinase. La fréquence élevée des mutations activatrices de RET ont permis d’identifier ce récepteur comme une cible thérapeutique majeure. Si la chirurgie est le traitement de référence pour les formes localisées, les formes localement avancées ou métastatiques, de pronostic plus péjoratif étaient avant le développement des thérapies moléculaires ciblées, dans une impasse thérapeutique. La meilleure compréhension de la biologie des tumeurs a permis le développement de ces thérapies plus rationnelles et plus spécifiques, en particulier des inhibiteurs d’activité tyrosine kinase (ITK). L’optimisation de leur utilisation en clinique nécessite de mieux comprendre leurs mécanismes d’action.Dans ce contexte, les objectifs de cette thèse ont été à la fois cognitifs et cliniques, visant à améliorer la compréhension de la réponse moléculaire à deux ITKs, le sunitinib et la vandetanib,dans le CMT, et à identifier de nouveaux biomarqueurs de suivi thérapeutique. Dans un premier temps, nous avons montré les effets antiprolifératifs, antitumoraux et antiangiogéniques du sunitinib et du vandetanib dans un modèle de CMT muté RETC634W, mettant en évidence des profils d’activité proches entre les deux inhibiteurs. Puis, les principales voies de signalisation mises en jeu lors de la réponse à ces ITKs ont été explorées par Reverse-Phase Protein Array(RPPA). Par une approche transcriptomique haut-débit menée sur des modèles précliniques, les principales fonctions cellulaires impliquées dans la réponse au sunitinib et au vandetanib ont été identifiées. Le rôle de gènes participant à l’invasion tissulaire et au pouvoir métastatique a été mis en évidence. De nouveaux biomarqueurs potentiels de réponse au vandetanib et au sunitinib, tels que l’IL-8 et le TGF-2 dont les taux sériques sont significativement plus élevés chez les patients atteints de CMT, ont été identifiés. Enfin, l’intérêt de trois approches méthodologiques dans lesuivi de la réponse antitumorale chez les patients a été évalué. Ainsi, le développement d’une méthode de dosage du vandetanib par spectrométrie de masse a permis de suggérer un lien entre des taux sériques élevés et l’apparition de toxicités sévères. L’évaluation de biomarqueurs dans le sérum de patients traités par le vandetanib a souligné l’intérêt de l’IL-8 comme marqueur pronostic potentiel dans cette pathologie. Enfin les résultats préliminaires, évaluant la réponse au sunitinib par échographie doppler sur un modèle préclinique de souris xénogreffées, ont confirmé l’intérêt de l’imagerie fonctionnelle dans ce domaine.

Oral targeted therapies are a growing class of medication. After clinical trials conducted on a selected population, these molecules are usually approved at a fixed dose. However, oral tyrosine kinase inhibitors are characterized by a large intra and inter-individual pharmacokinetic variability, and a narrow therapeutic index. Hence, their prescription is hazardous and unsafe in non-selected people from daily clinical practice. The increasing number of available targeted therapies point out new challenges. These challenges should especially concern prescription for out of the ordinary patients, rules for dose adjustment according to factors of frailty. The ultimate goal is to ensure a safe and individualized prescription. Moreover, many of these molecules are metabolized by the CYP3A4, leading to a serious risk of drug interaction. These interactions might involve not only conventional medicine but also alternative and complementary medicines. These latter are more and more common but oncologists often lack experience about them. Finally, the oral route raises the issues of adherence, and the question of its assessment should now become a permanent part of patients care., (Copyright © 2018.)