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En 2020, le cancer du sein est le type de cancer qui affecte le plus de personnes dans le monde mais est une maladie hétérogène. Le type luminal, représentant plus de 70 % des tumeurs, est identifiable par l'expression du récepteur des œstrogènes alpha (ERα). Certaines tumeurs comprennent cependant un mélange de cellules ERα-positives/négatives (ERα+/–). Les raisons de cette hétérogénéité restant inconnues, nous avons cherché à identifier une protéine membranaire positivement corrélée à ERα, dans le but d'isoler et caractériser des populations de cellules tumorales viables ERα+/– par la technique de Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Nos résultats démontrent la régulation de CA12 par ERα et par le facteur de transcription luminal GATA3 dans des lignées cellulaires tumorales mammaires et son expression protéique prépondérante dans les tumeurs mammaires luminales. Nous avons développé une approche de purification cellulaire par FACS en utilisant un anticorps contre la partie extracellulaire de CAXII afin de trier des cellules tumorales ERα+/–. Nous avons finalement examiné la fonction de CAXII dans les tumeurs mammaires luminales et ainsi démontré une contribution significative à l’acidification du pH extracellulaire et à la migration cellulaire. Cette étude indique que CAXII représente un bon marqueur de l'activité de ERα et GATA3 dans les tumeurs luminales et pourrait être utilisé pour séparer les cellules ERα+ des cellules ERα– à partir de tumeurs hétérogènes et ainsi déterminer par profilage génique la relation évolutive entre les cellules tumorales ERα+/– et identifier les régulateurs potentiels de la différenciation luminale dans le cancer du sein., In 2020, breast cancer is the type of cancer that affects the most people in the world but is a heterogeneous disease. The luminal type, representing more than 70% of tumors, is identifiable by the expression of the estrogen receptor alpha (ERα). However, some tumors include a mixture of ERα-positive/negative cells (ERα+/–). As the reasons for this heterogeneity remain unknown, we aimed to identify a membrane protein positively correlated with ERα, in order to isolate and characterize populations of viable ERα+/- tumor cells by the Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique. Our results demonstrate the regulation of CA12 by ERα and by the luminal transcription factor GATA3 in mammary tumor cell lines and its predominant protein expression in luminal mammary tumors. We have developed a cellular purification approach by FACS using an anticoprs against the extracellular part of CAXII in order to sort ERα+/– tumor cells. We finally examined the function of CAXII in luminal mammary tumors and thus demonstrated a significant contribution to extracellular pH acidification and cell migration. This study indicates that CAXII represents a good marker of the activity of ERα and GATA3 in luminal tumors and could be used to separate ERα+ cells from ERα– cells from heterogeneous tumors and thus determine by gene profiling the evolutionary relationship between ERα+/– tumor cells and identify potential regulators of luminal differentiation in breast cancer.

In drosophila, the ribosomal protein uL11 is involved in translation and regulates transcription. Indeed, uL11 trimethylated on lysine 3 directly interacts with the enhancer of Trithorax and Polycomb Corto and co-localises with it on many sites on polytene chromosomes. Furthermore, RNA-seq analyses of larval wing imaginal discs over-expressing uL11 or the chromodomain of Corto show that many ribosomal biogenesis and ribosomal protein genes are up-regulated. Three mutants of uL11K3 were obtained by CRISPR-Cas9 (uL11K3A, uL11K3Y et uL11ΔK3). Puromycine incorporation showed that only uL11K3A has a decreased translation in agreement with its dominant Minute phenotypes (which include high lethality, longer development, shorter bristles). Co-immunoprecipitation experiments show that uL11K3A and uL11K3Y do not interact with the chromodomain of Corto. Whereas, surprisingly, uL11ΔK3 still interacted with it. RNA-seq analyses of the wing imaginal disc transcriptomes of uL11K3A and uL11K3Y show that few genes are deregulated (414 genes for the former, 84 genes for the latter). As in Saccharomyces cerevisiae, uL11 controls transcription of genes of the PHO pathway in low-phosphate conditions. We next tested whether the uL11 mutants were more affected in restrictive diet conditions. We focused on the uL11K3Y mutants which are unaffected in normal conditions. In a restrictive diet, developmental time of uL11K3Y mutants is longer than the wild-type one, and their wings are smaller. Thus, in drosophila as S. cerevisiae, the transcriptional activity of uL11 might be important in poor environmental conditions.; Chez la drosophile la protéine ribosomique uL11 est impliquée dans la traduction et régule la transcription. En effet, uL11 triméthylée sur la lysine 3 interagit avec l’Enhancer de Trithorax et Polycomb Corto et co-localise avec lui en de nombreux sites sur les chromosomes polytènes. De plus, l’analyse du transcriptome de disques imaginaux d’ailes surexprimant uL11 ou le chromodomaine de Corto (CortoCD) montre que les gènes codant des protéines importantes pour la biogenèse des ribosomes sont plus exprimés. Nous avons généré 3 mutants d’uL11K3 en utilisant la technologie CRISPR/Cas9 (uL11K3A, uL11K3Y et uL11ΔK3). Seuls les mutants uL11K3A présentent des phénotypes Minute (létalité élevée, retard de développement, soies courtes) corrélés à une diminution du taux global de traduction. Nous avons montré qu’uL11K3A et uL11K3Y n’interagissent pas avec CortoCD. Alors que de manière inattendue, uL11ΔK3 interagit avec CortoCD. L’analyse du transcriptome de disques imaginaux d’ailes uL11K3A et uL11K3Y montre que peu de gènes sont dérégulés : 414 et 84 gènes chez les mutants uL11K3A et uL11K3Y, respectivement. Chez S. cerevisiae, uL11 contrôle la transcription de gènes de la voie PHO dans un milieu pauvre en phosphates. Nous avons donc testé si un milieu nutritionnel pauvre affecterait les mutants uL11. Nous avons étudié les mutants uL11K3Y qui ne présentent pas de phénotypes en conditions normales. Dans ce milieu pauvre, ces mutants ont un développement plus court et des ailes plus petites que les individus sauvages. Ainsi, chez la drosophile comme chez S. cerevisiae, l’activité transcriptionnelle d’uL11 pourrait être importante dans des conditions environnementales défavorables.

In drosophila, the ribosomal protein uL11 is involved in translation and regulates transcription. Indeed, uL11 trimethylated on lysine 3 directly interacts with the enhancer of Trithorax and Polycomb Corto and co-localises with it on many sites on polytene chromosomes. Furthermore, RNA-seq analyses of larval wing imaginal discs over-expressing uL11 or the chromodomain of Corto show that many ribosomal biogenesis and ribosomal protein genes are up-regulated. Three mutants of uL11K3 were obtained by CRISPR-Cas9 (uL11K3A, uL11K3Y et uL11ΔK3). Puromycine incorporation showed that only uL11K3A has a decreased translation in agreement with its dominant Minute phenotypes (which include high lethality, longer development, shorter bristles). Co-immunoprecipitation experiments show that uL11K3A and uL11K3Y do not interact with the chromodomain of Corto. Whereas, surprisingly, uL11ΔK3 still interacted with it. RNA-seq analyses of the wing imaginal disc transcriptomes of uL11K3A and uL11K3Y show that few genes are deregulated (414 genes for the former, 84 genes for the latter). As in Saccharomyces cerevisiae, uL11 controls transcription of genes of the PHO pathway in low-phosphate conditions. We next tested whether the uL11 mutants were more affected in restrictive diet conditions. We focused on the uL11K3Y mutants which are unaffected in normal conditions. In a restrictive diet, developmental time of uL11K3Y mutants is longer than the wild-type one, and their wings are smaller. Thus, in drosophila as S. cerevisiae, the transcriptional activity of uL11 might be important in poor environmental conditions., Chez la drosophile la protéine ribosomique uL11 est impliquée dans la traduction et régule la transcription. En effet, uL11 triméthylée sur la lysine 3 interagit avec l’Enhancer de Trithorax et Polycomb Corto et co-localise avec lui en de nombreux sites sur les chromosomes polytènes. De plus, l’analyse du transcriptome de disques imaginaux d’ailes surexprimant uL11 ou le chromodomaine de Corto (CortoCD) montre que les gènes codant des protéines importantes pour la biogenèse des ribosomes sont plus exprimés. Nous avons généré 3 mutants d’uL11K3 en utilisant la technologie CRISPR/Cas9 (uL11K3A, uL11K3Y et uL11ΔK3). Seuls les mutants uL11K3A présentent des phénotypes Minute (létalité élevée, retard de développement, soies courtes) corrélés à une diminution du taux global de traduction. Nous avons montré qu’uL11K3A et uL11K3Y n’interagissent pas avec CortoCD. Alors que de manière inattendue, uL11ΔK3 interagit avec CortoCD. L’analyse du transcriptome de disques imaginaux d’ailes uL11K3A et uL11K3Y montre que peu de gènes sont dérégulés : 414 et 84 gènes chez les mutants uL11K3A et uL11K3Y, respectivement. Chez S. cerevisiae, uL11 contrôle la transcription de gènes de la voie PHO dans un milieu pauvre en phosphates. Nous avons donc testé si un milieu nutritionnel pauvre affecterait les mutants uL11. Nous avons étudié les mutants uL11K3Y qui ne présentent pas de phénotypes en conditions normales. Dans ce milieu pauvre, ces mutants ont un développement plus court et des ailes plus petites que les individus sauvages. Ainsi, chez la drosophile comme chez S. cerevisiae, l’activité transcriptionnelle d’uL11 pourrait être importante dans des conditions environnementales défavorables.

Nitrate (NO3-) is an essential mineral ion for plant growth and is the main source of nitrogen (N). In A. thaliana, NRT2.1, NRT2.4 and NRT2.5 are the three main transporters of the high affinity transport system (HATS) for the uptake of NO3- by roots. Among them, NRT2.1 is the major player in HATS. NRT2.1 is transcriptionally controlled by all the regulations that affect the transport of NO3- : i) induction by NO3-, ii) repression by products resulting from the assimilation of NO3- and iii) induction by light and sugars. In addition to these transcriptional regulations, recent approaches indicate that NRT2.1 is also subject to post-translational regulations. Concerning the other members of the NRT2s family, NRT2.4 and NRT2.5 have been characterized as transporters with very high affinity for NO3-. Their expression is induced by N deficiency, while light and sugars also induce NRT2.4. Despite the functional importance of these transporters for plant growth, the mechanisms involved in their regulation are still poorly understood, in particular for the regulation by light and sugars as well as post-translational regulations of NRT2.1. In this context, the objectives of my thesis were: i) to characterize the light/sugar signaling pathway involved in the regulation of NRT2.1 and NRT2.4, (ii) to characterize the role of new regulators of N signaling pathways and C identified in my team and (iii) to participate in the study of post-translational regulations of the NRT2.1 protein. One of the major results of my thesis work concerns the regulation of NRT2s by light and sugars. The work previously carried out by the team had made it possible to determine that sugar signaling involves the oxidative pathway of pentose phosphates (OPPP). The results that I obtained allowed: (i) to identify that G6PD, the first enzyme of the OPPP pathway, seems to be at the origin of the sugar signal and (ii) to hypothesize that NADPH produced by this enzyme as well as redox signaling are involved in this regulation. In parallel, I characterized the role of BHLH093 transcription factor, previously identified in the team. I demonstrated its role in the regulation of NRT2.4 by light and sugars and highlighted the existence of another signaling pathway that is probably independent of the OPPP. A second important part of my thesis work concerned the study of the regulation of NRT2.4 and NRT2.5 transporters by N deficiency. This allowed me to demonstrate: (i) that NO3- is the signal involved in the repression of these two transporters in non-N-deficient plants and (ii) that this regulation depends on the signaling pathway linked to NRT1.1/NPF6.3. In addition, I was able to place known regulators of the response to high N into the signaling pathway that regulates NRT2.4 and NRT2.5 in response to repression by NO3-. Finally, I could confirm the essential role of the phosphorylation of the Ser501 residue, located in the C-terminal part, to repress the activity of NRT2.1 under repressive conditions, by studying its post-translational regulation. The hypothesis of a cleavage of the C-terminal part of NRT2.1 also led me to initiate an approach aiming to determine if the peptide released after cleavage and which contains the phosphorylated Ser501 site, could have a role in signaling NO3-.; Le Nitrate (NO3-) est un ion minéral indispensable pour la croissance des plantes et constitue la principale source d’azote (N). Chez A. thaliana, le système de transport à forte affinité (HATS) pour l'absorption de NO3- par les racines dépend principalement de trois transporteurs : NRT2.1, NRT2.4 et NRT2.5. Parmi eux, NRT2.1 constitue l’acteur majoritaire du HATS. NRT2.1 est la cible au niveau transcriptionnel de l’ensemble des régulations qui affectent le transport de NO3- : i) une induction par le NO3-, ii) une répression exercée par les produits issus de l’assimilation de NO3- et iii) une induction par la lumière et les sucres. En plus de ces régulations transcriptionnelles, des approches récentes indiquent que NRT2.1 est également soumis à des régulations post-traductionnelles. Concernant les autres membres de la famille NRT2s, NRT2.4 et NRT2.5 ont été caractérisé comme des transporteurs à très forte affinité pour le NO3- dont l’expression est induite par la carence en N et également par la lumière et les sucres pour NRT2.4. Malgré l’importance fonctionnelle de ces transporteurs pour la croissance des plantes, les mécanismes impliqués dans leur régulation restent encore mal connus, en particulier en ce qui concerne la régulation par la lumière et les sucres et les régulations post-traductionnelles de la protéine NRT2.1. Dans ce contexte les objectifs de ma thèse étaient : i) de caractériser la voie de signalisation lumière/sucre impliquée dans la régulation de NRT2.1 et NRT2.4, (ii) de caractériser le rôle de nouveaux régulateurs des voies de signalisation N et C identifiés dans mon équipe et (iii) de participer à l’étude des régulations post-traductionnelles de la protéine NRT2.1. Un des résultats majeurs de mon travail de thèse concerne la régulation des NRT2s par la lumière et les sucres. Les travaux réalisés dans l’équipe avait permis de déterminer que la signalisation sucre implique la voie oxydative des pentoses phosphates (OPPP). Les résultats que j’ai obtenus ont permis : (i) d’identifier que la première enzyme de la voie OPPP, la G6PD, semble être à l’origine du signal sucre et (ii) de faire l’hypothèse que le NADPH produit par cette enzyme ainsi que la signalisation redox sont impliqués dans cette régulation. En parallèle, la caractérisation du rôle de BHLH093, préalablement identifié dans l’équipe, a permis de démontrer le rôle de ce facteur de transcription dans la régulation de NRT2.4 par la lumière et les sucres et a mis en évidence l’existence d’une autre voie de signalisation sans doute indépendante de l’OPPP. Un deuxième volet important de mon travail de thèse a concerné l’étude de la régulation des transporteurs NRT2.4 et NRT2.5 par la carence en N. Ceci m’a permis de démontrer : (i) que le NO3- est le signal impliqué dans la répression de ces deux transporteurs chez des plantes non carencées en N et (ii) que cette régulation dépend de la voie de signalisation liée à NRT1.1/NPF6.3. De plus, l’étude de régulateurs connus pour être impliqués dans la réponse au fort N m’a permis de replacer certains de ces facteurs de transcription dans la voie de signalisation qui régule NRT2.4 et NRT2.5 en réponse à la répression par le NO3-. Enfin, l’étude de la régulation post-traductionnelle de la protéine NRT2.1 a permis de confirmer le rôle essentiel de la phosphorylation du résidu Ser501, située dans la partie C-terminale, pour désactiver l’activité de NRT2.1 en conditions répressives. L’hypothèse d’un clivage de la partie C-terminale de NRT2.1 m’a également amené à initier une approche visant à déterminer si le peptide libéré après clivage et qui contient le site Ser501 phosphorylé, pouvait avoir un rôle dans la signalisation NO3-.

B-cell development involves a first phase of differentiation in the bone marrow, in the absence of any specific antigenic stimulation, leading to immature B-cells. The second phase, staging activation and final maturation, is antigen-dependent and takes place in the secondary lymphoid organs, within transient structures called germinal centers (GC). It generates antigen-specific plasma cells and memory B cells.This thesis work focuses on different actors involved in the epigenetic and transcriptional regulation of B-cell differentiation: the enzymes TET2 and TET3 and the transcription factor (TF) SPI1/PU.1. Mutations in genes encoding these proteins are found in human neoplasms, we used in vivo and in vitro models to determine their functional consequences.I analyzed the impact of TET2 loss of function on the differentiation and maturation of B-cells. The results show an impaired plasma cell differentiation associated with GC hyperplasia and an increase in the percentage and absolute number of GC B-cells (BGC). Quantitative PCR analysis of the expression of key BGC and plasma cell TF showed that Tet2-deficient cells exhibit repression of the Prdm1 gene encoding BLIMP1, a master regulator of plasma cell differentiation. I then turned my attention to TET3, another TET family protein expressed in the B-cell lineage. In vivo and in vitro Tet3-deficient models show that the loss of TET3 does not significantly affect terminal B differentiation.In addition, I studied a somatic mutation of SPI1/PU.1, identified by our team in patients with Waldenström's disease (WM). In more than 95% of cases, the L265P activating mutation of MYD88 gene is also present. We have shown that SPI1 mutation, although not preventing its binding to DNA, alters its binding affinity at sites normally recognized by the wild-type form. The mutation appears to cause this class III ETS protein to behave in a manner similar to a class I/IIa ETS protein. I then sought to document the basis for oncogenic cooperation between SPI1 and MYD88 in two ways. First, by studying the proliferation and differentiation of naïve B-cells from a locally developped mouse model knock-in for the SPI1 mutation, transduced with a retrovirus carrying the MYD88 mutation. The results show an increase in proliferation in the double mutant condition as well as an increase of the terminal differentiation. Second, by modifying the human BCWM1 WM cell line by CRISPR/Cas9 in order to introduce the SPI1 mutation at the same time as the expression of the GFP. This model will be used in particular to perform ChIP-seq experiments to identify the targets of the mutant protein in a MW-like context.In conclusion, compliance to transcriptional programs is essential for the smooth progress of B-terminal differentiation and can be impacted either directly, by mutations affecting TF such as SPI1, or indirectly when the methylation profile of key TF-encoding genes (PRDM1) is altered following mutations in enzymes such as TET2., L’ontogenèse des lymphocytes B (LB) comporte une première phase de différenciation, dans la moelle osseuse en l'absence de toute stimulation antigénique spécifique, aboutissant au LB immature. La seconde phase, d’activation et de maturation finale, est dépendante des antigènes et se déroule dans les organes lymphoïdes secondaires, au sein de structures transitoires appelées centres germinatifs (CG). Elle génère des plasmocytes et des cellules B mémoires spécifiques d’un antigène.Ce travail de thèse s’intéresse à différents acteurs impliqués dans la régulation épigénétique et transcriptionnelle de la différenciation lymphoïde B terminale : les enzymes TET2 et TET3 et le facteur de transcription (FT) SPI1/PU.1. Des mutations affectant les gènes codant pour ces protéines sont trouvées dans les hémopathies chez l’Homme et nous avons cherché à déterminer leurs conséquences fonctionnelles en utilisant des modélisations in vivo et in vitro.J’ai d’une part analysé l’impact de la perte de fonction de TET2 sur la différenciation et la maturation des cellules B. Les résultats montrent un blocage de la différenciation plasmocytaire associé à une hyperplasie des CG et une augmentation du pourcentage et du nombre absolu des LB du CG (BGC). L’analyse par PCR quantitative de l’expression des FT importants pour la différenciation des BGC et des plasmocytes a montré que les cellules déficientes pour TET2 présentent une répression du gène Prdm1 codant pour BLIMP1, un régulateur essentiel de la différenciation plasmocytaire. Je me suis ensuite intéressée à TET3, autre protéine de la famille TET exprimée dans la lignée B. Les modèles Tet3-déficients in vivo et in vitro n’ont pas montré d’altération marquée de la différenciation B terminale.J’ai par ailleurs étudié une mutation somatique de SPI1/PU.1, identifiée par notre équipe chez des patients atteints de maladie de Waldenström (MW). Dans plus de 95% des cas, la mutation activatrice L265P du gène MYD88 est également présente. Nous avons montré que la mutation de SPI1, bien que n'empêchant pas sa liaison à l’ADN, modifie son affinité de liaison sur les sites normalement reconnus par la forme sauvage. La mutation semble faire adopter à cette protéine ETS de classe III un comportement qui ressemble à celui d'une classe I/IIa. J’ai ensuite cherché à documenter les bases de la coopération oncogénique entre SPI1 et MYD88 de deux façons. La première, en étudiant la prolifération et la différenciation de lymphocytes B naïfs issus d’un modèle murin knock-in pour la mutation SPI1 développé dans l’équipe, transduits avec un rétrovirus apportant la mutation de MYD88. Les résultats montrent une augmentation de la prolifération dans la condition double mutante ainsi qu’une augmentation de la différenciation terminale. La seconde approche consiste à modifier la lignée humaine BCWM1 de MW par CRISPR/Cas9 afin d’y introduire la mutation de SPI1 en même temps que l’expression de la GFP. Ce modèle sera notamment utilisé pour réaliser des expériences de ChIP-seq afin d’identifier les cibles de la protéine mutante dans un contexte MW-like.En conclusion, le respect des programmes transcriptionnels est essentiel pour le bon déroulement de la différenciation B terminale et peut être impacté soit directement, par des mutations affectant des FT comme SPI1, soit indirectement lorsque le profil de méthylation de gènes codant pour des FT (PRDM1) est altéré suite à des mutations affectant des enzymes comme TET2.

FOXL2 is a major transcription factor in ovarian granulosa cells, involved in their differentiation, maintenance andfunction. A specific mutation (p.C134W) is found in the majority of adult forms of granulosa cell tumors. Therefore FOXL2has been described to play a role both in the healthy or pathological ovary. In order to understand its molecular action,we have identified its direct and indirect transcriptomic targets as well as its binding sites on the genome using high-throughput approaches.We have identified more than 1000 target genes and new putative roles for FOXL2. In addition, AKT is proposed to inhibit,probably indirectly, the activity of FOXL2 on genes mainly involved in cell migration.FOXL2 has many partners including ESR2, SMAD3 and TRIM28, which are thought to co-regulated FOXL2 targets ingranulosa cells. We performed an analysis of the targets of these partners and of the binding of FOXL2 in their presenceor absence. For ESR2, in particular, we identified more than 350 targets involved in development, in the regulation of cellmigration and the organization of the extracellular matrix. We have shown that the presence of ESR2 is required forFOXL2 binding to chromatin and that they co-regulate the expression of more than 150 genes. Moreover, their joint actioncontrols the expression of Phactr1 modulating cell migration, invasion and adhesion.In a second project, still in progress, I wish to characterize the targets of FOXL2 p.C134W, at the transcriptomic level. Cellscarrying the mutation at the hemizygous state as well as WT control lines for FOXL2 were obtained by CRISPR/Cas9 andanalyzed by RNAseq. The results obtained are promising and will help understand the role of FOXL2 in these tumors., FOXL2 est un facteur de transcription majeur des cellules de la granulosa, participant à leur différenciation, leur maintienet leurs fonctions. Une mutation spécifique (p.C134W) est retrouvée dans la majorité des formes adultes des tumeurs descellules de la granulosa. FOXL2 joue donc un rôle à la fois dans l’ovaire sain mais aussi dans l’ovaire pathologique. Pourcomprendre son action moléculaire nous avons identifié par des analyses haut-débit ses cibles transcriptomiques directeset indirectes ainsi que ses sites de fixation sur le génome.Nous avons identifié 1001 gènes cibles et de nouveaux rôles putatifs pour FOXL2. De plus, AKT inhiberait, probablementde façon indirecte, l’activité de FOXL2 sur des gènes impliqués principalement dans la migration cellulaire.FOXL2 possède de nombreux partenaires parmi lesquels ESR2, SMAD3 et TRIM28, semblent jouer un rôle dans ledéveloppement et le maintien des cellules de la granulosa. Nous avons réalisé une analyse des cibles transcriptomiquesde ces partenaires et de la fixation de FOXL2, en leurs présences et en leurs absences. Pour ESR2, particulièrement, nousavons identifié de nouvelles cibles impliquées dans le développement, la régulation de la migration cellulaire etl’organisation de la matrice extracellulaire. Nous avons montré que la présence d’ESR2 est nécessaire à une bonne fixationde FOXL2 sur la chromatine et qu’ensemble ils régulent l’expression de plus de 150 gènes. De plus, leur action conjointepermet l’expression de Phactr1 assurant une migration, une invasion et une adhésion cellulaire correctes.Dans un second projet, toujours en cours, nous souhaitons caractériser les cibles de FOXL2 p.C134W, au niveautranscriptomique. Des cellules, portant la mutation à l’état hémizygote ainsi que des lignées contrôles WT pour FOXL2,ont été obtenues par CRISPR/Cas9 et analysées par RNAseq. Les résultats obtenus sont prometteurs et permettront decomprendre le rôle de FOXL2 dans ces tumeurs.

B-cell development involves a first phase of differentiation in the bone marrow, in the absence of any specific antigenic stimulation, leading to immature B-cells. The second phase, staging activation and final maturation, is antigen-dependent and takes place in the secondary lymphoid organs, within transient structures called germinal centers (GC). It generates antigen-specific plasma cells and memory B cells.This thesis work focuses on different actors involved in the epigenetic and transcriptional regulation of B-cell differentiation: the enzymes TET2 and TET3 and the transcription factor (TF) SPI1/PU.1. Mutations in genes encoding these proteins are found in human neoplasms, we used in vivo and in vitro models to determine their functional consequences.I analyzed the impact of TET2 loss of function on the differentiation and maturation of B-cells. The results show an impaired plasma cell differentiation associated with GC hyperplasia and an increase in the percentage and absolute number of GC B-cells (BGC). Quantitative PCR analysis of the expression of key BGC and plasma cell TF showed that Tet2-deficient cells exhibit repression of the Prdm1 gene encoding BLIMP1, a master regulator of plasma cell differentiation. I then turned my attention to TET3, another TET family protein expressed in the B-cell lineage. In vivo and in vitro Tet3-deficient models show that the loss of TET3 does not significantly affect terminal B differentiation.In addition, I studied a somatic mutation of SPI1/PU.1, identified by our team in patients with Waldenström's disease (WM). In more than 95% of cases, the L265P activating mutation of MYD88 gene is also present. We have shown that SPI1 mutation, although not preventing its binding to DNA, alters its binding affinity at sites normally recognized by the wild-type form. The mutation appears to cause this class III ETS protein to behave in a manner similar to a class I/IIa ETS protein. I then sought to document the basis for oncogenic cooperation between SPI1 and MYD88 in two ways. First, by studying the proliferation and differentiation of naïve B-cells from a locally developped mouse model knock-in for the SPI1 mutation, transduced with a retrovirus carrying the MYD88 mutation. The results show an increase in proliferation in the double mutant condition as well as an increase of the terminal differentiation. Second, by modifying the human BCWM1 WM cell line by CRISPR/Cas9 in order to introduce the SPI1 mutation at the same time as the expression of the GFP. This model will be used in particular to perform ChIP-seq experiments to identify the targets of the mutant protein in a MW-like context.In conclusion, compliance to transcriptional programs is essential for the smooth progress of B-terminal differentiation and can be impacted either directly, by mutations affecting TF such as SPI1, or indirectly when the methylation profile of key TF-encoding genes (PRDM1) is altered following mutations in enzymes such as TET2., L’ontogenèse des lymphocytes B (LB) comporte une première phase de différenciation, dans la moelle osseuse en l'absence de toute stimulation antigénique spécifique, aboutissant au LB immature. La seconde phase, d’activation et de maturation finale, est dépendante des antigènes et se déroule dans les organes lymphoïdes secondaires, au sein de structures transitoires appelées centres germinatifs (CG). Elle génère des plasmocytes et des cellules B mémoires spécifiques d’un antigène.Ce travail de thèse s’intéresse à différents acteurs impliqués dans la régulation épigénétique et transcriptionnelle de la différenciation lymphoïde B terminale : les enzymes TET2 et TET3 et le facteur de transcription (FT) SPI1/PU.1. Des mutations affectant les gènes codant pour ces protéines sont trouvées dans les hémopathies chez l’Homme et nous avons cherché à déterminer leurs conséquences fonctionnelles en utilisant des modélisations in vivo et in vitro.J’ai d’une part analysé l’impact de la perte de fonction de TET2 sur la différenciation et la maturation des cellules B. Les résultats montrent un blocage de la différenciation plasmocytaire associé à une hyperplasie des CG et une augmentation du pourcentage et du nombre absolu des LB du CG (BGC). L’analyse par PCR quantitative de l’expression des FT importants pour la différenciation des BGC et des plasmocytes a montré que les cellules déficientes pour TET2 présentent une répression du gène Prdm1 codant pour BLIMP1, un régulateur essentiel de la différenciation plasmocytaire. Je me suis ensuite intéressée à TET3, autre protéine de la famille TET exprimée dans la lignée B. Les modèles Tet3-déficients in vivo et in vitro n’ont pas montré d’altération marquée de la différenciation B terminale.J’ai par ailleurs étudié une mutation somatique de SPI1/PU.1, identifiée par notre équipe chez des patients atteints de maladie de Waldenström (MW). Dans plus de 95% des cas, la mutation activatrice L265P du gène MYD88 est également présente. Nous avons montré que la mutation de SPI1, bien que n'empêchant pas sa liaison à l’ADN, modifie son affinité de liaison sur les sites normalement reconnus par la forme sauvage. La mutation semble faire adopter à cette protéine ETS de classe III un comportement qui ressemble à celui d'une classe I/IIa. J’ai ensuite cherché à documenter les bases de la coopération oncogénique entre SPI1 et MYD88 de deux façons. La première, en étudiant la prolifération et la différenciation de lymphocytes B naïfs issus d’un modèle murin knock-in pour la mutation SPI1 développé dans l’équipe, transduits avec un rétrovirus apportant la mutation de MYD88. Les résultats montrent une augmentation de la prolifération dans la condition double mutante ainsi qu’une augmentation de la différenciation terminale. La seconde approche consiste à modifier la lignée humaine BCWM1 de MW par CRISPR/Cas9 afin d’y introduire la mutation de SPI1 en même temps que l’expression de la GFP. Ce modèle sera notamment utilisé pour réaliser des expériences de ChIP-seq afin d’identifier les cibles de la protéine mutante dans un contexte MW-like.En conclusion, le respect des programmes transcriptionnels est essentiel pour le bon déroulement de la différenciation B terminale et peut être impacté soit directement, par des mutations affectant des FT comme SPI1, soit indirectement lorsque le profil de méthylation de gènes codant pour des FT (PRDM1) est altéré suite à des mutations affectant des enzymes comme TET2.

The toxic gas CO can act in low quantities as signaling molecule; detected by heme-based sensor proteins.The CO-dependent transcription factor RcoM-2 has a very high affinity for CO, while being insensitive to O₂. RcoM-2 binds to DNA only when CO is bound to heme. We characterized the heme-CO interaction in full-length RcoM-2 and compared it with the isolated heme domain RcoMH-2. RcoM-2 can bind CO with lower effective affinity than RcoMH-2. CO dissociates with a 20-fold higher rate than in RcoMH-2, where CO binding is almost irreversible. A small fraction of CO can escape from the protein, thus allowing RcoM-2 to act as CO sensor. The presence of the DNA binding domain influences the binding properties of CO to heme. Identification of the precise molecular origin of the dynamic properties must await the 3D structure RcoM-2.CO detection is crucial for Mtb, the infectious agent of tuberculosis that must overcome the host's defense mechanisms, including CO. The gene cor (rv1829) has been implicated in these processes. We have shown that Cor is a highly stable dimer that is able to stoichiometrically bind a heme cofactor, suggesting a potential function as direct CO sensor. A histidine residue was identified as potential heme ligand. The internal CO dynamics is very similar to other bacterial CO sensors. Cor exhibits DNA binding activity that depends on the presence of heme and CO, which is abolished in the H70A mutant. Our studies also showed that the transcriptional regulator Rv0081, induced in response to gaz changes, can bind to the predicted regulatory region of cor. The creation of a Δcor strain in the non- pathogenic model M. smegmatis continues and will be a first step towards transcriptomic analyzes.; Le gaz toxique CO peut agir à faibles quantités comme molécule de signalisation ; détectée par les protéines senseurs à base d’hème.La première partie de ce travail concerne le régulateur de transcription bactérien CO-dépendant RcoM-2, qui possède une affinité extrêmement élevée pour le CO, tout en étant insensible à l'O₂. RcoM-2 se lie à son ADN cible seulement lorsque du CO est lié à l’hème. Nous avons caractérisé l'interaction hème-CO dans la protéine entière RcoM-2 et l'avons comparée à l’hémo-domaine isolé RcoMH-2. RcoM-2 peut lier du CO avec une affinité effective plus faible que RcoMH-2. Le CO se dissocie avec un taux 20 fois plus élevé par rapport à RcoMH-2, où la liaison du CO est quasi irréversible. Une petite fraction du CO peut échapper de la protéine, ainsi permettant RcoM-2 à agir comme senseur du CO. La présence du domaine de liaison à l'ADN influence les propriétés de fixation du CO à l'hème. Les études sur l'origine moléculaire précise des propriétés dynamiques doivent attendre la structure 3D de RcoM-2.La détection du CO est cruciale pour Mycobacterium tuberculosis, l’agent infectieux de la tuberculose, qui doit répondre aux mécanismes de défense de l'hôte, dont le CO. Le gène cor (rv1829) pourrait y jouer un rôle. Nous avons démontré que Cor est un dimère très stable, capable de lier un hème de façon stoechiométrique, suggérant ainsi une fonction potentielle de senseur direct du CO. Un résidu histidine a été identifié comme ligand potentiel de l’hème. La dynamique interne du CO est très similaire de celle d’autres senseurs à CO bactériens. Cor présente une activité de liaison à l'ADN dépendante de l'hème et du CO, qui est aboli dans le mutant H70A. Nos études ont également montré que le régulateur de transcription mycobactérien Rv0081, induit en réponse aux changements gazeux, peut se lier sur la région régulatrice prédite de cor. La création d’une souche Δcor dans le modèle non-pathogène M. smegmatis se poursuit et constituera un premier pas vers des futures analyses transcriptomiques.

Bcl11b is a transcription factor that acts both as a transcriptional repressor and activator in a context dependent way. A genetic study in humans revealed the association between common genetic variations in the Bcl11b locus and increased risk for cardiovascular disease. Microarray data comparisons showed that Bcl11b could modulate the expression of genes during cardiac hypertrophy. This suggests that studying Bcl11b in the heart may be of major interest. For this, we generated cardiac-specific Bcl11b KO mice (Bcl11b-HKO) and analyzed them at several time points. We observed that the inactivation of Bcl11b in adult mice altered cardiomyocytes’ homeostasis 7 days after Bcl11b’s KO and induced cell death. This causes the activation of repair mechanisms and cardiac remodeling: inflammation, fibrosis, hypertrophy, followed by a decrease in contractile function two months after Bcl11b’s inactivation. Cell death is also observed in Bcl11b-KO primary cardiomyocytes cultures. On the other hand, we observed a disturbance of circadian rhythm gene expression, especially in the pre-sleep period in Bcl11b-HKO mice. In parallel, we characterized the binding of Bcl11b on the proximal promoter region of the βMHC, skActin and cActin genes in a hypertrophic context using ChIP-qPCR experiments. We believe that Bcl11b participates in the regulation of genes involved in cardiac hypertrophy. In conclusion, my thesis work highlights the importance of Bcl11b to cardiac homeostasis through the role it could play in the regulation of cardiac circadian rhythm and its possible role in the regulation of hypertrophic mechanisms.; Bcl11b est un facteur impliqué à la fois dans la répression et l’activation de la transcription. Une étude génétique chez l’Homme a montré une association entre les variations de séquence dans le locus du gène Bcl11b et un risque accrue aux maladies cardiovasculaires. Ceci suggère que l’étude de la fonction de Bcl11b dans le cœur peut présenter un intérêt majeur. Pour cela, nous avons inactivé Bcl11b spécifiquement dans les cardiomyocytes de souris adultes (Bcl11b-HKO) et analysé leur phénotype à plusieurs temps. L’inactivation de Bcl11b chez les souris adultes modifie l’homéostasie des cardiomyocytes 7 jours après le KO et induit une mort cellulaire. Ceci provoque l’activation des mécanismes de réparation et de remodelage cardiaque: inflammation, fibrose, hypertrophie, suivie par une diminution de la fonction contractile deux mois après le KO de Bcl11b. La mort cellulaire a été aussi observée dans des cultures primaires de cardiomyocytes Bcl11b-KO. D’autre part, nous avons observé une perturbation de l’expression des gènes du rythme circadien, et surtout dans la période pré-sommeil chez les souris Bcl11b-HKO. Parallèlement, la fixation de Bcl11b sur la région proximale du promoteur des gènes βMHC, skActin et cActin a été montré dans un contexte hypertrophique grâce à des expériences de ChIP-qPCR. Nous pensons que Bcl11b participera à la régulation de l’expression des gènes impliqués dans l’hypertrophie cardiaque. En conclusion, mes travaux de thèse soulignent l’importance de Bcl11b pour l’homéostasie cardiaque à travers le rôle qu’elle pourrait jouer dans la régulation du rythme circadien cardiaque et son rôle éventuel dans la régulation des mécanismes hypertrophiques.

Le développement du membre nécessite les fonctions des complexes HoxA et HoxD. Les domaines d’expression des gènes Hoxa11 et Hoxa13 sont mutuellement exclusifs, avec l’expression de Hoxa11 restreinte à la partie proximale et de Hoxa13 restreinte à la partie distale. Il a été préalablement démontré que l’expression ectopique de Hoxa11 au niveau de l’autopode induit le développement d’un membre polydactyle, tandis que nous avons démontré que la combinaison de la mutation perte-de-fonction Gli3 (lignée Xt/Xt) avec cette mutation gain-de-fonction Hoxa11 (lignée Prx1Cre; Rosa26Hoxa11/Hoxa11) induit le développement d’un membre oligodactyle, avec la formation de moins de 5 doigts. L’objectif de ce projet était de caractériser l’effet de l’expression ectopique du facteur de transcription HOXA11 dans la modulation du nombre de doigts. Nous avons ainsi démontré par hybridation in situ que les mutants homozygotes Xt/Xt; Prx1Cre; Rosa26Hoxa11/Hoxa11 présente une diminution, voir une perte de l’expression du gène Grem1 dans ces bourgeons de membre, ce qui conduirait à une altération de la boucle de rétrocontrôle SHH – GREM1 – FGFs. De plus, nous avons utilisé des approches génomiques d’immunoprécipitation de la chromatine suivi d’un séquençage à haut débit (ChIP-Seq) pour le facteur HOXA11 et la marque de modification épigénétique des histones, H3K27Ac, afin de caractériser l’effet de HOXA11 distal dans ces bourgeons de membre. L’ensemble des données nous a permis de mettre en évidence que HOXA11 participe à la régulation de l’expression de Grem1, mais aussi de certains gènes propres à la partie antérieure de l’autopode tel que Alx4, Irx3/5 et Hand1., Limb development requires HoxA and HoxD complexes genes, the expression domain of Hoxa11 and Hoxa13 are mutually exclusive, with Hoxa11 being restricted to the proximal part of the limb bud, and Hoxa13 being restricted to the distal part. It has been shown that ectopic expression of Hoxa11 in the autopod domain induces a limb with polydactyly, but we have found that the combined Gli3 loss-of-function (Xt/Xt) with Hoxa11 gain-of-function (Prx1Cre; Rosa26Hoxa11/Hoxa11) induces the development of an oligodactyl limb, with less than 5 digits formed. The aim of this project was to characterize the effect of the ectopic expression of HOXA11 transcription factor in the modulation of the digit number. We show by in situ hybridization that Grem1 expression in the limb bud with ectopic Hoxa11 and inactivated Gli3 is reduced or lost, which leads to an alteration of the SHH – GREM1 – FGFs positive feedback loop. In addition, we have used genomic approaches (ChIP-Seq) for the HOXA11 transcription factor and the epigenetic mark H3K27Ac to characterize the effects of distal expression of Hoxa11 genome-wide. We provide evidence that HOXA11 contributes to the regulation of Grem1 expression, but also to the regulation of other anterior genes like Alx4, Irx3/5 and Hand1.

Bcl11b is a transcription factor that acts both as a transcriptional repressor and activator in a context dependent way. A genetic study in humans revealed the association between common genetic variations in the Bcl11b locus and increased risk for cardiovascular disease. Microarray data comparisons showed that Bcl11b could modulate the expression of genes during cardiac hypertrophy. This suggests that studying Bcl11b in the heart may be of major interest. For this, we generated cardiac-specific Bcl11b KO mice (Bcl11b-HKO) and analyzed them at several time points. We observed that the inactivation of Bcl11b in adult mice altered cardiomyocytes’ homeostasis 7 days after Bcl11b’s KO and induced cell death. This causes the activation of repair mechanisms and cardiac remodeling: inflammation, fibrosis, hypertrophy, followed by a decrease in contractile function two months after Bcl11b’s inactivation. Cell death is also observed in Bcl11b-KO primary cardiomyocytes cultures. On the other hand, we observed a disturbance of circadian rhythm gene expression, especially in the pre-sleep period in Bcl11b-HKO mice. In parallel, we characterized the binding of Bcl11b on the proximal promoter region of the βMHC, skActin and cActin genes in a hypertrophic context using ChIP-qPCR experiments. We believe that Bcl11b participates in the regulation of genes involved in cardiac hypertrophy. In conclusion, my thesis work highlights the importance of Bcl11b to cardiac homeostasis through the role it could play in the regulation of cardiac circadian rhythm and its possible role in the regulation of hypertrophic mechanisms., Bcl11b est un facteur impliqué à la fois dans la répression et l’activation de la transcription. Une étude génétique chez l’Homme a montré une association entre les variations de séquence dans le locus du gène Bcl11b et un risque accrue aux maladies cardiovasculaires. Ceci suggère que l’étude de la fonction de Bcl11b dans le cœur peut présenter un intérêt majeur. Pour cela, nous avons inactivé Bcl11b spécifiquement dans les cardiomyocytes de souris adultes (Bcl11b-HKO) et analysé leur phénotype à plusieurs temps. L’inactivation de Bcl11b chez les souris adultes modifie l’homéostasie des cardiomyocytes 7 jours après le KO et induit une mort cellulaire. Ceci provoque l’activation des mécanismes de réparation et de remodelage cardiaque: inflammation, fibrose, hypertrophie, suivie par une diminution de la fonction contractile deux mois après le KO de Bcl11b. La mort cellulaire a été aussi observée dans des cultures primaires de cardiomyocytes Bcl11b-KO. D’autre part, nous avons observé une perturbation de l’expression des gènes du rythme circadien, et surtout dans la période pré-sommeil chez les souris Bcl11b-HKO. Parallèlement, la fixation de Bcl11b sur la région proximale du promoteur des gènes βMHC, skActin et cActin a été montré dans un contexte hypertrophique grâce à des expériences de ChIP-qPCR. Nous pensons que Bcl11b participera à la régulation de l’expression des gènes impliqués dans l’hypertrophie cardiaque. En conclusion, mes travaux de thèse soulignent l’importance de Bcl11b pour l’homéostasie cardiaque à travers le rôle qu’elle pourrait jouer dans la régulation du rythme circadien cardiaque et son rôle éventuel dans la régulation des mécanismes hypertrophiques.

The laboratory has recently identified the DDB2 (Damaged-DNA Binding 2) protein as a regulator of target gene expression like SOD2, BCL2 and NFKBIA, thus conferring to this protein a role in control of metastatic progression and therapeutic response of breast cancer cells. However, the real activity of DDB2 in gene transcription remains to be defined because its structure cannot entirely explain its influence on target gene expression. This protein can act either as an inhibitor like for the SOD2 and BCL2 genes or as an enhancer like for the NFKBIA gene, encoding IκBα protein. This suggests that DDB2 must associate with, or promote recruitment, of inhibitors or activators of gene transcription. In order to search and identify potential partners that could participate in its transcriptional activity, we developed a “DNA pull-down” approach associated with a global proteomic analysis by mass spectrometry from MCF-7 breast cancer cells overexpressing naturally DDB2. With this approach, we reveal the presence of the UV-DDB complex composed by DDB2, DDB1 and Cullin 4A proteins on the SOD2 and NFKBIA gene promoters. We also highlighted that this complex, known for its role in first steps of UV-induced DNA lesion repair, promotes the recruitment of the p300 histone acetyl transferase on the NFKBIA gene promoter, which may explain, in part, the enhancer activity of DDB2 on this target gene. The proteomic analysis from the “DNA pull-down” also reveals, with originality, the presence of heterogeneous ribonucleoproteins K and J (hnRNP K and J) on the NFKBIA gene promoter with a high recovery score among many other proteins and independently of any physical interaction with DDB2. The J form, very poorly described, shows a higher affinity for NFKBIA gene promoter than the K form. Furthermore, we observed that the J form is strictly nuclear and mostly bound to chromatin, while the K form is also found in cytoplasm. Interestingly, we show that the J form is overexpressed in nucleus of metastatic breast cancer MDA-MB231 cells by comparison with non-metastatic breast cancer T47D cells. Then, we evaluated the importance of hnRNP K and J proteins in NFKBIA gene transcription compared with DDB2 and with a well-known regulator, the Sp1 transcription factor. Our results show that hnRNP K and J proteins, when they are overexpressed, play a repressor role on NFKBIA gene expression by binding on its promoter even in presence of DDB2 and Sp1 activators. Taken together, these data show that some proteins could participate in DDB2 transcriptional activity, like the UV-DDB complex and the p300 protein. Outside of any interaction with DDB2, this work highlights a relationship between the hnRNP K and J proteins, and NF-κB constitutive activity, especially with the J form. This latter has an expression correlated with aggressiveness of breast cancer cells and a potential clinical interest as a predictive marker of metastatic progression, like DDB2; Le laboratoire a identifié récemment la protéine DDB2 comme ayant une activité dans la régulation de l’expression de gènes cibles tels que SOD2, BCL2 et NFKBIA, conférant ainsi à cette protéine un rôle dans le contrôle de la progression métastatique et dans la réponse thérapeutique des cellules tumorales mammaires. Cependant, l’activité réelle de DDB2 dans la transcription génique reste à définir, car sa structure ne permet pas d’expliquer son influence sur l’expression de ses gènes cibles. Cette activité peut être soit inhibitrice comme pour SOD2 et BCL2, soit activatrice comme NFKBIA qui code la protéine IκBα, suggérant que DDB2 doit s’associer avec des inhibiteurs ou des activateurs de la transcription génique, ou en favoriser le recrutement. Afin d’identifier ces partenaires potentiels, susceptibles de participer à son activité transcriptionnelle, nous avons développé une approche de « DNA pull-down », couplée à une analyse protéomique globale par spectrométrie de masse à partir des cellules tumorales mammaires MCF-7 surexprimant naturellement DDB2. Nous avons révélé la présence du complexe UV-DDB (DDB2, DDB1 et Cul4A) sur le promoteur des gènes SOD2 et NFKBIA. Nous avons également mis en évidence que ce complexe, connu pour participer aux premières étapes de la réparation de l’ADN lésé par des rayonnements UV, favorise le recrutement de l’histone acétyl transférase p300 sur le promoteur du gène NFKBIA, expliquant en partie le rôle activateur de DDB2 sur ce gène cible. Notre analyse protéomique à révéler, avec un score élevé, la présence des protéines hnRNP K et J sur le promoteur du gène NFKBIA et d’une manière indépendante de toute interaction physique avec DDB2. La forme J, très peu décrite, présente une affinité plus grande pour le promoteur du gène NFKBIA que la forme K. De plus, nous l’avons observée strictement nucléaire et liée à la chromatine. De manière intéressante, nous montrons que la forme J est surexprimée dans le noyau des cellules tumorales MDA-MB231 métastatiques, comparativement aux cellules T47D non métastatiques. Par la suite, nous avons évalué l’importance des hnRNP K et J dans la transcription du gène NFKBIA par rapport à DDB2 et un régulateur bien décrit tel que le facteur de transcription Sp1. Nos résultats indiquent que les protéines hnRNP K et J, lorsqu’elles sont surexprimées, jouent un rôle de répresseur du gène NFKBIA et ce même en présence des activateurs DDB2 et Sp1. L’ensemble de ce travail a contribué à montrer la présence de protéines, pouvant participer à l’activité transcriptionnelle de DDB2, telles que le complexe UV-DDB et p300. En dehors de tout partenariat avec DDB2, il a été mis en évidence une relation entre les hnRNP K et J et l’activité constitutive de NF-κB, en particulier avec la forme J, qui, par son expression corrélée à l’agressivité des cellules tumorales mammaires, présente un intérêt clinique potentiel en tant que marqueur prédictif de la progression métastatique, tout comme DDB2

Nuclear receptors (NRs) are transcription factors which bind to specific DNA sequences and activate gene transcription in response to the binding of specific ligands. Among all of the RNs involved in the etiology of cancers, ERR estrogen receptors play an important role in breast, ovarian, colon, endometrial and prostate cancers. This NR is said to be orphan because it does not have a natural ligand known to date. Using an integrative structural biology approach combining cryo-electron microscopy, bioinformatics and evolution, my PhD work focused on the structural study of ERR and the origin and evolution of RNs. In this context, three informatic tools have been developed. The results obtained allowed, on the one hand, the revision of fundamental knowledge on the origin of nuclear receptors and their evolution. On the other hand, structural study of ERR allow us to acquire new data on topology of steroid nuclear receptors fixed on an element of ERRE / ERE response as well as on the allosteric mechanism of the binding of the coactivator PGC-1α on the dimer of ERR. The resolution of the complex at the atomic scale by cryo-electron microscopy will open the way towards the design of new therapeutic molecules.; Les récepteurs nucléaires (RNs) sont des facteurs de transcriptions se liant à des séquences spécifiques d'ADN et activant la transcription de gènes en réponse à la fixation de ligands spécifiques. Parmi tous les RNs impliquées dans l'étiologie des cancers, les récepteurs liés aux œstrogènes ERR jouent un rôle important dans les cancers du sein, de l'ovaire, du colon, de l’endomètre et la prostate. Ce RN est dit orphelin car il ne possède pas de ligand naturel connu à ce jour. Par une approche de biologie structurale intégrative combinant cryo-microscopie électronique, bioinformatique et évolution, mon travail de thèse s'est focalisé sur l'étude structurale de ERR et sur l'origine et l'évolution des RNs. Dans ce contexte, 3 outils informatiques ont été développés. Les résultats obtenus ont permis d'une part la révision des connaissances fondamentales sur l'origine des récepteurs nucléaires et leur évolution. D'autre part, l'étude structurale de ERR a permis d'acquérir de nouvelles données sur la topologie des récepteurs nucléaires stéroidiens fixés sur un élément de réponse ERRE/ERE ainsi que sur le mécanisme allostérique de la liaison du coactivateur PGC-1α sur le dimère de ERR. La résolution du complexe à l'échelle atomique par cryo-microscopie électronique permettra d'ouvrir la voie vers la conception de nouvelles molécules thérapeutiques.

La leucémie aiguë lymphoblastique de type B (B-LAL) représente environ 22% des cas de cancers pédiatriques. Parmi les lésions génétiques identifiées dans la B-LAL, la translocation t(12;21)(p13;q22) est la plus fréquente. Cette translocation génère une protéine chimérique jumelant les facteurs de transcription ETV6 et RUNX1. Bien que certains phénotypes oncogéniques aient été liés à ETV6-RUNX1, sa présence est insuffisante pour enclencher de manière indépendante la leucémogenèse. La délétion du locus 12p13 où est localisé le gène ETV6 est observée dans 70% des cas de B-LAL t(12;21) positives, suggérant que l'inactivation complète d'ETV6 est un événement complémentaire nécessaire à la transformation leucémique. Malgré la forte incidence d'altérations génétiques d'ETV6 observées dans les désordres hématologiques, peu d'études ont été faites pour élucider sa fonction moléculaire. Pour être en mesure de mieux comprendre l'impact de l'inactivation d'ETV6 dans la B-LAL, je me suis intéressé à l'identification de ses cibles transcriptionnelles par l'analyse de transcriptomes de lignées cellulaires et de patients leucémiques. Avec la cartographie des sites de liaison d'ETV6 élaborée à partir d'expériences d'immunoprécipitation de la chromatine, j'ai pu construire son réseau de régulation et mettre en lumière la complexité de sa fonction transcriptionnelle. Des études fonctionnelles ont permis d'identifier une nouvelle fonction pour le gène cible CLIC5 dans la résistance au stress oxydatif. Toujours dans l'optique de caractériser ETV6 au niveau moléculaire, j'ai mis en place une approche de criblage pangénomique par ARN interférant visant l'identification de gènes impliqués dans sa fonction transcriptionnelle. L'impact de certains de ces gènes sur le réseau transcriptionnel d'ETV6 a permis de confirmer leur rôle de modulateurs. En ce sens, les gènes AKIRIN1, COMMD9, DYRK4, JUNB et SRP72 sont des modulateurs généraux de la fonction d'ETV6 alors que d'autres agissent spécifiquement sur certaines cibles. Cette étude est la première à s'être penchée sur les gènes impliqués dans la régulation fonctionnelle d'ETV6 dans un contexte leucémique. Les résultats obtenus au cours de cette thèse ont permis d'améliorer considérablement nos connaissances du facteur de transcription ETV6 dans le cadre de la B-LAL. L'intégration de plusieurs approches a mis en évidence la complexité de sa régulation et permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à son implication dans les désordres hématologiques., B-cells acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) accounts for 22% of all childhood cancer cases. Among the genetic aberrations identified in B-ALL, the translocation t(12;21)(p13;q22) is the most frequent one. This translocation generates a chimeric protein between the transcription factors ETV6 and RUNX1. Although some oncogenic phenotypes have been associated to ETV6-RUNX1, its presence alone is not sufficient to induce leukemogenesis. The deletion of the 12p13 locus bearing the ETV6 gene is observed in approximately 70% of t(12;21) positive B-ALL cases, suggesting that the complete inactivation of ETV6 is a complementary event required for leukemic transformation. Despite the high occurrence of ETV6 abnormalities observed in hematological disorders, few studies have focused on its molecular function. To better understand the impact of ETV6 inactivation in B-ALL, I used expression data from leukemic cell lines and patients to identify its transcriptional targets. Together with the mapping of ETV6 binding sites obtained from chromatin immunoprecipitation experiments, I constructed its regulatory network and highlight the complexity of its transcriptional function. Functional studies have unveiled a new function for the CLIC5 target gene in protecting cells against oxidative stress. To further characterize ETV6 at the molecular level, I designed a genome wide shRNA screen and identified genes involved in its transcriptional function. The impact of some of these genes on ETV6 transcriptional network confirmed their role as modulators. In this regard, AKIRIN1, COMMD9, DYRK4, JUNB and SRP72 are broad modulators of ETV6 function whereas some others act specifically on certain targets. This study is the first to have focused on genes involved in the functional regulation of ETV6 in leukemia. The results obtained throughout this thesis have greatly improved our knowledge of the ETV6 transcription factor in B-ALL. The integration of various approaches has highlighted the complexity of its regulation and will allow a better understanding of the mechanisms underlying its role in hematological disorders.

The laboratory has recently identified the DDB2 (Damaged-DNA Binding 2) protein as a regulator of target gene expression like SOD2, BCL2 and NFKBIA, thus conferring to this protein a role in control of metastatic progression and therapeutic response of breast cancer cells. However, the real activity of DDB2 in gene transcription remains to be defined because its structure cannot entirely explain its influence on target gene expression. This protein can act either as an inhibitor like for the SOD2 and BCL2 genes or as an enhancer like for the NFKBIA gene, encoding IκBα protein. This suggests that DDB2 must associate with, or promote recruitment, of inhibitors or activators of gene transcription. In order to search and identify potential partners that could participate in its transcriptional activity, we developed a “DNA pull-down” approach associated with a global proteomic analysis by mass spectrometry from MCF-7 breast cancer cells overexpressing naturally DDB2. With this approach, we reveal the presence of the UV-DDB complex composed by DDB2, DDB1 and Cullin 4A proteins on the SOD2 and NFKBIA gene promoters. We also highlighted that this complex, known for its role in first steps of UV-induced DNA lesion repair, promotes the recruitment of the p300 histone acetyl transferase on the NFKBIA gene promoter, which may explain, in part, the enhancer activity of DDB2 on this target gene. The proteomic analysis from the “DNA pull-down” also reveals, with originality, the presence of heterogeneous ribonucleoproteins K and J (hnRNP K and J) on the NFKBIA gene promoter with a high recovery score among many other proteins and independently of any physical interaction with DDB2. The J form, very poorly described, shows a higher affinity for NFKBIA gene promoter than the K form. Furthermore, we observed that the J form is strictly nuclear and mostly bound to chromatin, while the K form is also found in cytoplasm. Interestingly, we show that the J form is overexpressed in nucleus of metastatic breast cancer MDA-MB231 cells by comparison with non-metastatic breast cancer T47D cells. Then, we evaluated the importance of hnRNP K and J proteins in NFKBIA gene transcription compared with DDB2 and with a well-known regulator, the Sp1 transcription factor. Our results show that hnRNP K and J proteins, when they are overexpressed, play a repressor role on NFKBIA gene expression by binding on its promoter even in presence of DDB2 and Sp1 activators. Taken together, these data show that some proteins could participate in DDB2 transcriptional activity, like the UV-DDB complex and the p300 protein. Outside of any interaction with DDB2, this work highlights a relationship between the hnRNP K and J proteins, and NF-κB constitutive activity, especially with the J form. This latter has an expression correlated with aggressiveness of breast cancer cells and a potential clinical interest as a predictive marker of metastatic progression, like DDB2, Le laboratoire a identifié récemment la protéine DDB2 comme ayant une activité dans la régulation de l’expression de gènes cibles tels que SOD2, BCL2 et NFKBIA, conférant ainsi à cette protéine un rôle dans le contrôle de la progression métastatique et dans la réponse thérapeutique des cellules tumorales mammaires. Cependant, l’activité réelle de DDB2 dans la transcription génique reste à définir, car sa structure ne permet pas d’expliquer son influence sur l’expression de ses gènes cibles. Cette activité peut être soit inhibitrice comme pour SOD2 et BCL2, soit activatrice comme NFKBIA qui code la protéine IκBα, suggérant que DDB2 doit s’associer avec des inhibiteurs ou des activateurs de la transcription génique, ou en favoriser le recrutement. Afin d’identifier ces partenaires potentiels, susceptibles de participer à son activité transcriptionnelle, nous avons développé une approche de « DNA pull-down », couplée à une analyse protéomique globale par spectrométrie de masse à partir des cellules tumorales mammaires MCF-7 surexprimant naturellement DDB2. Nous avons révélé la présence du complexe UV-DDB (DDB2, DDB1 et Cul4A) sur le promoteur des gènes SOD2 et NFKBIA. Nous avons également mis en évidence que ce complexe, connu pour participer aux premières étapes de la réparation de l’ADN lésé par des rayonnements UV, favorise le recrutement de l’histone acétyl transférase p300 sur le promoteur du gène NFKBIA, expliquant en partie le rôle activateur de DDB2 sur ce gène cible. Notre analyse protéomique à révéler, avec un score élevé, la présence des protéines hnRNP K et J sur le promoteur du gène NFKBIA et d’une manière indépendante de toute interaction physique avec DDB2. La forme J, très peu décrite, présente une affinité plus grande pour le promoteur du gène NFKBIA que la forme K. De plus, nous l’avons observée strictement nucléaire et liée à la chromatine. De manière intéressante, nous montrons que la forme J est surexprimée dans le noyau des cellules tumorales MDA-MB231 métastatiques, comparativement aux cellules T47D non métastatiques. Par la suite, nous avons évalué l’importance des hnRNP K et J dans la transcription du gène NFKBIA par rapport à DDB2 et un régulateur bien décrit tel que le facteur de transcription Sp1. Nos résultats indiquent que les protéines hnRNP K et J, lorsqu’elles sont surexprimées, jouent un rôle de répresseur du gène NFKBIA et ce même en présence des activateurs DDB2 et Sp1. L’ensemble de ce travail a contribué à montrer la présence de protéines, pouvant participer à l’activité transcriptionnelle de DDB2, telles que le complexe UV-DDB et p300. En dehors de tout partenariat avec DDB2, il a été mis en évidence une relation entre les hnRNP K et J et l’activité constitutive de NF-κB, en particulier avec la forme J, qui, par son expression corrélée à l’agressivité des cellules tumorales mammaires, présente un intérêt clinique potentiel en tant que marqueur prédictif de la progression métastatique, tout comme DDB2

Malgré de nombreux progrès réalisés dans les traitements des cancers gynécologiques, ceux-ci demeurent la principale cause de mortalité due au cancer chez la femme. Les instabilités chromosomiques et génomiques au niveau du locus 3p21.3 sont des événements fréquents liés à des cancers épithéliaux, notamment les cancers du sein et de l'ovaire. C’est dans cette région que se trouvent les gènes hyaluronidases HYAL-1, HYAL-2 et HYAL-3. HYAL-1 est particulièrement surexprimé dans plusieurs cancers, notamment, le cancer de la prostate, la vessie, le cou, la tête et le sein où il est impliqué dans la progression tumorale et les métastases. Nous avons démontré que dans le locus 3p21.3, HYAL-1 est un gène cible sélectivement réprimé par ERα et l’estrogène. L’analyse de la cohorte METABRIC a révélé une corrélation inverse significative entre l’expression du gène HYAL-1 et ERα. Nous avons identifié des sites de liaison pour ERα au niveau du locus 3p21.3, parmi eux, un ERE proximal était responsable de la répression de HYAL-1 par ERα en plus d’un site Sp-1 requis pour atteindre une répression optimale. Cette répression de HYAL-1 est accompagnée par un enrichissement de la marque répressive H3K27me3 au niveau des deux sites ERE et Sp-1. En plus de réguler l’expression de nombreux gènes, l’activité transcriptionnelle des ERs est aussi régulée par les corégulateurs qui sont recrutés sur les ERs. Nous avons identifié un nouveau partenaire d’interaction inattendu pour les ERs, soit le facteur de transcription hématopoïétique TAL1. Malgré sa réputation d’oncogène dans les leucémies lymphoblastiques aiguës des cellules T, ce facteur de transcription est un corépresseur d’ERα, dû à son effet répresseur direct sur l’activité transcriptionnelle du récepteur en réponse à l’estrogène et donc sur l’expression de ces gènes cible dans le cancer du sein. De plus, TAL1 réprime aussi l’activation d’ERα en réponse à la phosphorylation induite par la voie des MAPK/Erk. Cette répression d’ERα par TAL1 résulte en une diminution de la prolifération et la migration des cellules cancéreuses mammaires., Despite many advances in treatment of gynecological cancers, they remain the leading cause of cancer death in women. Chromosomal and genome instabilities at the 3p21.3 locus are frequent events related to epithelial cancers, including breast and ovarian cancers. It is in this region that the hyaluronidase HYAL-1, HYAL-2 and HYAL-3 genes are found. HYAL-1 is particularly overexpressed in several cancers, including prostate, bladder, neck, head and breast cancers where it promotes tumor progression and metastasis. We demonstrate here, that in the 3p21.3 locus, HYAL-1 is a target gene selectively repressed by ERα and estrogen. Integrative data mining using METABRIC dataset revealed a significant inverse correlation between ERα and HYAL-1 gene expression in human breast tumors. We identified binding sites for ERα at the 3p21.3 locus, among which a proximal ERE responsible for repression of HYAL-1 by ERα, in addition to an Sp-1 site required to achieve optimal repression. This repression of HYAL-1 is accompanied by an enrichment of the repressive mark H3K27me3 at the two sites ERE and Sp-1. In addition to regulate the expression of many target genes, the transcriptional activity of estrogen receptors is also regulated by coregulators who are recruited on ERs. We identified a new unexpected interaction partner for ERs, the hematopoietic transcription factor TAL1. Despite its reputation as an oncogene in T-cell acute lymphoblastic leukemia, this transcription factor is an ERα-corepressor due to its direct repressive effect on the transcriptional activity of the receptor in response to estrogen and thus to expression of its target genes in breast cancer. Moreover, TAL1 also inhibits ERs activation in response to phosphorylation induced by the MAPK/Erk pathway. This repression of ERα by TAL1 results in decreased growth and migration of mammary cancer cells.

Au cours des dernières années, de nouvelles évidences semblent indiquer que, tout autant que sa séquence, l’organisation d’un génome dans l’espace et le temps est importante pour comprendre la fonction de celui-ci. Une des avancées fonda- mentales sur le sujet a été de présenter à l’échelle du génome la carte des inter- actions ADN-ADN. Ces interactions sont essentiellement de 2 types, soit entre chromosomes ou entre régions du même chromosome. Par la suite, la modélisa- tion a permis de visualiser et appréhender la structure tridimensionnelle (3D) du génome à partir des données 3C, ou d’une modélisation purement théorique. Une question importante et centrale demeure, soit de résoudre les mécanismes res- ponsables de l’organisation spatiale et fonctionnelle du génome. Notamment, une question est de savoir comment des processus nucléaires tels que la transcription affectent la structure du génome. Cependant, l’idée selon laquelle les données de types 3C capturent cette information dans la levure est remise en question par le fait que les modèles théoriques du génome récapitulent les caractéristiques mar- quantes soulignées par 3C. Pour répondre à cette question, nous avons conçu une approche qui, pour évaluer l’importance d’une interaction, se base sur la distri- bution d’interactions entre les 2 régions d’ADN mises en contacts. Nos résultats supportent l’hypothèse selon laquelle les éléments fonctionnels et propres aux données expérimentales de la structure 3D du génome se forment d’une manière spécifique à l’échelle de l’interaction et au type d’interactions. Par ailleurs, nos résultats indiquent qu’un grand nombre de facteurs de transcription induisent la proximité spatiale des gènes dont ils régulent l’expression., Over the last decade, accumulating empirical evidence suggest that, as much as its sequence, a genome spatiotemporal organization is essential to understand it’s biological function. One of the major breakthroughs has been chromosome conformation capture (3C) experiments presenting DNA-DNA contact for whole genomes at unprecedented resolution (5-10kb). Along with genome-wide maps of DNA contacts came genome 3D modelling from experimental 3C data, and even from purely theoretical and biophysical basis. However, the mechanisms underlying the regulation of the genome spatial functional organization are still not well understood. Among other questions, how the regulation and event of nuclear processes such as transcription modulate genome structure or how genome structure affect these in turn is still not fully resolved. Moreover, computational models of S.cerevisae genome have recapitulated the hallmarks at larger scale of its 3D features. In order to contrast genome structural features arising from the event of biochemical and molecular activity, we have develop a method assessing the significance of structural features. The underlying principle is to consider for a given interaction, the two DNA regions put in contact and the distribution of existing interactions between these before assigning significance to the selected interaction. Using this method, we demonstrate that structural features resulting from potential biochemically active processes occur at precise scale on the genome. Our results also highlight that exact nature of the interaction (between vs across chromosomes) is crucial to such events. Finally, we have also found that a large portion of transcription factors have their targeted genes in spatial proximity.

Several B-cell lymphomas have characteristic genetic abnormalities that are important in determining their biologic features and can be useful in differential diagnosis. Historically, classical Hodgkin lymphomas have been distinguished from non-Hodgkin lymphomas (NHL). The most common types are follicular lymphoma and diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), which together make up more than 60% of all lymphomas. DBCL are aggressive but potentially curable with multi-agent chemotherapy. However the putative tumor suppressor genes (TSG) responsible for lymphomagenesis still remain unknown. The rational of this project was based on unpublished data from the translational project GHEDI (Deciphering the Genetic Heterogeneity of Diffuse large B-cell lymphoma in the rituximab era). Array comparative genomic hybridization (aCGH) (Agilent 180 K) was performed in a series of 202 DLBCL and found 40% of deletions of 6q21 region, whose minimal commune deleted region (MCR) contains HACE1 gene. Furthermore, transcriptomic analysis showed a significant correlation between gene copy number and expression level. HACE1, located on chromosome 6q, encodes an E3 ubiquitin ligase and is downregulated in human tumors such as neuroblastomas and natural killer (NK) lymphomas. HACE1 has been shown to ubiquitylate Rac1, a protein involved in cell proliferation and G2/M cell cycle progression. The function of HACE1 and the factors involved in its transcriptional regulation are largely unknown in the context of B-cell lymphomas. In this study, we investigated whether HACE1 is a candidate gene in the 6q genomic region involved in DLBCL lymphomagenesis. We determined the frequency of HACE1 inactivation in B-cell lymphoma and analyzed the mechanisms involved in its silencing. We show, by RT-qPCR, that HACE1 gene is constitutively expressed in normal lymph nodes and in normal B-cells isolated from peripheral blood, contrasting with a strong downregulation of its expression in more than 70% (77/111) of B-cell lymphoma cases and in four tested B-Lymphoma cell lines. HACE1 gene copy number was assessed by quantitative multiplex PCR of short fluorescent fragments (QMPSF) and array for comparative genomic hybridization (aCGH) in 91 DLBCL cases., Plusieurs lymphomes à cellules B présentent des anomalies génétiques qui sont importantes pour déterminer leurs caractéristiques biologiques et peuvent être utiles pour le diagnostic. Les types les plus courants sont le lymphome folliculaire et le lymphome diffus à grandes cellules B (LDGCB), qui représentent à eux deux plus de 60 % de tous les lymphomes. Les LDGCB sont agressifs mais peuvent être traités par chimiothérapie à agents multiples. Cependant, les gènes suppresseurs de tumeur (GST) potentiellement responsables de la lymphomagenèse ne sont pas tous connus. Le rationnel de ce projet reposait sur des données non publiées du projet translationnel GHEDI (déchiffrer l'hétérogénéité génétique du lymphome diffus à grandes cellules B à l'ère du rituximab). Une hybridation génomique comparative (CGH) (puce Agilent 180 K) a été réalisée sur une série de 202 LDGCB de la série GHEDI et 40 % des délétions de la région 6q21 ont été identifiées, dont la région minimale commune délétée qui contient le gène HACE1. Par ailleurs, l'analyse transcriptomique a montré une corrélation significative entre le nombre de copies du gène et le niveau d'expression. Le gène HACE1, situé sur le chromosome 6q, code pour une ubiquitine ligase E3 et est régulé négativement chez l'homme dans les tumeurs, y compris les neuroblastomes et les lymphomes à cellules tueuses naturelles (NK). Il a été montré que le gène HACE1 ubiquityle Rac1, une protéine impliquée dans la prolifération cellulaire et la progression G2/M du cycle cellulaire. La fonction du gène HACE1 et les facteurs impliqués dans sa régulation transcriptionnelle sont en grande partie inconnus dans le contexte des lymphomes à cellules B. Dans cette étude, nous avons examiné si le gène HACE1 était un gène candidat dans la région génomique 6q impliqué dans la lymphomagenèse des LDGCB et plus largement dans les lymphomes B. Nous avons déterminé la fréquence de l'inactivation du gène HACE1 dans le lymphome à cellules B et analysé les mécanismes impliqués dans son extinction.

Cutaneous melanoma is the deadliest skin condition. Curing this cancer requires an early diagnosis and surgical excision of the non-invasive primary lesions. Indeed, patients with metastasis have few chances to survive this cancer since the melanoma lesions rapidly develop treatment resistances, and can disseminate metastasis in numerous organs. Crossing the skin basal membrane called the dermal epidermal junction is the first crucial step of early melanoma invasion. Our team has studied the early invasion of melanoma for many years, and demonstrated for the first time the implication of Tetraspanin (TSPAN8) in melanoma early invasion. Indeed, the expression of this gene and the protein that it codes appears with the progression of melanoma and confers the tumor cells an invasive phenotype. Several members of the tetraspanin protein family are known for their implication in various cancers, yet their transcriptional regulation remains poorly understood. In the case of TSPAN8, nothing was known regarding its transcriptional regulation in melanoma. The experiments presented in this thesis allowed us to identify the first known regulators of TSPAN8 transcriptional expression, and also to begin the functional study of the regulators impact on TSPAN8 dependent invasion of human cutaneous melanoma. Amongst these regulators are the member of the Mediator Complex MED19/LCMR1 and the tumor suppressor p53. The results presented in the present manuscript allow a better understanding of cutaneous melanoma early invasion and should help improving the treatments against this cancer in the future, Le mélanome cutané est l’affection de la peau la plus meurtrière. Afin de pouvoir être traité efficacement, ce cancer nécessite un diagnostic et une exérèse chirurgicale précoce des lésions primitives non-invasives. En effet, les patients atteints de métastases ont peu de chance de survivre car les lésions de mélanome développent rapidement des résistances aux thérapies et possèdent une forte propension à disséminer des métastases dans de nombreux organes. Le franchissement de la lame basale de la peau appelée jonction dermo épidermique est la première étape cruciale dans l’invasion précoce du mélanome cutané. Notre équipe étudie cette étape depuis plusieurs années et a démontré que l’expression de la tétraspanine 8 (TSPAN8) apparait lors de la progression de ce cancer et permet l’acquisition d’un phénotype invasif par les cellules tumorales. Plusieurs membres de la famille des protéines tétraspanines sont connus pour leurs implications dans divers cancers, mais notre connaissance de leurs régulations transcriptionnelles est encore assez réduite. Les travaux présentés dans cette thèse ont permis d’identifier les premiers régulateurs transcriptionnels connus de TSPAN8, et également de commencer l’étude fonctionnelle de ces régulations sur l’invasion dépendante de TSPAN8 par le mélanome cutané. En particulier, nous montrons que l’invasion dépendante de TSPAN8 est entre autres régulée par le membre du complexe Mediator LCMR1/MED19 et par le suppresseur de tumeur p53. Ainsi, ces travaux apportent une meilleure compréhension de l’invasion précoce du mélanome cutané, ce qui devrait permettre une meilleure prise en charge des patients à l’avenir

Nuclear receptors regulate expression of important genes involved in development and homeostasis in eukaryotic cells. While some of them are regulated by the binding of a natural ligand, others, like ERR, are orphan and don’t have any natural ligand identified up to now. ERR binds to ERRE response elements through its DBD on promoter regions of genes and its activity can be modulated by the binding of synthetic antagonist ligands. By an integrative structural biology approach, my thesis work consisted in the study of the structural organization of ERR to understand the antagonism mechanisms induced by the inverse agonist XCT-790, and the adopted topology upon binding to DNA. My project focused on the study of the modular domains DBD and LBD complexes with DNA and ligand and extended to the functional study of the whole receptor. Thanks to significant biochemical work, I set up the purification protocols for these proteins and characterized by biophysics the stability and stoichiometry of the DNA and ligand complexes. This work revealed that XCT-790 binds on each LBD monomer with high affinity and that the DBD interacts to an ERRE as a monomer. Many crystallization trials led to crystals for the LBD and DBD complexes that diffracted respectively up to 3.5 Å and 7 Å of resolution but no structure could be determined. These results allow to conclude that the DBD is monomeric on the ERRE and IR3 and appears to be dimeric on the combined response element ERRE/ERE. The topology adopted by ERR on DNA is guided by the ligand binding and might be the consequence for an allosteric communication between the modular domains. These results provide the basis for a future structure determination of the full ERR by X-ray crystallography and cryo electron microscopy., Les récepteurs nucléaires régulent l’expression des gènes importants pour le développement et l’homéostasie des cellules eucaryotes. Si certains d’entre eux sont activés par la liaison d’un ligand naturel, d’autres, comme le récepteur ERR, sont orphelins et ne possèdent pas de ligand naturel connu à ce jour. ERR se lie via son domaine DBD sur un élément de réponse ERRE au niveau des régions promotrices des gènes et son activité peut être modulée par la liaison de ligands synthétiques antagonistes. Par une approche de biologie structurale intégrative combinant biochimie, biophysique et cristallographie aux rayons-X, mon travail de thèse consistait en l’étude de l’organisation structurale d’ERR pour comprendre les mécanismes d’antagonisme induits par le ligand agoniste inverse XCT-790, et la topologie qu’il adopte en interagissant avec l’ADN. Mon projet était axé sur l’étude des domaines modulaires DBD et LBD en complexe avec ADN et ligand transposée à l’étude fonctionnelle du récepteur entier. Par un important travail biochimique, j’ai mis en place les protocoles de purification de ces protéines et caractérisé biophysiquement la stabilité et la stœchiométrie des complexes avec ADN et ligand. J’ai mis en évidence que le ligand XCT-790 se lie sur chacun des monomères de LBD avec une forte affinité et que le DBD interagit avec un ERRE sous la forme d’un monomère. De multiples essais de cristallisation ont abouti à l’obtention de cristaux pour les complexes avec le LBD et le DBD ayant diffracté respectivement jusqu’à 3,5 Å et 7 Å de résolution sans néanmoins pouvoir en déterminer les structures. L’ensemble de ces résultats permettent de conclure que le DBD est monomérique sur les ERRE et IR3 et semble être dimérique sur l’élément de réponse combiné ERRE/ERE. La topologie qu’adopte ERR sur l’ADN est dictée par la liaison de ligand et serait la conséquence d’une communication allostérique entre les domaines modulaires. Ces connaissances acquises faciliteront la détermination structurale d’ERR entier par cristallographie aux rayons-X ou par cryo-microscopie électronique.

Bacteria face frequent environmental changes. Transcriptional regulation plays a major role in the adaptation to these changes. In particular, the phytopathogen bacteria Dickeya have recently adapted to vegetal hosts. They produce Pecate lyases (Pel), among others, to degrade pectin in plant cell walls, which is necessary for disease development. The pelD and pelE genes, despite the strong divergence in their expression, originate from a horizontal gene transfer followed by a recent duplication. This raises the question of their integration into the preexisting regulatory networks.Detailed molecular mechanisms of the transcriptional regulation of pelD were studied first. It was shown that this regulation relies on a high-affinity but low transcription efficiency divergent promoter and a strategic arrangement of four FIS repressor binding sites and two CRP activator binding sites. These elements interact together to fine-tune the expression of pelD. Next, the origin of the regulatory divergence between the paralogous genes pelD and pelE was explored. Surprisingly, their divergence and selection relies mostly on a TSS turnover which happened on the pelE regulatory region and transformed pelE into an initiator of pectin degradation. This widespread phenomenon in multicellular eukaryotes (human, fly, mouse…) had not yet been seen in bacteria. To conclude, through the study of D. dadantii pelD and pelE promoters, new mechanisms highlighting the relevance of transcriptional regulation in adaptation were discovered in this work, Les bactéries sont en permanence confrontées à des changements d'environnements. La régulation transcriptionnelle joue alors un rôle majeur dans l'adaptation des bactéries. En particulier, la bactérie phytopathogène D. dadantii s'est récemment adaptée à l'hôte végétal. Elle produit en particulier des pectate lyases (Pel) qui dégradent la pectine, ciment des parois végétales, et jouent un rôle majeur dans le développement de la maladie. Les gènes pelD et pelE, malgré la forte divergence dans leur expression, sont issus d'un transfert horizontal suivi d'une duplication récente. La question de l'intégration de ces gènes avec les régulations préexistantes s'est alors posée.Dans un premier temps, les mécanismes moléculaires détaillés de la régulation de pelD ont été étudiés. Il a été montré que cette régulation s'appuie sur un promoteur divergent de forte affinité pour l'ARN polymérase mais de faible efficacité pour la transcription et sur un arrangement stratégique de quatre sites de fixation de répresseur FIS et deux sites de l'activateur CRP. Tous ces éléments interagissent entre eux pour produire une régulation fine de l'expression de pelD. L'origine de la divergence régulatrice entre les paralogues pelD et pelE a par la suite été explorée. De manière surprenante, la divergence entre ces deux gènes et leur sélection s'appuie presque exclusivement sur un décalage de la position du promoteur de pelE (« TSS turnover ») qui l'a transformé en initiateur de la dégradation de la pectine. Ce mécanisme très fréquent chez les eucaryotes pluricellulaires (homme, drosophile, souris…) n'avait jamais encore été décrit chez les bactéries.A travers l'étude des promoteurs pelD et pelE de D. dadantii, de nouveaux mécanismes renforçant l'importance de la régulation transcriptionnelle dans les processus adaptatifs ont ainsi été découverts

To optimize the production of a value added compound while avoiding toxic consequences on the cell viability, a challenge in the metabolic engineering field is to balance the endogenous metabolic fluxes and the newly consumed fluxes. In this optimization context, combinatorial strategies can generate several variants of synthetic metabolic pathways. This strategy gives precious strategic information on the right combinations of function and regulation choices to be made in the ultimate pathway reconstruction. Our study aimed at the production of the molecules responsible for aroma, dye, and fragrance of saffron (Crocus sativus) in Saccharomyces cerevisiae. A combinatorial approach was chosen to modulate expression levels of three genes involved in their common precursor biosynthesis: zeaxanthin. This strategy allowed us to describe some unexpected bias in the regulation of the plasmid-encoded genes expression levels. We detected strong transcriptional interference between the different genes in our system, and the ORF nature also seemed to influence the expression levels. These critical factors imposed a stronger regulation of the three genes expression levels than the promoter strength initially chosen to control them. The project was continued toward its final objective by making a detailed functional analysis of the zeaxanthin cleavage reaction leading to the molecules of interest synthesis. This reaction was described to be catalyzed by a specific enzyme, but no activity was observed in our experiments. This result led us to propose some tools to reach the final goal of the project; Afin d’optimiser la production d’un composé d’intérêt tout en évitant les conséquences néfastes sur la viabilité cellulaire, un défi majeur de l’ingénierie métabolique est d’obtenir un équilibre entre les flux métaboliques endogènes de la cellule et le flux consommé par une nouvelle voie de biosynthèse. Dans ce contexte d’optimisation, les stratégies combinatoires génèrent une diversité de voies métaboliques et de modes de régulation rassemblant de précieuses informations quant aux choix d’orientations stratégiques à faire. Notre étude s’inscrit dans un projet visant à produire les molécules responsables de l’arôme, de la couleur et du parfum du safran (Crocus sativus) chez Saccharomyces cerevisiae. Une approche combinatoire a été adoptée pour moduler les niveaux d’expression de trois gènes menant à la synthèse de leur précurseur commun : la zéaxanthine. Cette stratégie nous a permis de décrire des biais inattendus dans la régulation des niveaux d’expression des gènes exprimés sur plasmide. Nous avons détecté une forte interférence transcriptionnelle entre les gènes dans notre système, ainsi qu’une influence de la nature des séquences codantes. Ces éléments, identifiés comme critiques, imposent sur les niveaux d’expression des trois gènes une régulation plus importante que la force des promoteurs qui les contrôlent. Afin de poursuivre le projet vers son objectif final, la réaction de clivage de la zéaxanthine menant à la synthèse des composés d’intérêt du safran a fait l’objet d’une analyse fonctionnelle détaillée. Une absence d’activité de l’enzyme décrite dans la littérature comme responsable de cette réaction nous a conduits à proposer des perspectives d’ingénierie pour atteindre l’objectif final du projet

Immune surveillance of tumors is based on the ability of effector cells of the immune system to detect and eliminate the cancer cells. Notwithstanding, the complete and spontaneous regression of established cancers was observed only in very few cases. The failure of cancer resolution by the immune system could result from the combination of several factors: i) inadequate immune response related to a low tumor immunogenicity, ii) incompetent immune system consecutively to induced or acquired immunodeficiencies and iii) the selection of resistant tumor variants able to thwart immune surveillance or subverting immune responses. Developing novel cancer immunotherapy strategies leading to potentiation of the host antitumor responses is thus a key challenge in oncology.We aim to better characterize the relationships between immune response and cancer. My work is precisely to understand the molecular mechanisms involved in CD4 T cell differentiation and to determine the role of these cells in antitumor immunity. I am particularly committed to explore the molecular mechanisms underlying the Th17, Th9 and TFh cell differentiations. The goal is to better understand and adjust their effector functions to optimize antitumor responses. This work is part of a potential application in cancer immunotherapy approach, an area that is experiencing dramatic advances and is likely to grow in the years ahead.We first studied the influence of the n 3 polyunsaturated fatty acid docosahexaenoic acid (DHA) on Th17 cell differentiation. We unraveled the molecular mechanism responsible for the direct inhibition of Th17 cell polarization by DHA, explaining one way of DHA to exert its anticancer activity. TH17 cells induced in vitro displayed increased SOCS3 expression and diminished capacity to produce interleukin 17 following activation of PPARγ by DHA. In two different mouse cancer models, DHA prevented tumor outgrowth and angiogenesis in an IL 17 dependent manner. Altogether, our results uncover a novel molecular pathway by which PPARγ induced SOCS3 expression prevents IL 17 mediated cancer growth.Then, we characterized the effects of interleukin 1β (IL-1β) on Th9 cells molecular program. We found that the transcription factor IRF1 enhanced the effector functions of Th9 cells and dictated their anticancer properties. Under Th9 skewing conditions, IL-1β induced phosphorylation of the transcription factor STAT1 and subsequent expression of IRF1, which bound to Il9 and Il21 gene promoters and enhanced their secretion by Th9 cells. In addition, IL-1β induced Th9 cells exerted potent anticancer functions in an IRF1 and IL 21 dependent manner. Thus, our findings identify IRF1 as a target for controlling the function of Th9 cells.We are currently investigating the transcriptional regulation of IRF1 on follicular helper CD4 T (TFh) cell program. We address the question whether TFh cells could be beneficial in cancer immunotherapy. Our study highlights the early activation of IRF1 during the TFh cell polarization and suggests that IRF1 appears to initiate the development of these cells. Adoptive transfer approaches show that TFh lymphocytes seem to habor anticancer properties by limiting efficiently tumor outgrowth in mouse models of cancer. Finally, phenotypic characterization of TFh cells points out that they infiltrate human breast tumors and express IRF1., La surveillance immunologique des tumeurs repose sur la capacité des cellules effectrices du système immunitaire à détecter et à éliminer les cellules cancéreuses. Nonobstant ce constat, la régression complète et spontanée de cancers établis n’est observée que dans de très rares cas. L’échec de la résolution des cancers par le système immunitaire pourrait résulter de la conjonction de plusieurs facteurs : i) une réponse immune inadéquate liée au manque d’immunogénicité des tumeurs, ii) l’incompétence du système immunitaire consécutif à des immunodéficiences acquises ou induites et iii) la sélection de variants tumoraux résistants capables de déjouer la surveillance opérée par le système immunitaire ou de subvertir ses effets. Ainsi, le développement de stratégies visant à potentialiser les réponses antitumorales de l’hôte revêt un enjeu crucial en cancérologie.Au laboratoire, notre travail de recherche a pour objectif de mieux caractériser les liens entre réponse immunitaire et cancer. Mon travail de thèse vise précisément à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la différenciation des lymphocytes T CD4 et à déterminer le rôle de ces cellules dans l’immunité antitumorale. Au cours de ma thèse, nous nous sommes particulièrement attachés à explorer les mécanismes moléculaires qui sous tendent la différenciation des populations lymphocytaires Th17, Th9 et TFh pour mieux appréhender et moduler leurs fonctions effectrices afin d’optimiser les réponses antitumorales. Ces travaux s’inscrivent dans une démarche d’application potentielle en immunothérapie anticancéreuse, un domaine de recherches qui connaît actuellement des avancées spectaculaires.Nous avons tout d’abord étudié l’influence de l’acide docosahexaénoïque (DHA), un acide gras à longue chaîne de la série n 3, sur la différenciation des cellules Th17. Nous avons mis en évidence le mécanisme moléculaire responsable de l’inhibition directe de la polarisation cellulaire Th17 par le DHA. L’activation de PPARγ par le DHA induit l’expression de SOCS3 qui agit comme un répresseur intrinsèque de la différenciation Th17. Dans deux modèles de cancers murins, nous avons également montré que l’activité anticancéreuse du DHA était dépendante de sa capacité à inhiber la sécrétion d’IL 17 par les cellules T CD4 in vivo. Nous avons ainsi caractérisé l’un des mécanismes impliqués dans l’effet anticancéreux du DHA.Dans un deuxième travail, nous avons caractérisé les effets de l’interleukine 1β sur le programme moléculaire des cellules Th9. Nous avons montré que les cellules Th9 différenciées en présence d’IL-1β possédaient de puissantes propriétés anticancéreuses dépendantes de l’IL-21 reposant sur l’activation du facteur de transcription IRF1. Au niveau moléculaire, nous avons démontré que l’IL-1β induisait la phosphorylation de STAT1 elle même responsable de l’activation d’IRF1 qui est alors capable d’interagir sur les promoteurs de l’Il9 et de l’Il21 pour induire l’expression de ces gènes dans les cellules Th9.Le dernier projet porte sur la régulation transcriptionnelle du facteur de transcription IRF1 sur la réponse T folliculaire auxiliaire et cherche à en évaluer les retombées potentielles en immunothérapie anticancéreuse. Notre étude met en évidence l’activation précoce d’IRF1 dans la différenciation TFh et suggère que ce facteur de transcription semble initier le développement de ces cellules. Des approches de transfert adoptif révèlent que les TFh semblent posséder des propriétés anticancéreuses capables de limiter efficacement la croissance des tumeurs dans des modèles murins. Enfin, après caractérisation phénotypique nous montrons que les cellules TFh sont présentes dans des tumeurs mammaires chez l’Homme et validons la présence d’IRF1 dans ces lymphocytes.

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene was identified in 1989. Twenty five years later, the regulatory mechanisms controlling its complex expression are still not fully understood. Although, almost 1980 mutations have been identified, many cases of cystic fibrosis or CFTR Related Disorders remain still of unknown origin. The promoter which binds transcription factors and drives some aspects of CFTR gene expression, cannot alone account for tissue specific control. This implicates other distal cis- or trans-acting elements in cell-type-specific regulation of CFTR expression. The aim of our project is to study long-range regulatory elements of the CFTR gene, which could interact specifically with the CFTR promoter by tri-dimensional folding mechanism. We first developed the Chromosome Conformation Captures (3C) approach to map these chromosomal contacts. Subsequently, we enhanced our analyses with a high-throughput adaptation of 3C: the 3C-Carbon Copy (5C) technology. This approach allows the analysis of millions chromatin interactions. Thus, we have analyzed the spatial organization of a ～790kb region, comprising the CFTR gene, in primary nasal epithelial cells, which express the gene, and primary skin fibroblasts, which do not express the gene. Interactions between this locus and the CFTR promoter have been analysed by next generation sequencing with the Ion PGM™. We have compared chromatin conformation in order to identify uncharacterized regulatory elements that act especially in CFTR-expressing cells. Our approach has been validated by the identification of previously characterized regulatory elements. Moreover, we identify novel chromatin contacts of the CFTR promoter with chromosomal regions, which could potentially be involved in CFTR gene expression regulation. Thanks to 3C and 3C-derivated analyses, we could identify new possible mutations far from the gene, which may lead to its dysfunction by modifying the chromatin conformation or regulatory elements., Le gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) a été identifié en 1989. Vingt-cinq ans après, les mécanismes contrôlant sa fine expression, sont encore mal compris. Bien qu’environ 1980 mutations aient été découvertes, il reste des patients pour qui le génotype n’a pas été établi. Les éléments de régulation, décrits au sein du promoteur, ne peuvent à eux seuls expliquer cette complexe régulation tissu spécifique. Des éléments de régulation à distance, en cis ou en trans, sont certainement impliqués dans ce contrôle d’expression. L’objectif de ce projet est de mieux décrypter les mécanismes de régulation à distance du gène CFTR en identifiant des séquences régulatrices éloignées, mais pouvant, par des mécanismes de repliement, interagir spécifiquement avec celui-ci. Afin d’étudier ces contacts chromosomiques, nous avons, dans un premier temps, mis au point la technique de Capture de Conformation Chromosomique (3C). Suite à cette technique, nous sommes passés à une approche à plus grande échelle, la technique de Copie Conforme de 3C (5C), qui permet de mesurer des milliers d’interactions chromatiniennes en une analyse. L’organisation spatiale d’une région d’environ 790 kb recouvrant le gène CFTR, a été analysée dans des cultures primaires de cellules épithéliales nasales, exprimant le gène CFTR et des fibroblastes de peau, ne l’exprimant pas ou très peu. Les interactions entre les régions de ce locus et le promoteur CFTR ont été étudiées par séquençage nouvelle génération sur Ion PGM™. Nous avons comparé ces conformations chromatiniennes afin d’identifier des éléments de régulation spécifiques d’une expression de CFTR. Notre approche a été validée par l’identification de régions régulatrices précédemment décrites. De plus, nous avons mis en évidence de nouveaux contacts chromatiniens avec le promoteur CFTR. Ces régions semblent fortement impliquées dans la régulation de l’expression du gène CFTR. Grâce à la technique 3C et ses variantes, l’identification de nouvelles mutations à distance du gène pourraient expliquer des dérégulations de son expression.

Listeria monocytogenes is a ubiquitous bacterium responsible for listeriosis, a food-borne disease. This pathogen has been isolated from various environments of which the telluric environment. The presence of L. monocytogenes in soil can increase health hazards due to the risk of transfer to vegetables, animals and animal products and water. Considering the role of soil in the circulation of pathogens from farm environment to plant and animal products and eventually to foodstuff, it is critical to identify intrinsic and extrinsic factors that drive the fate of L. monocytogenes in soil. Genome-wide and transcriptomic analyses found that an important part of the genome of L. monocytogenes (7.3%) is dedicated to regulation including 209 transcriptional regulators. Among these, AgrA is the response regulator of the two component system AgrC/AgrA which is part of the Agr communication system. We investigated the role of AgrA for L. monocytogenes adaptation to soil. A ∆agrA mutant displayed significantly reduced survival in soil microcosms. Additionally, microarray analyses identified 386 genes and a large repertoire of ncRNA as differentially transcribed between the mutant and the parental strain. The results presented here suggest that AgrA may be critical for the adaptation of L. monocytogenes by regulating an important network of genes and ncRNAs.Moreover, co-inoculation of mutants of the Agr system with the parental strain showed that inactivation of the regulator AgrA resulted in a decrease of the fitness of the strain, confirming that AgrA is necessary for optimal L. monocytogenes adaptation. On the other hand, when co-cultured with the parental strain, the fitness of the ∆agrD mutant was not affected, indicating that the mutant ∆agrD took advantage of the parental strain.Soil biology is a major extrinsic factor that conditions the fate of L. monocytogenes populations in soil. Inactivation of microbial communities lifted growth inhibition. Experimental erosion of soil microbial diversity showed that highly diverse soil microbial communities act as a biological barrier against L. monocytogenes invasion and that phylogenetic composition of the community also has to be considered. These results suggest that erosion of diversity may have damaging effects regarding circulation of pathogenic microorganisms in the environment., Listeria monocytogenes est une bactérie ubiquiste responsable d’une infection d’origine alimentaire, la listériose. Ce pathogène a été isolé de divers environnements dont l’environnement tellurique. La présence de L. monocytogenes dans le sol pose des problèmes sanitaires du fait de son possible transfert vers les plantes cultivées, les animaux et productions animales et l’eau. Dans ce contexte, il est essentiel de déterminer les facteurs extrinsèque et intrinsèque qui impactent l’écologie de L. monocytogenes dans le sol.Les études d’association génomique et les analyses transcriptomiques ont permis d’identifier qu’une part importante du génome de L. monocytogenes (7,3%) est dédiée à la régulation incluant 209 régulateurs transcriptionnels. Parmi eux, AgrA appartient à un système à deux composants du système de communication Agr. Nous avons étudié le rôle du régulateur transcriptionnel AgrA dans l’adaptation de L. monocytogenes au sol. La survie du mutant ∆agrA est significativement réduite dans les microcosmes de sol. De plus, une analyse transcriptomique a permis d’identifier que les taux de transcrits de 386 gènes et d’un large répertoire d’ARN non codant diffèrent significativement entre le mutant et la souche parentale. Les résultats suggèrent que la régulation de gènes et d’ARN non codant sous la dépendance d’AgrA pourrait être nécessaire pour l’adaptation optimale de L. monocytogenes au sol.De plus, la co-inoculation de mutants au système Agr défectueux avec la souche parentale a montré que le mutant ∆agrA est moins compétitif, confirmant l’importance d’AgrA dans l’adaptation de L. monocytogenes. En revanche, au cours de co-cultures, la compétitivité du mutant ∆agrD est similaire à celle de la souche parentale, ce qui laisse présumer que le mutant ∆agrD tire avantage de la présence de la souche parentale.L’un des facteurs extrinsèque essentiels susceptibles d’affecter la survie tellurique de L. monocytogenes est la composante biotique du sol. En effet, l’inactivation de la microflore du sol par ionisation lève l’inhibition de la croissance de L. monocytogenes. Au-delà de la seule abondance des communautés microbiennes, leur diversité influence le devenir des populations de L. monocytogenes. Par une approche de dilution jusqu’à extinction, nous avons démontré expérimentalement que l’érosion de la diversité microbienne se traduit par une meilleure survie de L. monocytogenes dans le sol. Nous avons démontré que les communautés microbiennes hautement diversifiées agissent comme une barrière biologique contre l’invasion de L. monocytogenes et que la composition phylogénétique de ces communautés doit être aussi considérée. Ces résultats suggèrent que l’érosion de la diversité pourrait accroître la circulation des microorganismes pathogènes dans l’environnement.

The Damaged DNA-Binding 2 protein (DDBZ) is known to play a role in repair of UV-induced DNA damages. However. the laboratory has shown that this protein is overexpressed in nonmetastatic breast tumor cells and stimulates their proliferation by favouring their entry in G1/S transition phase of cell cycle. This novel biological activity of DDB2 depends on its ability to modulate transcription of target genes. such as that encoding the manganese superoxide dismutase (MnSOD) antioxidant enzyme. The fact that DDB2 is not expressed in metastatic breast tumor cells led us to focuse this work on the role of DDB2 in the invasive abilities of these cells.In a 1st time, we have shown that highly metastatic breast tumor cells (MDA-MBZSI et SKBR3), when they overexpress DDB2 after introduction of its gene. have a strong decrease in their in vitro migratory and invasive abilities. and in their properties to develop in vivo lung metastasis. associated with a highly reduced expression of matrix metalloprotease 9 (MMP-9). In addition DDBZ expression was analyzed in a cohort of 92 breast samples from patients. An inverse correlation is observed between DDB2 level and the high-grade (SBR>3) breast tumors. In a 2nd time, we identified the molecular mechanism by which DDB2 controls negatively the invasive abilities of breast tumor cells. We have shown that DDB2 plays a positive role in the expression of gene encoding 1 kappa B alpha gene (Item). though its binding to a specific DNA sequence localized in the proximal promoter, and which promotes a strong decrease in the NF-kappaB activity. This transcription factor is well known to play a role in migratory and invasive abilities of metastatic breast tumor cells by regulating many target genes, such as that encoding MMP-9. We have shown that inhibition by RNA interference of I-kappa-B-alpha expression restores in part the invasive properties of DDB2-overexpressing metastatic breast tumor cells, associated with an induction of MMP-9 gene expression In a 3rd time. we have also shown in metastatic breast tumor cells, that the high basal MnSOD expression when DDB2 is lacking, depends on the related activity of the NF-kappaB and Sp1 transcription factors, considering that this other molecular mechanism is involved in invasive properties of these cells.Taken together, this work contributes to a better understanding how breast tumor cells progress toward an invasive phenotype and underlines also the idea that DDB2 has a clinical relevance as a good potential marker for predicting breast tumor progression toward metastasis. Finally, the relationship between DDB2. NF-kappaB and MnSOD may be considered as an interesting pathway for development of new anticancer therapies., La protéine Damaged DNA-Binding 2 (DDB2) est connue pour son rôle dans la réparation de l'ADN lésé par les UV. Cependant, le laboratoire a montré que cette protéine est surexprimée naturellement dans les cellules tumorales mammaires non métastatiques et active leur prolifération, en favorisant leur entrée en phase de transition G1/S du cycle cellulaire. Il a été montré que cette nouvelle activité biologique de DDB2 dépend de sa capacité à intervenir dans la transcription de gènes cibles, comme celui codant l'enzyme anti-oxydante, la superoxyde dismutase à manganèse (SOD Mn). Sur la base que DDB2 est peu ou pas exprimée dans les cellules tumorales mammaires métastatiques, ce travail a consisté à étudier le rôle de cette protéine dans les capacités invasives de ces cellules. Dans un 1er temps, nous avons montré que les cellules tumorales mammaires hautement métastatiques (MDA-MB231 et SKBR3), lorsqu'elles surexpriment DDB2 après introduction de son gène, ont des capacités migratrices et invasives in vitro, ainsi que des propriétés in vivo à développer des métastases pulmonaires, fortement réduites, en association avec une diminution importante de l'expression de la métalloprotéase matricielle 9 (MMP-9). De même, lors d'une analyse rétrospective sur 92 échantillons cliniques provenant de patientes, une corrélation inverse entre l'expression de DDB2 et le haut grade (SBR> ou =3) des tumeurs mammaires est observée. Dans un 2ème temps, nous avons identifié le mécanisme moléculaire par lequel DDB2 agit négativement sur les capacités invasives des cellules tumorales mammaires. Nous avons montré que DDB2 intervient positivement sur l'expression du gène codant I kappa B alpha (IkBa), en se fixant sur une séquence d'ADN localisée dans la région proximale du promoteur, qui entraîne en conséquence une forte diminution de l'activité du facteur de transcription NF-kB. Ce dernier est connu pour son rôle dans les capacités invasives et migratrices des cellules tumorales mammaires métastatiques, en régulant de nombreux gènes cibles comme celui codant la MMP-9. Nous avons montré, que l'inhibition de l'expression d'IkBa, par ARN interférence restaure en partie les propriétés invasives des cellules tumorales mammaires métastatiques surexprimant DDB2, en association avec une réexpression de MMP-9. Dans un 3ème temps, nous avons également montré dans les cellules tumorales mammaires métastatiques, que l'expression constitutivement élevée de la SOD Mn, en l'absence de DDB2, dépend de l'activité conjointe des facteurs de transcription NF-kB et Sp1, révélant ainsi un autre mécanisme moléculaire impliqué dans les propriétés invasives de ces cellules. L'ensemble de ce travail contribue ainsi à mieux comprendre comment les cellules tumorales mammaires progressent vers un statut invasif et renforce également l'idée que DDB2 présente un intérêt clinique potentiel, comme marqueur prédictif de la progression métastatique des tumeurs mammaires. Enfin, la relation entre la DDB2, NF-kB et la SOD Mn représente une voie intéressante pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses.

HYAL-1 (hyaluronidase-1) appartient à la famille des hyaluronidases connues pour leur rôle dans la dégradation de l’acide hyaluronique. L’expression de HYAL-1 est élevée dans de nombreux type de cancers, notamment dans le cancer de la prostate, de la vessie, des reins et du sein où il est impliqué dans la croissance tumorale et les métastases. Récemment notre laboratoire a aussi démontré une expression élevée de HYAL-1 dans le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) de type mucineux et à cellules claires, expression qui est inversement corrélée à celle du récepteur de l’oestrogène alpha (REα). Cependant, malgré le fait que le rôle de HYAL-1 dans le cancer soit bien établit, le mécanisme de sa régulation reste encore inconnu. Le REα est un facteur de transcription qui suite à sa liaison avec son ligand va réguler l’expression de plusieurs gènes. Le REα ainsi stimulé par l’hormone va activer la transcription de ces gènes cibles mais il est connu maintenant qu’une grande partie des gènes régulés par le REα sont en réalité réprimés par ce récepteur. Dans ce travail nous proposons d’étudier le mécanisme de la régulation du gène HYAL-1 par le REα dans le CEO à cellules claires et dans le cancer du sein. L’expression ectopique du REα dans la lignée TOV21G (RE-) de même que le traitement de la lignée MCF-7 (RE+) avec de l’oestrogène a induit une diminution du niveau d’expression de l’ARN m de HYAL-1. Ces résultats nous ont permis de confirmer que HYAL-1 est un gène cible du REα. Il est aussi connu que le REα peut exercer son action par différents mécanismes d’action, entre autres en interagissant avec une séquence d’ADN appelée élément de réponse à l’oestrogène (ERE), retrouvé sur le promoteur des gènes cibles ou bien indirectement par des interactions protéine-protéine en se liant à d’autres facteur de transcription tels que Sp1. Après avoir identifiés de telles séquences sur le promoteur proximal de HYAL-1, (1 ERE proximal à -900 pb, 3 distaux à -32350 pb, 48430, -50130 pb du site d’initiation de la transcription) en plus des 2 Sp1 connus (-60 et – 1020pb), nous avons démontrés par immunoprécipitation de la chromatine que le REα est recruté sur le promoteur de HYAL-1 au niveau de l’ERE proximal -900 pb et du distal -32350 pb de même que sur le site Sp1 -1020 pb. De plus, l’activité biologique de l’ERE -900 pb et du ii Sp1-1020pb à été confirmée par des essais de gènes rapporteurs à la luciférase. Avec son rôle connu dans la tumorigenèse, l’identification de HYAL-1 comme gène cible du REα pourrait être une avenue intéressante pour le traitement des cancers hormono-indépendants., HYAL-1 (hyaluronidase-1) belongs to the hyaluronidase family of enzymes that degrade hyaluronic acid. HYAL-1 expression is elevated in many types of cancers including prostate, bladder, liver and breast cancer where it is involved in tumor growth and metastasis. In accordance to these observations, our group has also demonstrated high expression of HYAL-1 in clear cell and mucinous epithelial ovarian cancer (EOC) subtypes which was inversely correlated to that of estrogen receptor alpha (ERα). However, despite the fact that the role of HYAL-1 in cancer is well established, the mechanism of its regulation is still unknown. ERα is a transcriptional factor that regulates target-gene expression following ligand binding. Upon hormone stimulation, activated ERα will upregulate transcription of many target genes. However, it has been recently well documented that a large number of ERα responsive genes are in fact repressed. In this work we propose to study the mechanism by which ERα regulates HYAL-1 expression in clear cell EOC subtype as well as in breast cancer. The ectopic expression of ERα in TOV21G cell line (ERα -) and estrogen treatment of MCF-7 cells (ERα +) decreased HYAL-1 mRNA expression and allowed us to confirm that HYAL-1 is an ERα target gene. It is also known that ERα may exert its action through different mechanisms of action including interacting with a DNA sequence called estrogen response element (ERE) found in the promoter of target genes or indirectly by protein-protein interactions by binding to other transcription factor such as Sp1. Having identified such sequences in the proximal promoter of HYAL-1, (one proximal ERE -900 bp, 3 distals at -32350, -48430, -50130 bp from the start site of transcription) in addition to the two known Sp1 (-60 and -1020pb), we have demonstrated by chromatin immunoprecipitation that ERα is recruited at the HYAL-1 promoter at the ERE sites -900 pb and -32350 pb as well as at the Sp1 site -1020. Furthermore, the biological activity of the proximal ERE -900 and Sp1 -1020 sites were further confirmed by luciferase reporter gene assay. Given its known role in tumorigenesis, identification of HYAL-1 as an ERα target may provide an interesting approach for the treatment of hormono-independent cancer.

Le diabète de type 2 (DT2) est caractérisé par une résistance des tissus périphériques à l’action de l’insuline et par une insuffisance de la sécrétion d’insuline par les cellules β du pancréas. Différents facteurs tels que le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’immunité innée affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Toutefois, leur implication dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline demeure imprécise. Le but de cette thèse était d’identifier et de caractériser le rôle du stress du RE et de l’immunité innée dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline. Les cellules β-pancréatiques ont un RE très développé, conséquence de leur fonction spécialisée de biosynthèse et de sécrétion d’insuline. Cette particularité les rend très susceptible au stress du RE qui se met en place lors de l’accumulation de protéines mal repliées dans la lumière du RE. Nous avons montré qu’ATF6 (de l’anglais, activating transcription factor 6), un facteur de transcription impliqué dans la réponse au stress du RE, lie directement la boîte A5 de la région promotrice du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans isolés de rat. Nous avons également montré que la surexpression de la forme active d’ATF6α, mais pas ATF6β, réprime l’activité du promoteur de l’insuline. Toutefois, la mutation ou l’absence de la boîte A5 ne préviennent pas l’inhibition de l’activité promotrice du gène de l’insuline par ATF6. Ces résultats montrent qu’ATF6 se lie directement au promoteur du gène de l’insuline, mais que cette liaison ne semble pas contribuer à son activité répressive. Il a été suggéré que le microbiome intestinal joue un rôle dans le développement du DT2. Les patients diabétiques présentent des concentrations plasmatiques élevées de lipopolysaccharides (LPS) qui affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Nous avons montré que l’exposition aux LPS entraîne une réduction de la transcription du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans de rats, de souris et humains. Cette répression du gène de l’insuline par les LPS est associée à une diminution des niveaux d’ARNms de gènes clés de la cellule β-pancréatique, soit PDX-1 (de l’anglais, pancreatic duodenal homeobox 1) et MafA (de l’anglais, mammalian homologue of avian MafA/L-Maf). En utilisant un modèle de souris déficientes pour le récepteur TLR4 (de l’anglais, Toll-like receptor), nous avons montré que les effets délétères des LPS sur l’expression du gène de l’insuline sollicitent le récepteur de TLR4. Nous avons également montré que l’inhibition de la voie NF-kB entraîne une restauration des niveaux messagers de l’insuline en réponse à une exposition aux LPS dans les îlots de Langerhans de rat. Ainsi, nos résultats montrent que les LPS inhibent le gène de l’insuline dans les cellules β-pancréatiques via un mécanisme moléculaire dépendant du récepteur TLR4 et de la voie NF-kB. Ces observations suggèrent ainsi un rôle pour le microbiome intestinal dans la fonction de la cellule β du pancréas. Collectivement, ces résultats nous permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la répression du gène de l'insuline en réponse aux divers changements survenant de façon précoce dans l’évolution du diabète de type 2 et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles qui permettraient de prévenir ou ralentir la détérioration de l'homéostasie glycémique au cours de cette maladie, qui affecte plus de deux millions de Canadiens., Type 2 diabetes is characterized by insulin resistance and impaired insulin secretion from the pancreatic β-cell. Endoplasmic reticulum (ER) stress and innate immunity have both been reported to alter pancreatic β-cell function. However, it is not clear whether these factors can affect the transcription of the insulin gene. The aim of this thesis was to assess the role of ER stress and innate immunity in the regulation of the insulin gene. Pancreatic β-cells have a well-developed endoplasmic reticulum (ER) due to their highly specialized secretory function to produce insulin in response to glucose and nutrients. In a first study, using several approaches we showed that ATF6 (activating transcription factor 6), a protein implicated in the ER stress response, directly binds to the A5/Core of the insulin gene promoter in isolated rat islets. We also showed that overexpression of the active (cleaved) fragment of ATF6α, but not ATF6β, inhibits the activity of an insulin promoter-reporter construct. However, the inhibitory effect of ATF6α was insensitive to mutational inactivation or deletion of the A5/Core. Therefore, although ATF6 binds directly to the A5/Core of the rat insulin II gene promoter, this direct binding does not appear to contribute to its repressive activity. In recent years, the gut microbiota was proposed has an environmental factor increasing the risk of type 2 diabetes. Subjects with diabetes have higher circulating levels of lipopolysaccharides (LPS) than non-diabetic patients. Recent observations suggest that the signalling cascade activated by LPS binding to Toll-Like Receptor 4 (TLR4) exerts deleterious effects on pancreatic β-cell function; however, the molecular mechanisms of these effects are incompletely understood. We showed that exposure of isolated human, rat and mouse islets of Langerhans to LPS dose-dependently reduced insulin gene expression. This was associated in mouse and rat islets with decreased mRNA expression of two key transcription factors of the insulin gene, PDX-1 (pancreatic duodenal homeobox 1) and MafA (mammalian homologue of avian MafA/L-Maf). LPS repression of insulin, PDX-1 and MafA expression was not observed in islets from TLR4-deficient mice and was completely prevented in rat islets by inhibition of the NF-kB signalling pathway. These results demonstrate that LPS inhibits β-cell gene expression in a TLR4-dependent manner and via NF-kB signaling in pancreatic islets, suggesting a novel mechanism by which the gut microbiota might affect pancreatic β-cell function. Our findings provide a better understanding of the molecular mechanisms underlying insulin gene repression in type 2 diabetes, and suggest potential therapeutic targets that might prevent or delay the decline of β-cell function in the course of type 2 diabetes, which affects more than two million Canadians.

Le développement et l'homéostasie des os requièrent l'orchestration spatio-temporelle d'un grand nombre de signaux moléculaires. Ces signaux entraînent l'activation ou l'inhibition de différents facteurs de transcription, lesquels sont en mesure de contrôler la prolifération et la différenciation des ostéoblastes et des chondrocytes. L'intégrité de ces différents mécanismes se doit d'être maintenu tout au long de la vie. Ainsi, une anomalie dans l'un de ces mécanismes conduit à l'apparition de pathologies osseuses et métaboliques telles qu’une hypophosphatémie, l'ostéoporose ou l'ostéoarthrite (OA). Afin d'en apprendre davantage sur la biologie osseuse, le projet décrit dans cette thèse a pour objectif de caractériser de nouveaux mécanismes de régulation transcriptionnelle pour deux gènes importants dans le développement des os et le maintien de leur intégrité. Il s’agit du Paired-like Homeodomain Transcription Factor 1 (PITX1) et du Phosphate-regulating gene with homology to endopeptidase on the X chromosome (PHEX). Le premier mécanisme présenté dans cette thèse concerne la régulation transcriptionnelle du gène PITX1, un facteur de transcription à homéodomaine nécessaire, notamment, au développement des os des membres inférieurs et au maintien de l'intégrité du cartilage articulaire chez l'adulte. Ainsi, dans les chondrocytes articulaires, on note que l'expression de PITX1 est assurée par le recrutement du facteur de transcription E2F1 à deux éléments de réponse présents dans la région proximale du promoteur de PITX1. Aussi, dans les chondrocytes articulaires de patients souffrant d'OA, dans lesquels l'expression de PITX1 est fortement diminuée, un mécanisme de répression transcriptionnelle, lequel implique la protéine multifonctionnelle Prohibitin (PHB1), semble être activé. En effet, dans ces chondroytes, on note une forte accumulation nucléaire de PHB1 comparativement aux chondrocytes articulaires de sujets sains. Le second mécanisme présenté dans cette thèse concerne la répression transcriptionnelle de PHEX, la peptidase mutée dans le syndrome d'hypophosphatémie lié au chromosome X (X-Linked Hypophosphatemia, XLH), lequel se caractérise par une hypophosphatémie et une ostéomalacie. Le traitement d'ostéoblastes à la Parathyroid hormone-related protein (PTHrP) permet d’observer la répression de PHEX. Afin de caractériser le mécanisme responsable de cette répression, des expériences de gènes rapporteurs ont révélé la présence de deux éléments de réponse pour le répresseur transcriptionnel E4BP4 dans le promoteur de PHEX. La suppression de l'expression d'E4BP4 par l'utilisation d'ARN d'interférence a permis de valider que ce facteur de transcription est responsable de la répression de PHEX suite au traitement d'ostéoblastes à la PTHrP. En somme ces nouveaux mécanismes de régulation transcriptionnelle permettent de mieux comprendre la régulation de l'expression de PITX1 et de PHEX. Aussi, cette nouvelle implication de PHB1 dans la pathogenèse de l'OA offre de nouvelles possibilités de traitement et pourrait servir pour le diagnostic précoce de cette pathologie. Enfin, la caractérisation d'E4BP4 en tant que médiateur pour la répression de PHEX par la PTHrP suggère que ce répresseur transcriptionnel pourrait être impliqué dans le contrôle de la minéralisation des os et des niveaux de phosphate sanguin., Bone development and homeostasis need a large amount of molecular signals to be finely regulated in time and space. These signals lead to the activation or to the inhibition of different transcription factors, which are implicated in the control of osteoblast and chondrocyte proliferation and differentiation. The integrity of these mechanisms is required in order to have a healthy life. Indeed, if one of these mechanisms is dysfunctional, different diseases could develop such as hypophosphatemia, osteoporosis and osteoarthritis (OA). In order to contribute to the comprehension of bone biology, the present thesis describes new mechanisms for the transcriptional regulation of two genes implicated in bone development and regulation: PITX1 (Paired-like Homeodomain Transcription Factor 1) and PHEX (Phosphate-regulating gene with homology to endopeptidase on the X chromosome). The first mechanism described in this thesis relates to the transcriptional regulation of PITX1, a gene that encodes for a member of the homeobox family of transcription factors. PITX1 is required in bone development of inferior members and in the maintenance of the articular cartilage integrity in adults. Thereby, we showed that in articular chondrocytes, the expression of PITX1 is activated after the transcription factor E2F1 was recruited at two response elements in the proximal region of its promoter. Moreover, in articular chondrocytes from OA patients, we observed that the expression of PITX1 is strongly decreased. We proposed that the mechanism responsible for this repression requires the multitask protein Prohibitin (PHB1), which is strongly accumulated in OA chondrocyte nuclei, but not in chondrocyte nuclei from healthy individuals. The second mechanism described in this thesis reports a transcriptional mechanism by which PHEX, the gene that encodes for the peptidase mutated in the syndrome X-Linked Hypophosphatemia (XLH)and characterized by hypophosphatemia and osteomalecia, is repressed. We showed that the treatment of osteoblasts with the Parathyroid hormone-related protein (PTHrP) induced a decrease in PHEX expression. In order to characterize the mechanism responsible for this repression, we performed gene reporter experiments and identified two response elements for the transcription factor E4BP4 in the PHEX promoter. The downregulation of E4BP4 by siRNA led to the validation that this repressor decreased the expression of PHEX in osteoblasts after their treatment with PTHrP. In conclusion, the new transcriptional mechanisms presented in this thesis allow a better understanding of PITX1 and PHEX expression. Moreover, the potential role of PHB1 in the establishment of OA presents many interesting possibilities regarding the treatment and diagnosis of this disease. Finally, the characterization of E4BP4 as a mediator of PHEX repression by the PTHrP suggests that E4BP4 could be implicated in the control of bone mineralization and phosphate levels in the blood.

Early development of female mammals is accompanied by transcriptional inactivation of one of their two X chromosomes. This event is initiated following mono-allelic expression of the Xist non-coding RNA – what is achieved by the interplay of numerous cis-regulatory elements present within the X inactivation center (Xic), such as its repressive antisense Tsix. Our work aimed at throwing light on the structural landscape that underlies such long-range regulation. Characterization of the three-dimensional architecture of the Xic, by the means of Chromosome Conformation Capture (3C)-based techniques and in situ fluorescence hybridization (FISH), revealed that the respective promoters of Xist and Tsix contact many distal genomic elements within the Xic, and that at least one of such interacting region exerts long-range cis-transcriptional control. Noticeably, Xist and Tsix promoters associate with different sets of elements in their respective 5’ direction that are spread out over several hundreds of kilobases These experiments also revealed unforeseen properties of chromatin architecture. Indeed, the Xic appears to be partitioned in several sub-regions, each spanning between 200kb and 1Mb, inside which chromosomal interactions are preferentially established. The existence of these interaction domains integrates with other structural features of the genome, such as underlying chromatin composition and association with the nuclear lamina, but does not seem to directly depend on them. By analyzing chromosome conformation of the Xic during cell differentiation we document the robustness of this organizational principle, with the noticeable exception of the inactive X chromosome that assumes a folding pattern that is more random than its active homolog. Finally we also bring evidence that variability in the folding pattern of the two X chromosomes in the same cell brings each Tsix allele in association with different sets of chromosomal partners at a given moment, suggesting that the instantaneous structural environment of each allele at the onset of mono-allelic Xist up-regulation is different.By combining approaches at the scale of cell populations on the one hand, and at the single chromatin fiber level on the other, this study provides a first vision of the structural landscape in which Xist regulation takes place, and brings new insights concerning fundamental properties of chromosome organization in mammals., Le développement embryonnaire précoce des mammifères femelles s’accompagne de l’inactivation transcriptionnelle d’un de leurs deux chromosomes X. Cet évènement est initié suite à l’expression mono-allélique de l’ARN non codant Xist, qui est contrôlée par de nombreux éléments cis-régulateurs présents dans le centre d’inactivation du chromosome X (Xic) – tel son anti-sens répresseur Tsix. Mon travail de thèse a consisté à développer des approches permettant d’appréhender le paysage structural dans lequel s’exerce cette régulation. La caractérisation de l’architecture tridimensionnelle du Xic, par des techniques basées sur la capture de conformation chromosomique (3C) et l’hybridation in situ en fluorescence (FISH), m’a permis de mettre en évidence que les promoteurs respectifs de Xist et Tsix sont engagés dans des interactions physiques intimes avec des loci distaux, localisés au sein du Xic, et de montrer qu’au moins certaines de ces régions exercent un effets régulateurs à longue-distance. Les éléments du Xic contactés par les régions promotrices de Xist et de Tsix sont en outre fondamentalement différents, chacune engageant des associations chromosomiques sur plusieurs centaines de kilobases dans leur direction 5’ respective.Ce travail a également permis de révéler des propriétés insoupçonnées de l’architecture chromosomiques. En effet, le Xic apparaît scindé en plusieurs sous-régions, couvrant chacune entre 200kb et 1Mb, à l’intérieur desquelles les interactions chromosomiques sont préférentiellement établies. L’existence de ces domaines d’interaction s’intègre avec d’autres propriétés structurales du génome, tels la composition de la chromatine sous-jacente et l’association à la lamine nucléaire, mais n’apparaît pas en dépendre directement. En étudiant la dynamique de la conformation chromosomique du Xic au cours de la différenciation cellulaire, j’ai pu constater la robustesse de cette organisation, sauf sur le chromosome X inactif, qui se distingue par la perte des contacts chromosomiques préférentiels détectables sur son homologue actif.Enfin, j’ai pu mettre en évidence que la variabilité du repliement général du chromosome X amène à un instant donné chaque allèle de Tsix à contacter physiquement des jeux de séquences distales différents, suggérant que l’environnement structural instantané de chacun de ces allèles à l’orée de l’activation mono-allélique de Xist est différent. Ce travail, combinant des approches à l’échelle de la population cellulaire d’une part et de la fibre de chromatine unique d’autre part, apporte une nouvelle vision du paysage structural et régulateur dans lequel s’inscrit le contrôle de l’activité transcriptionnelle de Xist, et fourni de nouvelles perspectives concernant les principes fondamentaux de l’organisation topologique des chromosomes chez les mammifères.

X-chromosome inactivation is evolution's answer to compensate for the gonosomal discrepancy between male (XY) and female (XX). This phenomenon therefore serves to put both sexes on an equal footing by limiting the amount of transcripts produced from the X chromosomes in female cells. During my Ph.D., I tried to contribute to the study of transcriptional regulatory mechanisms, including activation of the two main players in inactivation: Xist (for X-inactive Specific transcript) and Tsix, its antisense transcript. Both genes produce non-coding transcripts essential for correct initiation of this epigenetic phenomenon. Xist RNA coats one of the two X chromosomes in female cells to induce inactivation, and does so in a manner very related to the early embryo development. During these four years, I began to map the binding of several proteins along the Xist/Tsix locus in order to obtain a better understanding of the mechanisms leading to Xist overexpression following the disappearance of its repressors during differentiation. This mapping has been performed in several wild-type or mutant mouse embryonic stem cell strains (which are capable of summarizing XCI ex vivo). I was able to establish a model for transcriptional regulation of the non-coding Xist RNA, involving several proteins known for their role in transcriptional regulation (CTCF and YY1) as well as in the formation of three-dimensional structures (cohesin). The relevance of this model is reinforced by our studies showing that many aspects of this model are conserved throughout evolution (including humans). I have also contributed to the discovery of new Tsix activators, some pluripotency factors binding to the DxPas34 minisatellite to regulate the antisense's transcription elongation. These results thus provide important information about the mechanisms regulating Xchromosome inactivation during early development of the embryo., L'inactivation du chromosome X est la réponse trouvée par l'évolution pour pallier à la divergence gonosomique entre mâle (XY) et femelle (XX). Ce phénomène sert donc à mettre les deux sexes sur un pied d'égalité en limitant la quantité de transcrits provenant des chromosomes X présents dans les cellules femelles. Au cours de mon doctorat, j'ai tenté de contribuer à l'étude des mécanismes de régulation transcriptionnelle, notamment l'activation, des deux acteurs principaux de l'inactivation: Xist et Tsix, son transcrit antisens. Pendant ces 4 anne��es, j'ai entrepris de cartographier le profil de fixation de plusieurs protéines le long du locus Xist/Tsix, dans le but de comprendre les mécanismes permettant une surexpression de Xist lors de la disparition de ses facteurs répressifs en cours de différenciation. J'ai donc pu établir un modèle de régulation transcriptionnelle de l'ARN non-codant Xist, impliquant plusieurs protéines connues pour leur rôle dans la régulation transcriptionnelle (CTCF et YY1) aussi bien que dans la formation de structures tridimensionnelles (la cohésine). La pertinence de ce modèle est renforcée par nos études montrant que de nombreux aspects de ce modèle sont conservés à travers l'évolution (notamment chez l'homme). J'ai également pu contribuer à la découverte de nouveaux activateurs de Tsix, certains facteurs de pluripotence se fixant au minisatellite DxPas34 afin de réguler l'élongation de la transcription de l'antisens. Ces résultats apportent donc d'importantes informations concernant les mécanismes régulant la mise en place du phénomène d'inactivation du chromosome X au cours du développement précoce de l'embryon.

Expression of the genes encoding the Type Three Secretion System T3SS, major virulence factor of Pseudomonas aeruginosa, is under the positive transcriptional control of ExsA. This activator is a member of the AraC/XylS family of transcriptional regulators characterized by a DNA binding domain containing two helix–turn–helix motifs. The activity of these proteins is generally modulated by a ligand which binds to an additional non-conserved domain. AraC/XylS family members involved in SST3 control can be regulated by protein ligands. The ExsA activity is inhibited by the anti-activator ExsD. The study of the functional domains of ExsA through in vitro and in vivo approaches showed that the C- terminal of ExsA is the DNA-binding domain and that two monomers bind to the promoter of the exsCEBA regulatory gene operon (pC). However, this domain possesses a lower affinity for pC and a lower transcriptional activity than the entire protein. Indeed, the efficient binding of ExsA to pC requires its dimerization through its N-terminal domain. The last -helix of this domain seems to play a crucial role in this dimerization. The second goal of my work was to understand the interaction between ExsA and ExsD and to define the molecular mechanism of inhibition used by the anti-activator. By co-producing the two proteins, we succeeded to purify and characterize the ExsA-ExsD complex. ExsA and ExsD form a heterodimeric complex within which ExsD prevents ExsA from binding to its target sequences., L'expression des gènes codant pour le Système de Sécrétion de Type III (SST3), facteur de virulence majeur de Pseudomonas aeruginosa, est activée par ExsA. Ce facteur de transcription appartient à la famille des régulateurs de type AraC/XylS caractérisés par un domaine de fixation à l'ADN comportant deux motifs hélice-tour-hélice. L'activité de ces protéines est généralement régulée par la fixation d'un ligand sur un domaine supplémentaire non conservé. Ce ligand peut être de nature protéique dans le cas de certains régulateurs contrôlant la synthèse de SST3. Ainsi, l'activité transcriptionnelle de ExsA est inhibée par l'anti-activateur ExsD. L'étude de la fonctionnalité de ExsA et de ses domaines par des approches in vitro et in vivo a révélé que le domaine C-terminal de ExsA est bien le domaine de fixation à l'ADN et que deux monomères se fixent sur le promoteur de l'opéron des gènes de régulation du SST3 (pC). Ce domaine isolé possède une affinité pour pC et une activité transcriptionelle inférieure à celle de ExsA. En effet, la fixation efficace de ExsA sur le promoteur pC requiert sa dimérisation à travers son domaine N-terminal. La dernière hélice  de ce domaine N-ter semble jouer un rôle majeur dans la dimérisation de ExsA. Le deuxième objectif de ma thèse était de comprendre l'interaction entre ExsA et ExsD et d'identifier le mécanisme grâce auquel l'inhibiteur empêche ExsA d'activer la transcription des gènes du SST3. Après co-production des deux protéines, le complexe ExsA/ExsD a été purifié puis caractérisé. ExsA et ExsD forment un complexe hétérodimérique au sein duquel l'inhibiteur empêche le facteur de transcription de se fixer à l'ADN.

Skin is the first body barrier exposed to various environmental hazardous including solar UV irradiations wich can alter DNA structure. To protect and maintain the integrity of the genome, cells are equipped with the UV-inducible skin pigmentation pathway and specific defense machinery including Nucleotide Excision Repair (NER). NER is one of the most complexe and versatile DNA repair system, highly conserved during evolution, wich requires several actors whose mutations lead to extrem cutaneous photosensibility. In parallel of the UV-inducible and USF-1 (Upstream Stimulating Factor 1) dependante transcriptional regulation of actors of the pigmentation pathway, we have investigated transcriptional induction of genes encoding NER actors. Using an approach of combined in-vivo (RT-QPCR and ChIP) and in-vitro (EMSA, luciferase assay) experiments, we show that USF-1 is directly implicated in transcriptional induction of UV induced DNA damages recognition step of NER. This model is confirmed by using USF-1 KO mice. Data obtained during my PhD complete the listing of USF-1 target genes and expand implicated pathways. These results suggest a potential role of this transcription factor in skin cancer processes.; La peau est la première barrière de protection de l'organisme face aux agressions de l'environnement incluant notamment les radiations UV solaires, responsables de nombreux dommages sur l'ADN. Afin de prévenir l'apparition de lésions et de maintenir l'intégrité du génome, la cellule a mis en place des systèmes de protection avec la réponse pigmentaire, et de réparation avec le mécanisme du NER (nucleotide excision repair). Le NER est un mécanisme complexe et versatile, conservé au cours de l'évolution, qui repose sur l'action coordonnée d'acteurs protéiques dont les mutations conduisent à l'apparition de syndromes d'hyper-sensibilité aux UV. Ainsi, parallèlement à la régulation transcriptionnelle UV induite dépendante du facteur USF-1 (Upstream Stimulating Factor 1) des gènes clés de la pigmentation, nous avons étudié l'induction transcriptionnelle potentielle de gènes codant pour les acteurs du NER. Par une approche combinant expériences in-vivo (RT-QPCR et ChIP) et in-vitro (EMSA, luciférase essais), nous impliquons le facteur USF-1 dans l'induction transcriptionnelle de gènes codant deux acteurs des étapes de reconnaissance des lésions UV-induites par le NER. L'utilisation de souris invalidées pour le gène USF-1 confirme le modèle observé. L'ensemble de ces données obtenues au cours de ma thèse vient compléter la liste des gènes cibles du facteur de transcription USF-1 et élargit son réseau d'implication en réponse aux UV. Ces résultats suggèrent un rôle potentiel du facteur USF-1 dans le processus tumoral des cancers cutanés UV-induits.

Skin is the first body barrier exposed to various environmental hazardous including solar UV irradiations wich can alter DNA structure. To protect and maintain the integrity of the genome, cells are equipped with the UV-inducible skin pigmentation pathway and specific defense machinery including Nucleotide Excision Repair (NER). NER is one of the most complexe and versatile DNA repair system, highly conserved during evolution, wich requires several actors whose mutations lead to extrem cutaneous photosensibility. In parallel of the UV-inducible and USF-1 (Upstream Stimulating Factor 1) dependante transcriptional regulation of actors of the pigmentation pathway, we have investigated transcriptional induction of genes encoding NER actors. Using an approach of combined in-vivo (RT-QPCR and ChIP) and in-vitro (EMSA, luciferase assay) experiments, we show that USF-1 is directly implicated in transcriptional induction of UV induced DNA damages recognition step of NER. This model is confirmed by using USF-1 KO mice. Data obtained during my PhD complete the listing of USF-1 target genes and expand implicated pathways. These results suggest a potential role of this transcription factor in skin cancer processes., La peau est la première barrière de protection de l'organisme face aux agressions de l'environnement incluant notamment les radiations UV solaires, responsables de nombreux dommages sur l'ADN. Afin de prévenir l'apparition de lésions et de maintenir l'intégrité du génome, la cellule a mis en place des systèmes de protection avec la réponse pigmentaire, et de réparation avec le mécanisme du NER (nucleotide excision repair). Le NER est un mécanisme complexe et versatile, conservé au cours de l'évolution, qui repose sur l'action coordonnée d'acteurs protéiques dont les mutations conduisent à l'apparition de syndromes d'hyper-sensibilité aux UV. Ainsi, parallèlement à la régulation transcriptionnelle UV induite dépendante du facteur USF-1 (Upstream Stimulating Factor 1) des gènes clés de la pigmentation, nous avons étudié l'induction transcriptionnelle potentielle de gènes codant pour les acteurs du NER. Par une approche combinant expériences in-vivo (RT-QPCR et ChIP) et in-vitro (EMSA, luciférase essais), nous impliquons le facteur USF-1 dans l'induction transcriptionnelle de gènes codant deux acteurs des étapes de reconnaissance des lésions UV-induites par le NER. L'utilisation de souris invalidées pour le gène USF-1 confirme le modèle observé. L'ensemble de ces données obtenues au cours de ma thèse vient compléter la liste des gènes cibles du facteur de transcription USF-1 et élargit son réseau d'implication en réponse aux UV. Ces résultats suggèrent un rôle potentiel du facteur USF-1 dans le processus tumoral des cancers cutanés UV-induits.

Nitrate taken up by root cells from the soil solution is a major nitrogen source for nutrition of most plant species. It is known for long that root nitrate uptake is feedback regulated by the nutrient status of the whole plant, but the mechanisms responsible for this control are unknown at the molecular level. To unravel these mechanisms, two strategies were developed in Arabidopsis thaliana, using the NRT2.1 nitrate transporter gene as a model. Previous studies have shown that NRT2.1 transcription is repressed by high N supply to the plant. Therefore, (1) we searched for cis-regulatory elements in NRT2.1 promoter (pNRT2.1), and (2) we performed a genetic screen to isolate mutants impaired in the down-regulation of pNRT2.1 activity by high N supply. Although a 150 pb region of pNRT2.1 was confirmed to mediate promoter regulations, neither linkerscan analysis nor in vivo footprinting approaches allowed to clearly identify cis regulatory elements. Three hni mutants (high nitrogen insensitive) displaying a misregulation of pNRT2.1 activity were characterized as Nsignaling mutants, specifically altered in the feedback regulation of root nitrate uptake by the plant N status. Map based cloning allowed to identify the mutated gene in one (hni9) mutant. The HNI9 gene encodes a putative transcription elongation factor that was uncharacterized in A. thaliana. We showed that HNI9 is a nuclear protein which controls the N regulation of more than 400 genes. Concerning specifically NRT2.1, our results support the hypothesis that HNI9 down-regulates pNRT2.1 activity in response to high N supply by increasing the level of repressive histone methylation marks (H3K27me3) on the 150 bp cis-acting region of pNRT2.1. These data point out, for the first time in plants, the possible involvement of histone methylation as a mechanism for modulating gene expression in response to nutrient signaling pathways.; Le nitrate prélevé par les racines à partir de la solution du sol constitue une source majeure d'azote pour la nutrition des végétaux. Il est bien établi que l'absorption racinaire de nitrate est sujette à un rétro-contrôle exercé par le statut nutritionnel de la plante, mais les mécanismes moléculaires impliqués dans cette régulation sont inconnus. Pour identifier ces mécanismes, deux stratégies ont été développées chez Arabidopsis thaliana, en utilisant le gène NRT2.1 comme modèle. NRT2.1 code un transporteur racinaire de nitrate, et sa transcription est réprimée par les fortes doses de N. Nous avons donc (1) recherché des éléments cis-régulateurs dans le promoteur de NRT2.1, et (2) conduit un crible génétique destiné à isoler des mutants présentant un défaut de répression de pNRT2.1 en réponse à une forte dose de N. Bien qu'une zone de 150 pb de pNRT2.1 a été confirmée comme cible majeure des mécanismes de régulation, ni l'analyse par linker-scan, ni une approche de footprinting in vivo, n'ont permis d'identifier des motifs cis-régulateurs. Trois mutants hni (high nitrogen insensitive) chez qui l'activité de pNRT2.1 est dé-régulée ont été effectivement caractérisés comme mutants de régulation de l'absorption racinaire de nitrate. Le clonage positionnel du gène affecté chez un de ces mutants (hni9), a permis d'identifier un facteur putatif d'élongation de la transcription (HNI9), non encore étudié chez A. thaliana. Nous avons montré que HNI9 est bien une protéine nucléaire, et qu'elle contrôle la régulation par N de l'expression de plus de 400 gènes. En ce qui concerne le mécanisme de régulation de NRT2.1, nos résultats indiquent que HNI9 réprime son expression en situation d'alimentation N abondante en augmentant le niveau d'accumulation des marques répressives (H3K27me3) des histones sur pNRT2.1. Ces résultats suggèrent pour la première fois chez les plantes, un rôle potentiel des modifications des histones dans les mécanismes de signalisation nutritionnelle gouvernant l'expression des gènes.

The mitosis entry is associated with increase of Aurora A kinase expression. In this study, we characterise the effects of sn38, the active metabolite of irinotecan, the main drugs used in the treatment of colorectal cancer. Without treatment, the transcription factor c-myc actives the Aurora A promoter. However, the treatment of cells with sn38 induces inhibition of c-myc and prevents his association with Aurora A promoter. This treatment is also associated with induction of senescence. On the other hand, we study Ras oncogene effects on Aurora A. We observe a decrease of Aurora A expression through modulation of c-myc transcriptional cofactors activity. Our results show that Aurora A is a target of chemotherapeutics treatment and oncogenic pathways. Blocking Aurora A expression is certainly a protection against tumor development., L'entrée des cellules en mitose se caractérise par l'augmentation d'expression de la kinase Aurora A. Nous avons caractérisé l'effet du sn38, métabolite actif de l'irinotecan utilisé dans le traitement du cancer colorectal sur l'expression de cette kinase. En absence de traitement, le facteur de transcription c-myc se lie au promoteur d'Aurora A et l'active. Cependant, le traitement des cellules avec du sn38 induit l'inhibition de c-myc et son absence du promoteur d'Aurora A s'accompagnant de l'induction du processus de sénescence. Nous avons également étudié l'effet de l'oncogène Ras sur la kinase Aurora A. Cet oncogène induit une diminution d'expression d'Aurora A par une modulation de l'activité des cofacteurs transcriptionnels de c-myc. En résumé, nos résultats indiquent qu' Aurora A est une cible des traitements de chimiothérapie et des mécanismes de contrôles oncogéniques. Le blocage de son expression constitue certainement une protection contre le développement tumoral.

Microsporidia are obligate intracellular parasites characterized by a unique invasive mechanism, and, in some species, by a highly compact nuclear genome. To improve our knowledge of gene expression in these opportunistic pathogens, experiments on transcriptional regulation mechanisms were undertaken. In the microsporidia Encephalitozoon cuniculi (a mammalian parasite with a genome size of 2.9 Mb), we demonstrated a polycistronic gene organization. At the time of transcription, the transcripts are randomly processed leading to an mRNA population composed of monocistronic and polycistronic mRNA. To study the structure of microsporidian genomes and their adaptation capacities, the sequencing of Brachiola algerae genome (an insect and mammalian microsporidia) has been initiated in collaboration with Genoscope. Thirty chromosome bands from 160 to 2240 kb were identified, giving a haploid genome size estimated of 23 Mb. The study of the chromosomal distribution of the 16S rRNA unit showed the presence of 16S copy on at least 9 chromosome bands. The first analysis of this AT rich genome (more than 75%) revealed the presence of different kinds of transposable elements as well as genes encoding for enzymes involved in the RNA interference process. We further demonstrated that two Anopheles gambiae cellular lineages Sua4.0 (haemocytic cell) and Mos 55 (embryonic cells) can be infected by B. algerae providing a model to study in vitro the interaction between An. gambiae and its pathogens. The successful use of the RNA interference in these two types of cells will contribute to a better understanding of the adaptation mechanisms of pathogens like P. falciparum and B. algerae., Les microsporidies sont des parasites intracellulaires obligatoires caractérisés par un mode d'infestation original, et pour certaines espèces, par un très fort degré de compaction du génome nucléaire. Des travaux portant sur les mécanismes de régulation transcriptionnelle chez Encephalitozoon cuniculi montrent qu'une organisation polycistronique des gènes est présente. Une maturation aléatoire des messagers conduit à la formation d'une population d'ARNm comprenant des ARNm monocistroniques et polycistroniques. Afin d'améliorer nos connaissances sur la structure des génomes microsporidiens et leur capacité d'adaptation, le sequençage du génome de Brachiola algerae a été initié : 30 bandes d'ADN chromosomiques ont pu être visualisées (taille du génome estimée à 23Mb). Les premières données de séquence ont révélées la présence de plusieurs classes d'éléments transposables ainsi que des gènes codant des enzymes impliquées dans le processus d'ARN interférence

The work presented in this thesis is oriented towards computational genome analysis. More precisely it focuses on gene expression and cis-regulatory elements. The cis-regulatory elements identification problem can be considered as a computational motif finding problem.Finding such motifs is a challenging question due to the low specificity of these motifs. To answer this question, new kind of information need to been taken into account. This can be cross species conservation (comparative genomics), over-represented signals such as those shared by co-regulated genes, or even spatial conservation of binding site locations.We have developed a method that searches for locally overrepresented regulatory motifs in a set of regulated genes. This method takes advantage of spatial conservation in the sequence and supports multiple species.The method has been implemented in a software named TFM-Explorer. Promising results were obtained in a variety of examples in human, mouse, and rat genomes., Les travaux présentés dans cette thèse s'inscrivent dans le cadre bio-informatique de l'analyse des génomes. Plus particulièrement, ces travaux concernent l'expression des gènes et les éléments régulateurs, présents dans l'ADN, qui participent à la modulation de cette expression.Le problème de la recherche de ces éléments régulateurs peut être envisagé sous l'angle informatique de la recherche de motifs approchés particuliers.La recherche de motifs régulateurs est une question difficile du fait de la faible spécificité des motifs recherchés. Pour pouvoir y répondre, il faut prendre en compte différentes formes d'information. En particulier, il est pertinent de prendre en compte la conservation entre espèces (génomique comparative), la conservation entre séquences génomiques partageant des éléments de régulation (gènes co-régulés) ou encore, dans certains cas, la conservation spatiale des sites de fixation.Dans ce cadre, nous proposons une méthode permettant de tirer parti, à la fois de la conservation spatiale, et de la conservation entre espèces. Cette approche se compose d'un algorithme de recherche locale et d'évaluateurs statistiques adaptés au problème de la recherche de motifs sur-représentés localement lorsque l'environnement de recherche est hétérogène, c'est-à-dire pour des séquences pouvant provenir d'organismes différents ou de régions différentes du génome. Ces travaux ont été mis en oeuvre dans un logiciel appelé TFM-Explorer, que nous avons évalué avec succès sur des données issues du génome humain, de la souris et du rat.

Iron is an essential nutrient, but its accumulation can be highly cytotoxic. Iron homeostasis must be tightly regulated in order to satisfy cell demand without damage. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, this regulation is mediated by two paralogous transcription factors: Aft1p and Aft2p. Under iron starvation conditions, Aft1p activates the transcription of high affinity iron transport related genes by specific binding to the DNA consensus sequence 5'-TGCACCC-3' found in the promoters of these genes. The role of Aft2p remains poorly understood. Aft2p is capable of binding in vitro to the Aft1p DNA consensus sequence and it activates the transcription of some of the Aft1p target gene under specific conditions, such as overexpression, or expression of a gain-of-function allele. We aimed at further understanding the role of Aft2p in a physiological context, by identification of its target genes and characterisation of its mode of action. For this purpose, we performed global transcriptome analyses, Northern blot and chromatin immunoprecipitation experiments using wild type and Δaft1 and/or Δaft2 mutant strains grown under iron depleted conditions. We demonstrated that Aft2p directly activates the transcription of genes that are essential for the iron intracellular sub-compartimentalization and use, while Aft1p does not. We discovered that the consensus sequence in the promoter region of genes specifically activated by At2p was not the 5'-TGCACCC-3' sequence, but the shorter 5'-(G/A)CACCC- 3'. Aft2p plays also a direct role in the transcriptional regulation of some genes involved in zinc metabolism, and it could be involved in the regulation of ergosterol and fatty acid metabolism. We also showed that Aft1p and Aft2p proteins amount is iron-regulated. The modulation of Aft1p protein amount can be attributed to its own transcriptional regulation, while the modulation of Aft2p protein amount involves post-transcriptional regulation., Le fer est à la fois indispensable et toxique pour les cellules. Un contrôle strict de son métabolisme est nécessaire pour pourvoir aux besoins des cellules tout en évitant ses effets délétères. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, ce contrôle est assuré par les activateurs transcriptionnels paralogues Aft1p et Aft2p. En condition de carence en fer, Aft1p active la transcription des gènes du transport à haute affinité du fer extracellulaire en se fixant sur la séquence cis-régulatrice 5'-TGCACCC-3'. Le rôle d'Aft2p est moins bien caractérisé ; il reconnaît in vitro la même séquence consensus qu'Aft1p et active la transcription de plusieurs gènes régulés par Aft1p lorsqu'il est surexprimé ou sous une forme mutée constitutivement active. Nous avons cherché à mieux comprendre le rôle d'Aft2p en condition de carence en fer en identifiant ses gènes cibles et en caractérisant son mode d'action, par une combinaison d'expériences d'analyses globales de transcriptome, de Northern blot et d'immunoprécipitation de la chromatine réalisées avec les souches sauvage et délétées d'AFT1 et/ou d'AFT2. Nous avons montré qu'Aft2p, mais pas Aft1p, active directement la transcription des gènes de l'utilisation et du stockage du fer intracellulaire. Nous avons mis en évidence que la séquence cis-régulatrice des gènes régulés par Aft2p n'est pas 5'-TGCACCC-3', mais une séquence plus courte, 5'-(G/A)CACCC-3'. Aft2p joue également un rôle direct dans la régulation transcriptionnelle de plusieurs gènes du métabolisme du zinc, et il pourrait intervenir dans la régulation des gènes du métabolisme de l'ergostérol et des acides gras. Par ailleurs, nous avons montré l'existence d'une régulation par le fer de la quantité des protéines Aft1p et Aft2p. La variation de quantité d'Aft1p semble résulter de son autorégulation transcriptionnelle, alors que la variation de quantité d'Aft2p implique une régulation post-transcriptionnelle.