Etude des voies de signalisations impliquées dans la régulation des transporteurs de NO3- aux niveaux transcriptionnel et post-traductionnel chez Arabidopsis thaliana

Nitrate (NO3-) is an essential mineral ion for plant growth and is the main source of nitrogen (N). In A. thaliana, NRT2.1, NRT2.4 and NRT2.5 are the three main transporters of the high affinity transport system (HATS) for the uptake of NO3- by roots. Among them, NRT2.1 is the major player in HATS. NRT2.1 is transcriptionally controlled by all the regulations that affect the transport of NO3- : i) induction by NO3-, ii) repression by products resulting from the assimilation of NO3- and iii) induction by light and sugars. In addition to these transcriptional regulations, recent approaches indicate that NRT2.1 is also subject to post-translational regulations. Concerning the other members of the NRT2s family, NRT2.4 and NRT2.5 have been characterized as transporters with very high affinity for NO3-. Their expression is induced by N deficiency, while light and sugars also induce NRT2.4. Despite the functional importance of these transporters for plant growth, the mechanisms involved in their regulation are still poorly understood, in particular for the regulation by light and sugars as well as post-translational regulations of NRT2.1. In this context, the objectives of my thesis were: i) to characterize the light/sugar signaling pathway involved in the regulation of NRT2.1 and NRT2.4, (ii) to characterize the role of new regulators of N signaling pathways and C identified in my team and (iii) to participate in the study of post-translational regulations of the NRT2.1 protein. One of the major results of my thesis work concerns the regulation of NRT2s by light and sugars. The work previously carried out by the team had made it possible to determine that sugar signaling involves the oxidative pathway of pentose phosphates (OPPP). The results that I obtained allowed: (i) to identify that G6PD, the first enzyme of the OPPP pathway, seems to be at the origin of the sugar signal and (ii) to hypothesize that NADPH produced by this enzyme as well as redox signaling are involved in this regulation. In parallel, I characterized the role of BHLH093 transcription factor, previously identified in the team. I demonstrated its role in the regulation of NRT2.4 by light and sugars and highlighted the existence of another signaling pathway that is probably independent of the OPPP. A second important part of my thesis work concerned the study of the regulation of NRT2.4 and NRT2.5 transporters by N deficiency. This allowed me to demonstrate: (i) that NO3- is the signal involved in the repression of these two transporters in non-N-deficient plants and (ii) that this regulation depends on the signaling pathway linked to NRT1.1/NPF6.3. In addition, I was able to place known regulators of the response to high N into the signaling pathway that regulates NRT2.4 and NRT2.5 in response to repression by NO3-. Finally, I could confirm the essential role of the phosphorylation of the Ser501 residue, located in the C-terminal part, to repress the activity of NRT2.1 under repressive conditions, by studying its post-translational regulation. The hypothesis of a cleavage of the C-terminal part of NRT2.1 also led me to initiate an approach aiming to determine if the peptide released after cleavage and which contains the phosphorylated Ser501 site, could have a role in signaling NO3-.; Le Nitrate (NO3-) est un ion minéral indispensable pour la croissance des plantes et constitue la principale source d’azote (N). Chez A. thaliana, le système de transport à forte affinité (HATS) pour l'absorption de NO3- par les racines dépend principalement de trois transporteurs : NRT2.1, NRT2.4 et NRT2.5. Parmi eux, NRT2.1 constitue l’acteur majoritaire du HATS. NRT2.1 est la cible au niveau transcriptionnel de l’ensemble des régulations qui affectent le transport de NO3- : i) une induction par le NO3-, ii) une répression exercée par les produits issus de l’assimilation de NO3- et iii) une induction par la lumière et les sucres. En plus de ces régulations transcriptionnelles, des approches récentes indiquent que NRT2.1 est également soumis à des régulations post-traductionnelles. Concernant les autres membres de la famille NRT2s, NRT2.4 et NRT2.5 ont été caractérisé comme des transporteurs à très forte affinité pour le NO3- dont l’expression est induite par la carence en N et également par la lumière et les sucres pour NRT2.4. Malgré l’importance fonctionnelle de ces transporteurs pour la croissance des plantes, les mécanismes impliqués dans leur régulation restent encore mal connus, en particulier en ce qui concerne la régulation par la lumière et les sucres et les régulations post-traductionnelles de la protéine NRT2.1. Dans ce contexte les objectifs de ma thèse étaient : i) de caractériser la voie de signalisation lumière/sucre impliquée dans la régulation de NRT2.1 et NRT2.4, (ii) de caractériser le rôle de nouveaux régulateurs des voies de signalisation N et C identifiés dans mon équipe et (iii) de participer à l’étude des régulations post-traductionnelles de la protéine NRT2.1. Un des résultats majeurs de mon travail de thèse concerne la régulation des NRT2s par la lumière et les sucres. Les travaux réalisés dans l’équipe avait permis de déterminer que la signalisation sucre implique la voie oxydative des pentoses phosphates (OPPP). Les résultats que j’ai obtenus ont permis : (i) d’identifier que la première enzyme de la voie OPPP, la G6PD, semble être à l’origine du signal sucre et (ii) de faire l’hypothèse que le NADPH produit par cette enzyme ainsi que la signalisation redox sont impliqués dans cette régulation. En parallèle, la caractérisation du rôle de BHLH093, préalablement identifié dans l’équipe, a permis de démontrer le rôle de ce facteur de transcription dans la régulation de NRT2.4 par la lumière et les sucres et a mis en évidence l’existence d’une autre voie de signalisation sans doute indépendante de l’OPPP. Un deuxième volet important de mon travail de thèse a concerné l’étude de la régulation des transporteurs NRT2.4 et NRT2.5 par la carence en N. Ceci m’a permis de démontrer : (i) que le NO3- est le signal impliqué dans la répression de ces deux transporteurs chez des plantes non carencées en N et (ii) que cette régulation dépend de la voie de signalisation liée à NRT1.1/NPF6.3. De plus, l’étude de régulateurs connus pour être impliqués dans la réponse au fort N m’a permis de replacer certains de ces facteurs de transcription dans la voie de signalisation qui régule NRT2.4 et NRT2.5 en réponse à la répression par le NO3-. Enfin, l’étude de la régulation post-traductionnelle de la protéine NRT2.1 a permis de confirmer le rôle essentiel de la phosphorylation du résidu Ser501, située dans la partie C-terminale, pour désactiver l’activité de NRT2.1 en conditions répressives. L’hypothèse d’un clivage de la partie C-terminale de NRT2.1 m’a également amené à initier une approche visant à déterminer si le peptide libéré après clivage et qui contient le site Ser501 phosphorylé, pouvait avoir un rôle dans la signalisation NO3-.