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Colloque « Les biotechnologies pour relever le défi du carbone renouvelable » Toulouse 18/04/2013; Synthetic biology aims to design, using the building blocks of life, various systems ranging from molecules to organisms following a logic that can move-away from the one of natural biological systems to create unique features of interest. Metabolic engineering has gained new developments in this context particularly taking advantage of in silico approaches and of new technologies for the large-scale reconstruction of the genome of microorganisms, up to their total synthesis. Through these tools, new strategies for metabolic engineering have been developed, in particular through diversification of biocatalysts and of their functional assemblies by implementing combinatorial approaches to quickly explore a large number of solutions to functional engineering problems.; La biologie de synthèse vise à recomposer, en utilisant les briques du vivant, des systèmes variés de la molécule à l’organisme en suivant une logique qui peut s’éloigner des systèmes biologiques naturels pour créer de nouvelles fonctions d’intérêt. L’ingénierie métabolique a pris un nouvel essor dans ce cadre en mettant à profit les approches in silico et un ensemble de nouvelles technologies permettant une recomposition à grande échelle du génome des micro-organismes allant jusqu’à leur synthèse totale. Au travers de ces outils, de nouvelles stratégies pour l’ingénierie métabolique se sont développées, en particulier au travers de la diversification des biocatalyseurs ou de leurs assemblages mettant en oeuvre des approches combinatoires permettant d’explorer rapidement un grand nombre de solutions aux problèmes d’ingénierie fonctionnelle.

International audience

Workshop

Workshop; International audience

RaIstonia solanacearum est l'agent responsable du flétrissement bactérien chez 55 familles botaniques différentes, dont les solanées. Cette bactériose vasculaire, présente sur tous les continents, peut entraîner la destruction totale de la parcelle en production. Comme pour la plupart des phytobactérioses il n'existe pas de moyen de lutte curatif et les mesures prophylactiques ainsi que l'utilisation d'un matériel sain est à privilégier. Afin de répondre aux impératifs de lutte préventive, il est indispensable de disposer d'un outil de détection spécifique, sensible, utilisable pour la détection de la bactérie in planta et dans les sources potentielles de contamination, l'eau en particulier. Plusieurs outils de détection sont disponibles, mais aucun ne combine spécificité et haute sensibilité, deux pré requis indispensables. Nous avons développé une Nested-PCR à partir d'un fragment d'ADN de 282pb (1) qui amplifie spécifiquement le complexe d'espèce R. solanacearum (2). Pour limiter les risques de contaminations inhérents à une PCR en deux étapes, une Nested-PCR en un seul tube a été mise au point: Single Closed-Tube Nested-PCR (SCTN-PCR). La spécificité de cet outil moléculaire a été validée sur 16 espèces bactériennes, incluant R. pickettii, R. eutropha, Pseudomonas spp. ainsi que X. campestris pv. campestris. Quarante-quatre souches couvrant l'ensemble de la diversité génétique du complexe d'espèce R. solanacearum (dont l'agent du BDB et R. syzygii) sont diagnostiquées par SCTN-PCR. Des plants de Hawaï 7996, variété résistante à R. solanacearum, ont été inoculés par trempage des racines dans une suspension bactérienne à 107 cfu.mr-1 (souche réunionnaise JT519, phylotype I). La détection de R. solanacearum a été mise en oeuvre par différentes méthodes sur des tiges prélevées au cours du temps: détection par PCR simple (amorces Opina) ou par SCTN-PCR, directement sur broyat ou après une extraction d'ADN à l'aide d'un kit d'extraction QUIAamp (Quiagen). Des comptages sont réalisés en parallèle par étalement sur milieu semi-sélectif. La détection la plus sensible est obtenue par SCTN-PCR, avec la détection de 100,1 cfu.mr-1 dès six heures après l'inoculation, soit plus de sept jours avant l'apparition de symptômes. Cette sensibilité remarquable de l'outil a permis de regrouper plusieurs échantillons afin de répondre aux contraintes d'efficacité de la certification. R. solanacearum est détecté dans un mélange réunissant dix extraits d'ADN de tiges dès le deuxième jour après inoculation. D'autre part, un protocole de préparation d'échantillons d'eau (3) a été validé sur 12 différents types d'eaux d'irrigations à la Réunion: rivières, nappes phréatiques, retenues collinaires et bassins. La sensibilité de la SCTN-PCR a été testée sur ces eaux artificiellement contaminées de 100 à 106 cfu.ml-1. Sur les 3 répétitions effectuées pour les faibles concentrations, l'outil présenté détecte au moins un des triplicats à partir de 103 cfu.ml-1. Des populations de 10 cfu.ml-1 sont détectées, mais de façon non reproductible pour des raisons évidentes liées à l'échantillonnage. Au cours d'une première validation sur le terrain, l'outil moléculaire a détecté R. solanacearum dans deux bassins provenant de régions infestées. Des études sont en cours afin de relier seuil de détection et quantité d'inoculum nécessaire pour déclencher une épidémie, ce qui est particulièrement stratégique dans le cas des cultures de type hors-sol. SCTN-PCR est sensible, spécifique et rapide d'emploi. Les applications concernent le contrôle phytosanitaire, la certification ou l'épidémio-surveillance. Par ailleurs SCTN-PCR doit pouvoir être adapté aux besoins de certification du matériel de propagation (vitroplants, semences...) d'autres espèces hôtes de R. solanacearum. (Texte intégral)

The authors report a case of post-traumatic pseudo-aneurysm of the pericallosal artery in an 11 year old child. The lesion was secondary to a perforating wound of the roof of the right orbit, the eye itself being undamaged.

A rapid procedure for extraction and partial purification of ciguatoxin has been achieved and compared to one of the routine methods. Fish from two species which provided extracts of differing purity by the routine method were used. From 8 g of raw flesh, 1.0 +/- 0.2 mg of a semi-purified extract of ciguatoxin of homogeneous quality was obtained within 1 hr, whatever the species or toxicity of the fish. The results were reproducible, making the procedure very promising.

La biologie de synthèse vise à recomposer, en utilisant les briques du vivant, des systèmes variés de la molécule à l’organisme en suivant une logique qui peut s’éloigner des systèmes biologiques naturels pour créer de nouvelles fonctions d’intérêt. L’ingénierie métabolique a pris un nouvel essor dans ce cadre en mettant à profit les approches in silico et un ensemble de nouvelles technologies permettant une recomposition à grande échelle du génome des micro-organismes allant jusqu’à leur synthèse totale. Au travers de ces outils, de nouvelles stratégies pour l’ingénierie métabolique se sont développées, en particulier au travers de la diversification des biocatalyseurs ou de leurs assemblages mettant en oeuvre des approches combinatoires permettant d’explorer rapidement un grand nombre de solutions aux problèmes d’ingénierie fonctionnelle., Synthetic biology aims to design, using the building blocks of life, various systems ranging from molecules to organisms following a logic that can move-away from the one of natural biological systems to create unique features of interest. Metabolic engineering has gained new developments in this context particularly taking advantage of in silico approaches and of new technologies for the large-scale reconstruction of the genome of microorganisms, up to their total synthesis. Through these tools, new strategies for metabolic engineering have been developed, in particular through diversification of biocatalysts and of their functional assemblies by implementing combinatorial approaches to quickly explore a large number of solutions to functional engineering problems.

One of the possibilities considered to reduce the side effects associated to chemotherapeutic treatments was to use cytotoxic prodrugs, like cyclophosphamide (CPA), activated directly into the tumors. CPA is mainly activated with a low efficiency by human CYP2B6, so large doses of prodrug are used to induce a response. The transfection of an optimized CYP gene, possessing a high catalytic efficiency towards CPA while presenting a low immunogenicity, is a route to lower active doses. For this purpose, the canine CYP2B11, which exhibits a low Km for CPA activation, was modelled and divided into 15 structural "modules". A synthetic CYP2B11 gene was designed to permit a good expression in yeast and to swap defined modules between the human and canine forms. An original sequence – independent method, SIGNAL, was developed, which allowed the construction of 15 chimeras with defined junction points. This ordered library, halfway between random directed evolution and defined directed mutagenesis, permitted the generation of targeted diversity, which do not need a high-throughput approach for functional analysis. Resulting information highlighted critical segments for CPA metabolism, which are potentially involved in the high CYP2B11 affinity. The P450 functional optimization could be further enhanced by a random mutagenesis process, which requires, in contrast, a high throughput screening system. Its development in S.cerevisiae was initiated using a reporter gene method., Le souhait de réduire des effets secondaires associés aux anticancéreux a mené à considérer l'utilisation de prodrogues activables au site d'action, comme la cyclophosphamide (CPA). La CPA est activée majoritairement par le CYP2B6 humain avec une faible efficacité, obligeant à l'utilisation de concentrations importantes de prodrogue. Celles-ci peuvent être réduites par transfection au niveau de la tumeur d'un gène codant pour un P450 optimisé, possédant une efficacité catalytique élevée vis-à-vis de la CPA tout en étant le moins immunogène possible. Pour ce faire, en partant de la modélisation du CYP2B6 et du CYP2B11, forme canine à bas Km pour l'activation de la CPA, un gène synthétique du CYP2B11 pour l'expression dans la levure a été dessiné et divisé en 15 "modules" structuraux. Quinze chimères à points de jonction définis entre les deux CYP2Bs ont ensuite été construites par échange de ces modules, via une méthode originale de génération de banques ordonnées de chimères, SIGNAL, indépendante de l'homologie de séquence des enzymes parentaux. SIGNAL, à mi-chemin entre les processus classiques d'évolution dirigée et de mutagenèse dirigée, nous a permis, après analyse fonctionnelle des chimères, de mieux comprendre le mécanisme de métabolisation de la CPA par les deux enzymes et d'identifier des modules structuraux jouant potentiellement un rôle important dans la haute affinité du CYP2B11. En parallèle, la mise au point d'un système de sélection à haut débit des variants les plus efficaces pour l'activation de la CPA dans la levure, basé sur le principe du gène rapporteur, a été débutée, afin de pouvoir raffiner l'optimisation du P450 par un processus de mutagenèse aléatoire.

One of the possibilities considered to reduce the side effects associated to chemotherapeutic treatments was to use cytotoxic prodrugs, like cyclophosphamide (CPA), activated directly into the tumors. CPA is mainly activated with a low efficiency by human CYP2B6, so large doses of prodrug are used to induce a response. The transfection of an optimized CYP gene, possessing a high catalytic efficiency towards CPA while presenting a low immunogenicity, is a route to lower active doses. For this purpose, the canine CYP2B11, which exhibits a low Km for CPA activation, was modelled and divided into 15 structural "modules". A synthetic CYP2B11 gene was designed to permit a good expression in yeast and to swap defined modules between the human and canine forms. An original sequence – independent method, SIGNAL, was developed, which allowed the construction of 15 chimeras with defined junction points. This ordered library, halfway between random directed evolution and defined directed mutagenesis, permitted the generation of targeted diversity, which do not need a high-throughput approach for functional analysis. Resulting information highlighted critical segments for CPA metabolism, which are potentially involved in the high CYP2B11 affinity. The P450 functional optimization could be further enhanced by a random mutagenesis process, which requires, in contrast, a high throughput screening system. Its development in S.cerevisiae was initiated using a reporter gene method.; Le souhait de réduire des effets secondaires associés aux anticancéreux a mené à considérer l'utilisation de prodrogues activables au site d'action, comme la cyclophosphamide (CPA). La CPA est activée majoritairement par le CYP2B6 humain avec une faible efficacité, obligeant à l'utilisation de concentrations importantes de prodrogue. Celles-ci peuvent être réduites par transfection au niveau de la tumeur d'un gène codant pour un P450 optimisé, possédant une efficacité catalytique élevée vis-à-vis de la CPA tout en étant le moins immunogène possible. Pour ce faire, en partant de la modélisation du CYP2B6 et du CYP2B11, forme canine à bas Km pour l'activation de la CPA, un gène synthétique du CYP2B11 pour l'expression dans la levure a été dessiné et divisé en 15 "modules" structuraux. Quinze chimères à points de jonction définis entre les deux CYP2Bs ont ensuite été construites par échange de ces modules, via une méthode originale de génération de banques ordonnées de chimères, SIGNAL, indépendante de l'homologie de séquence des enzymes parentaux. SIGNAL, à mi-chemin entre les processus classiques d'évolution dirigée et de mutagenèse dirigée, nous a permis, après analyse fonctionnelle des chimères, de mieux comprendre le mécanisme de métabolisation de la CPA par les deux enzymes et d'identifier des modules structuraux jouant potentiellement un rôle important dans la haute affinité du CYP2B11. En parallèle, la mise au point d'un système de sélection à haut débit des variants les plus efficaces pour l'activation de la CPA dans la levure, basé sur le principe du gène rapporteur, a été débutée, afin de pouvoir raffiner l'optimisation du P450 par un processus de mutagenèse aléatoire.