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Cardiovascular diseases, which are mostly related to high levels of low density lipoproteins (LDL), are currently one of the major causes of death. Currently, there are various polymer based drugs (hydrogels) capable of lowering the cholesterol levels in the blood, through bile acid complexation. However, all of the commercially available bile acid sequestrants have problems in terms of efficiency. Thus, in order to try to create a more effective drug, hydrogels of 2-hydroxyethyl acrylate (HEA) and ((3- acrylamidopropyl)trimethylammonium chloride) (AMPTMA) were prepared using two different polymerization methods: free radical polymerization (FRP) and supplemental activator and reducing agent atom transfer radical polymerization (SARA ATRP). It was found that the new hydrogels were able to bind the sodium cholate (NaCA) (bile acid model molecule), but showing lower binding capacity than the products of the same category that are already present on the market. The effect of the amount of HEA present on the hydrogels on the binding parameters was also investigated. Generally, the results showed that an increase on the amount of HEA lead to an decrease of the binding capacity of the new BAS. The results also showed that BAS produced using SARA ATRP techniques present a higher binding capacity than the ones produced using FRP techniques. Finally, it was observed that copolymers of PAMPTMA-co-PHEA showed no sign of degradation in solutions that mimic the stomach and intestine environment. Keywords: Hydrogels; Bile acid sequestrants; FRP; SARA ATRP; 2-hydroxyethyl acrylate; ((3- acrylamidopropyl)trimethylammonium chloride) As doenças cardiovasculares, que na sua maioria, estão relacionadas com elevados níveis de lipoproteínas de baixa densidade (colesterol LDL), constituem atualmente uma das principais causas de morte. De momento, já existem vários fármacos baseados em polímeros (hidrogéis) capazes de diminuir os níveis de colesterol no sangue, através da complexação de ácidos biliares. Porém, todos os sequestradores de ácidos biliares(BAS) presentes no mercado apresentam problemas ao nível da eficiência. Assim, de modo a tentar criar um fármaco mais eficaz, recorreu-se à preparação de hidrogéis de acrilato de 2-hidroxietil(HEA) e cloreto de (3-acrilamidopropil)trimetil amónio (AMPTMA), usando dois métodos de polimerização distintos: polimerização radicalar livre (FRP) e polimerização radicalar por transferência de átomo com ativador suplementar e agente de redução (SARA ATRP). Verificou-se que os novos hidrogéis são capazes de se ligar ao sal de sódio do ácido cólico (NaCA) (ácido biliar modelo), mas apresentam uma capacidade de ligação inferior aos produtos da mesma categoria que já se encontram no mercado. Foi ainda investigado o efeito que a quantidade de HEA presente no hidrogel tem nos parâmetros de ligação. De um modo geral, verificou-se que a capacidade de ligação diminui com o aumento da quantidade de HEA nos BAS. Os resultados mostraram ainda que os BAS produzidos usando técnicas de SARA ATRP apresentam uma maior capacidade de ligação que os produzidos por técnicas de FRP. Finalmente, foi observado que o copolímero PAMPTMA-co-PHEA não mostrou sinais de degradação pela solução que simulou o ambiente estomacal e intestinal.

Dissertação de Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. Estima-se que, atualmente, cerca 67 milh˜oes de pessoas em todo o mundo sofram de glaucoma, doen¸ca esta que pode levar `a cegueira quando n˜ao tratada. Os tratamentos dispon´ıveis no mercado possuem efeitos secund´arios adversos e/ou necessitam de destreza manual por parte do paciente para serem administrados corretamente. Nesta perspectiva, e de forma a melhorar a biodisponibilidade do f´armaco no olho atrav´es da administra¸c˜ao de uma dose mais baixa de medicamento, diversos tipos de sistemas de liberta¸c˜ao tˆem vindo a ser desenvolvidos. Devido essencialmente `a sua elevada biocompatibilidade e interesse para aplica¸c˜oes biom´edicas, o poli(´acido l´actico) (PLA) foi o pol´ımero escolhido para o desenvolvimento deste trabalho. Contudo, sendo um material duro e quebradi¸co, a sua utiliza¸c˜ao em diversas aplica¸c˜oes tem sido limitada. Por forma a viabilizar a sua utiliza¸c˜ao na aplica¸c˜ao final, o uso de plastificantes tem-se mostrado como uma promissora alternativa. Assim, o presente trabalho tem como finalidade o estudo do PLA como material pass´ıvel de ser utilizado na entrega de f´armacos anti glaucoma. Para tal, numa primeira etapa, procedeu-se `a s´ıntese e caracteriza¸c˜ao de poli´esteres saturados (SP) para plastifica¸c˜ao do PLA e, utilizando os filmes de PLA desenvolvidos, estudou-se numa segunda fase a capacidade de liberta¸c˜ao controlada de f´armaco anti glaucoma dos mesmos. Diferentes poli´esteres saturados foram sintetizados por policondensa¸c˜ao utilizando, para tal, diferentes glic´ois e ´acidos saturados. Ap´os sintetizados, os diversos SPs foram caracterizados qu´ımica, t´ermica e morfologicamente. Atrav´es das referidas an´alises verificou-se, com sucesso, a obten¸c˜ao de quatro poli´esteres: dois alif´aticos (SP1 e SP3) e dois arom´aticos (SP2 e SP4). De seguida, por solvent casting, procedeu-se `a forma¸c˜ao de filmes de PLA com poli´esteres, utilizando o clorof´ormio como solvente. Para a obten¸c˜ao do filme final, o solvente utilizado na sua prepara¸c˜ao foi evaporado numa estufa a 50 oC. Atrav´es deste m´etodo todos os poli´esteres mostraram ser capazes de formar filmes com o PLA. Contudo, apenas os poli´esteres SP1 e SP3 mostraram ser capazes de formar filmes com o PLA e cujas propriedades mecˆanicas os tornam pass´ıveis de ser estudados para liberta¸c˜ao controlada de f´armaco. Ap´os caracteriza¸c˜ao, os filmes com melhores propriedades - SP1 PLA50 (formula¸c˜ao SP1/PLA na propor¸c˜ao de 50/50), SP3 PLA70 (formula¸c˜ao SP3/PLA na propor¸c˜ao de 30/70) e SP3 PLA50 (formula¸c˜ao SP3/PLA na propor¸c˜ao de 50/50) - foram revestidos com a solu¸c˜ao polim´erica de origem (PLA com SP) ou com um silicone reativo. Posteriormente foram realizados estudos de liberta¸c˜ao de acetazolamida, um f´armaco anti glaucoma. O filme SP3 PLA70, formula¸c˜ao de PLA com poli´ester de ´acido seb´acico e 1,6-hexanodiol, provou ser o mais promissor dos trˆes no que se refere aos perfis de liberta¸c˜ao do f´armaco. No que respeita aos revestimentos estudados, ambos mostraram ser eficazes na diminui¸c˜ao da liberta¸c˜ao do f´armaco. Paralelamente, e numa an´alise comparativa, o mesmo processo de secagem foi realizado `a temperatura ambiente, avaliando assim o impacto da evapora¸c˜ao lenta do clorof´ormio sendo obtidos os mesmos resultados quando em compara¸c˜ao com a evapora¸c˜ao na estufa. Currently, about 67 million people worldwide are affected by glaucoma. Without an appropriate treatment this disease can lead to irreversible blindness. The treatments available in the market present adverse side effects and/or require manual dexterity of the patient to be administered properly. In this regard, and in order to improve the bioavailability of the drug in the eye, a variety of drug delivery systems have been developed. Poly(lactic acid) (PLA) was chosen for the development of this work due to its high biocompatibility and interest for biomedical applications. However, this polymer is a brittle and stiff material, which restricts its use in a variety of applications, namely ocular drug delivery systems. The use of plasticizers aims to improve the mechanical properties in order to meet the specifications of the final application. Thus, the present work aims to study the PLA as a material that can be used in the delivery of anti glaucoma drugs. To this end, in a first stage, different saturated polyesters (SP) were synthesized and characterized in order to plasticize PLA. In a second stage, the developed SP/PLA films were studied by their ability for controlled release of acetazolamide, an anti-glaucoma drug. Different saturated polyesters were synthesized by polycondensation using different saturated glycols and acids. Once synthesized, the different SPs have been characterized chemically, thermally and morphologically. Through these analyzes, it was verified that four polyesters, two aliphatic (SP1 and SP3) and two aromatic (SP2 and SP4), were successfully obtained. Then, using chloroform as solvent, the formation of SP/PLA films was performed by solvent casting. To obtain the final films, the solvent used in their preparation was evaporated in an oven at 50 oC. All the polyesters showed to be able to form films with PLA. However, only SP1 and SP3 polyesters showed to be able to form films with the PLA with mechanical properties of interest for drug controlled release. After characterization, the films with improved properties - SP1 PLA50 (films containing 50/50 wt.% of SP1/PLA), SP3 PLA70 (films containing 30/70 wt.% of SP3/PLA) and SP3 PLA50 (films containing 50/50 wt.% of SP3/PLA) - were coated with the film main solution (SP PLA) or with a silicone. Afterwards, acetazolamide release studies were performed. The SP3 PLA70 films proved to be the most promising of the three films used in this study, in what concerns the drug release profiles. As regards the studied coatings, both showed to be effective in lowering drug release. At the same time, the same drying process was performed at room temperature in order to evaluate the impact of slow evaporation of the chloroform in the film properties. The obtained results were similar to those obtained for the film prepared in the oven at 50 oC.

Tese de doutoramento em Engenharia Química, apresentada ao Departamento de Engenharia Química da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra The aim of this work was the development of well-defined co(polymers) based on stimuli-responsive segments to further use as building blocks in the development of nanocarriers for biomedical applications. The synthesis strategy involved the use of reversible deactivation radical polymerization (RDRP) methods, as well as “click” coupling reactions that led to the preparation of well-defined polymers, with controlled molecular weight, narrow molecular weight distributions, and well-defined chain-end functionalities. The homopolymerization studies of the 2-(diisopropylamino)ethyl methacrylate (DPA) by atom transfer radical polymerization (ATRP) involving an eco-friendly catalytic system that uses sodium dithionite (Na2S2O4) as a reducing agent and supplemental activator originated well-defined pH-responsive polymers with controlled properties. The detailed mechanism of such reaction system was investigated and the structure of the initiator, solvent, concentration of the catalyst, and the ratios of Na2S2O4 were adjusted to optimize the polymerization and afford polymers with narrow molecular weight distribution (Đ < 1.15) even at high monomer conversion (~ 90%). The slow and continuous feed of Na2S2O4 solution to the reaction mixture allowed the polymerization to be carried out in the presence of only 100 ppm of CuBr2 when the ligand tris(2-pyridylmethyl)-amine (TPMA) was used. This system was successfully extended to the polymerization of oligo(ethylene oxide) methyl ether methacrylate (OEOMA). The residual metal catalyst concentrations used and non-toxic nature of the Na2S2O4 make this SARA ATRP method very attractive for the well-controlled synthesis of water soluble polymers for biomedical applications. The high conversion and preservation of the chain-end functionality allowed the direct synthesis of POEOMA-b-PDPA block copolymers through one-pot polymerization approach. The pH-dependent self-assembly behavior of these brush-like copolymers in aqueous solutions was studied and the preliminary results suggested that the preparation method plays an important role on the final morphology of the nanoaggregates. Due to the pH critical value of the DPA block, these block copolymers form stable nanostructures at physiological pH, but disassemble at pH < 6.2. Copolymers composed by longer PDPA segments were found to originate larger self-assembled particles with critical micelle concentration (CMC) in the range of 1.0 x 10-3 mg.mL-1. Despite the high versatility of the ATRP method, it is not very efficient in the polymerization of the so called non-activated monomers, namely vinyl acetate (VAc) and N-vinyl caprolactam (NVCL). The reversible addition fragmentation chain transfer (RAFT) was proposed as an alternative RDRP method for the polymerization of such monomers and two new xanthates with alkyne functionalities were designed and synthesized. The kinetic studies revealed that the protected alkyne-terminated RAFT agent (PAT-X1) was able to conduct the RAFT polymerization of both VAc and NVCL in 1,4-dioxane at 60 °C, with a good control over the molecular weight and relatively narrow MW distributions (Đ < 1.4) up to high monomer conversions. The linear evolution of Mn,GPC with conversion as well as the close agreement between Mn,th and Mn,GPC values confirmed the controlled feature of the RAFT system. The poly(N-vinyl caprolactam) (PNVCL) is a temperature-responsive polymer and its solution behaviour was fully investigated under different conditions. The stringent control over the polymer molecular weight allows the development of PNVCL with tunable phase transition temperatures around 37 °C. The deprotection of the alkyne functionality of the polymers synthesized by RAFT, allowed a further copper catalyzed azide–alkyne [3+2] dipolar cycloaddition (CuAAC) to obtain new linear block copolymers. This “click” coupling reaction allowed the conjugation of the alkyne-terminated PNVCL synthesized by RAFT with and azide-terminated POEOMA synthesized by ATRP, originating POEOMA-b-PNVCL copolymers. Such block copolymers are hydrophilic but, due to the temperature responsive nature of the PNVCL segment, they become amphiphilic at temperatures above its low critical solution temperature (LCST) and self-assemble into spherical vesicular aggregates with narrow size distributions. A small drop in the solution temperature caused the disruption of the nanostructures and induced the fast release of nile red (NR), an hydrophobic small molecule used as a model drug. Moreover, the sharp and reversible solution properties of the PNVCL block turn those copolymers interesting candidates for the development of temperature-triggered drug delivery systems (DDS). The CuAAC coupling reaction was extended for the development of responsive polymers with linear-dendritic architectures. The synthesized linear pH-responsive and temperature-responsive polymers were conjugated to polyester dendritic structures based on the monomer 2,2-bis(hydroxymethyl) propionic acid (bis-MPA), functionalized with poly(ethylene glycol) (PEG) segments, to obtain linear dendritic block copolymers (LDBC). This thesis contributed to the development of methods that allow the synthesis of new block copolymers having stimuli-responsive segments, and intended to extend the application of these structures to the development of tailor made nanocarriers to be used as DDS for cancer therapy. FCT - SFRH/BD69635/2010

Dissertação de Mestrado em Engenharia Biomédica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra

Dissertação de Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra

Na última década, as resinas de poliéster insaturado (UPRs) têm vindo a tornar-se um material importante na área Biomédica. Estas resinas apresentam excelentes propriedades mecânicas e uma capacidade intrínseca de biodegradação, contudo são constituídas normalmente por monómeros ou agentes de reticulação/monómeros reativos que não são biocompatíveis, o que pode comprometer a sua aplicabilidade em produtos da área da Saúde, como implantes e adesivos, scaffolds e sistemas de libertação controlada de fármacos. Esta tese pretende desenvolver UPRs mais adequados para aplicações biomédicas. Para isso, são usados monómeros de origem renovável na produção dos poliésteres insaturados (UPs), na tentativa de aumentar a sua biocompatibilidade sem comprometer as suas propriedades mecânicas. Para isso, os UPs foram reticulados com 2-hidroxietil metacrilato (HEMA), pois é bastante usado em áreas médicas, como a Oftalmologia e a Engenharia de Tecidos. Os UPs sintetizados foram caracterizados pelas técnicas de FTIR, 1H NMR (composição química), SEC (peso molecular), SDT e DMTA (propriedades termo-mecânicas). As UPRs obtidas através de reticulação térmica e fotoreticulação foram primeiramente analisadas relativamente ao seu teor de gel. Seguidamente, as amostras reticuladas termicamente foram analisadas pelas técnicas SDT e DMTA (propriedades termo-mecânicas), e as suas capacidades de absorção e degradação hidrolítica in vitro também foram avaliadas. Os resultados revelaram sucesso na preparação dos UPs e UPRs compostos por monómeros de fonte renovável, assim como a observação de efeitos interessantes nas suas propriedades, constituindo pontos de partida importantes para a futura otimização dos sistemas e respectiva aplicação no campo biomédico.

Este projecto teve como principal objectivo o desenvolvimento de uma estrutura dendrítica de quarta geração, de base poliéster, funcionalizada com um grupo alcino. O dendron de quarta geração (baseada no composto bis-MPA) foi sintetizado segundo o método double-stage convergent growth, tendo os resultados obtidos sido confirmados por ressonância magnética nuclear e espectrometria de massa. A estrutura sintetizada, com um grupo carboxílico no seu `núcleo', foi sujeita a diversas reacções de funcionalização com terminais alcino, revelando-se, no entanto, infrutíferas. Deste modo, um novo método, através do anidrido carboxílico, foi testado e um dendron de segunda geração, funcionalizado com o grupo alcino, foi sintetizado com sucesso. Com o mesmo intuito de construir uma estrutura de quarta geração, reacções de esterificação e acilação foram executadas, mas os resultados obtidos sugerem que o terminal alcino, presente inicialmente, foi afectado. Concomitantemente, reacções de funcionalização do polietilenoglicol com um terminal alcino foram também realizadas, tendo sido sintetizado com sucesso (após várias tentativas). Embora o objectivo inicial não tenho sido totalmente alcançado, as metodologias abordadas e os resultados obtidos neste projecto, permitem retirar algumas ilações acerca do processo de síntese de estruturas dendríticas. Este conhecimento reveste-se de especial importância na definição de novas estratégias que devem ser adoptadas futuramente. Palavras-chave: anidrido, bis-MPA, PEG