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ルーメン微生物によるタンパク質の分解機構を知るために,プロトゾアのエキソペプチダーゼ活性について検討した.全エキソペプチダーゼ活性はカゼインを基質として培養後,あるいは酵素反応後の遊離したアミノ基とペプチド量の差から求めた.山羊ルーメンから得た混合プロトゾアを塩類緩衝液中で培養したところ,活性はプロトゾアの細胞内画分に認められた.この活性は超音波破壊したプロトゾア細胞の遠心沈殿に主に分布していたことから,エキソペプチダーゼが細胞膜などに結合したものであることが考えられた.最適pHを超音波破壊したプロトゾアについて検討したところ,pH7.3付近にピークが認められたが,それより低いpHでもさらに高い活性が認められた.一方、ロイシル-β-ナフチルアミドを基質としてロイシンアミノペプチダーゼ様活性も測定したところ,細胞内の分布では可溶性画分に存在し,最適pHは7.8であった.これらのことからプロトゾアのエキソペプチダーゼには多くの種類があるものと考えられた.全エキソペプチダーゼ活性,ロイシンアミノペプチダーゼ様活性ともにアミノペプチダーゼBとロイシンアミノペプチダーゼの特異的阻害剤であるウベニメクス(ベスタチン)ではわずかに阻害されたにすぎなかった.したがって,プロトゾアにおいてはアミノペプチダーゼの関与は少ないことが示唆された。

ルーメンプロトゾアが尿中アラントイン排泄量に及ぼす影響について検討した.結果については,尿中アラントイン排泄量が小腸で吸収される微生物体蛋白質量に比例するとの前提で考察した.試験は2回行ない,それぞれ6頭の日本ザーネン種去勢ヤギを用いた.このうち半数はルーメンプロトゾア不在ヤギ,残りの半数はプロトゾア存在ヤギとした.尿中アラントイン排泄量は,プロトゾア存在ヤギに比較して不在ヤギで高まる傾向が示された.プロトゾア不在ヤギにおいては,可消化有機物(DOM)摂取量がルーメン微生物体蛋白質合成の制限因子と考えられる場合には尿中アラントイン排泄量はDOM摂取量に比例して増加した.また,ルーメン微生物への窒素の供給が制限因子と考えられる場合には,尿素摂取量の増加に伴い尿中アラントイン排泄量が増加した.尿中のアラントイン/クレアチニン比も同様の結果を示した.一方,存在ヤギにおいては,尿素摂取量が増加しても尿中アラントイン排泄量は変化しなかった.このにとは,尿素が窒素源として給与される場合には,ルーメンプロトゾアの存在により小腸で消化吸収される微生物体蛋白質量が減少することを示している.

反芻動物の反芻胃液中に繊毛虫類の細胞外蛋白質分解酵素の存在を明らかにすることと,その活性を検討するために,山羊と牛の反芻胃液より遠心分離法で無細胞反芻胃液(CFRL)を調製して蛋白質分解活性を測定した.その結果は以下に示す通りであった.1, 山羊1頭を有繊毛虫期(通常期,CV期)と無繊毛虫期(DF期)に分け,CFRLの蛋白質分解活性を検討した結果,CV期においては飼料給与により活性が著たく大きくなるのに対して,DF期では変化なかった.2, CFRLをo-iodosobenzoic acid(o-IB)で酸化すると蛋白質分解活性は小さくなり,dithiothreitol(DTT)で還元すると大きくなった.3. CFRLの蛋白質分解活性は飼料給与後1時間前後で最大となり,その後比較的短時間に低下した.4. CFRLの各種蛋白質の分解活性はカゼイン,大豆蛋白質粉末およびグルテンの順になり,ツェインはほとんど分解されなかった.

無繊毛虫ヤギでは,繊毛虫が存在する通常のヤギに比べ反芻胃内容液中のアンモニア濃度が低下するので,その要因をアンモニア生成の面から明らかにする目的で両区のヤギに乾草と濃厚飼料とを給与し,反芻胃内容液遊離アミノ酸の濃度と組成とにつき比較検討した.1) 反芻胃内容液中のα-アミノ態窒素濃度は,両区とも採食1時間後に増加しその後は低下する傾向を示したが,通常区の方が無繊毛虫区よりも明らかに高かった.2) 採食1時間後における総遊離アミノ酸中の個々のアミノ酸の割合は,通常区では,グルタミン酸:20.1%,アラニン:16.1%,プロリン:7.2%,δ-アミノバレリアン酸:11.1%であるのに対し,無繊毛虫区では,それぞれ13.9%, 7.9%, 2.7%, 36.1%であり,アミノ酸組成に両区の間で差異が認められた.3) 給与飼料中からは多種類の遊離アミノ酸が検出されたが,特にプロリン,アスパラギン酸,チロシンおよびグルタミン酸が多く,反芻胃内容液の遊離アミノ酸組成とは著しく相違し,さらにその含量は採食後の反芻胃内容液中の含量と比べると極めて少なかった.これらの結果から,無繊毛虫区でアンモニア濃度が低下する主な要因は,飼料タンパク質からのアミノ酸の生成が通常区に比べ少ないためであると考察された.

ホルスタイン種成雌牛2頭および黒毛和種成雌牛2頭を供試し,給与飼料は,粗飼料として稲わら,青草(オーチャードグラス),乾草(オーチャードグラス)およびサイレージ(トウモロコシ茎葉)を,濃厚飼料は大麦挽砕を使用した.これらの飼料を粗飼料単味または濃厚飼料を加えて給与することにより,反芻胃内繊毛虫類に及ぼす影響を比較検討した.その結果次のことが認められた.1) 粗飼料単味の給与では,反芻胃内繊毛虫類の反芻胃内容液1ml中の総数は減少した．2) 粗飼料に濃厚飼料(大麦)を加えて給与したときに繊毛虫数は著しい増加を示した.3) 反芻胃内繊毛虫類に対する飼料の影響は貧毛虫類に顕著にあらわれ,特にEntodinium属は飼料組成に敏感に反応して増減した.すなわち,繊毛虫数の大多数を占めるEntodinium属は,大麦給与時に増加し,また,その中ではEntodinium simplexの数が最も顕著に増加した.4) 給与飼料をもとの飼料に戻すことにより,もとの繊毛虫集団構成に近くなったことから,給与する飼料の種類が反芻胃内繊毛虫数の重要な変動要因であると考えられた.

二組の双子の山羊のそれぞれ一方を無繊毛虫山羊として,アンモニアを中心とする反芻胃内物質代謝を比較することにより,それらに及ぼす繊毛虫類の影響を調べた.その結果,つぎの知見が得られた.(1) 三種類の異なった組成を有する飼料を給与し,反芻胃内容液中のアンモニア濃度を経時的に測定した結果,その濃度はいずれの飼料区においても,無繊毛虫山羊では明らかに低下するのが認められた.(2) VFA濃度は,生後3か月における比較ではその値に相違は認められなかったが,それ以降において無繊毛虫山羊では低下し,有意の差が認められた.(3) アンモニア濃度の相違の要因を明らかにするために,15N標識クエン酸アンモニウムを両区の山羊に投与し,反芻胃内容液遠沈上澄液区分中の15Nの減少速度を調べ,アンモニアの利用性を比較検討した.その結果,15Nの減少については,繊毛虫の有無によって明らかな相違は認められなかった.このことは,アンモニアのルーメン壁からの吸収速度ならびに第三胃以下への移行速度が両区の山羊において差はないと仮定すれば,アンモニアの利用性は繊毛虫の存在によって,とくに影響されないことを示すものと解される.以上の結果から,無繊毛虫山羊の反芻胃内においては,細菌によるアンモユアの利用性が高まるためにアンモニア濃度が低下するという従来の解釈のみでは,上記の相違は必ずしも十分に説明しえないことが明らかにされた.

細胞外へ蛋白質分解酵素を分泌する繊毛虫の種類と, その活性に及ぼす繊毛虫の体表付着細菌および遊離細菌の影響について検討した. 第一胃フィステル装着牛から採取した反芻胃液から繊毛虫と細菌を分離し, 前者は貧毛虫と全毛虫とに分画した. これらの微生物区分を飢餓培養後に遠沈して細胞外粗酵素液を調製し, そのカゼイン分解能から細胞外蛋白質分解活性を求めた。その結果は以下に示す通りであった。1) 細胞外蛋白質分解活性は貧毛虫の培養後に調製した粗酵素液にのみ認められ, 全毛虫のそれには認められなかった.2) 繊毛虫の体表付着細菌を除去するため, ショ糖脂肪酸エステルで洗滌した繊毛虫の細胞外蛋白質分解活性は洗滌しない繊毛虫のそれと差がなかった.3) 細菌はカゼインを分解したが, 細菌培養液を遠沈して得た上清液中には蛋白質分解活性がほとんど認められなかった.4) 以上の結果は, 細胞外蛋白質分解活性が主として貧毛虫の産生する酵素によるものであり, 遊離細菌または付着細菌の影響はほとんどないことを示唆するものと考えられた.

6頭の山羊を用いて,エネルギー代謝とルーメン液および血液性状に及ぼすプロトゾアの影響を調べた.飼料は,実験1では乾草のみ,実験2では乾草+濃厚飼料,実験3では実験2の飼料にモネンシンを添加したものとした.プロトゾア存在の山羊は不在のものに比べ,いずれの実験でもルーメン液中のアンモニア濃度と酪酸の比率が高かったが,プロピオン酸の比率は低かった.モネンシンはプロトゾア数を減少させプロピオン酸の比率を上昇させた.エネルギー代謝については,実験1ではプロトゾアの影響は認められなかったが,実験2ではプロトゾアの存在によるメタン生成量の増加が認められた.いずれの実験でも,プロトゾアの存在によりエネルギーの尿への損失は高まり,糞への損失は低下し,蓄積量は高まる傾向がみられた.飼料Nの消化率も同様に上昇したが,尿中N損失がプロトゾアの存在で高まったため,N蓄積量にはその有無で差は認められなかった.モネンシンはエネルギーのメタンと糞への損失を低下させ尿中N損失を増加させた.血漿グルコース濃度は実験2と3ではプロトゾア存在の方が高く推移したが,尿素-N濃度には差は認められなかった.モネンシンによりこれらの濃度は高まる傾向がみられた.

本邦の主要な反芻家畜であるウシ126頭,ヒッジ51頭,ヤギ10頭におけるルーメン内繊毛虫の分布調査と移植試験をおこない,以下の所見を得た.1) この調査で検出された繊毛虫は,ウシ44種,ヒッジ34種,ヤギ26種の計3科16属47種で,そのうち7属15種は従来本邦での存在は不明のものであった.2) しかし,これらすべてが各個体に棲息するのではなく,その平均棲息種数はいずれの家畜でもほぼ14種であった.3) またルーーメン内容中の繊毛虫密度はいずれの家畜においても平均約5×105/mlであった.4) Entodinium属,特にE. simplex, E. nanellumは各種家畜において多数の個体に出現し,その密度も高く,最も優勢に棲息するものであった.5) 各種繊毛虫の密度と検出率は相関し,ルーメン内で高密度に存在する繊毛虫はその分布が広い傾向があった.6) 供試した3種の家畜におけるルーメン内の繊毛虫の種類構成はおおむね類似したが,13種の繊毛虫はウシのみに分布し,また2種はヒッジのみから検出された.7) しかし,ウシ特有と思われた繊毛虫をヒッジルーメン内に移植すると,それは明らかに増殖定着した.これは,家畜による繊毛虫の分布の相違は宿主特異性によるよりはむしろ感染の機会の有無によることを示唆するものと思われた.

反芻動物における非蛋白態窒素(NPN)化合物の利用におよぼすルーメンプロトゾア存否の影響を明らかにする目的で,プロトゾアの存在するヤギの区(Fヤギ区)とプロトゾアの存在しないヤギの区(Dヤギ区)にそれぞれ尿素含有飼料を給与し,N消化率,N保留率を測定した.さらに尿素含有飼料給与後10日目の反芻胃内容液についてアンモニア,総低級脂肪酸(VFA)および乳酸濃度を経時的に調べ,また14日目の内容液についてin vitroで反芻胃内微生物によるアンモニア利用の程度を両区で比較を行い以下の結果を得た.1) 飼料中のN源の約半分が尿素の場合,大豆蛋白質の場合に比べN消化率はFヤギ区およびDヤギ区でともに高かった.2) 尿素飼料給与時におけるN保留率は全般的にFヤギ区に比べDヤギ区で高い傾向が示され,特に尿素飼料に切り換えた直後でその傾向は顕著であった.3) 反芻胃内容液のアンモニアおよび総VFA濃度はいずれもFヤギ区で高かった.4) in vitro培養実験における微生物蛋白質合成量はDヤギ区で高い値が示された.以上の結果より反芻胃内にプロトゾアの存在しないDヤギ区で尿素の利用性が高い傾向が示された.

反芻胃内窒素代謝に及ぼす繊毛虫類の影響を明らかにするため,双子のヤギの一方を繊毛虫が存在しない無原虫区とし,混合繊毛虫が存在する通常のヤギと,消化率,窒素出納および反芻胃内容物タンパク質区分のアミノ酸組成を比較した.1) 無原虫区では反芻胃内細菌数が著しく増大した.2) アルファルファペレットを主体とした飼料では消化率,窒素出納ともに両区で差異は認められなかったが,乾草を主体とした飼料では粗タンパク質消化率は通常区の方がいく分高く,窒素蓄積率も高かった.3) 反芻胃内容物のアミノ酸のなかで,アスパラギン酸,グルタミン酸,イソロイシン,フェニルアラニンおよびリジンの含量は通常区の方が多く,グリシン,アラニンおよびメチオニンの含量は無原虫区の方が多かった.このうち,リジン含量の差がもっとも大きかった.

反芻胃内繊毛虫による蛋白質分解の特性を明らかにするための一助として, 繊毛虫を全毛虫区分と貧毛虫区分とに分別し, それぞれの懸濁液, またはその超音波破壊液に溶液状カゼイン (soluble casein) を添加してin vitroで培養した結果, 以下の知見を得た. 1. 全毛虫懸濁液では培養後2時間まで溶液状カゼインの分解がほとんど認められなかった. 2. 貧毛虫懸濁液では培養直後から溶液状カゼインの分解が認められた. 3. 全毛虫懸濁液でも培養5時間以降は明らかにその分解が認められた. 4.超音波破壊した全毛虫および貧毛虫区分は, 共に培養直後から溶液状カゼインを分解した. 5. 予め20時間飢餓培養後に調製した貧毛虫懸濁液では溶液状カゼインの分解量が著しく低下したが, 全毛虫の場合はほとんど変化しなかった. 6. 以上の結果, 貧毛虫による溶液状カゼインの分解は, かなりの部分をその細胞外蛋白質分解酵素に負っているのに対し, 全毛虫は専ら溶液状カゼインを細胞内にとり込み, 一時貯蔵した後徐々に分解するものと考えられた.

カゼインのパンクレアチン消化物(ポリペプトン)を添加して反芻胃内繊毛虫類を培養後,増加したアンモニア態およびアミノ態窒素を測定することにより,繊毛虫類のペプチド代謝を検討した.ポリペプトンは,全毛目を含む混合虫体によっても,また,貧毛目のみによっても分解され,培地中にアンモニアおよびアミノ酸が増加した.貧毛目は粒状カゼインを,また,全毛目を含む混合虫体は溶液状力ゼインをも,それぞれ分解して,非蛋白態窒素を増加させるが,その中で最も多いペプチド態窒素は,さらに培養を続けることによって分解され,アミノ酸およびアンモニアが増加した.繊毛虫類培養後(5hr)の培地上澄液および虫体ホモジエネートも,ポリペプトンからアミノ酸およびアンモニアを産生した.培地上澄液によって産生されたアンモニア態窒素に対するアミノ態窒素の比は,繊毛虫類懸濁液および虫体ホモジェネートによって産生されたそれらの比よりも高いので,繊毛虫類は,培地中にペプチターゼを分泌しているのではないかと考えられた.しかし,繊毛虫類が膜透過によって体内にペプチドを取り込む可能性は,本実験からは必ずしも否定されなかった.

山羊の反芻胃液から,遠心分離法によって繊毛虫を集め,塩類溶液で培養した.培養後繊毛虫を除去した培養上清液から,硫安分画とゲル〓過によって繊毛虫の細胞外酵素を精製し,その性質について検討し次の結果をえた.i) 主な活性をもつ細胞外酵素の分子量は,38,000前後と推定される.ii) 蛋白質分解活性は,pH5.5,6.0および7.5の3点にピークをもつので,蛋白質分解酵素は,少なくとも3種類あることが推察される.iii) 蛋白質分解活性の最適温度は,60°C付近であった.しかし60°Cでは酵素の失活は大きかったが,40°Cではほとんど失活しなかった.iv) 酸化によって活性は低下するが,還元することにより活性は復活した.v) Fe2+は,活性に阻害的作用を及ぼし,EDTAよびEGTAも阻害的傾向を示したが,Ca2+,Mg2+およびPO43-は影響を及ぼさなかった.

反芻胃内に存在するprotozoaの種構成に近い混合虫体の懸濁液を用いて,可溶性糖類の資化性について低濃度で検討を行なった結果,資化される糖はマンノースを除いて,Dasytrichaによって資化される糖に一致した.即ち,アラピノース,リボース,キシロース,メリビオースと乳糖は資化されず,ブドウ糖,果糖,マンノース,ガラクトース,セロビオース,蔗糖,麦芽糖とラフィノースは資化されて,protozoaは反芻胃内の糖類の代謝の一部に関与していることを示した.しかしマンノースについてはさらに検討する必要がある.ラフィノースの利用について,ペーパークロマトグラブィで検討して,この三糖類の一部をなしている果糖部分は資化されたが,メリビオース部分は資化されなかった.ラフィノースをこのようにして資化するprotozoaはHolotricaであると推論された.

反芻胃内繊毛虫類のN栄養源として,アミノ酸がどの程度重要であるのか,また,主要なN栄養源は何かを知るために,微生物生態論的な立場から,14Cアミノ酸および14Cラベル細菌を使用して研究を行ない,次の結果を得た.1) バンスライク検圧法の結果では消費されなかったAsp, Val, Ala, Arg, Pheも虫体内に取り込まれた.2) 被検アミノ酸のうちでは,虫体蛋白質成分中に少いMetが多く取り込まれ,逆に蛋白質成分中に多いGlu, Lys, Aspは取り込み量が少なかった.3) 繊毛虫•細菌の共存培養時に虫体内に取り込まれた14Cアミノ酸活性は,繊毛虫の単独培養時に虫体内に取り込まれたそれよりも常に高い値であり,共存培養時に菌体内に取り込まれた14Cアミノ酸活性は,単独培養時に虫体内に取り込まれたそれの2～10倍であった.4) 共存培養時の培地中の14Cアミノ酸活性は,3時間で,始めの24.2～83.9%も減少したが,単独培養時では,0～2.8%しか減少しなかった.5) 14Cラベル細菌を培地に添加して繊毛虫を培養すると,14C活性は虫体に移行し,3時間目に最大となった.これは,明らかに細菌が虫体内に取り込まれることを示すものである.6) 虫体内に取り込まれた菌体N量は,アミノ酸のうちで最もよく取り込まれたMetのN量の約20倍であった.以上の結果より,次のこうな結論を得た.1. 繊毛虫にとって,アミノ酸は,主要なN栄養源とは考えられない.2. 繊毛虫の主要なN栄養源は,細菌などの粒状の物質であろう.3. アミノ酸が虫体に移行する主要な経路としては,「アミノ酸→細菌→繊毛虫」という一種の食物連鎖の経路が考えられる.