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O bagaço de cana-de-açúcar é o resíduo agrícola mais abundante no Brasil e apresenta elevado potencial para ser utilizado na produção de etanol de segunda geração. Entretanto, a grande complexidade da biomassa lignocelulósica requer diferentes enzimas para uma hidrólise eficiente. Neste trabalho, foi realizada a purificação, a caracterização bioquímica, a caracterização cinética e a aplicação na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar de duas xilanases de Aspergillus nidulans clonadas em Pichia pastoris: AN1818.2 e AN3613.2. A indução da expressão dos genes das xilanases foi realizada em meio BMMY contendo metanol, o qual induz a ativação do promotor AOX1, envolvido no metabolismo deste álcool. O sobrenadante do cultivo constitui-se no extrato bruto, o qual foi submetido à cromatografia de afinidade em coluna His Trap HP e, em seguida, à cromatografia de exclusão molecular em coluna Superdex 200. A temperatura ótima de atividade para a xilanase AN1818.2 foi 60 ºC, já para a xilanase AN3613.2 foi 50 ºC. Ambas as enzimas mostraram-se estáveis quando pré-incubadas a 50 ºC e pouco estáveis quando pré-incubadas a 60 ºC. A xilanase AN1818.2 apresentou um pH ótimo de atividade de 7,5 e a xilanase AN3613.2 apresentou melhor atividade em pH 6,0. Ambas as xilanases foram altamente estáveis quando pré-incubadas durante uma hora em tampões na faixa de pH de 2,5 a 13 e retornadas ao pH 5,0. As enzimas AN1818.2 e AN3613.2 foram fortemente inibidas por HgCl2, SDS, CuSO4 e xilotriose. A xilanase AN1818.2 hidrolisou melhor o substrato arabinoxilana de trigo e a xilanase AN3613.2 o substrato xilana beechwood. O valor de Km utilizando xilana beechwood como substrato foi de 1,66 e 4,23 mg/mL para as xilanases AN1818.2 e AN3613.2, respectivamente. A hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar com o coquetel Multifect CL Genencor® foi mais eficiente quando suplementada com a xilanase AN1818.2 em combinação com a xilanase AN3613.2. Já a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar com o coquetel Accellerase 1500 Genencor® foi mais eficiente quando suplementada apenas com a xilanase AN3613.2. Sugarcane bagasse is the most abudant agricultural waste in Brazil and has a high potential to be used in the production of second generation ethanol. However, the high complexity of lignocellulosic biomass requires different enzymes for efficient hydrolysis. In this study, two xylanases from Aspergillus nidulans, AN1818.2 and AN3613.2, cloned in Pichia pastoris were purified, biochemically characterized, kinetically characterized and applied in sugarcane bagasse hydrolysis. BMMY medium was used to induce xylanases gene expression. This medium contains methanol, which induces AOX1 promoter, involved in methanol metabolism. The enzymatic extract was submitted to affinity (His Trap HP) and gel filtration (Superdex 200) chromatographies. Xylanase AN 1818.2 is optimally active at 60 oC and in pH 7,5. AN3613.2 was optimally active at 50 oC and in pH 6,0. Both xylanases were higly thermostable at 50 oC and in pH range from 2,5 to 13 and less stable at 60 oC. HgCl2, SDS, CuSO4 and xylotriose inhibited enzymatic activities. Wheat arabinoxylan was the best substrate for AN1818.2 hydrolysis and AN3613.2 is better suitable for beechwood xylan hydrolysis. Km for AN1818.2 and AN3613.2 was 1,66 and 4,23 mg/mL, respectively, using beechwood xylan as substrate. Sugarcane bagasse hydrolysis with Multifect CL Genencor® was more efficient when xylanase AN1818.2 was added with xylanase AN3613.2. Sugarcane bagasse hydrolysis with Accellerase 1500 Genencor® was more efficient when only xylanase AN3613.2 was added.

A cristalografia de raios-X, em relação ao número de estruturas depositadas no Protein Data Bank (PDB), é o método mais utilizado para se obter informações estruturais de macromoléculas biológicas. Tais informações são úteis para o entendimento dos sistemas biológicos dos quais essas macromoléculas participam. Nesse trabalho, duas proteínas com interesse biotecnológico foram estudadas do ponto de vista bioquímico e estrutural: a proteína antigênica Pb27 de Paracoccidioides brasiliensis e a enzima NahF de Pseudomonas putida. O fungo P. brasiliensis é o agente causador de uma das mais importantes micoses sistêmicas do Brasil, a paracoccidioidomicose (PCM) e a proteína Pb27, apesar de já ter sido utilizada com alta especificidade e sensibilidade no diagnóstico e como adjuvante no tratamento da PCM, tem sua função ainda desconhecida e não apresenta proteínas similares com estrutura terciária resolvida. Com o intuito de resolver sua estrutura por cristalografia de raios-X, a proteína Pb27 recombinante (Pb27r) foi expressa em bactérias E. coli BL21(DE3) e purificada por cromatografia de afinidade e gel filtração de onde eluiu com volume equivalente a um monômero (24 kDa após remoção da cauda de histidinas N-terminal). Estudos de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e dicroísmo circular (CD) mostraram essa proteína estava monodispersa e enovelada. Cristais da Pb27 foram obtidos em MgCl2 0,25 M, PEG 4000 25%, Tris-Cl 100 mM pH 7,0, com grupo espacial P212121 e difrataram com resolução de 1,9 Å. Para a obtenção de cristais derivados para a resolução da estrutura da Pb27r por espalhamento anômalo ou substituição isomórfica, foram realizados soaking e co-cristalização com sais de átomos pesados (NaI, CsCl, GdCl3, sais de Hg e Pt) além de marcação com Se-Met, no entanto, ainda não foram obtidos cristais com diferença isomórfica/anômala suficiente para determinação da estrutura da Pb27. Já a enzima NahF catalisa a oxidação do salicilaldeído em salicilato utilizando NAD+ como cofator, última reação da via superior de degradação do naftaleno em P. putida. O naftaleno é o composto mais abundante e tóxico do petróleo e tem sido utilizado como modelo em estudos de biorremediação. Para a compreensão dos determinantes estruturais da atividade dessa enzima, a proteína NahF recombinante (NahFr) foi expressa em E. coli Arctic Express a 12 oC e purificada por cromatografias de afinidade e gel filtração de onde eluiu em três frações. A fração principal, que continha a proteína em sua forma dimérica e monodispersa (dados obtidos por DLS) foi utilizada em ensaios cinéticos e estruturais. A NahFr apresentou maior atividade em pH 8,5 e 60 oC. EDTA, DTT e SDS inibiram a atividade enzimática enquanto Ni2+ a elevou em quase 20%. A enzima apresentou altos valores de kcat/KM e preferência para aldeídos aromáticos e por aldeídos alifáticos de cadeia longa. A sua estrutura mostrou um enovelamento do tipo / com os domínios de oligomerização de ligação ao cofator e catalítico bem definidos. O salicilaldeído estava presente em um bolsão profundo na estrutura da enzima onde também estavam a Cys284 e o Glu250 catalíticos. Os resíduos Arg157, Gly150 e Trp96 se mostraram importantes para a especificidade por aldeídos aromáticos. O entendimento das características da enzima NahF que são responsáveis por sua atividade e especificidade e, também, suas diferenças para outras ALDHs de outros organismos pode abrir possibilidades para, por exemplo, o aumento da sua estabilidade e outras características por mutações sistemáticas, tornando possível o seu uso e o de outras enzimas relacionadas em processos biotecnológicos According to the number of structures deposited on Protein Data Bank (PDB), the X-ray crystallography is the main method used to obtain structural information of biological macromolecules. Such information is useful for understanding the biological systems of which these macromolecules participate. In this study, two proteins with biotechnological interest were studied from the structural and biochemical view: the antigenic protein Pb27 from Paracoccidioides brasiliensis and the enzyme NahF from Pseudomonas putida. The fungus P. brasiliensis is the agent of one of the most important systemic mycoses in Brazil, paracoccidioidomycosis (PCM) and the protein Pb27, despite having been used with high sensitivity and specificity in the diagnosis and as an adjuvant in the treatment of PCM, Pb27s function is still unknown and this protein has no similar proteins with tertiary structure solved. Aiming to solve its structure by X-ray crystallography, recombinant Pb27 protein (Pb27r) was expressed in bacteria E. coli BL21(DE3) and purified by affinity chromatography and gel filtration, which was eluted with a volume equivalent to a monomer (24 kDa after removing the N-terminal Histag). Studies of dynamic light scattering (DLS) and circular dichroism (CD) revealed that protein is monodisperse and folded. Pb27 crystals were obtained in 0.25 M MgCl2, 25% PEG 4000, 100 mM Tris-Cl pH 7.0, with space group P212121 and diffracted up to 1.9 Å of resolution. In order to obtain crystals derivatives for solving the structure of Pb27r by anomalous scattering or isomorphous substitution it was performed soaking and co-crystallization with heavy atom salts (NaI, CsCl, GdCl3, Hg and Pt salts) were performed in addition to Se-Met labeling. However, derivative crystals with isomorphic/anomalous difference enough to determine Pb27 structure were not obtained yet.The NahF enzyme catalyzes the oxidation of salicylaldehyde to salicylate using NAD+ as a cofactor, the last reaction of the degradation upper pathway of naphthalene in P. putida. The naphthalene is the most abundant and toxic compound in oil and has been used as a model for bioremediation studies. To understand the structural determinants of activity of this enzyme, the recombinant protein NahF (NahFr) was expressed in E. coli Arctic Express at 12 oC and purified by affinity chromatography and gel filtration in which it eluted in three fractions. The main fraction contained the protein in its dimeric form and monodisperse (data obtained by DLS) and was used for kinetic and structural studies. NahFr was most active at pH 8.5 and 60 oC. EDTA, DTT and SDS inhibited the enzymatic activity while the Ni2+ increased by almost 20%. The enzyme showed high values of kcat/KM and preference for aromatic and long chain aliphatic aldehydes. The structure showed an / folding with the oligomerization, cofactor binding and catalytic domains well defined. The salicylaldehyde was present in a deep pocket in the structure where the catalytic Cys284 and Glu250 were seen. Moreover, the residues Arg157, Gly150 and Trp96 were important to specificity for aromatic aldehydes. The understanding of the characteristics of the enzyme NahF that are responsible for its activity and specificity and also its differences for other ALDHs from other organisms may open up possibilities for, for example, increased stability and other characteristics by systematic mutations, making it possible its use and other related enzymes in biotechnological processes