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The genome of influenza A viruses (IAV) is encoded in eight distinct viral ribonucleoproteins (vRNPs) that consist of negative sense viral RNA (vRNA) covered by the IAV nucleoprotein. Previous studies strongly support a selective packaging model by which vRNP segments are bundling to an octameric complex, which is integrated into budding virions. However, the pathway(s) generating a complete genome bundle is not known. We here use a multiplexed FISH assay to monitor all eight vRNAs in parallel in human lung epithelial cells. Analysis of 3.9 × 105 spots of colocalizing vRNAs provides quantitative insights into segment composition of vRNP complexes and, thus, implications for bundling routes. The complexes rarely contain multiple copies of a specific segment. The data suggest a selective packaging mechanism with limited flexibility by which vRNPs assemble into a complete IAV genome. We surmise that this flexibility forms an essential basis for the development of reassortant viruses with pandemic potential., The mechanism underlying packaging of the 8 segments of the influenza virus genome into virions is not well understood. Here, the authors use a multiplexed FISH assay to monitor the 8 segments in parallel in infected cells suggesting bundling routes during the packaging process.

Binders of langerin could target vaccines to Langerhans cells for improved therapeutic effect. Since langerin has low affinity for monovalent glycan ligands, highly multivalent presentation has previously been key for targeting. Aiming to reduce the amount of ligand required, we rationally designed molecularly defined high‐affinity binders based on the precise display of glycomimetic ligands (Glc2NTs) on DNA‐PNA scaffolds. Rather than mimicking langerin's homotrimeric structure with a C3‐symmetric scaffold, we developed readily accessible, easy‐to‐design bivalent binders. The method considers the requirements for bridging sugar binding sites and statistical rebinding as a means to both strengthen the interactions at single binding sites and amplify the avidity enhancement provided by chelation. This gave a 1150‐fold net improvement over the affinity of the free ligand and provided a nanomolar binder (IC50=300 nM) for specific internalization by langerin‐expressing cells., Statistical rebinding and chelate binding reinforce each other and cooperatively increase the affinity for a multivalent target. The distance‐defined display of two small clusters of a glycomimetic compound on a rigid PNA‐DNA scaffold provided the first molecularly defined, nanomolar binder of the C‐type lectin receptor langerin. The high‐affinity binders are selectively internalized by langerin‐expressing cells.

Several genomic disorders are caused by an excessive number of DNA triplet repeats., Several genomic disorders are caused by an excessive number of DNA triplet repeats. We developed a DNA-templated reaction in which product formation occurs only when the number of repeats exceeds a threshold indicative for the outbreak of Chorea Huntington. The combined use of native chemical PNA ligation and auxiliary DNA probes enabled reactions on templates obtained from human genomic DNA.

International audience; Two different organic monolayers were prepared on silicon Si(111) and modified for attaching gold nanoparticles. The molecules are covalently bound to silicon and form very ordered monolayers sometimes improperly called self-assembled monolayers (SAM). They are designed to be electrically insulating and to have very few electrical interface states. By positioning the tip of an STM above a nanoparticle, a double barrier tunnel junction (DBTJ) is created, and Coulomb blockade is demonstrated at 40 K. This is the first time Coulomb blockade is observed with an organic monolayer on oxidefree silicon. This work focuses on the fabrication and initial electrical characterization of this double barrier tunnel junction. The organic layers were prepared by thermal hydrosilylation of two different alkene molecules with either a long carbon chain (C11) or a shorter one (C7), and both were modified to be amine-terminated. FTIR and XPS measurements confirm that the Si(111) substrate remains unoxidized during the whole chemical process. Colloidal gold nanoparticles were prepared using two methods: either with citrate molecules (Turkevich method) or with ascorbic acid as the surfactant. In both cases AFM and STM images show a wellcontrolled deposition on the grafted organic monolayer. I−V curves obtained by scanning tunneling spectroscopy (STS) are presented on 8 nm diameter nanoparticles and exhibit the well-known Coulomb staircases at low temperature. The curves are discussed as a function of the organic layer thickness and silicon substrate doping.

Einleitung: Die Prävalenz von Dysphagien infolge von Kopf-Hals-Tumoren wird je nach Größe und Sitz des Tumors sowie Art der onkologischen Therapie mit bis zu 88% angegeben. Für den Patienten bedeutet dies eine deutliche Reduktion der Lebensqualität, für das Gesundheitssystem[for full text, please go to the a.m. URL], 82. Jahresversammlung der Deutschen Gesellschaft für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde, Kopf- und Hals-Chirurgie

Die Fähigkeit Nukleinsäuren in lebenden Organismen nachzuweisen und zu visualisieren, ist entscheidend für das Verständnis zellulärer Prozesse. Die Forschungsgruppe von Prof. Dr. Oliver Seitz hat zu diesem Zweck fluorogene FIT-Hybridisierungssonden entwickelt, die die besondere Eigenschaft der Cyaninfarbstoffe Thiazolorange und Chinolinblau nutzen, stärker zu fluoreszieren, wenn sie in die beengte Umgebung eines Nukleinsäureduplex aus Sonde und spezifischer Zielsequenz eingebracht werden. Obwohl FIT-Sonden eine gute Fluoreszenzverstärkung und Spezifität aufweisen, wäre eine weitere Verbesserung ihrer Helligkeit und des Signal-Hintergrund-Verhältnisses wünschenswert. Um dies zu erreichen, wurde in dieser Arbeit ein Ansatz untersucht, bei dem FIT-Sonden mit zwei Fluorophoren desselben Typs ausgestattet werden (FIT2-Strategie). Dies sollte sowohl die Helligkeit der Sonde erhöhen, als auch die Fluoreszenz im Einzelstrang und bei Hybridisierung mit fehlgepaarter RNA durch eine Mischung aus kontaktvermittelter Fluo-reszenzlöschung und strahlungsfreiem Energietransfer verringern. Verschiedene Sonden-längen, Farbstoffabstände und -positionen wurden untersucht und es konnte bestätigt werden, dass FIT2-Sonden eine höhere Extinktionskoeffizienten, größere Fluoreszenzver-stärkung und eine bessere Selektivität aufweisen als einfach markierte Sonden. Außerdem behalten sie ihre Fähigkeit zur Unterscheidung von Match- und Mismatch-Zielen in visko-sem Zelllysat besser bei. Zudem konnte gezeigt werden, dass das FIT2-Konzept durch Hinzufügen eines hybridisie-rungsunempfindlichen Cyanin 7 Farbstoffs zu den Sonden dahingehend erweitert werden kann, dass eine ratiometrische Detektion der hybridisierten Sonde möglich ist und Hellig-keitsunterschiede aufgrund von lokalen Schwankungen der Sondenkonzentration bei der Bildgebung lebender Zellen korrigiert werden können. Mit diesen qFIT2-Sonden konnten Jurkat und CCRF-CEM T-Zellen in einem Mikroskopie-basierten Experiment unterschieden werden., The ability to detect and visualize nucleic acids in living organisms is crucial for under-standing cellular processes. For this purpose, the research group of Prof. Dr. Oliver Seitz has introduced fluorogenic forced intercalation (FIT) hybridization probes, which exploit the unique property of the cyanine dyes thiazole orange and quinoline blue to exhibit increased fluorescence when placed in the constrained environment of a nucleic acid du-plex formed between probe and specific target sequence. Although FIT probes demon-strate solid fluorescence enhancement and specificity, further improvement of their abso-lute brightness and signal-to-background ratio would be desirable. To achieve this, the present thesis investigated an approach that equips FIT probes with two identical fluorophores (FIT2 strategy). This should on the one hand increase probe brightness, while simultaneously reducing fluorescence in the single strand and when hy-bridized to mismatched RNA, through a combination of contact-mediated quenching and non-radiant energy transfer. Various probe lengths, dye-dye distances and positions were screened, and it could be confirmed that FIT2 probes have higher extinction coefficients, greater fluorescence enhancement and better selectivity than their mono-dye counter-parts. Moreover, they better retain their ability to discriminate match and mismatch tar-gets in viscous cell lysate. Finally, it was demonstrated that the FIT2 concept can be extended by adding a hybridiza-tion-insensitive Cyanine 7 dye to the probes, allowing ratiometric detection of hybridized probe and correction of brightness differences due to local fluctuations in probe concen-tration during live-cell imaging. Using these qFIT2 probes, Jurkat and CCRF-CEM T-cells could be distinguished in a microscopy-based experiment.

Fluoreszenzmarkierungstechniken für lebende Zellen ermöglichen es Biologen, einen Blick in eine komplexe biologische Umgebung zu werfen und Informationen über ein bestimmtes Ziel in einer nahezu natürlichen Umgebung zu erhalten. Dank der konzertierten Bemühungen der wissenschaftlichen Gemeinschaft gibt es eine Fülle von kommerziell erhältlichen, genetisch kodierbaren Markern und Reportern für die Fluoreszenzmikroskopie. Allerdings gibt es nur wenige Lebendzellmethoden, die eine direkte Konjugation von Nukleinsäuren mit Proteinen erlauben, obwohl es robuste DNA-Technologien gibt, die mit Oligo-Antikörper-Konjugaten auf Zelloberflächen durchgeführt werden. Ein weiterer, oft einschränkender Aspekt der Markierung ist die Fähigkeit, Ziele selektiv zu multiplexen. In dieser Studie wurde eine Methode der Tag-Probe-Markierung entwickelt, die eine selektive, gleichzeitige Markierung von zwei verschiedenen Zielen mit zwei Peptid-Nukleinsäure-Strängen (PNA) ermöglicht. Diese Methode verwendet ein Paar von Coiled-Coil-Peptiden, um die Konjugation einer PNA-Gruppe an ein Zielprotein zu steuern, das ein Peptid-Tag exprimiert. Die Verwendung orthogonaler Coiled-Coils ermöglicht Multiplexing. Die Markierung von synthetischen Tag-Peptiden, die mittels Flüssigchromatographie analysiert wurden, hat gezeigt, dass der orthogonale duale Transfer von PNA selektiv, quantitativ und schnell ist. Die PNA-Konjugation von exemplarischen Membranrezeptoren, gefolgt von der Hybridisierung mit komplementären Fluorophor-DNAs, ermöglichte eine unkomplizierte Visualisierung von dualen Rezeptoren in lebenden Zellen. Durch den Einsatz einfacher molekularer Hilfsmittel, die die Grundlage der DNA-Nanotechnologie bilden, konnte durch die Rekrutierung mehrerer DNAs eine zunehmend hellere Markierung erreicht werden und die löschbare Oberflächenmarkierung ermöglichte eine quantitative Untersuchung der Rezeptorinternalisierung., Live-cell fluorescent labelling techniques allow biologists to glimpse into a complex biological environment and derive information about a specific target in a near-native environment. Thanks to a concerted effort from the scientific community, a plethora of commercially available, genetically encodable tags and reporters for fluorescence microscopy exist. However, few live-cell methods allow direct conjugation of nucleic acids with proteins despite the robust DNA technologies carried out on cell surfaces using oligo-antibody conjugates. Another aspect of labelling which is often limiting is the ability to selectively multiplex targets. In this study, a method of tag–probe labelling was developed that accomplishes selective, simultaneous labelling of two distinct targets with two peptide nucleic acid (PNA) strands. The technique uses a pair of coiled-coil peptides to guide conjugation of a PNA group to a target protein expressing a peptide tag and using orthogonal coiled-coil enables multiplexing. Initially, the labelling of synthetic tag-peptides analysed by liquid chromatography revealed the orthogonal dual transfer of PNA to be selective, quantitative, and rapid. PNA conjugation of exemplar membrane receptors followed by hybridization with complementary fluorophore-DNAs achieved straightforward live-cell dual receptor visualization. Finally, using simple molecular tools that form the basis of DNA nanotechnology, recruitment of multiple DNAs facilitated progressively brighter labelling, and erasable surface labelling allowed quantitative study of receptor internalisation.

Die Verwendung von nukleinsäuretemplatgesteuerten Reaktionen stellt einen innovativen Ansatz zur Therapie von Krankheiten dar, deren Ursprung in einer genetischen Veränderung von Zellen liegt. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit erfolgte eine Weiterentwicklung der RNA-templatgesteuerten Acyltransferreaktion nach Seitz et al. hinsichtlich des Aufbaus von aromatischen Amidbindungen, wie sie in vielen niedermolekularen Wirkstoffen vorkommen. Als Modellverbindungen dienten die Bcr-Abl-Tyrosinkinaseinhibitoren Nilotinib, Ponatinib und GZD824, die durch zentrale Benzanilidmotive charakterisiert sind und zur Therapie der chronischen myeloischen Leukämie eingesetzt werden. Das konzipierte Reaktionssystem beruht auf dem Mechanismus der nativen chemischen Ligation, weswegen die Bcr-Abl-Inhibitoren durch die Einführung einer Thiolgruppe modifiziert werden mussten. Es wurde gezeigt, dass diese Modifikation in den meisten Fällen nur zu einer geringen Beeinträchtigung der biologischen Aktivität führt. Der RNA-templatgesteuerte Aufbau der Benzanilidstrukturen konnte sowohl mit PNA- als auch mit DNA-verknüpften Inhibitorfragmenten basierend auf Ponatinib und GZD824 erzielt werden. In Gegenwart eines komplementären RNA-Templats erfolgte die benachbarte Hybridisierung der reaktiven Konjugate, infolgedessen ein Benzoyltransfer von einem thioestermodifizierten Donor auf ein ortho-Mercaptoanilinderivat als Akzeptor stattfand. Mit PNA/PNA-Reaktionssystemen wurde auch in Abwesenheit des RNA-Templats eine signifikante Produktbildung beobachtet, was auf hydrophobe Wechselwirkungen der Konjugate zurückgeführt wurde. Unter Verwendung von DNA/DNA- bzw. PNA/DNA-Konjugatpaaren blieb die templatunabhängige Produktbildung hingegen ausreichend gering. Die entsprechenden Reaktionssysteme wurden hinsichtlich der erzielten Produktausbeuten optimiert, wobei sowohl die Linkerlänge bzw. -struktur der reaktiven Konjugate als auch die Templatarchitektur variiert wurde., The use of nucleic acid-templated reactions represents an innovative approach to the therapy of diseases that originate in genetic alterations of cells. In this work, the RNA-templated acyl transfer reaction invented by Seitz et al. was extended towards the formation of aromatic amide bonds which occur in a variety of small molecule drugs. The Bcr-Abl tyrosine kinase inhibitors nilotinib, ponatinib, and GZD824 were used as model compounds, as they are characterized by central benzanilide motifs and find application in the treatment of chronic myeloid leukemia. The designed reaction system is based on the mechanism of native chemical ligation which required the modification of the Bcr-Abl inhibitors by introducing a thiol group. It was shown that thiolation affected the biological activity only moderately. The RNA-templated formation of the benzanilide structures was achieved with both PNA- and DNA-linked inhibitor fragments of ponatinib and GZD824. The presence of a complementary RNA template enabled adjacent binding of the reactive conjugates, triggering a rapid benzoyl transfer from a thioester-linked donor to an ortho-mercaptoaniline derivative as an acceptor. With PNA/PNA reaction systems, significant product formation was observed in absence of the RNA template, which was attributed to hydrophobic interactions between the conjugates. However, the template-independent product formation remained low when DNA/DNA or PNA/DNA conjugate pairs were used. The product yields of the corresponding reaction systems were optimized by varying the linker length and structure of the conjugates as well as the template architecture.

Nukleinsäuretemplatkontrollierte Reaktionen, die häufig auf Ligations- oder Transferreaktionen basieren, unterliegen dem Effekt der Produktinhibierung. Dadurch können besonders niedrige Templatmengen nur schwer detektiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmalig eine grundlegend neue Kategorie templatkontrollierter Reaktionen etabliert werden: templatkontrollierte Spaltungsreaktionen. Dazu wurde ein spaltbarer Linker auf N-Alkylpicoliniumbasis (NAP) entwickelt, der mit einfachen, orthogonalen Konjugationsmethoden (SPAAC, Maleimid-Thiol-Konjugation oder via Amidbinungsknüpfung) sowohl in PNA- als auch in DNA-Strukturen inkludiert werden kann. Die Templat-vermittelte Photoreduktion induziert eine C-O-Bindungsspaltung des Linkers. Daraus resultieren Produkte, die eine geringere Templataffinität besitzen als das Edukt, sodass die Reaktion keiner Produktinhibierung unterliegt. Dies konnte zum Beispiel mittels Triplex-bildender, spaltbarer PNA-Sonden realisiert werden, die eine rasche Spaltungsgeschwindigkeit aufweisen. Hierzu bindet die spaltbare PNA-Sonde auf dem Templat benachbart zu einer mit einem Ruthenium(II)-Komplex modifizierten Assistenzsonde, die die Photoreduktion lichtkontrolliert induzieren kann. In einem alternativen Ansatz wurde die Fluorophor-induzierte Photolyse von NAP-Derivaten näher untersucht und führte letztlich zur Entwicklung eines selbst-spaltenden Molecular Beacons (iMB). Dieser verhält sich wie ein konventioneller iMB, wodurch eine neue Klasse an Molecular Beacons vorgestellt werden konnte. Die templatkontrollierte Photolyse konnte nicht nur in wässrigem Milieu, sondern auch in komplexen Umgebungen wie Zellkulturmedium, Zelllysat und RNA-Extrakt durchgeführt werden., Nucleic acid templated reactions, which are often based on ligation or transfer reactions, are limited by the phenomenon of product inhibition. As a result, the usage of catalytical amounts of target are up to date only applicable to a limited extend. In this work, a fundamentally new category of nucleic acid templated reactions could be established: nucleic acid templated cleavage reactions. For this purpose, a cleavable linker based on N-alkylpicolinium (NAP) was developed, which can be included in both PNA and DNA structures using simple, orthogonal conjugation methods (SPAAC, maleimide-thiol conjugation or via amide bond formation). A template-mediated photoreduction induces the C-O bond cleavage of the linker. The target affinity of the cleavage products is lower than the parental oligonucleotide prior to cleavage, hence providing a thermodynamical driving force for amplified nucleic acid detection. This could be realized, for example, using triplex-forming, cleavable PNA probes which have a fast cleavage rate. In a first approach various triplex-forming PNA probes were developed that would undergo a photo-reductive C-O-bond cleavage upon irradiation when placed on a template adjacent to an assistant probe equipped with a sensitizer (Ruthenium(II)-complex). In an alternative approach, the fluorophore-induced photolysis of NAP derivatives was investigated and ultimately led to the development of a self-immolative Molecular Beacon (iMB). The iMB behaves like a conventional MB, therefore a new class of Molecular Beacons was introduced. The template-controlled photolysis can be performed not only in aqueous environments, but also in various complex environments such as cell culture medium, cell lysate or RNA extract.

Im ersten Teil der Arbeit wurde die Verwendung von Präkursor microRNA-21(pre-miR21)-spezifischen Peptidnukleinsäure(PNA)-Sonden zur Inhibierung der Dicer-vermittelnden miRNA-Reifung untersucht. Im Gegensatz zur Arbeitshypothese wurde bei der Behandlung von Zellen mit den pre-miR21-spezifischen PNA-Sonden jedoch keine Änderung des miR-21 Niveau beobachtet. Um die Hybridisierung der Sonde an die Zielsequenz nachzuweisen, wurden fluorogene Hybridisierungssonden zur erzwungenen Interkalation (FIT-Sonden), unter Verwendung des Interkalationsfarbstoffes Thiazolorange (TO), entwickelt. Wie vorläufige Ergebnisse zeigen, könnte die TO-PNA Sonde für die Unterscheidung von Zellen mit hohem miR-21-Gehalt nützlich sein, aber eine weitere Verbesserung der Sonde ist noch erforderlich. Im nächsten Teil der Arbeit wurden neuartige FIT-Sonden für die Analyse der Dicer-vermittelnden miR-21-Reifung entwickelt. Um die gleichzeitige Detektion der entstehenden pre-miR21 und der antisense miR-21 (as-miR21) in Echtzeit zu ermöglichen, wurden die Verwendung von spektral unterscheidbaren FIT-Sonden auf Quinolinblau(QB)-und TO-Basis getestet. Das entwickelte Sonden-Paar ermöglichte die Analyse der rhDicer-Reaktion. Dabei wurde entdeckt, dass die rhDicer-Reaktion an der in vitro transkribierten pre-miR21 unspezifisch spaltet. Zusätzlich wies die kürze as-miR21 spezifische TO-Sonde (7nt) eine Sensitivität gegenüber der Anwesenheit des Ago-2 Proteins auf. In der Zukunft könnten die entwickelten Sonden für schnelle in vitro Screenings neuer Dicer-und Ago-2-Inhibitoren angewendet werden. Im zweiten Teil der Dissertation wurde die Verwendung von niedermolekularen Inhibitoren (small molecular inhibitors, SMIs) getestet. Zusammenfassend könnten die zwei identifizierten SMIs für die Inhibierung der miR-122-Reifung genutzt werden, allerdings bleibt die Spezifität der SMIs fraglich und mögliche off-target-Effekte können nicht ausgeschlossen werden. MicroRNAs (miRNAs) represent small non-coding RNA molecules that mostly negatively regulate gene expression. To yield mature miRNAs, primary miRNA precursors go through two consequent cleavages by Drosha and Dicer RNAse. This work describes the development of tools for inhibition und monitoring the dicer-mediated miRNA processing. Here, peptide nucleic acid (PNA) based probes, targeting the precursor miR-21 (pre-miR21), were designed for inhibition the dicer-mediated miR-21 maturation. In contrast, no change in miR-21 level was observed after cell treatment with the pre-miR21 specific PNA probes. To detect the probe/target hybridization state, the fluorogenic forced intercalation (FIT) PNA probes, bearing thiazole orange dye (TO), were developed. As preliminary results show, the FIT PNA probe might be useful for discrimination of high miR-21 abundant cells, but further probe improvement is still required. To monitor the pre-miR21 cleavage, the combination of the two spectrally distinguishable FIT PNA probes, bearing quinoline blue (QB) and TO fluorophore, was developed to allow the rapid and simultaneous detection of pre-miR21 and antisense mature miR-21 (as-miR21). The probe set was successfully used for detection of the modelled dicer reaction. However, the monitoring of rhDicer reaction have revealed that rhDicer cleaves the in vitro transcribed pre-miR21 nonspecifically. Additionally, the short as-miR21 specific TO PNA probe (7nt) was responsive to the presence of Ago-2 protein. In future, the developed probes can be applied for the fast in vitro screening of new Dicer and Ago-2 inhibitors. In the second part of this work, an alternative approach, small molecular inhibitors (SMIs), was tested. Two identified pre-miR122-targeting SMIs might be used for inhibition of the miR-122 maturation, although, a specificity of these SMIs remains questionable and possible off target effects cannot be excluded.

Exploration of secondary metabolites produced by insect pathogenic bacteria has emerged as a successful strategy to identify novel bioactive chemical entities and to shed light on ecology and evolution of bacterial defensive mechanisms. The paenilamicins are a group of four complex secondary metabolites produced by the honey bee brood pathogen Paenibacillus larvae – a causative agent of the worldwide spread devastating American Foulbrood disease. Structurally paenilamicins are linear polycationic polyketide-peptide hybrids bearing unusual hydroxylated and N-methylated building blocks, as well as D-amino acids and a polyamine moiety. The paenilamicins show antibacterial and antifungal activities while not affecting the mortality of bee larvae and only influencing the time course of the disease, which led to the hypothesis that the main function of paenilamicin is to outcompete ecological niche competitors of Paenibacillus larvae in the honey bee larval gut. The first identification and characterization of paenilamicins was accomplished by SÜSSMUTH et al. employing chromatography methods and NMR spectroscopy. Since then, continuous efforts towards the total synthesis of paenilamicin have been being made, finally resulting in two stereoisomers which showed no identity to the natural product. This doctoral thesis aimed to achieve the final total synthesis of the correct stereoisomer of paenilamicin B2, motivated by the fact that the total synthesis is a powerful tool for an unambiguous structural confirmation and is crucial for sufficient supply for exploring biological functions and understanding structure-activity relations. As continuation of previous efforts towards the total synthesis of paenilamicins in our group, this work shows the synthesis of the all necessary non-proteinogenic amino acid building blocks, their assembly to the final correct stereoisomer of paenilamicin B2 and revision of the originally reported structure. Special attention is paid to the synthesis of the correct isomers of galantinic acid (Gla) and agmatinamic acid (Aga) fragments. Sufficient supply of paenilamicins enabled further evaluation of their biological activities. These studies revealed the N-terminal fragment of paenilamicin as an important pharmacophore for antimicrobial activity and for mediating the self-resistance in the producer organism P . larvae. Additional in vivo experiments of paenilamicins corroborate their role of an agent to control the number of bacterial competitors. Finally, the data is shown that classifies paenilamicins as potential ribosome inhibitors., Die Erforschung von Sekundärmetaboliten, die von insektenpathogenen Bakterien produziert werden, hat sich als erfolgreiche Strategie zur Identifizierung neuer bioaktiver chemischer Einheiten und zur Aufklärung der Ökologie bakterieller Abwehrmechanismen erwiesen. Paenilamicine sind eine Gruppe von vier komplexen Sekundärmetaboliten, die vom Honigbienenbrutpathogen Paenibacillus larvae produziert werden – einem Erreger der weltweit verbreiteten verheerenden Bienenkrankheit Amerikanische Faulbrut. Strukturell sind Paenilamicine lineare polykationische Polyketid-Peptid-Hybride, die ungewöhnliche hydroxylierte und N-methylierte Bausteine, D-Aminosäuren sowie eine Polyamineinheit tragen. Paenilamicine wirken antibakteriell und antimykotisch ohne sich direkt auf die Mortalität der Bienenlarven auszuwirken. Sie beeinflussen stattdessen den zeitlichen Verlauf der Krankheit, was zur Hypothese führte, dass die Hauptfunktion von Paenilamicinen in der Bekämpfung ökologischer Nischenkonkurrenten von Paenibacillus larve im Honigbienenlarvendarm besteht. Die erste Identifizierung und Charakterisierung von Paenilamicinen gelang SÜSSMUTH et al. unter Einsatz von chromatographischen Methoden und NMR-Spektroskopie. Seitdem wurden kontinuierliche Anstrengungen zur Totalsynthese von Paenilamicin unternommen, was zur Synthese von zwei Stereoisomeren führte, die mit dem Naturstoff nicht identisch waren. Das Ziel dieser Dissertation ist es die abschließende T otalsynthese des korrekten Stereoisomers von Paenilamicin B2 zu erreichen, motiviert durch die Tatsache, dass die chemische Totalsynthese von Naturstoffen einerseits ein mächtiges Werkzeug zur eindeutigen Strukturaufklärung ist und andererseits zur Bereitstellung ausreichender Stoffmengen für die Erforschung ihrer biologischen Funktion und zum Aufklärung ihrer Struktur-Aktivitäts- Beziehungen dient. Als Fortsetzung der systematischen Anstrengungen zur Totalsynthese von Paenilamicin in unserem Arbeitskreis zeigt diese Doktorarbeit den Weg zur Synthese aller notwendigen nicht- proteinogenen Aminosäurebausteine, deren Zusammenbau zum korrekten Stereoisomer von Paenilamicin B2, sowie die Revision der ursprünglich berichteten Struktur. Besonderes Augenmerk wird auf die Synthese der korrekten Stereoisomere von Galantinsäure (Gla) und Agmatinamsäure (Aga) gelegt. Ein ausreichender Nachschub mit Paenilamicin ermöglichte weitere Bewertungen ihrer biologischen Aktivitäten. Diese Studien zeigten, dass das N- terminale Fragment von Paenilamicin einen wichtigen Pharmakophor für die antimikrobielle Aktivität und für die Vermittlung der Selbstresistenz im Produzentenorganismus P. larvae darstellt. Zusätzliche in vivo Experimente von Paenilamicine bestätigen seine Rolle als ein Wirkstoff zur Kontrolle der Anzahl bakterieller Konkurrenten. Schließlich werden die ersten Daten gezeigt, die Paenilamicine als potentielle Ribosomeninhibitoren einstufen.

In dieser Arbeit wurde eine neue Templat-gesteuerte fluorogene Peptidverknüpfung vorgestellt. Speziell modifizierte Peptidfragmente wurden durch die Bindung an ein Templatmolekül zu einer chemischen Reaktion befähigt, wodurch ein Fluoreszenzsignal erzeugt werden konnte. Das erlaubte eine Reaktionskontrolle in Echtzeit. Die fluorogene Peptidverknüpfung konnte erfolgreich mit einem Coiled-coil Peptid-Model etabliert werden. Dabei wurden Peptidthioester derart modifiziert, dass in räumlicher Nähe zur Thioestergruppe ein Fluorophor platziert wurde und die acetylierte Mercaptogruppe als Fluoreszenzlöscher agierte. Die modifizierten Thioester können nach dem Reaktionsmechanismus der nativen chemischen Peptidverknüpfung (NCL) unter der Bildung einer Amidbindung mit N-terminalen Cysteinylpeptiden reagieren. Die fluoreszenzlöschende Mercaptogruppe verlässt dabei den Peptidthioester als Nukleofug, wodurch ein fluoreszierendes Reaktionsprodukt entsteht. Die Templat-gesteuerte Durchführung dieser fluorogenen nativen chemischen Peptidverknüpfung (fNCL) erlaubte die Reaktionsdurchführung bei sehr geringen Peptidkonzentrationen. Die Synthese der benötigten fluorogenen Thioester gelang zum einem durch die Anwendung der selbstreinigenden Thioestersynthese mit einer Tandem-Entschützungs-Kupplungs-Strategie und zum Anderen mit Hilfe eines synthetisierten fluorogenen Azid-Thioesterbausteins, welches mit einem Alkin-modifizierten Peptid zur Reaktion gebracht wurde. Neben Coiled-coil Peptiden, wurden auch doppelsträngige DNA und Antikörper als Template für die fNCL eingesetzt. Die fNCL konnte zur Durchführung eines Abstandsscreenings angewendet werden. Es wurde eine Abhängigkeit zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und dem Abstand der Bindungsstellen im Templat für zwei reaktive Peptidbindungspartner gezeigt. Durch diese Untersuchung konnte die räumliche Abstandsgrenze zwischen zwei Bindungsstellen in einem Templatmolekül bestimmt werden, die keinen Templat-Effekt mehr beobachten lässt., In this thesis a new template-controlled fluorogenic peptide linkage was presented. Specially modified peptide fragments were enabled to undergo a chemical reaction by binding to a template molecule, which resulted in a fluorescent signal. This allowed a reaction control in real time. The fluorogenic peptide linkage was successfully established using a coiled coil peptide model. Peptide thioesters were modified in such a way that a fluorophore was placed in close proximity to the thioester group and the acetylated mercapto group acted as fluorescence quencher. These modified thioesters can react with N-terminal cysteinyl peptides according to the reaction mechanism of the native chemical ligation (NCL) under the formation of an petide bond. The fluorescence-quenching mercapto group leaves the peptide thioester as a leaving group, resulting in a fluorescent reaction product. Template-controlled execution of this fluorogenic native chemical ligation (fNCL) allowed the reaction to be performed at very low peptide concentrations. The synthesis of the required fluorogenic thioesters was achieved on the one hand by applying a self-purifying thioester synthesis with a tandem-protective coupling strategy and on the other hand by using a synthesized fluorogenic azide thioester building block which was reacted with an alkine-modified peptide. In addition to the coiled coil peptides, double-stranded DNA and antibodies were used as templates for fNCL. Finally, the fNCL could be used to perform a distance screening. A dependence between the reaction rate and the distance between the binding sites in the template for two reactive peptide binding partners was shown. By this investigation a distance between two binding sites in a template molecule could be determined, which does not show a template effect anymore.

Aufgrund der Fähigkeit von Langerhans Zellen, welche den C-Typ Lektin (CTL) Rezeptor Langerin exprimieren, Antigene zu internalisieren und T-Zellen zu präsentieren, wurde Langerin als attraktives Ziel für neue Immunotherapien erkannt. Langerin kann Pathogene wie z.B. Viren erkennen, die zur Erhöhung der Avidität Kohlenhydratliganden multivalent präsentieren, da die monovalenten Kohlenhydratliganden nur niedrige Affinitäten für Langerin aufweisen. Die natürlichen monovalenten Kohlenhydratliganden besitzen nur niedrige Affinitäten für Langerin. Inspiriert durch die Natur stellt Multivalenz eine Strategie zur Überwindung der schwachen CTL-Kohlenhydrat-Wechselwirkung dar. Im Gegensatz zur hochmultivalenten Präsentation von Liganden mit undefinierter Anordnung hat sich diese Arbeit zum Ziel gesetzt auch die Ökonomie der Liganden zu optimieren, indem Liganden auf einer DNA Gerüststruktur so präsentiert wurden, dass sie die Distanz zwischen den Bindungstaschen des Homotrimers Langerin wiederspiegeln. Eine Untersuchung der relevanten multivalenten Bindungsmechanismen führte zu einer Anordnung der Liganden, die sowohl statistisches Rebinding als auch den Chelate Effekt einbezog. Der Rebinding Effekt wurde als Mittel erkannt, dass nicht nur die Avidität des Liganden an einer Bindungstasche erhöht, sondern auch ausgenutzt werden kann, um den Chelate Effekt zu amplifizieren. Diese Methode stellt eine Möglichkeit dar niedrige oder nicht vorhandene Multivalenzeffekte bei der bivalenten Präsentation von Liganden zu überwinden, wenn hochaffine Liganden nicht zur Verfügung stehen. Eine Kombination dieser Strategie mit der Entwicklung eines neuen selektiven Liganden für Langerin führte zu dem stärksten bekannten Langerinbinder (IC50 = 300 nM). Die Ligand-PNA-DNA Konstrukte wurden selektiv von Langerin exprimierenden Zellen bei nanomolaren Konzentrationen internalisiert und stellen ein System dar, welches in Zukunft für den Transport von Beladungen Anwendung finden könnte., Targeting the C-type lectin (CTL) langerin has received increasing attention as a novel immunotherapy strategy due to the capacity of Langerhans cells, which express langerin, to endocytose and cross-present antigens to T-cells. Langerin recognizes pathogens such as viruses, which present carbohydrates in a multivalent fashion to increase avidity as the monovalent carbohydrate ligands only display low affinity for langerin. Inspired by nature, multivalency has therefore been a key tool for overcoming the low affinities of CTL-carbohydrate interactions. In contrast to highly multivalent ligand presentation with undefined arrangements this work strove to optimize ligand economy by designing bivalent ligands that take the distance between the binding sites of the homotrimeric langerin into consideration by precise arrangement of ligands on DNA-based scaffolds. Studying the multivalent mechanisms at work led us to the design of ligands that take both statistical rebinding and the chelate effect into account. The rebinding effect was recognized as a tool that not only increases ligand avidity at a single binding site but in addition can be exploited to amplify the chelate effect. This method provides a solution for overcoming the low or non-existing multivalency effects when bivalently presenting low affinity ligands on a rigid scaffold if high affinity ligands are unavailable. A combination of this arrangement strategy with the development of a first langerin selective glycomimetic ligand led to the most potent molecularly defined langerin binder to date (IC50 = 300 nM). The ligand-PNA-DNA constructs were selectively internalized by langerin expressing cells at nanomolar concentrations and constitute a delivery platform for the future transport of cargo to Langerhans cells.

Das Prinzip der Multivalenz ist in der Natur allgegenwärtig, welches auch von Influenza-Viren genutzt wird, um über ihre Oberflächenproteine an epitheliale Wirtszellen zu binden. Diese Interaktion bietet einen interessanten Ansatzpunkt für multivalente Inhibitoren, wenn es gelingt, die Bedingungen für eine effiziente Wechselwirkung mit dem Virus zu entschlüsseln. Hierzu wurde in dieser Arbeit eine Charakterisierung des Hämagglutinin-Trimers (HA) auf viralen Partikeln mittels Kohlenhydrat-Nukleinsäuregerüsten und Kohlenhydrat-Polyethylenglykol (PEG)-Gerüsten vorgenommen. Distanz-Affinitäts-Beziehungen für die Interaktion des trimeren HA mit den bivalenten Präsentationen des Sialyl-LacNAc zeigten, dass bivalente PEG-Konjugate nicht in der Lage sind, eine bivalente Verstärkung der Wechselwirkungen mit der löslichen HA-Ektodomäne oder mit HA auf der viralen Oberfläche herbeizuführen, wobei die räumliche Rasterung mit PNA∙DNA-Gerüsten eine bimodale Distanz-Affinitäts-Beziehung ergab. Ein Affinitätsmaximum in einem Abstand von 52 - 59 Å wurde einer simultanen Bindung an zwei kanonische Bindungsstellen eines HA-Trimers zugeordnet, wobei ein zweites Affinitätsmaximum bei 26 Å auf die Existenz einer sekundären Bindungsstelle hindeutet. In dieser Arbeit wurde erstmals die multivalente Präsentation von Glykoliganden auf langen repetitiven DNA-Templaten demonstriert. Es wurden Nukleinsäure-Komplexe erhalten die eine vollständige Inhibierung der Virus-induzierten Hämagglutination bei einer Konzentration von 10^(-9) M des Templats erzielten, was einer 10^7-fachen Verstärkung bezogen auf den monovalenten Zucker entspricht. Neben einer hochpotenten Inhibition offenbarten distanzoptimierte bivalente und multivalente Binder auf Nukleinsäuregerüsten auch subtypspezifische Inhibition. The principle of multivalency is omnipresent in nature, which is also used by influenza viruses to bind to epithelial host cells via their surface proteins. This interaction offers an interesting starting point for multivalent inhibitors if the conditions for an efficient interaction with the virus can be deciphered. For this purpose, the hemagglutinin trimer (HA) on viral particles was characterized using carbohydrate-nucleic acid scaffolds and carbohydrate-polyethylene glycol (PEG) scaffolds. Distance-affinity relationships for the interaction of the trimeric HA with the bivalent presentations of the sialyl-LacNAc showed that bivalent PEG conjugates are not capable of a bivalent enhancement of the interactions with the soluble HA ectodomain or with HA on the viral surface, whereby the spatial screening with PNA∙DNA scaffolds resulted in a bimodal distance-affinity relationship. An affinity maximum at a distance of 52 - 59 Å was assigned to simultaneous binding to two canonical binding sites of an HA trimer, with a second affinity maximum at 26 Å indicating the existence of a secondary binding site. In this work the multivalent presentation of carbohydrate ligands on long repetitive DNA templates was demonstrated for the first time. Nucleic acid complexes were obtained which achieved a full inhibition of the virus-induced hemagglutination at a concentration of 10^(-9) M of the template, which corresponds to a 10^7-fold increase in relation to the monovalent sugar. In addition to a highly potent inhibition, distance-optimized bivalent and multivalent binders on nucleic acid structures also revealed subtype-specific inhibition.

In dieser Arbeit wurden die von Seitz et al. entwickelten forced intercalation (FIT)-Sonden zur mRNA-Charakterisierung in lebenden Zellen eingesetzt. Es erfolgte die Synthese verbesserter FIT-Sonden für die systematische Untersuchung der Aufnahme durch lebende Flp-In™ 293 T-REx™-Zellen. Dafür wurden sowohl hergestellte FIT-Sonden-Konjugate/Aggregate als auch kommerziell erhältliche Reagenzien, wie z.B. die Palmitinsäure und das porenbildende Enzym Streptolysin-O auf ihre Effizienz untersucht. Die optimalen Bedingungen für das Einbringen von DNA- und PNA-FIT-Sonden in Flp-In™ 293 T-REx™-Zellen lieferte das Enzym Streptolysin-O. Durch den simultanen Einsatz von drei unterschiedlichen Sonden (BO-, TO- und CB-markiert), komplementär zu drei verschiedenen Zielsequenzen, gelang es erstmals eine Dreifarben-Lebendzell-Bildgebung mit FIT-Sonden durchzuführen. Des Weiteren wurden TO-FIT-Sonden zur Unterscheidung verschiedener T-Zelllinien eingesetzt. Mithilfe eines kompetitiven Hybridisierungsexperiments konnte die spezifische Fluoreszenzemission der Sonden in den Zellen belegt werden. Untersuchungen mit zwei T-Zelllinien zeigten, dass TO-FIT-Sonden sowie terminal Cy7-markierte TO-FIT-Sonden eine erhöhte TO-Emission bei Vorhandensein der komplementären TCR-mRNA-Zielsequenz in den Zellen aufwiesen. Der terminale Cy7-Farbstoff bot mit einem zweiten Detektionskanal die Möglichkeit die Cy7-Intensität und die vorhandene TO-Intensität ins Verhältnis zu setzen, sodass Signale von ungebundener Sonde leichter ausgeschlossen werden konnten. Dies ermöglichte eine spezifische Markierung der T-Zellen. Es folgte die Synthese CB-markierter FIT-Sonden zur Aufklärung biologischer Fragestellungen, wie dem Verlauf einer Influenza A Infektion und die Synthese und Evaluation neuer Farbstoffe mit einem Absorptionsmaximum bei 590/596 nm. Zudem wurde der Einbau eines zyklischen PNA- Monomers bezüglich der Verbesserung von Responsivität und Helligkeit von PNA-FIT-Sonden analysiert., In this work forced Intercalation (FIT) probes, developed by Seitz et al. were used for the mRNA characterization in living cells. The synthesis of improved FIT probes as well as the systematic study on the uptake of FIT probes by living Flp-In™ 293 T-REx™ cells was performed. Therefore FIT probe conjugates/aggregates as well as commercially available reagents, e.g. palmitic acid and the pore-forming enzyme Streptolysin-O were investigated under various conditions. Furthermore, the transfection was tested using an electroporator. The optimal transfection condition for the introduction of DNA and PNA FIT probes into Flp-In™ 293 T-REx™ cells was achieved using Streptolysin-O. Multicolor live cell imaging with the simultaneous use of three different FIT probes (BO, TO and QB) against three different target sequences was performed successfully. In addition, FIT probes were used for the differentiation between T cell lines. A competitive hybridization experiment with cells confirmed the specific fluorescence emission of the probes. Further studies with two cell lines and TO-FIT probes as well as terminal Cy7-labeled TO-FIT probes showed an increased TO emission in the presence of the complementary TCR mRNA target sequence in the cells. A second detection channel of the terminal Cy7 dye provided the advantage of comparing the Cy7- and TO-intensity ratio, thereby making it easier to exclude signals from unbound probe. This enabled the specific tagging of t cells. This was followed by the synthesis of QB-DNA-based FIT probes for the use in various biological applications e.g. as a pan selective marker for Influenza A infection. Moreover, the synthesis and evaluation of new dyes with an absorption maximum at 590/596 nm was performed. The incorporation of a cyclic PNA monomer next to the TO dye has also been realized to improve responsiveness and brightness in PNA-FIT probes.

In den letzten Jahren gab es rasche Weiterentwicklungen auf dem Gebiet der Nukleinsäure-Erkennung. Von microRNA-Quantifizierung zur Untersuchung von Zelltods, --Teilung und -Regulation bis zur Bewertung genetischer Variabilität in Hinblick auf Krankheitsentstehung und -Behandlung: Die Analyse von Nukleinsäuren wird in der zukünftigen Medizin eine zentrale Rolle zukommen. Vor allem die Erkennung von SNPs als Hauptquelle der genetischen Vielfalt, aber aus Analysesicht auch eine der herausforderndsten Mutationen, stellt in dieser Hinsicht einen wesentlichen Aspekt dar. Methoden zur SNP-Erkennung müssen nicht nur sensibel, selektiv und stabil, sondern auch vielfältig sein und eine der wachsenden Analyseanzahl gerecht werdende hohe Verarbeitungsmenge bieten. Im Rahmendieser Arbeit wurde ein chemisches Prüfverfahren zur Erkennung von Nukleinsäuren und Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) entwickelt. Das Reaktionssystem zur Nukleinsäuren- Erkennung beruht hierbeiauf der Interaktion zweier modifizierter Peptid-Nukleinsäure (PNS) Oligonukleotiden. Das Erste beinhaltet einen C-terminalen Thioester (Donor-Sonde), die zweite einen N-terminalen Cysteinyl-Rest (Akzeptor-Sonde). Zusätzlich ist die Donor-Sonde durch einenmakrocyclischen Metall Chelatkomplex aus 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure(DOTA) mit einem gebundenen lanthanoid-tag funktionalisiert. In die Akzeptor-Sonde wurde, zurReinigung mit magnetischen Streptavidin Partikeln, Biotin integriert. Der Ziel-DNA-Strang bringt beideSonden in räumliche Nähe zueinander und ermöglicht so eine chemische Reaktion. Das so gewonneneLigationsprodukt beinhaltet den Lanthanoid-Tag und Biotin, über welches das Produkt gereinigt wird,bevor die Detektion mittels ICP-MS erfolgt. Die Lanthanoid Konzentration dient als Indikator desLigationsprodukts welches wiederum den Reporter des Ziel-DNS-Strangs darstellt. Die, mithilfe diesesSystems erreichte, methodische Nachweisgrenze lag bei 29 pM mit einem RSD von 6,8% bei 50 pM(n=5). Zur Erkennung von SNPs wurde das Experiment mit einer Kombination zweier-Sets PNS Sonden mit unterschiedlichen Lanthanoid Tags durchgeführt. Das erste Set zielte auf die SNP beinhaltende Sequenz (Reportersystem) ab, während das zweite an eine benachbarte Sequenz (Kontrollsystem) binden sollte. Zur Erkennung der SNP wurden die Signale bei der Lanthanoide wurden ins Verhältnis gesetzt. Mithilfe dieses Verfahrens konnte durch Messung von sechs Lanthaniden bei einer Konzentration von 5 nM erfolgreich simultan zwischen den Allelen dreier SNPs unterschieden werden. The field of nucleic acid detection has evolved swiftly in recent years. From quantification of micro RNA for the study of cell death, proliferation, and regulation, to the assessment of the influence of genetic variability towards disease development and treatment, the analysis of nucleic acids will play a central role in future medicine. In that regard, the detection of SNPs, as the primary source of genetic variability and the most challenging mutation from the analytical point of view, will be at the forefront of the discussion. Methods for the detection of SNPs not only require sensitivity, selectivity and robustness, but they should also allow multiplexing and offer high throughput in order to face the growing analysis demand In this work an assay for the detection of nucleic acids and single nucleotide polymorphisms (SNPs) was developed. The reaction system for the detection of nucleic acids is based on the interaction between two modified peptide nucleic acid (PNA) oligonucleotides. The first incorporated a C-terminal thioester (donor probe), and the second one a N-terminal cysteinyl residue (acceptor probe). In addition, the donor probe is functionalized with a metal-tag, which consist of a macrocyclic metal chelate complex of 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) with a chelated lanthanoide. A biotin tag for purification by streptavidin magnetic particles was incorporated in the acceptor probe. The target DNA strand brings together the reporter probes allowing the chemical reaction. The resulting ligation product contains the metal-tag and the biotin, which is used to purify the product before measurement in the ICP-MS system. The lanthanoid concentration is used as an indicator of the ligation product, which at the same time serves as reporter of the target template. The methodological limit of detection achieved with this system was 29 pM with RSD of 6.8% at 50 pM (n=5). Detection of SNPs was performed using a combination of two sets of PNA probes labeled with different lanthanoid metal tags. The first probe set targeted the sequence where the SNP was present (reporter probe system), while the second set of probes was designed to bind to a neighboring sequence (control probe system). The signals of both lanthanides were used to establish a ratio that allowed the detection of the SNP. This assay was successfully used to simultaneously differentiate between alleles of 3 SNPs by measuring six lanthanoids at 5 nM concentration.

Multivalente Wechselwirkungen spielen sowohl in der Natur als auch für die Konstruktion hochaffiner Binder eine wichtige Rolle. In dieser Arbeit wurde die Grenze der Bivalenz in Bezug auf den Bindungsabstand, die monovalente Interaktionsstärke und die Flexibiltät des Gerüsts untersucht. Die Modifizierung von DNA mit Cucurbit[7]uril und zwei verschiedenen Adamantananaloga (Ad1 und Ad2) sowie die Verwendung verschiedener Template, ermöglichte die Konstruktion diverser bivalenter Modellsysteme. Die Ergebnisse zeigten eine Distanzabhängigkeit des bivalenten Effekts, der mit dem Bindungsabstand abnahm. Im Gegensatz zum schwächeren Binder (Ad2), war der stärkere Binder (Ad1) in der Lage auch noch bei großen Abständen von einer bivalenten Verstärkung zu profitieren. Somit besteht eine Abhängigkeit des bivalenten Effekts von der monovalenten Bindungsstärke. Mit diesem System wurde anschließend untersucht, unter welchen Bedingungen bivalente Systeme multimolekulare Strukturen ausbilden. Es konnte gezeigt werden, dass verbrückende Strukturen nur bei hohen Konzentrationen und bei Abwesenheit eines bivalenten Effekts vorliegen können. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein bispezifischer Binder auf seine Affinität, Selektivität und auf seinen Einfluss auf die Rezeptoraktivität untersucht. Dafür wurden Oligonukleotide mit Cilengitid, welches αvβ3-Integrin binden kann, und mit einem Peptoid, welches VEGFR2 binden kann, modifiziert. Durch Verwendung verschiedener Template konnten bispezifische Binder mit unterschiedlichen Ligandenabständen konstruiert werden. Messungen an HUVEC-Zellen ergaben eine höhere Affinität der bispezifischen Binder im Vergleich zu den monospezifischen. ELISA-Messungen ergaben eine distanzabhängige Aktivierung oder Deaktivierung der Phosphorylierung von VEGFR2. Es konnte somit ein Modellsystem konstruiert werden, mit dem die Rezeptoraktivität gesteuert werden konnte. Multivalent interactions play an important role in nature and are also used to construct high-affinity binders. In this work the limit of bivalency based on binding distance, flexibility of the system and monovalent binding-strength was investigated. Modification of DNA with Cucurbit[7]uril (CB[7]) and two adamantane-analogues (Ad1 and Ad2), along with the use of different templates, enabled the construction of diverse bivalent model-systems. The results revealed a distance-dependency of the bivalent effect, which decreased with increasing binding distance. The stronger binder (Ad1) was able to benefit from bivalent enhancement at relatively large binding distances compared to the weaker binder (Ad2). This denotes a dependency of the bivalent effect on the monovalent binding strength. The same system was used to investigate the factors leading to crosslinking. The results show that only at high concentrations, and when the system does not have to compete with a bivalent enhancement, can multimolecular structures be formed. The second part of this work deals with a bispecific binder. Binding affinities, selectivity and the impact of the binder on receptor activity were tested. Accordingly, oligonucleotides were modified with cilengitide, which is able to bind αvβ3-Integrin, and with a bivalent peptoid, which binds to VEGFR2. The use of different DNA templates enabled construction of several bispecific binders with different binding distances. Measurements with HUVEC cells revealed higher affinities of the bispecific binders compared to the monospecific ones. ELISA-measurements demonstrated that activation or deactivation of the VEGFR2-phosphorylation was distance dependent. Consequently, a model system was constructed which was able to control receptor activity.

Die Detektion von Nukleinsäuren ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Erkennung von viralen und bakteriellen Spezies in biologischen Proben. Oligonukleotid-vermittelte Reaktionen (OVR), die die Zielsequenz als Katalysator der chemischen Reaktion zwischen reaktiven Sonden verwenden, bieten gegenüber den enzymatischen Methoden viele Vorteile, wie z.B. Simplizität und Kosteneffizienz. Normalerweise besitzt das Produkt der OVR deutliche fluoreszierende Eigenschaften, die durch Fluoreszenzspektroskopie gemessen werden können. Die Haupteinschränkung solcher Systeme ist die nur moderate Helligkeit von organischen Farbstoffen, die meistens zur Markierung von reaktiven Sonden genutzt werden. Um dieses Problem zu lösen, sind Fluorophore mit höherer Helligkeit erforderlich. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung einer Methode zur Detektion von RNA durch Templat-vermittelten Transfer des Fluorophors auf den Quantum Dot (QD). Das System besteht aus zwei reaktiven Peptide Nucleic Acid (PNA)-basierten Antisense-Sonden. Die Label Akzeptor PNA (LAPNA) Sonde ist auf dem QD immobilisiert und enthält eine Cysteineinheit am N-terminus. Die Label Donor PNA (LDPNA) Sonde trägt eine Cy5-Einheit, die als Thioester gebunden ist. Durch die benachbarte Hybridisierung der Sonden am RNA-Templat nimmt die effektive Molarität der reaktiven Gruppen zu, und führt somit durch das Prinzip von Native Chemical Ligation zum Transfer des Cy5 auf den QD. Dies resultiert in Förster−Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen dem QD und den Cy5-Molekülen, der durch die Löschung der Emission des QDs sowie die Verstärkung der Fluoreszenz des Cy5 beobachtet werden kann. Die Verwendung von sehr hellen QDs als FRET-Donor ermöglicht die Umsetzung von Sonden bei geringen Konzentrationen und ermöglicht die Erkennung von RNA mit Nachweisgrenzen im Bereich von weniger pikomolar. Detection of nucleic acids is one of the most reliable methods for the identification of bacterial and viral species in biological samples. Oligonucleotide-templated reactions (OTRs) that exploit an RNA or DNA target to catalyze a chemical reaction hold great promise for the development of enzyme-free and low-cost detection schemes. Commonly, these strategies rely on organic dyes and are designed so that the product of OTR exhibits distinct fluorogenic properties. The main constraint of such schemes is the moderate brightness of organic fluorophores, which limits the read-out when the probes are used at low concentrations. To tackle this obstacle, significantly brighter fluorophores are needed. This work describes the development of an RNA detection scheme that relies on target-templated fluorophore transfer onto a semiconductor quantum dot (QD). The approach uses two reactive peptide nucleic acid (PNA) antisense probes. Label acceptor peptide nucleic acid (LAPNA) probe is immobilized on a QD and bears a cysteine at the N-terminus; label donor peptide nucleic acid (LDPNA) probe is equipped with a Cy5 dye, attached as a thioester. The adjacent annealing of these recognition elements following binding to target RNA triggers the transfer of Cy5 onto a QD in a native chemical ligation manner. This leads to a detectable fluorescence signal brought about by FRET from QD to the Cy5. The use of unprecedentedly bright QDs that can act as FRET donors for several Cy5 functionalities allows application of probes at very low concentrations (pM range) and achieves enhanced sensitivity of target-templated RNA detection. The method enabled RNA detection in the low pM range using a conventional microtiter plate reader.

Nukleinsäuren und Peptide erlauben es, Kontrolle über molekulare Prozesse auszuüben. In dieser Arbeit werden strukturgebende Elemente wie Coiled-Coil-Peptide oder PNA∙DNA-Strukturen genutzt, um Rezeptoren auf lebenden Zellen zu markieren und in ihrem Verhalten zu modulieren, oder cytosolische Proteine in ihrem Bindungsverhalten zu steuern. Im ersten Konzept wird die Interaktion des Coiled-Coil-Paars K3/E3 genutzt, um eine Transferreaktion, in welcher eine PNA-Sequenz vom K3-Donor auf den E3-Akzeptor übertragen wird, zu induzieren. Durch die Fusion des Akzeptorpeptids mit einem Rezeptor werden kovalente PNA-Rezeptorkonjugate auf der Oberfläche lebender Zellen geschaffen. Die Reaktion zwischen Thiol und Thioester erlaubt dabei einen schnellen Transfer. So wurden Rezeptoren aus der Familie der GPCR sowie der EGFR mit einem PNA-Strang versehen und durch fluoreszente PNA oder DNA selektiv markiert. Zusätzlich wurden verzweigte DNA-Architekturen mit mehreren Fluorophoren genutzt, um die Helligkeit der Markierung quantitativ zu erhöhen. Die PNA-EGFR-Konjugate wurden durch eine zwei Rezeptoren verbrückende Cy3-DNA adressiert und so zeitgleich markiert und dimerisiert. Dadurch wurde die Rezeptoraktivität gesteigert, was über Western Blot-, Immunofluoreszenz- und Fluoreszenzmikroskopieanalyse belegt wurde. In weiteren Ansätzen wurden Coiled-Coil-Systeme genutzt, um i) parallel zwei verschiedene Akzeptorpeptide mit verschiedenen Fluorophoren zu markieren und ii) Coiled-Coil-Peptide schaltbar zu machen. Durch die asymmetrische Verlängerung von K3/E3-Paaren mit Coiled-Coil-Sequenzen kann die Interaktion der Peptide an und aus geschaltet werden. Dies wurde sowohl in einem Fluoreszenzassay als auch in einer direkten Anwendung an der Syk-Kinase demonstriert. Die Liganden der Kinase wurden an den schaltbaren Peptiden angebracht und so die Affinität zur Syk-Kinase kontrolliert., Nucleic acids and peptides can be used to obtain control over molecular processes within living cells. In this work, structural elements as coiled-coil peptides or PNA∙DNA-structures were used to label and modulate receptor behavior on living cells and to control ligand binding of cytosolic proteins. For the first concept the K3/E3-coiled-coil peptide pair was used to establish a proximity-guided, covalent transfer of a PNA strand from a K3-donor peptide onto the complementary E3-acceptor peptide. By fusion of the acceptor peptide to a receptor, PNA-receptor-conjugates were generated selectively on living cells. The native chemical ligation type of reaction allowed a fast PNA-transfer within minutes. Receptors from the family of GPCRs and the EGFR were tagged with a PNA-sequence and subsequently labeled by the addition of a fluorescent DNA or PNA. By recruiting branched DNA architectures which were decorated with several fluorophores, the total brightness of the labeling was increased quantitatively. A twice complementary Cy3-DNA was used to simultaneously label and dimerize the EGFR. Thereby, an artificially induced increase in receptor activity could be achieved, which was shown in Western Blot and immunofluorescence analysis as well as in fluorescence microscopy. In two other approaches coiled-coil peptides were used to i) label two different acceptor peptides simultaneously with two different dyes and ii) introduce coiled-coil peptides as part of a dynamic switchable system. Using an asymmetric coiled-coil elongation on the K3/E3 pair the interaction of both can be turned on and off. This was demonstrated in a fluorescence assay and applied to the Syk kinase, were Syk ligands were attached to the switchable peptides. Those ligands were changed from a bi- to a monovalent presentation status and thus the affinity of the Syk kinase towards its ligands can be controlled.

Chemoselektive Peptidfragmentverknüpfungsmethoden sind ein zentrales Element der chemischen Peptid- und Proteinsynthese. Auf der Suche nach einem „universellen Werkzeug für die Peptidligation“ wurde in den vergangenen zwei Jahrzenten eine Vielzahl unterschiedlicher Hilfsmolekülen (Auxiliare) entwickelt. Trotz des enormen Forschungaufwandes blieben bisher verfügbare Nα-Auxiliare jedoch in ihrer Anwendung auf glycinhaltige Ligationsstellen beschränkt. Im Fall der häufig verwendeten säurelabilen Nα-Auxiliare müssen zudem starke Säuren oder Supersäuren eingesetzt werden, um das Hilfsmolekül nach der Peptidligation zu entfernen. Dabei wurde häufig die Spaltung der zuvor aufgebauten Amidbindung als unerwünschte Nebenreaktion beobachtet. In der vorliegenden Arbeit wurde die Synthese von acht Nα-Auxiliaren erarbeitet und deren Anwendung in der erweiterten nativen chemischen Ligation untersucht. Dabei konnten sechs Hilfsmoleküle identifiziert werden, welche die Auxiliar-Abspaltung unter mild-basischen Bedingungen ermöglichten. Von besonderer Bedeutung war das 2-Mercapto-2-phenethyl-Grundgerüst, welches im Gegensatz zu bisher beschriebenen Nα-Auxiliaren erstmals den Zugang zu sterisch anspruchsvollen Verknüpfungstellen, jenseits von Glycin, gestattete. Der Nutzen des Auxiliars wurde in die chemische Totalsynthese zweier antimikrobieller Peptide demonstriert. Durch die Verwendung eines 13C-markierten Hilfsmoleküls konnte der Mechanismus der radikalischen Auxiliar-Abspaltungsreaktion in NMR-Experimenten detailliert untersucht werden. Zusätzlich wurde das 2-Mercapto-2-phenethyl-Auxiliar in einer neuen Methode der chemischen Proteinsynthese eingesetzt, welche die gewünschten Proteine ohne eine einzige HPLC-Reinigung in reiner Form lieferte. Im letzen Teil der Arbeit wurde mit dem 2-Selenol-2-phenethyl-Grundgerüst erstmals die Anwendung eines Selenol-funktionalisierten Nα-Auxiliars beschrieben. Das Hilfsmolekül ermöglichte besonders schnelle Verknüpfungsreaktionen und konnte zudem rasch mit hoher Selektivität entfernt werden., Chemoselective ligation methods are an essential element of chemical peptide and protein synthesis. The search of a „universal tool for peptide ligation“ led to a range of different ligation auxiliaries over the last two decades. Despite the intense research in this field established Nα-auxiliaries remained limited to glycine-containing ligation sites. Furthermore, the application of frequently used acid-labile Nα-auxiliaries requires strong acids or superacids to remove the auxiliary after the ligation reaction. Under these harsh acidic conditions the cleavage of the established amide bond has been observed as an undesired side-reaction. This work describes the synthesis of eight Nα-auxiliaries and their application in extended native chemical ligation. Six helping molecules were identified enabling auxiliary cleavage under mild-basic conditions. Perhaps most important and in contrast to previously reported Nα-auxiliaries, the 2-mercapto-2-phenethyl group facilitated access to sterically demanding ligation sites, beyond glycine. The synthetic utility of the auxiliary was demonstrated by the chemical total synthesis of two antimicrobial peptides. The application of a 13C-labelled scaffold allowed a detailled study oft the radical auxiliary cleavage reaction by NMR-spectroscopy. Additionally, the 2-mercapto-2-phenethyl auxiliary was utilised for a novel method of chemical protein synthesis, which delivered the desired proteins without a single HPLC-purification in high purity. Finally, a selenol-functionalized Nα-auxiliary is described for the first time by introducing the 2-selenol-2-phenethyl mojety. This scaffold enabled execptionally rapid peptide ligations and is readily removed with high selectivity.

Protein-Arrays sind das Mittel der Wahl, um eine Vielzahl von Proteinen parallel zu untersuchen. Ziele dieser Untersuchungen sind meistens Proteininteraktionsnetzwerke zu entdecken oder besser verstehen zu können. Bisher wurden die benötigten Proteine fast ausschließlich mit biologischen Methoden gewonnen. Diese bieten allerdings keinen generellen Zugang zu posttranslational-modi-fizierten (PTM)-Proteinen. Somit war es bisher nicht möglich den Einfluss von PTMs auf Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) im Arrayformat zu untersuchen. Die chemische Synthese kann dagegen Proteine mit ortsspezifischen PTMs liefern. Daher ist es verwunderlich, dass bislang noch keine Berichte über chemisch hergestellte PTM-Protein-Arrays existieren, besonders da PTMs meist entscheidend für proteomische Interaktionsnetzwerke sind. In der vorliegenden Arbeit wird eine Methodik beschrieben, die es ermöglicht PTM-modifizierte Protein-Domänen-Arrays auf der Oberfläche zu synthetisieren und zu analysieren. Mit der Methodik wurden 20 SH3-Domänen synthetisiert und 64 PPIs gemessen. Neben vier Hefe-SH3-Domänen wurden je acht humane (Phospho)SH3-Domänen der Abl- und Arg(Abl2)-Tyrosinkinase synthetisiert und funktionell untersucht. Es wurde gefunden, dass die Ligandenspezifität von Abl-SH3-Domänen durch Phosphorylierung feinreguliert wird. Je nach Phosphorylierungsmustern wurde die Affinität für spezifische Liganden erhöht oder erniedrigt. Der Ursprung dieser Phosphoregulierung wurde für die Abl-SH3-Domäne mit Hilfe der NMR-Spektroskopie und durch Zellexperimente versucht zu entschlüsseln und weiter validiert., Protein-arrays are the method of choice to investigate a variety of proteins in a parallel fashion. Objectives of these studies are mostly to discover or to investigate protein interaction networks. So far, the necessary proteins were almost exclusively gained by biological methods. Unfortunately, generic access to proteins bearing post-translational modifications (PTM) is not provided by these techniques. Therefore, it was not possible to investigate the impact of PTMs on protein-protein-interactions (PPIs) on arrays so far. Chemical synthesis in contrast offers proteins with site-specific PTM incorporation. In this context, it is surprising, that chemical methods of PTM-protein array synthesis remained virtually unexplored, especially since these modifications are usually crucial for proteomic interaction networks. In this thesis, a methodology is described, that allows to synthesize and functional analyse post-translationally modified protein domain arrays on the surface. By using this methodology, 20 SH3 domains were synthesized and 64 protein-pep-tide interactions were measured. In addition to 4 yeast SH3 domains, 8 human (phospho) SH3 domains of the Abl and Arg(Abl2) tyrosine kinase were synthesized and functionally investigated. The experiments revealed that phosphorylation might serve as a means to fine tune the ligand recognition. Depending on the phosphorylation pattern the affinity to specific interaction partners were enhanced or reduced. The origin of this phosphoregulation was further investigated for the Abl SH3 domain by means of NMR spectroscopy and cellular experiments.

Nicht-codierende RNAs sind ein bedeutender Bestandteil genregulatorischer Prozesse. Ihre Fehlregulierung wird mit zellulärer Dysfunktion und der Entstehung von Krankheiten in Zusammenhang gebracht. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung verschiedener Testsysteme zur Untersuchung nicht codierender RNAs mit dem Schwerpunkt microRNA (miRNA), precursor miRNA (pre-miRNA) und circular RNA (circRNA). Für eine Zyklisierung und Funktionalisierung von circRNA mittels Cu-katalysierter Click-Chemie zur Identifizierung zellulärer Interaktionspartner und zugehöriger Wirkmechanismen wurden die Termini linearer RNA-Template modifiziert. Mit Hilfe enzymatischer Techniken wie Transkription und Ligation konnte in vitro die Inkorporation Azid- und Alkin-funktionalisierter Nukleotid-Bausteine am 5‘- und 3‘-Terminus gezeigt werden. Zur Untersuchung der miRNA-Reifung in cellulo wurde die pre-miRNA-134 unter Verwendung chemo-enzymatischer Methoden mit einem Fluorophor/Quencher-Paar an den Termini ausgestattet. Durch intrazelluläre Reifung der gelabelten pre-miRNA mit einhergehender Fluoreszenzfreisetzung sollte die Visualisierung und damit die Lokalisierung des miRNA-Reifungsortes innerhalb von Neuronen realisiert werden. Zudem gelang die Entwicklung eines auf branched rolling-circle amplification (BRCA) basierenden Argonaute2(Ago2)-vermittelten Spaltungsassays. Ein Enzymkomplex aus rekombinantem, humanem Ago2 und der miRNA miR 122, genannt minimal RISC, wurde dabei zur Substrat-Spaltung eingesetzt. Zur Etablierung des BRCA-basierenden Ago2-vermittelten Spaltungsassays als Screening-Tool für die Identifizierung potentieller Inhibitoren der mRNA-Spaltung wurden exemplarisch sechs Testsubstanzen aus der Gruppe der Aminoglykoside untersucht. Der BRCA-basierende Ago2-vermittelte Spaltungsassay stellte eine einfache und zuverlässige Detektionsmethode dar, der die Untersuchung einer größeren Probenzahl mit geringem Aufwand und ohne Verwendung von fluorogen gelabeltem Substrat ermöglichte., Non-coding RNAs are an important factor in gene regulation in which their deregulation is associated with cellular dysfunction and disease. Here, the development of different test systems for the investigation of non-coding RNAs, namely microRNA (miRNA), precursor miRNA (pre-miRNA), and circular RNA (circRNA), was on focus. In order to circularize and functionalize circRNA with the purpose of identifying cellular interaction partners and possible mechanisms of action, 5‘- and 3‘-terminal modifications were added to a linear RNA template. This was accomplished by using azide- and alkyne-functionalized nucleotides which were incorporated by enzymatic approaches like transcription and ligation to be followed by Cu-catalyzed click chemistry for circularization. For investigating miRNA maturation in neuronal cells, pre-miR-134 was modified by chemo-enzymatic approach with fluorophore and quencher at its 5‘ and 3‘ ends, respectively. Intracellular maturation of labeled pre-miRNA would produce a fluorescent signal upon cleavage, thus enabling visualization and localization of miRNA maturation in neuronal cells. Furthermore, the development of Ago2-mediated mRNA cleavage assay based on branched rolling-circle amplification (BRCA) was accomplished. A complex of recombinant human Ago2 and miRNA miR-122, called minimal RISC, was used for substrate cleavage. To establish this assay as adequate screening method for identifying potential inhibitors of mRNA cleavage, a group of six aminoglycosides was tested. The BRCA-based Ago2-mediated cleavage assay showed to be a simple and reliable detection method and screening tool for small molecule binders with little effort and without fluorescent labeling of substrate.

Um die Funktion von Proteinen in ihrer natürlichen Umgebung zu verstehen, ist es unerlässlich ihre Lokalisation und Bewegung im lebenden System durch z.B Fluoreszenz-markierung sichtbar zu machen. Eine ideale Markierungsmethode zeichnet sich dadurch aus, dass sie das Zielprotein (protein of interest, POI) selektiv und in kurzer Zeit mit einer maßgeschneiderten Reportergruppe ausstattet, ohne die Proteinfunktion und -lokalisation zu beeinflussen. Dabei ist die Größe der Erkennungssequenz von großer Bedeutung. In dieser Arbeit wird die Entwicklung einer Markierungsstrategie beschrieben, bei der die Ausbildung eines parallelen Coiled-Coil-Motivs den Transfer einer Reportergruppe auslöst. Untersucht wurde dabei die Übertragung eines Sulfonat-gebundenen Fluorophors auf ein Cystein in der Erkennungssequenz durch nukleophile Substitution. Ebenfalls untersucht wurde der Transfer verschiedener Thioester-verknüpfter Reporter auf ein N-terminales Cystein der Erkennungssequenz durch eine Acyltransferreaktion. Beide Strategien zeichnen sich durch eine hohe Selektivität und einen geringen Massenzuwachs am Zielprotein aus. Der Acyltransfer mit Arylthioestern zeigte zudem eine bemerkenswerte Reaktivität und erlaubte eine Markierung innerhalb weniger Minuten Reaktionszeit. Die Vielfältigkeit dieser Methode wurde anhand der Fluoreszenzmarkierung von sieben verschiedenen G-Protein gekoppelten Membranrezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen demonstriert. Die markierten Rezeptoren blieben dabei funktional und konnten ihren entsprechenden Liganden mit hoher Affinität binden., In order to understand the function of proteins in their native environment, it is crucial to visualize their localization and trafficking in living cells by means of e.g. fluorescence labeling. An ideal labeling method adds a custom reporter group to the protein of interest (POI) in a selective and fast manner without disturbing the POIs function and localization. Hence the size of the recognition sequence is of major concern. This work describes the development of a labeling strategy in which the formation of a parallel coiled coil motif triggers the transfer of a reporter group. The transfer of a sulfonate-linked fluorescence dye onto the cysteine-modified recognition sequence via a nucleophilic substitution reaction was tested. Also the transfer of various thioester-linked reporters onto the N-terminal cysteine of the recognition sequence via an acyl transfer reaction was investigated. Both strategies are characterized by a high selectivity and low mass increase at the target protein. The acyl transfer with aryl thioesters also showed a remarkable reactivity and allowed labeling reactions to proceed within minutes. The versatility of this method was demonstrated by applying it to the labeling of seven different G-protein coupled membrane receptors on the surface of living cells. The labeled receptors remained functional and were able to bind their respective ligand with high affinity.

Native chemische Ligation ist heutzutage die Methode der Wahl für die chemische Synthese von Proteinen. Die Voraussetzung der Methode: ein Cystein Rest am N-Terminus, gilt als größter Nachteil der Methode. N-alpha-Auxiliare werden seit mehreren Jahren als Cystein-Surrogat verwendet, um diese Einschränkungen zu überwinden. Aufgrund zahlreicher Einschränkungen haben sich die Auxiliare als Standard Methode nicht durchgesetzt. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neue Klase N-alpah-Auxiliare entwickelt. Die Auxiliare sind einfach zu synthesieren, können direkt auf den Festphasen in das Peptid eingeführt und unter milden basischen Bedingungen wieder abgespalten werden. Modelversuche wurden durchgeführt um ihr Eigenschaften hinsichtlich der native chemische Ligation und Abspaltung zu evaluieren. Daraufhin wurden die Auxiliare für die Synthese der antimikrobiellen Domäne des Dermicidin Proteins verwendet. Die chemische Ligation an der festen Phase hat in den letzten Jahren erheblich an Popularität gewonnen. Die Methode profitiert von der einfachen Reinigungseigenschaften der Festphasensynthese und erlaubt die sequenzielle Verknüpfung von mehreren Peptidfragmenten zu den gewünschten Zielproteinen mit hohen Reinheiten. Im zweiten Teil der Dissertation wurde das Konzept der chemische Festphasen Ligation mit der Hilfe eines „Second Generation“ Auxiliar über die Cysteinchemie hinaus erweitert. Durch Auxiliar-unterstüzte Festphase Ligation“ wurde die variable tandem repeats Domäne des MUC1 Proteins hergestellt. Native chemical ligation continues to lead as the method of choice for the total chemical synthesis of proteins. Despite the methods broad use the method requirement for a terminal cysteine residue remains its biggest disadvantage. N-alpah-auxiliaries have long been used to overcome this inherent hindrance by acting as cysteine mimics. The method however has still not achieved broad use due to several key issues. In the first part of the thesis a new class of N-alpha-auxiliaries is presented. The auxiliaries are straightforwardly synthesized, readily introduced onto the peptide building blocks and cleaved under mild basic conditions. Model tests were carried out to evaluate the auxiliaries’ characteristics and their removal chemistry was developed. Finally, the auxiliary was utilized for the synthesis of the antimicrobial C-terminal domain of Dermicidine. Solid phase chemical ligation has grown in popularity in the recent years. Benefitting from the solid-phase inherent purification characteristic it allows for multiple peptide fragments to be ligated in a sequential fashion to yield the full length protein target in high purity. In the second part of the dissertation the concept of solid phase chemical ligation is expanded beyond the cysteine junction using a “second generation” auxiliary. MUC1 protein variable tandem repeats domain was synthesized using auxiliary-assisted solid phase chemical ligation.

Wir haben DNA-basierte Hybridisierungssonden zur erzwungenen Interkalation (sogenannte FIT-Sonden) entwickelt. Diese beruhen auf dem Ersatz einer natürlichen Nukleobase durch einen umgebungssensitiven Farbstoff. Die einzelsträngigen Sonden zeigen ein geringes Fluoreszenzsignal, da die Rotation um die zentrale Methinbrücke den angeregten Zustand effizient entvölkert. Durch Hybridisierung mit komplementären Zielsequenzen wird der Farbstoff in den Basenstapel gezwungen, wodurch die Rotation eingeschränkt wird und verstärkt Fluoreszenz auftritt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Sonden optimiert, um maximale Fluoreszenzanstiege und maximale Helligkeit zu erzielen. Wir konnten zeigen, dass der Einbau von Locked Nucleic Acid (LNA) gleichzeitigt die Helligkeit und die Stabilität gegenüber Nukleaseverdau vergrößert. Solche LNA-verstärkten FIT-Sonden konnten in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Anne Ephrussi (EMBL-Heidelberg) wurden solche Sonden erfolgreich in der Lebendzell-Bildgebung von Oskar mRNA in Oozyten von Drosophila Melanogaster eingesetzt. Die kombinierte Verwendung von Thiazolorange und einem zweiten, terminal angebrachten Cy7-Reporter ermöglichte durch Ratiometrische Messungen die Quantifizierung von Sonden und Ziel RNA durch waschfreien Fluoreszenz in-situ Hybridisierung. Wir konnten die Farbauswahl für FIT-Sonden erweitern und etablierten Chinolinblau als den höchst-responsiven Farbstoff in DNA-FIT-Sonden, welcher bis zu 195-fache Fluoreszenzintensivierung zeigte. Die Verwendung von cyan- (Thiazolgelb), grün- (Thiazolorange) und rot-emittierende (Chinolinblau) FIT-Sonden ermöglichte die simultane Detektion drei verschiedener RNA-Sequenzen. Dieselben Farbkanäle wurden ebenfalls zur Entwicklung von Wiederholungseinheiten für FIT-Sonden verwendet. Durch die Expression transgener RNA und die benachbarter Hybridisierung zahlreicher Sonden sollten die Mehrfarbdetektion in lebenden Zellen mit sehr geringer Nachweisgrenze gelingen. We developed oligonucleotide hybridization probes based on forced intercalation (FIT). FIT probes contain asymmetric cyanine dyes of the thiazole orange family as nucleobase surrogates as an internal label. The thiazole orange is dark in the unbound, single stranded state, due to rapid depletion of the chromophores excited state by torsional twisting. Upon hybridization with target nucleic acids, the reporter is forced into the base stack, resulting in restriction of intramolecular rotation which is accompanied by a dramatic increase in quantum yield. The probes have been optimized for highest fluorescence response and maximum brightness upon hybridization with complementary nucleic acids. We discovered that locked nucleic acids (LNA) increase both, the nuclease resistance in living cells and the brightness. FIT-probes were applied in real-time PCR and RNA localization studies in fixed tissue and in living cells. Together with our collaborator Anne Ephrussi we demonstrated that carefully chosen probe sequences disrupted RNA secondary structure and thereby altered the motility of oskar ribonucleotide-particles in living oocytes of Drosophila melanogaster. The combined use of fluorogenic base surrogates and a second, terminally attached, independent reporter allowed the rapid intracellular RNA-quantification by means of wash-free fluorescence in-situ hybridization. We expanded the color repertoire of FIT probes by screening multiple chromophores and discovered quinoline blue as the most responsive chromophore with up to 195-fold fluorescence enhancement. The combined use of cyan- (thiazole yellow), green- (thiazole orange) and red-emissive (quinoline blue) FIT probes allowed the simultaneous detection of multiple RNAs of interest. The same color channels could be used for the development of artificial repeat tags for FIT-probes that will enable live-cell multiplexing by FIT-probes with transgenic RNAs.

Das Entwicklungsstadium bestimmter Krankheiten ist eng mit der Konzentration diverser Proteine in biologischen Proben verknüpft. Eine sensitive Detektion dieser sogenannten Biomarker kann somit maßgeblich zu einer frühzeitigen Diagnose beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurden strukturierte, fluorogene Sonden entwickelt, die die Möglichkeit bieten in einem homogenen Verfahren Zielproteine sensitiv, direkt und in Echtzeit nachzuweisen. Die peptidische Erkennungssequenz für das Zielprotein wurde dabei von zwei zueinander komplementären PNA-Segmenten flankiert. Die Sonden besaßen dadurch eine haarnadelförmige Anordnung, die kontrolliert eingebaute Reporter in eine enge Proximität zwang und ein minimales Hintergrundsignal im ungebundenen Zustand gewährleistete. Durch die Wechselwirkung mit dem Zielprotein erfolgte eine Reorganisation der Sondenstruktur, die fluoreszenzspektroskopisch verfolgt werden konnte. Für den Einbau der fluorogenen Einheiten wurden verschiedene Strategien entwickelt und die resultierenden Architekturen bzgl. ihres Einsatzes als sensitives Detektionssystem validiert. Als Zielproteine wurden die intrazellulären SH2-Domänen der Src- und Lck-Kinase sowie die extrazelluläre Matrix-Metalloprotease MMP-7, ein proteolytischer Biomarker für Krebs, untersucht. Besonders die neuartigen In-Stem Hairpin Peptide Beacons (IS-HPBs), bei denen fluorogene Pseudonukleobasen in die PNA-Stammregion eingebaut wurden, zeichneten sich als sensitive Proteasereporter mit einer bis zu 50-fachen Signalverstärkung aus. Mit einem excimerbasierten IS-HPB und einer zeitaufgelösten Fluoreszenzmethode konnte die direkte Detektion von MMP-7 bei einer kritischen Konzentration von 1 nM im humanen Blutserum erreicht werden. Eine mögliche Anwendbarkeit in der medizinischen Diagnostik wurde somit bekräftigt. Weiterhin wurden erste Hinweise mithilfe thermodynamischer Untersuchungen erhalten, dass die Strukturierung einer peptidischen Sonde zu einer erhöhten Selektivität beiträgt. The developmental stage of certain diseases is closely linked to the concentration of various proteins in biological samples. A sensitive detection of these so-called biomarkers can thus significantly contribute to an early diagnosis. In the present work, structured, fluorogenic probes were developed that offer the possibility of a sensitive, direct and in real-time detection of target proteins in a homogeneous process. The peptidic recognition sequence for the target protein was thereby flanked by two self-complementary PNA segments. As a result, the probes possessed a hairpin-type arrangement, in which suitable appended labels are forced into close proximity and guaranteed a minimal background signal in the unbound state. By interacting with the target protein a reorganization of the probe structure occured, which could be followed by fluorescence spectroscopy. To embed the fluorogenic units different approaches were developed and the resulting architectures were validated relating to their use as a sensitive detection system. As target proteins the intracellular SH2-domains of the Src and Lck kinase and the extracellular matrix metalloprotease MMP-7, a proteolytic biomarker for cancer, were investigated. In particular, the new In-Stem Hairpin Peptide Beacons (IS-HPBs), in which fluorogenic pseudo nucleic acids were incorporated into the PNA-stem region, proved as sensitive protease reporters with an up to 50-fold signal amplification. By using an excimer-signaling IS-HPB and a time-resolved fluorescence method the direct detection of MMP-7 with a critical concentration of 1 nM within complex human blood serum was achieved. A possible application in medical diagnostics was thus confirmed. Furthermore, initial indications were obtained using thermodynamic studies that the structure of a peptide-based probe contributes to increased selectivity.

Zweck der molekularen Bildgebung ist es, biologische Prozesse auf zellulärer und molekularer Ebene zu messen und zu charakterisieren, um so die Ursachen von Krankheiten und Veränderungen im Organismus zu diagnostizieren. Sie basiert auf dem Einsatz molekularer Bildgebungssonden, welche einen spezifischen biologischen Vorgang darstellen oder sich spezifisch in dem zu untersuchenden Gewebe anreichern oder aktiviert werden. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Analyse neuer Bildgebungssonden für die spezifische in-vivo-Bildgebung der Apoptose und von Enzymaktivitäten mittels Magnetresonanztomographie (MRT) auf der Grundlage sehr kleiner Eisenoxidnanopartikel (very small iron oxide particles, VSOP). VSOP sind superparamagnetisch und durch ihre negativ geladene Citrathülle elektrostatisch stabilisiert. Für die Apoptose-Bildgebung sollte durch Bindung des Proteins Annexin A5 (AnxA5) an die Citrathülle der VSOP eine zielgerichtete Sonde hergestellt werden (AnxA5-VSOP). Für die Bildgebung von Enzymaktivitäten sollte eine durch die Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) aktivierbare Sonde hergestellt werden (Protease-spezifische Eisenoxidpartikel, PSOP). The goal of molecular imaging is to characterize and measure biological processes at cellular and molecular levels for the purpose of diagnosing the cause of diseases and molecular abnormalities. Molecular imaging is based on the use of probes with a high affinity to the target tissue and / or which are specifically activated. The aim of this study was to develop and analyze new molecular imaging probes for the in vivo imaging of apoptosis and enzyme activity using magnetic resonance imaging (MRI), based on very small iron oxide particles (VSOP). VSOP are superparamagnetic and electrostatically stabilized due to their negatively charged citrate surface. For the imaging of apoptosis the protein annexin A5 (AnxA5) was coupled to the citrate surface (AnxA5-VSOP). For the imaging of enzyme activities an activatable imaging probe with a cleavage site for the matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) was synthesized (protease-specific iron oxide particles, PSOP).

Reaktionen zwischen reaktiven Oligonukleotiden, die durch komplementäre Nukleinsäuretemplate in hoher effektiver Molarität angeordnet werden, haben auf dem Gebiet der Nukleinsäurediagnostik an Bedeutung gewonnen. Sie bieten die Möglichkeit zur Erzeugung von mehreren Signalmolekülen pro Templat, wenn die templatgebundenen Produkte durch neue Reaktanden verdrängt werden. Da die Produkte ebenfalls hohe Templataffinitäten aufweisen, schränken sie jedoch die katalytische Templataktivität ein (Produktinhibierung). In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein neuer Ansatz zur Umgehung der Produktinhibierung entwickelt. Dazu wurde eine DNA-vermittelte PNA-Verknüpfungsreaktion in eine PCR integriert. Die Reaktion wurde direkt durch das während der PCR vervielfältigte Templat ausgelöst und erfolgreich in der einzelbasenspezifischen Genotypisierung von genomischer DNA eingesetzt. Die Nachweisgrenze war mit 30 Templatmolekülen im Vergleich zu bisherigen templatgesteuerten Reaktionen um etliche Größenordnungen niedriger. Ein alternativer Ansatz widmete sich neuen Strategien zur Verminderung der Produktinhibierung. Templatgesteuerte Verknüpfungs-Zyklisierungsreaktionen lieferten zyklische Verknüpfungsprodukte, welche gegenüber ihren linearen Pendants durch deutlich geringere Templataffinitäten gekennzeichnet waren. Daher überstiegen die Ausbeuten jene von Verknüpfungsreaktionen ohne Zyklisierung. Die Zunahme der Templataffinität in Folge der Verknüpfung wurde jedoch durch die Zyklisierung nicht vollständig kompensiert. Daher wurden templatgesteuerte Transferreakionen entwickelt, bei denen das DNA-Templat die Zyklisierung von nicht verknüpften Reaktionsprodukten steuert. Diese waren durch geringere Templataffinitäten als die linearen Reaktanden gekennzeichnet. Die Transfer-Zyklisierungsreaktionen lieferten bei fortgeschrittener Reaktion höhere Ausbeuten als Transferreaktionen ohne Zyklisierungsschritt. Dies bestätigte die erfolgreiche Verminderung der Produktinhibierung. Reactions between reactive oligonucleotides that are aligned by complementary nucleic acid templates at high effective molarities have gained considerable attention in the field of nucleic acid diagnostics. They are capable of generating multiple signaling molecules per target, if the template-bound products are replaced by fresh reactants. However, since product molecules usually exhibit high template affinities, they impede the catalytic activity of the template (product inhibition). This work initially describes the development of a new approach that bypasses product inhibiton. To this end, a DNA-mediated PNA-ligation reaction was integrated in a PCR. The reaction was directly triggered by the template which was amplified during PCR. Furthermore, the reaction was successfully applied in single base-specific genotyping of genomic DNA. The limit of detection (30 template molecules) was several magnitudes lower compared to previous template-controlled reactions. In an alternative approach, new strategies to reduce product inhibition were developed. Template-mediated ligation-cyclization (“cycligation”) reactions generated cyclic ligation products that were characterized by significantly lower template affinities compared to their linear counterparts. The yields upon cycligation were higher than those from ligation reactions without cyclization. However, the increase in template affinity gained upon ligation of the reactants could not be completely compensated through product cyclization. Therefore, template-mediated transfer reactions were designed in which the DNA-template actuates the cyclization of non-ligated products. These were characterized by reduced template affinities compared to the linear reactants. The transfer-cyclization reactions produced higher yields than transfer reactions without a cyclization step, thereby confirming the successful reduction of product inhibition.

Das fibrillen-bildende beta2-Mikroglobulin (b2M) und das CRF1-Mimetikum mit verzweigter Rückgratstruktur können als „schwierige“ Proteine betrachtet werden, deren Darstellung sich eignet, gegenwärtige Möglichkeiten und Grenzen der Proteinsynthese zu ermitteln. Die Proteine sollen zu spektroskopischen Untersuchungen von Proteinfaltung bzw. Ligand-Rezeptor- Wechselwirkungen eingesetzt werden. Versuche zur Chemosynthese von b2M über drei Segmente führten per NCL zwar zu linearen Produkten mit korrekter Primärstruktur, aber wiederholt wurden zwei, mittels HPLC trennbare Proteine erhalten, deren enzymatische Spaltung zu identischen Fragmenten führte. Eine Isomerisierung (wie z.B. Epimerisierung) als Ursache für die Bildung der zwei Produkte konnte ausgeschlossen werden. Mittels CD- und FTIR-Spektroskopie wurden für beide Produkte beta- Faltblatt-Strukturen ermittelt, die sich sowohl untereinander als auch vom rekombinanten Protein unterschieden. Die „fehlgefalteten“ Syntheseprodukte konnten nicht entfaltet und anschließend in die „korrekte“ Struktur des rekombinanten b2M überführt werden. Es ist denkbar, dass die beobachtete „Fehlfaltung“, deren Ursache nicht geklärt werden konnte, für vom b2M ausgelöste Amyloidosen verantwortlich ist. Das CRF1-Modell, das aus drei zyklischen Peptiden und einem Protein mit Disulfidbrücken besteht, welche auf einem linearen Peptid-Templat verankert sind, wurde durch ein zyklisches Templat zur strukturellen Einschränkung modifiziert. Durch das zyklische Templat ergaben sich keine Syntheseprobleme, aber interessanterweise führte die Zyklisierung des Templats zu einer signifikant höheren Affinität für den Agonisten Urocortin-I im funktionellen Assay. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass ein zyklisches Rezeptor-Loop-Peptid mittels EPL im mg-Maßstab erhalten werden kann, was künftig die Synthese isotopenmarkierter Analoga für Struktur-Untersuchungen ermöglicht. The fibril forming beta2-microglobulin (b2m) and the CRF1 mimic with branched peptide backbone could be considered as “difficult” proteins, whose synthesis is suited for determining present possibilities and limits of protein synthesis. The proteins shall be used for spectroscopic analysis of protein misfolding or ligand-receptor-interaction, respectively. Efforts of the chemosynthesis of b2m over three segments may lead via NCL to linear products with correct primary structure, but two, via HPLC isolatable proteins were repetitively susbstained, whose enzymatic digest lead to identical fragments. An isomerization (such as e. g. epimerization) as reason for the formation of the two products could be excluded. By means of CD and FTIR spectroscopy for both products beta-sheet structure were determined, which differ among themselves as well as from the recombinant protein. The “misfolded” synthetic product could not be unfolded und subsequently converted into the “correct” structure of the recombinant b2m. It is possible that the observed “misfolding”, whose cause could not be clarified, is reasonable for the amyloidosis induced by b2m. The CRF1 model that consists of three cyclic peptides and one protein with disulfid bridges coupled to a linear peptide template, was modified for structural constraints by a cyclic template. In consequence of the cyclic template no synthetic problems aroused, although the cyclisation of the template leads interestingly to a significant higher affinity for the antagonist urocortin-I in the functional assay. Furthermore, it was shown that a cyclic receptor loop peptide could be received via EPL in mg scale, what in future enables the synthesis of isotopically labeled analogs for structure investigations.

Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese niedermolekularer Verbindungen, die an die prä-miRNA binden und dadurch die Reifung zur miRNA inhibieren. Daher sollten die RNA-Binder 2-Desoxystreptamin sowie Neamin mit Alkinen funktionalisiert und durch Kupfer-katalysierte Azid-Alkin 1,3-dipolare Cycloaddition (CuAAC) mit verschiedenen bivalenten Aziden verknüpft werden. Im Rahmen dieses Projekts wurde der synthetische Zugang zu den benötigten Alkin- sowie Azid-funktionalisierten Grundbausteinen optimiert. Ferner wurde ein effektives und zuverlässiges Protokoll für die CuAAC erarbeitet, welches es ermöglichte, 88 Testsubstanzen in guter Ausbeute und hoher Reinheit zu isolieren. Anschließend wurde die Substanzbibliothek in einem BRCA-Reifungsassay unter kompetitiven Bedingungen auf die Inhibition der miRNA-Reifung getestet. Dabei wurden mehrere potente Inhibitoren der miRNA-Reifung mit IC50-Werten von bis zu 0.5 µM identifiziert. Der zweite Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Etablierung einer chemo-enzymatische RNA-Funktionalisierungsstrategie um prä-miRNA-Sonden herzustellen: In-vitro-Transkriptionen mit der T7-RNA-Polymerase sowie Ligationen mit der T4 RNA Ligase 1 waren das Fundament der enzymatischen RNA-Synthese, während die Funktionalisierung der RNA durch CuAAC erzielt wurde. Dafür wurden die neuen Verbindungen O-(5‘-Guanosin)-O-propargylmonophosphat sowie 3‘,5‘-O,O-Bisphosphat-5-ethinyluridin synthetisiert, durch in-vitro-Tran¬skription an das 5‘-Ende von prä-miRNAs eingeführt und anschließend durch CuAAC mit einem Fluoreszenzlöscher modifiziert. Das Uridinbisphosphat wurde durch CuAAC mit einem Fluorophor markiert und anschließend effizient mit der T4 RNA Ligase 1 an das 3‘-Ende verschiedener prä-miRNAs ligiert. Darüber hinaus war es auch möglich, das Alkin-modifizierte Uridinbisphosphat an das 3‘-Ende von prä-miRNAs zu ligieren, dieses durch eine zweite Ligation an eine definierte interne Position zu verschieben und abschließend durch CuAAC zu funktionalisieren. The objective of this work was the synthesis of small molecules, which bind to pre-miRNAs to prevent their maturation to fully active miRNAs. To create a substance library of bivalent inhibitors, the RNA binding motifs 2-deoxystreptamine as well as neamine were alkyne modified and linked with several bisazides via a copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC). Hence, optimized syntheses of the basic building blocks along with an effective and reliable CuAAC-protocol were established. 88 test substances were isolated in good yield and high purity. Finally they were analyzed with regard to their potential to selectively inhibit the miRNA maturation. For this purpose, the assay was performed under competitive conditions with a set of two pre-miRNA-pairs. The initial screening revealed several inhibitors with IC50-values in the lower µM range. The second focus of this work was on the development of a synthetic access to alkyne modified ribonucleotides to establish a chemo-enzymatic functionalization strategy for RNAs using in-vitro-transcription, ligation and CuAAC. In this context, the syntheses of 3‘,5‘-O,O-bisphosphate-5-ethinyl uridine and O-(5‘-guanosine)-O-propargyl monophos-phate are described for the first time. The guanosine monophosphate was used as transcription starter to address the 5’-end of RNA and was consecutively labeled with an azido-tagged quencher. The uridine bisphosphate was conjugated with a fluorophor and introduced to the 3’-end of RNAs by T4 RNA ligase 1. Moreover, the uridine bisphosphate can be ligated to the 3’-end without a fluorophor attached, to serve as a connecting point for a further ligation with an oligonucleotide of any length. Thereby, the former terminal alkynylated uridine was shifted to a defined internal position by successive enzymatic reactions and was successfully derivatized with a fluorophor by CuAAC.

In dieser Dissertation wurden Verfahren für die konvergente Synthese von Peptide entwickelt. Für die erweiterte native chemische Ligation kamen bisher raumbeanspruchende Auxiliare zum Einsatz, die anspruchsvolle Ligationen behinderten. Zudem waren die drastischen säure-basierten Abspaltbedinungen mit vielen post-translationalen Modifikationen nicht vereinbar. In dieser Arbeit wurde ein neuartiges Auxiliargerüst mit geringerem Raumanspruch untersucht, dass eine erheblich mildere Abspaltung unter basischen Bedingungen ermöglichte. Dazu wurde ein kleiner Elektronenakzeptorsubsituent eingeführt, durch den nach der Ligation eine das Zielpeptid freisetzende Eliminierungsreaktion induziert werden konnte. Weiterhin konnte die Verwendung des kommerziell verfügbaren Penicillamins als Vorläufer in der Ligations-Entschwefelungs-Strategie demonstriert werden. Abschließend wurde die Ligation mit sequenz-internem Cystein untersucht. Hierbei zeigte sich, dass Peptide mit Cystein in einer bestimmten Position bevorzugt in thioester-basierten Kondensationen reagierten. In this thesis approaches for convergent synthesis of peptides have been developed. In the extended native chemical ligation so far space demanding auxiliaries encumbered challenging condensations. Furthermore the required drastic acidolytic cleavage conditions were furthermore incompatible with many post-translational modifications. In the thesis a nouvelle less space demanding scaffold was scrutinized which allowed a milder basic cleavage. Therefore a small electron-accepting substituent was introduced that enabled the induction of an elimination reaction liberating the target peptide after the peptide ligation had taken place. Furthermore the applicability of the commercially available penicillamine as precursor of valine in the ligation-desulfurization strategy could be demonstrated. Finally the ligation with sequence internal cysteines was scrutinized. Herein it could be shown that certain peptides with cysteine in a distinctive position of the sequence preferable reacted in thioester-based condensation reactions.

Die hydrolysestabile C-C-Bindung von Nukleosiden, deren Nukleobase über ein aromatisches oder methylen-verbrücktes Kohlenstoffatom an Ribose oder 2-Desoxyribose gebunden ist, ermöglicht die Synthese von neuartigen Strukturen und Eigenschaften, die bei N-Nukleosiden nicht stabil oder nicht gegeben wären. In dieser Arbeit wurde die die Cuprat-vermittelte Glycosylierung und die Friedel-Crafts-Alkylierung als Methoden zur Darstellung von Desoxyribose-basierenden C-Nukleosiden weiterentwickelt. Die Cuprat-vermittelte Glycosilierung ermöglichte die Synthese von C-Nukleosiden in bis zu 93% Ausbeute, wenn Grignard-basierende Normant-Cuprate verwendet wurden. Die Verwendung Organolithium-basierender Gilman-Cuprate war ebenfalls möglich. In Gegenwart von Sauerstoff wurden O-Glycoside isoliert in über 80 % Ausbeute isoliert. Mit den C-Nukleosiden wurden modifizierte Oligonukleotide, die als potentiell verbesserte Binder an M.TaqI und E.coli Dam dienen, dargestellt. Nach ihrer Charakterisierung über Schmelzwerte und Fluoreszenzeigenschaften wurde diese an die Arbeitsgruppe von Prof. Elmar Weinhold weitergereicht und dort erfolgreich als optimierte Binder an an M.TaqI und E.coli Dam getestet. Oligonukleotide, die ein oder mehrere 1,1-Binaphthyl-Chromophore als einen neuen Typus eines torsionsflexiblen Farbstoffes enthalten, wurden untersucht. Die Einführung mehrerer aufeinander folgender Binaphthyle führte zu einer thermodynamischen Stabilisierung von Duplex-Oligonukleotiden. Die geringe Neigung Binaphthyls zur Selbstlöschung bewirkte dabei einen starken Anstieg der Fluoreszenz., The stable C-C-bond of ncleosides, whose nucleobase is attached to the ribose or 2-deoxyribose via an aromatic or methylen-bridged carbon atom, is stable to hydrolyses. This allows the synthesis of new structures and properties, which would not be available in N-nucleosides. In this work, a cuprate-mediated glycosilation and the Friedel-Crafts-alkylation as methods for the preparation of doxyribose-based C-nucleosides were developed. The cuprate-mediated glycosilation allowed the synthesis of C-nucleosides in up to 93 % yield, when Grignard-based Normant-Cuprates were used. The use of Organolithium-based Gilman-Cuprates was also possible. In the presence of oxygen O-glycosides were isolated in over 80 % yield. With the C-nucleosides modified oligonucleotides, which serve as potentially improved binders of the DNA-methyltransferases M.TaqI und E.coli, were prepared. After their charakterisation via melting point measurements and fluorescence properties, the oligonucleotides were given to the working group of Prof. Elmar Weinhold and successfully tested as improved binders of the DNA-methyltransferases M.TaqI und E.coli. Oligonucleotides, which contain one or multiple 1,1-binaphthyles as a new type of a torsionally flexible chromophore, were charakterised. The incorporation of several successive binaphthyls led to a thermodynamical stabilisation of the duplex-oligonucleotides. The low tendency of the Binaphthyl for self-quenching caused a remarkable increase of the fluorescence.

Peptide und Proteine sind wichtige Untersuchungsobjekte der biochemischen Forschung. Es wurden in den letzten Jahren eine Reihe von Ligationsmethoden entwickelt, um weitgehend entschützte, gereinigte Peptidsequenzen im wässrigen Milieu zu koppeln. Vor diesem Hintergrund von besonderem Interesse für einen möglichen Einsatz bei Ligationen ist die bakterielle Transpeptidase Sortase A. Dieses Enzym ist in vivo an der Anknüpfung von Proteinen an das bakterielle Peptidoglycan beteiligt, wobei es Substrate an einem LPXTG-Motiv zwischen Threonin und Glycin spaltet und auf ein Oligoglycin-Nucleophil überträgt. Zur Untersuchung der Enzymaktivität wurde in dieser Arbeit ein einfacher HPLC-basierter Assay etabliert. Die an Peptidmodellen gewonnenen Resultate wurden schließlich für den Aufbau eines löslichen Rezeptors genutzt. Ein Schlüsselschritt war die Sortase-vermittelte Ligation des in E. coli exprimierten, gefalteten Rezeptor-N-Terminus an ein 3-Loop-Konstrukt. Das erhaltene 23 kDa große Rezeptormimetikum war nach chromatographischer Reinigung homogen gemäß HPLC und MS. Es zeigte eine spezifische, hoch affine Bindung zu natürlichen Peptidliganden des CRF1-Rezeptors. Weiterhin konnte demonstriert werden, dass sich Sortase für die selektive Markierung von Proteinen eignet. So wurde ein Fluoreszenzlabel C-terminal an das 50 kDa Protein NEMO geknüpft. Als weiteres Anwendungsbeispiel der Sortase-vermittelten Ligation diente die Darstellung von PNA–CPP-Konjugaten. Die Verwendung von Überschüssen des Peptides und die Entfernung der niedermolekularen Abgangsgruppe durch Dialyse erwies sich als sehr effektiv und gestattete gute bis hervorragende Kupplungsausbeuten von bis zu 94%. Die biologische Wirkung der erhaltenen CPP–PNA-Konjugate konnte in Aufnahmeuntersuchungen an Zellen gezeigt werden., Peptides and proteins are important research objects in biochemical research. Therefore, several ligation methods to couple unprotected, purified peptide sequences in aqueous media have been developed during the last years. At a special interest in this case is the bacterial transpeptidase sortase A. This enzyme couples proteins in vivo to the bacterial peptidoglycan by cleavage at a LPXTG-recognition motif between threonine and glycine and subsequent transfer to an oligoglycin nucleophile. In order to investigate the enzymatic activity, a simple HPLC-based assay was established in this work. Results obtained with model peptides were used for the assembly of a soluble receptor. A key step was the sortase-mediated ligation of the folded receptor N-terminus (expressed in E. coli) to the 3-loop-construct. The resulting receptor mimic of 23 kDa was homogeneous according to HPLC and MS. It showed specific binding to natural peptide ligands of the CRF1-receptor with high affinity. Furthermore, it could be shown that sortase is usable for selective protein labeling. For this purpose, a fluorescence label was attached C-terminally to the 50 kDa protein NEMO. As a further example of sortase-mediated ligation served the synthesis of PNA-CPP-conjugates. The use of an excess of the peptide and dialyzing away the small leaving group proved to be very effective and coupling yields up to 94% could be achieved. The biological activity of the CPP-PNA-conjugates could be shown by uptake studies in cells.

Micro RNA sind nicht-kodierende dsRNA ~22 Nukleotiden lang, die eine wichtige Rolle in der Entwicklung und Regulation in beinahe allen Eukaryoten spielen. MiRNAs binden target mRNA, was zu einer Blockierung der Proteintranslation führt. Viele Krankheiten sind bekannt, die durch veränderte miRNA Expressionsmuster entweder beeinflusst oder verursacht werden. Demnach könnte eine Manipulation der miRNA-Bildung einen therapeutischen Ansatz darstellen. MiRNA werden im Zytoplasma von längeren haarnadelförmigen prekursor RNA (pre-miRNA) durch das Enzym Dicer freigsetzt. Inhibition dieser Spaltung könnte durch spezifische pre-miRNA-bindende Moleküle erfolgen. Selektive Binder der pre-miRNA als Inhibitoren der miRNA-Reifung können durch testen von Substanzbibliotheken mit Hochdurchsatzscreening (HTS) gefunden werden. Diese Arbeit beschreibt den ersten homogenen Assay der miRNA-Reifung. Eine Fluoreszenzsonde in Form einer pre-miRNA wurde benutzt, die einen 5´-Fluorophor (FAM, Cy3, oder TMR) und einen 3´-Quencher (DABCYL) aufweist. Durch die nahe Nachbarschaft von Fluorophor und Quencher in der nativen Haarnadelstruktur erfolgt Fluoreszenzlöschung. Dicer spaltet diese Struktur effizient, was zur Dissoziation von Fluorophor und Quencher und somit zu einem Fluoreszenzanstieg führt. Der Assay wurde für HTS optimiert. Die ersten Verbindungen wurden auf deren Inhibition der miRNA-Reifung getestet. Mit einem Duplexassay, wobei zwei unterschiedliche pre-miRNA Sonden mit verschiedenen Fluorophoren eingesetzt wurden, konnte etwas spezifische Inhibition gezeigt werden. Der Assay wurde in Zellen durchgeführt und der Fluoreszenzanstieg mit Fluoreszenzmikroskopie detektiert. Somit ist ein Zell-basiertes Screening von Inhibitoren möglich. Eine einfachere Synthese der Sonde mittels in vitro Transkription und anschließender enzymatischen Ligation wurde entwickelt. Verwendung des Assays um hoch selective Inhibitoren der miRNA-Reifung zu entdecken könnte zu therapeutischen Ansätzen führen., Micro RNAs (miRNAs) are non-coding dsRNAs of ~22 nucleotides that play a vital role in development and regulation in nearly all eukaryotes. MiRNAs bind target mRNA, thus blocking protein translation. Many diseases have been found to be influenced or caused by aberrant expression of miRNAs. A manipulation of miRNA formation may have therapeutic potential. MiRNAs are cleaved from longer hairpin precursor RNA (pre-miRNA) in the cytoplasm by the enzyme Dicer. It might be possible to inhibit this cleavage through specific pre-miRNA binding molecules. Selective binders of pre-miRNA as inhibitors of miRNA maturation can be found by testing large libraries of substances through high throughput screening (HTS) using an appropriate assay. This work describes the first homogenous assay of miRNA maturation. A fluorescent probe in the form of a pre-miRNA containing a 5´-fluorophore (FAM, Cy3, or TMR) and a 3´-quencher (DABCYL) was used. This ‘beacon’ in its native hairpin formation brings the fluorophore and quencher moieties into close proximity, resulting in fluorescence quenching. Dicer efficiently cleaves this structure, leading to dissociation of fluorophore and quencher and thus a fluorescence increase. In the presence of an RNA ligand that blocks cleavage, a lower fluorescence increase is seen. The assay was optimized for HTS. The first compounds were tested for their inhibition of miRNA maturation. Using a duplex assay, with two different pre-miRNA probes each containing a different fluorogenic group, some specific inhibition was shown. The assay was performed in cells using fluorescence microscopy to measure the fluorescence. This would allow for a cell-based screening of inhibitors. A simpler approach of beacon synthesis using in vitro transcription followed by enzymatic ligation was also established. Use of this assay to discover highly selective inhibitors of miRNA maturation may lead to disease therapeutics.

Interkalatorfarbstoffe wie Thiazolorange (TO) wurden an Stelle einer internen Nucleobase in PNA eingebaut. Solche Konjugate werden als FIT-Sonden (Forced Intercalation of Thiazole Orange) bezeichnet. Bei Hybridisierung interkaliert Thiazolorange in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem mismatch Basenpaar in einen PNA·DNA-Duplex . Diese Arbeit befasste sich zunächst mit der Entwicklung einer linearen Strategie für die Festphasensynthese von PNA. Um den Einfluss der stacking- und pairing-Partner von Thiazolorange auf Stabilität und optische Eigenschaften der entsprechenden PNA•DNA-Duplexe zu untersuchen, wurden sowohl N-terminal (x) als auch C-terminal (y) benachbarte. Basen von TO in Aeg-TO- und D-Orn-TO-Oligomeren variiert. Die durchgeführten Studien belegen, dass das Thiazolorange-Basensurrogat seine Fluoreszenzintensität bei Hybridisierung am stärksten ändert, wenn es von zwei Adenin-Bausteinen flankiert wird. In Light-up-Sonden ist TO über einen flexiblen Linker mit dem N-oder C-Terminus des Oligomers verbunden, in FIT-Sonden ist eine Base durch TO ersetzt. Beide Varianten wurde in Hybridisierungsexperimenten miteinander verglichen., Intercalator dyes such as thiazole orange have been linked into PNA by replacing an internal nucleobase. In these conjugates the DNA stain thiazole orange (TO) was forced to intercalate next to mismatched base pairs in a PNA•DNA duplex. These conjugates were named as FIT (Forced Intercalation of Thiazole orange) probes and are used to find single base mutation. This work was first concerned with the development of a linear strategy for the solid-phase synthesis of FIT-PNA. To explore the influence of thiazole orange stacking and pairing partners on stability and optical properties of duplexes the N’-terminal (x) and C’-terminal (y) bases of thiazole orange environment were varied for both Aeg-TO and D-Orn-TO containing oligomers. The above studies showed that the fluorescence of the thiazole orange base surrogate is most responsive to hybridisation when TO is flanked by adenine-adenine. The influence of the different attachment modes was explored by the hybridization experiments.