Verbesserte FIT-Sonden für die selektive und quantitative RNA-Visualisierung in lebenden Zellen

In dieser Arbeit wurden die von Seitz et al. entwickelten forced intercalation (FIT)-Sonden zur mRNA-Charakterisierung in lebenden Zellen eingesetzt. Es erfolgte die Synthese verbesserter FIT-Sonden für die systematische Untersuchung der Aufnahme durch lebende Flp-In™ 293 T-REx™-Zellen. Dafür wurden sowohl hergestellte FIT-Sonden-Konjugate/Aggregate als auch kommerziell erhältliche Reagenzien, wie z.B. die Palmitinsäure und das porenbildende Enzym Streptolysin-O auf ihre Effizienz untersucht. Die optimalen Bedingungen für das Einbringen von DNA- und PNA-FIT-Sonden in Flp-In™ 293 T-REx™-Zellen lieferte das Enzym Streptolysin-O. Durch den simultanen Einsatz von drei unterschiedlichen Sonden (BO-, TO- und CB-markiert), komplementär zu drei verschiedenen Zielsequenzen, gelang es erstmals eine Dreifarben-Lebendzell-Bildgebung mit FIT-Sonden durchzuführen. Des Weiteren wurden TO-FIT-Sonden zur Unterscheidung verschiedener T-Zelllinien eingesetzt. Mithilfe eines kompetitiven Hybridisierungsexperiments konnte die spezifische Fluoreszenzemission der Sonden in den Zellen belegt werden. Untersuchungen mit zwei T-Zelllinien zeigten, dass TO-FIT-Sonden sowie terminal Cy7-markierte TO-FIT-Sonden eine erhöhte TO-Emission bei Vorhandensein der komplementären TCR-mRNA-Zielsequenz in den Zellen aufwiesen. Der terminale Cy7-Farbstoff bot mit einem zweiten Detektionskanal die Möglichkeit die Cy7-Intensität und die vorhandene TO-Intensität ins Verhältnis zu setzen, sodass Signale von ungebundener Sonde leichter ausgeschlossen werden konnten. Dies ermöglichte eine spezifische Markierung der T-Zellen. Es folgte die Synthese CB-markierter FIT-Sonden zur Aufklärung biologischer Fragestellungen, wie dem Verlauf einer Influenza A Infektion und die Synthese und Evaluation neuer Farbstoffe mit einem Absorptionsmaximum bei 590/596 nm. Zudem wurde der Einbau eines zyklischen PNA- Monomers bezüglich der Verbesserung von Responsivität und Helligkeit von PNA-FIT-Sonden analysiert.
In this work forced Intercalation (FIT) probes, developed by Seitz et al. were used for the mRNA characterization in living cells. The synthesis of improved FIT probes as well as the systematic study on the uptake of FIT probes by living Flp-In™ 293 T-REx™ cells was performed. Therefore FIT probe conjugates/aggregates as well as commercially available reagents, e.g. palmitic acid and the pore-forming enzyme Streptolysin-O were investigated under various conditions. Furthermore, the transfection was tested using an electroporator. The optimal transfection condition for the introduction of DNA and PNA FIT probes into Flp-In™ 293 T-REx™ cells was achieved using Streptolysin-O. Multicolor live cell imaging with the simultaneous use of three different FIT probes (BO, TO and QB) against three different target sequences was performed successfully. In addition, FIT probes were used for the differentiation between T cell lines. A competitive hybridization experiment with cells confirmed the specific fluorescence emission of the probes. Further studies with two cell lines and TO-FIT probes as well as terminal Cy7-labeled TO-FIT probes showed an increased TO emission in the presence of the complementary TCR mRNA target sequence in the cells. A second detection channel of the terminal Cy7 dye provided the advantage of comparing the Cy7- and TO-intensity ratio, thereby making it easier to exclude signals from unbound probe. This enabled the specific tagging of t cells. This was followed by the synthesis of QB-DNA-based FIT probes for the use in various biological applications e.g. as a pan selective marker for Influenza A infection. Moreover, the synthesis and evaluation of new dyes with an absorption maximum at 590/596 nm was performed. The incorporation of a cyclic PNA monomer next to the TO dye has also been realized to improve responsiveness and brightness in PNA-FIT probes.