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Parkinson’s Disease (PD) is currently the most rapid growing neurodegenerative disease and over the past generation, its global burden has more than doubled. The onset of PD can arise due to environmental, sporadic or genetic factors. Nevertheless, most PD cases have an unknown etiology. Chemicals, such as the anthropogenic pollutant 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) and amphetamine-type stimulants, have been associated with the onset of PD. Conversely, cannabinoids have been associated with the treatment of the symptoms’. PD and medical cannabis is currently under the spotlight, and research to find its benefits on PD is on-going worldwide. However, the described clinical applications and safety of pharmacotherapy with cannabis products are yet to be fully supported by scientific evidence. Furthermore, the novel psychoactive substances are currently a popular alternative to classical drugs of abuse, representing an unknown health hazard for young adults who may develop PD later in their lifetime. This review addresses the neurotoxic and neuroprotective impact of illicit substance consumption in PD, presenting clinical evidence and molecular and cellular mechanisms of this association. This research area is utterly important for contemporary society since illicit drugs’ legalization is under discussion which may have consequences both for the onset of PD and for the treatment of its symptoms. publishersversion published

Relatório de Estágio para a obtenção do grau de Mestre em Ensino da Música Submitted by Paulo Moreira (paulomoreira@esmae.ipp.pt) on 2016-10-07T17:05:51Z No. of bitstreams: 1 DM_AlexandreQuintas_2016.pdf: 718911 bytes, checksum: 6109dc7f44c1f46514f30f2e3442b105 (MD5) Made available in DSpace on 2016-10-07T17:05:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DM_AlexandreQuintas_2016.pdf: 718911 bytes, checksum: 6109dc7f44c1f46514f30f2e3442b105 (MD5) Previous issue date: 2016-07-15 Restored into DSpace on 2021-10-06T13:17:52Z (GMT).

Poster presented at the From Basic Sciences to Clinical Research - 1st Internacional Congress of CiiEM. Caparica, Portugal, 27-28 November 2015

Poster presented at Young Researchers in Life Sciences, 26-28 May 2014, Institut Pasteur, Paris, France.

1st International Caparica Conference on Chromogenic and Emissive Materials "The network of chemical reactions of the compound 4′-(2-hydroxyethoxy)-7-hydroxyflavylium and its photochromic properties were studied in the absence and presence of β-cyclodextrin. The system was characterized by 1H NMR, UV–Vis, continuous irradiation and circular dichroism. In the presence of β-cyclodextrin 4.8 mM the pK′a is reduced to 2.2. The association constants with β-cyclodextrin, follow the order trans-chalcone > quinoidal base > flavylium cation, respectively 1.7 × 103 M−1; 5.6 × 102 M−1; ≈0. The rate of inter-conversion of the network species increases in the presence of β-cyclodextrin circa 2.6 times. The appearance of an induced circular dichroism signal of trans-chalcone inside the β-cyclodextrin is described for the first time. It gives information about the position of the guest inside the host and allows the calculation of the respective association constant."

“NOTICE: this is the author’s version of a work that was accepted for publication in Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. Changes resulting from the publishing process, such as peer review, editing, corrections, structural formatting, and other quality control mechanisms may not be reflected in this document. Changes may have been made to this work since it was submitted for publication. A definitive version was subsequently published in Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. Volume 1834, Issue 6, June 2013, Pages 1010–1022, DOI 10.1016/j.bbapap.2012.12.001" "Protein glycation induces structural and stability changes that impair protein function, and is associated with several human neurodegenerative diseases, such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease and Familial Amyloidotic Polyneuropathy. Recently we have shown that methylglyoxal induces and stabilizes the formation of small native-like aggregates in the amyloidogenic protein insulin and the same was previously shown for α-synuclein. However, the fundamental biophysical mechanism underlying such methylglyoxal-induced protein aggregation is not yet fully understood. In this study, we used the model protein cytochrome c to characterize the specific glycation targets and to investigate the glycation effects on protein structure, stability and aggregation. Methylglyoxal was found modify cytochrome c in a single residue and to induce the formation of cytochrome c native-like aggregates. Additionally, it is shown that methylglyoxal glycation of cytochrome c also results in the formation of a partially unfolded species. Interestingly, the formation of this partially unfolded species is not implicated in the aggregation process, a clear difference from amyloid fibril mechanisms that involve partially or totally unfolded intermediates. Equilibrium-unfolding experiments using guanidinium hydrochloride shows that glycation strongly reduces cytochrome c conformational stability. This reduction is balanced by aggregation that increases conformational stability. The data collected from analytical and spectroscopic techniques along with kinetic analysis based on least-squares parameter fitting and statistical model discrimination permitted the proposal of a comprehensive thermodynamic and kinetic model for native-like aggregation of methylglyoxal glycated cytochrome c."

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Universitário Egas Moniz Este estudo estabelece, através da espetroscopia de Raman, uma metodologia de identificação e quantificação, quer de substâncias ou misturas precursoras de explosivos, quer de explosivos improvisados, em cenário policial de fiscalização ou de combate ao terrorismo. Nestes ambientes, as substâncias apresentam-se desconhecidas, sendo necessário a sua identificação e, em certos cenários, a quantificação, para que todo o trabalho policial seja realizado com sucesso. Foram identificados dez explosivos improvisados, fabricados com substâncias sujeitas a restrições, e determinadas quais as substâncias ou misturas de substâncias a analisar. Foram realizadas análises em triplicado a dez explosivos improvisados, a vinte e cinco substâncias no maior grau de pureza conseguido, a sessenta substâncias preparadas em diferentes percentagens de concentração e a dois sais usados para realizar algumas preparações sólidas, perfazendo no total duzentos e noventa e uma análises realizadas. A análise química foi efetuada com recurso à técnica de espetroscopia de Raman, por se caraterizar como uma técnica robusta, portátil e, acima de tudo, uma técnica que não exige nenhuma, ou muito pouca, preparação da amostra, possibilitando uma análise in loco de forma rápida e segura, podendo a leitura ser realizada de forma direta ou através do recipiente onde esta se encontra. O desenvolvimento do presente trabalho permitiu a criação de uma biblioteca com sessenta e nove entradas iniciais de substâncias precursores de explosivos, no seu maior grau de pureza conseguido e em diversas concentrações. Conseguiram-se obter resultados positivos na identificação de substâncias precursores de explosivos, per si e inseridas em misturas de substâncias – explosivos improvisados. Embora mostre várias vantagens, a técnica e instrumentação empregada apresenta algumas limitações, i.e., não permitiu a identificação de algumas substâncias ou de alguns explosivos improvisados e o detetor saturava facilmente em alguns casos. No entanto, estas limitações poderão ser suplantadas ao se empregar passos adicionais de otimização. This study establishes, through Raman spectroscopy, a methodology for the identification and quantification, either of substances or mixtures precursors of explosives, or of improvised explosives, in a police surveillance or combat against terrorism scenario. In these environments, substances are unknown, requiring identification and, in certain scenarios, quantification, so that all police work is carried out successfully. Ten improvised explosives, manufactured with substances subject to restrictions, were identified and the substances or mixtures of substances to be analyzed were determined. Analyzes were carried out in triplicate to ten improvised explosives, to twenty-five substances in the highest degree of purity achieved, to sixty substances prepared in different concentration percentages and to two salts used to perform some solid preparations, making a total of two hundred and nighty one analyzes performed. The chemical analysis was performed using the Raman spectroscopy technique, as it is characterized as a robust, portable technique and, above all, a technique that does not require any, or very little, sample preparation, enabling an in loco analysis quickly and safely, and the reading can be performed directly or through the container where it is located. The development of the present work allowed the creation of a library with 69 initial entries of explosive precursor substances, in their highest degree of purity achieved and in different concentrations. Positive results were obtained in the identification of explosive precursor substances, per se and inserted in mixtures of substances - improvised explosives. Although it shows several advantages, the technique and instrumentation employed have some limitations. I.e., did not allow the identification of some substances or some improvised explosives and the detector saturated easily in some cases. However, these limitations can be overcome by employing additional optimization steps.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Universitário Egas Moniz O trabalho que se segue consiste na discriminação de diferentes tipos de pólvora, com base em análises cromatográficas e espectroscópicas, e com o propósito de possibilitar a identificação de amostras de pólvora desconhecida, em contextos policiais e forenses. Estas análises foram efetuadas em 29 tipos de pólvora diferentes, provenientes das três marcas de fabricantes de pólvoras e munições mais comercializadas em Portugal, a Maxam (através da sua sucursal portuguesa, a Cacicambra), a Nobel Sports e a Baschieri & Pellagri. Para ambos os métodos foram utilizados três replicados de cada tipo de pólvora, perfazendo um total de 87 amostras. Esta investigação foi realizada em cooperação com o Centro Nacional de Peritagens, sediado no Departamento de Armas e Explosivos da Polícia de Segurança Pública de Lisboa. A análise química foi efetuada através de GC/MS, o solvente utilizado foi o diclorometano (DCM) e elaborou-se um perfil químico das pólvoras através dos seus cromatogramas, visualizando os diferentes picos cromatográficos e respetivas áreas, correspondentes às substâncias presentes em cada pólvora. A análise espectroscópica foi realizada através de NIRS. Foram efetuadas leituras diretamente nos grãos de pólvora e também na pólvora dissolvida em metil-etil-cetona (MEK). Os espectros foram obtidos através do Vision Spectral Analysis Software. Relativamente aos resultados, através da análise de GC/MS verificou-se a discriminação de 15 das 29 pólvoras, sendo que as restantes 14 apresentaram perfis químicos demasiado semelhantes para poderem ser diferenciados através desta técnica. A análise de NIRS na pólvora dissolvida em MEK revelou-se inconclusiva uma vez que o aparelho apenas conseguiu detetar a presença do solvente utilizado. Já a análise de NIRS dos grãos de pólvora permitiu construir, através dos dados dos espectros, um modelo estatístico capaz de discriminar corretamente todas as 29 pólvoras em estudo, sendo, por isso, a técnica mais robusta apresentada neste estudo.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Universitário Egas Moniz Nos últimos anos, a prevalência do uso de canabinóides tem aumentado rapidamente, inclusive em mulheres grávidas. Fitocanabinóides, substâncias extraídas da Cannabis sativa, atuam principalmente pela ligação aos recetores canabinóides 1 e 2 (CB1R e CB2R), exercendo efeitos psicoativos e não psicoativos. Os canabinóides sintéticos são uma classe de Novas Substâncias Psicoativas, e apresentam altas afinidades de ligação aos CB1/2R. Visto que o sistema endocanabinóide é altamente relevante para o desenvolvimento embrionário, temos como hipótese que o consumo de canabinóides durante a gravidez pode causar defeitos no neurodesenvolvimento. Assim, foi utilizado um modelo tridimensional que recapitula os passos iniciais do neurodesenvolvimento. Organoides corticais com 46 dias foram gerados e expostos aos fitocanabinóides Δ9-tetrahidrocanabinol (Δ9-THC) e canabidiol (CBD), e aos canabinóides sintéticos THJ-018 e EG-018 por 9 dias, mimetizando a exposição pré-natal aos mesmos. Estes foram também administrados na presença de um antagonista dos CB1R, para determinar se os seus efeitos são mediados por estes recetores. Análises de imunofluorescência, RNA e Western Blot foram realizadas para avaliar alterações em marcadores de diferenciação neuronal, e na expressão dos recetores canabinóides. Foi efetuado single-cell calcium imaging para avaliar a funcionalidade celular. Embora preliminares, estes resultados sugerem que o Δ9-THC pode retardar a diferenciação neuronal e afetar a funcionalidade celular por mecanismos mediados pelos CB1R. O CBD induziu mínimas alterações nestes parâmetros, mas evidenciou a interação complexa entre CB1R e CB2R. Os canabinóides sintéticos THJ-018 e EG-018 apresentaram um impacto mais negativo comparativamente aos fitocanabinóides. Estes induziram uma redução de progenitores neurais e neurónios maduros, e um aumento da apoptose, sugerindo efeitos neurotóxicos. Algumas destas alterações não foram revertidas pelo antagonista dos CB1R, indicando a interação com outros recetores. No entanto, os nossos resultados não obtiveram significância estatística, evidenciando a necessidade de validação adicional. Contudo, este projeto demonstra o potencial dos canabinóides para impactar o neurodesenvolvimento embrionário, evidenciando a importância da investigação científica sobre exposição pré-natal a canabinóides. In the last years, the use prevalence of cannabinoids has been rapidly rising, including among pregnant women. Phytocannabinoids, substances extracted from Cannabis sativa, act mainly by binding to cannabinoid receptors 1 and 2 (CB1R and CB2R), exerting a range of psychoactive and nonpsychoactive effects. Synthetic cannabinoids are a class of New Psychoactive Substances, and also present high affinities to CB1/2R. Since the endocannabinoid system is highly relevant for embryonic development, we hypothesise that cannabinoids consumption during pregnancy can lead to neurodevelopmental defects. For this purpose, a three dimensional model, recapitulating the first steps of neurodevelopment, was used. 46 days-old dorsal forebrain organoids were generated and exposed to phytocannabinoids Δ9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC) and cannabidiol (CBD), and to synthetic cannabinoids THJ-018 and EG-018 for 9 days, to mimic prenatal exposure to these compounds. They were also administrated in the presence of a CB1R antagonist, to determine if the effects are CB1R-mediated. Immunofluorescence, RNA analysis and Western Blot were performed to evaluate alterations in neuronal differentiation markers, and in CB1/2R expression levels. Single-cell calcium imaging was performed to evaluate cell functionality. Although preliminary, the results suggest that Δ9-THC might delay neuronal differentiation and affect neuronal functionality by mechanisms mediated by CB1R. CBD induced minimal effects on these parameters, but highlighted the complex interaction between CB1R and CB2R. Synthetic cannabinoids THJ-018 and EG-018 had a more negative impact compared to phytocannabinoids. Their administration led to a reduction of neural progenitors and mature neurons, and increased apoptosis, suggesting neurotoxic effects. Some of these alterations were not reverted by the CB1R antagonist, indicating interation with other receptors. However, our results lack statistical significance, highlighting the need for further confirmation. Nonetheless, this project demonstrates the potential of cannabinoids to impact embryonic neurodevelopment, highlighting the importance of research on prenatal exposure to cannabinoids.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Universitário Egas Moniz Parkinson’s disease is a fast-growing disease in terms of prevalence, especially in the last generation. The symptoms of PD are usually associated with impairments in motor skills. Lewy bodies are a PD feature widely accepted by the scientific community. The Lewy bodies are mainly composed by α-synuclein (α-syn). According to the literature, the formation of α-syn oligomers due to folding changes forming β-sheets, which are seen in amyloid fibrils structure is the currently accepted hypothesis regarding the rise of the Lewy pathologies and their neurodegenerative roles. Cannabis is used by Parkinson´s Disease patients worldwide to reduce symptoms. Recent studies suggest that the effects of phytocannabinoids are mediated by CB1 and/or CB2 receptors. The present study aimed to understand the interactions between α-synuclein and cannabidiol, by studying the behaviour of α-synuclein in solution when exposed to this phytocannabinoid. After α-synuclein purification, the protein was incubated, with Cannabidiol (CBD) and its oligomeric profile, aggregation rate and secondary structure was assessed by gel exclusion chromatography, ThT fluorescence spectroscopy and circular dichroism. The results from the size-exclusion chromatography reveal an equilibrium between dimer and tetramer, with a higher increase of the dimer in the CBD sample. Regarding the circular dichroism, the percentage of random coil decreased in both samples. The ThT analysis led to the conclusion that there was no aggregation of α-synuclein. At low protein concentration the size-exclusion chromatography revealed a dynamic equilibrium between the dimeric and monomeric species, which in turn change to other monomeric form, appearing in the chromatogram, towards the end of the experiment. A Doença de Parkinson é uma doença em crescimento rápido em termos de prevalência, em especial na última geração. Os sintomas da Doença de Parkinson estão geralmente associados com debilidades no sistema motor. Os corpos de Lewy são maioritariamente aceites pela comunidade científica como um marcador da Doença de Parkinson. Os corpos de Lewy são maioritariamente compostos por α-sinucleína. De acordo com a literatura, a formação de oligómeros de α-sinucleína devido a alterações no enrolamento de folhas-β, vistas em fibras amilóides, é a hipótese atualmente aceite em relação ao aumento das patologias de Lewy e as suas representações neurodegenerativas. A cannabis é utilizada por doentes com Parkinson para reduzir os sintomas. Estudos recentes indicam que o efeito dos fitocanabinóides são mediados pelos receptores CB1 e/ou CB2. O presente estudo tem como objetivo perceber as interações entre a α-sinucleína e o canabidiol, através do estudo do comportamento da α-sinucleína em solução. Depois da purificação da α-sinucleína, esta foi incubada com canabidiol (CBD) e o seu perfil oligomérico, nível de agregação e estrutura secundária através de cromatografia de exclusão molecular, espetroscopia de fluorescência com ThT e dicroísmo circular. Os resultados da cromatografia por exclusão molecular revelaram um equilíbrio entre o dímero e o tetrâmero, com um aumento do dímero na amostra com CBD. No dicroísmo circular, a percentagem de random coil diminuiu em ambas as amostras. A análise de Tioflavina-T levou à conclusão de que não existiu agregação. No ensaio com menor concentração, na cromatografia de exclusão molecular, existiu um equilíbrio dinâmico entre o dímero e o monómero, que por sua vez se alterou para outra forma monomérica no fim da experiência.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Universitário Egas Moniz The forensic investigations regarding firearm-related crimes are of paramount importance, focusing mainly on visual analysis of marks in firearm-related elements. When the cartridge or the projectile, printed with specific marks from the firearm who fired the round, are not available, the analysis needs to find alternative approaches to continue with the forensic investigation. This often leads to the chemical analysis of the compounds created when the firearm is discharged. With the popular and political pressure on manufacturers, the most characteristics elements of gunshot residue, such as lead, antimony and barium, are quickly being removed from the formulations and replaced with others that grant gunshot residue chemical analysis less probatory value. This led to an increase in studies focused on the organic compound profiles of the ammunitions. These are mainly located in the propellant – smokeless gunpowder. The most common procedures for the profile analysis of chemical compounds in gunshot residues are spectroscopy and chromatography. In the present work, we propose the use of solid-phase microextraction in combination with Gas Chromatography-Flame Ionisation Detection and Attenuated Total Reflectance- Fourier Transform Infrared Spectroscopy to evaluate their discriminative capability for the determination of chemical profile of different gunpowder samples. The results showed visible differences among samples from different manufacturers and models. The obtained data was used in for training and validation of predictive models, with the objective of identifying the manufacturer and model of specific ammunitions. The results showed an overall accuracy of around 60% when classifying data not used for the predictive model. Problems in data acquisition may have harmed the predictor's accuracy, while overfitting of the models is also a possibility. Nevertheless, these results showed that the analytical approaches and predictive model herein proposed have great potential for identifying specific ammunition manufacturers and models. As investigações criminais a crime onde foi utilizada arma de fogo é de extrema importância, baseando-se principalmente na análise visual de marcas em elementos municiais. Quando o invólucro ou o projétil, com essas marcas especificas da arma de fogo que disparou a munição, não estão disponíveis, é preciso encontrar abordagens alternativas para prosseguir com a investigação. Isto leva frequentemente à análise química dos compostos gerados pelo disparo da arma de fogo. Devido à pressão popular e política sobre os fabricantes, os elementos mais característicos do resíduo de disparo de uma arma de fogo, como o chumbo, antimónio e bário, estão rapidamente a ser removidos das formulações e substituídos por outros que conferem a este resíduo um menor valor probatório. Isto levou a um aumento dos estudos focados no perfil químico dos compostos orgânicos de uma munição. Estes encontram-se principalmente na carga propulsora – pólvora química. Os procedimentos mais comuns para a análise do perfil dos compostos químicos em resíduo de disparo de arma de fogo são os espetroscópicos e os cromatográficos. Neste trabalho, propomos o uso de microextração de fase sólida em combinação com cromatografia gasosa acoplada a detetor de ionização de chama e ainda Espetroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier com Refletância Total Atenuada para avaliar o seu potencial discriminativo relativo à determinação do perfil químico de várias amostras de pólvora química. Nos resultados são visíveis diferenças entra amostras de diferentes fabricantes e modelos de munições. Os dados obtidos foram usados para treinar e validar modelos preditivos, com o objetivo de identificar o fabricante e o modelo de munições específicas. Os resultados obtidos apresentação uma precisão de cerca de 60% dos modelos preditivos quando classificam dados que não foram usados no seu treino. Problemas relacionados com a aquisição de dados podem ter prejudicado a precisão do modelo, sendo que overffiting dos modelos é também uma possibilidade. Contudo, estes resultados provam que esta abordagem analítica, aliada aos modelos preditivos desenvolvidos, tem um elevado poder discriminatório na identificação dos fabricantes e modelos de munições específicas.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Universitário Egas Moniz A canábis é a substância de abuso prevalente nos padrões de consumo atuais. Adicionalmente, verifica-se um desconhecimento da composição destes produtos pelo consumidor e uma tendência crescente nos teores de tetrahidrocanabinol (THC). Esta problemática conduz a uma série de consequências, nomeadamente a generalização do consumo recreativo, a automedicação desregulada e o desencadeamento de psicoses. Neste sentido, é fundamental desenvolver metodologias analíticas que permitam caracterizar estes produtos. No presente trabalho, pretende-se desenvolver e validar uma metodologia analítica para determinação de Δ9-THC, CBD, CBN, THCA e CBDA em amostras de canábis herbáceo. Para tal, recorreu-se à extração sólido-líquido (SLE) assistida por ultrasonicação e combinou-se o teste colorimétrico Fast Blue BB à cromatografia gasosa acoplada à espetrometria de massa (GC-MS). A utilização do teste colorimétrico permitiu definir com antecipação a massa de amostra necessária à análise cromatográfica. Esta etapa previne a saturação da instrumentação, o que se traduz num maior intervalo de tempo decorrente entre manutenções e na extensão da sua utilização. Adicionalmente, evita a reinjeção da amostra, possibilitando a realização de mais análises no mesmo intervalo de tempo. A metodologia desenvolvida é seletiva, apresenta linearidade, precisão e veracidade satisfatórias e limiares analíticos adequados ao objetivo do trabalho. Neste parâmetro, destaca-se o limite de quantificação (LOQ) do Δ9-THCTMS de 0,2% (m/m), sendo este correspondente ao teor de máximo de THC aceitável em plantas para fins industriais. Os teores de Δ9-THC e THCA determinados em amostras provenientes de apreensões policiais encontram-se entre 2,72% e 18,47% (m/m) e 10,95% e 25,06% (m/m), respetivamente. Estes valores estão em concordância com os valores reportados pelo Observatório Europeu da Droga e da Toxicodependência (EMCDDA) e pela literatura. Relativamente às amostras provenientes de lojas, os níveis de CBD e CBDA determinados encontram-se entre 2,50% e 6,60% (m/m) e 5,84% e 24,10% (m/m), respetivamente, e os teores de Δ9-THC abaixo do LOQ. A metodologia apresentada permite cumprir o objetivo proposto no presente trabalho. Deste modo, a metodologia desenvolvida poderá contribuir para a compreensão do panorama atual associado ao consumo de canábis e observar tendências face à composição dos produtos consumidos. Cannabis is the substance of abuse prevalent in current consumption patterns. In addition, there is a misknowledge of the composition of these products by the consumer and a growing trend in the levels of tetrahydrocannabinol (THC). This problem leads to several consequences, including the generalization of recreational consumption, deregulated self-medication and the triggering of psychoses. In this sense, it is essential to develop analytical methodologies that allow to characterise these products. In the present work, it is intended to develop and validate an analytical methodology for the determination of Δ9-THC, CBD, CBN, THCA and CBDA in herbaceous cannabis samples. For this, the solid-liquid extraction (SLE) assisted by ultrasonication was used and the colorimetric test Fast Blue BB was combined with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The use of the colorimetric test allowed to define with anticipation the sample mass necessary for chromatographic analysis. This step prevents the saturation of instrumentation, which results in a longer interval of time between maintenance and the extent of its use. Additionally, it avoids the reinjection of the sample, allowing more analysis in the same time interval. The methodology developed is selective, presents satisfactory linearity, precision and trueness and analytical limits appropriate to the objective of the work. In this parameter, the quantification limit (LOQ) of Δ9-THC-TMS of 0.2% (m/m) stands out, corresponding to the maximum acceptable THC content in plants for industrial purposes. The levels of Δ9-THC and THCA determined in samples from police seizures are between 2.72% and 18.47% (m/m) and 10.95% and 25.06% (m/m), respectively. These values are in agreement with the data reported by the European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction (EMCDDA) and the literature. For store samples, the levels of CBD and CBDA determined are between 2.50% and 6.60% (m/m) and 5.84% and 24.10% (m/m), respectively, and Δ9- THC contents below LOQ. The methodology presented allows to achieve the objective proposed in the present study. Thus, the methodology developed can contribute to the understanding of the current panorama associated with cannabis consumption and observe trends in the composition of the products consumed.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Universitário Egas Moniz A importância da análise das plantas de canábis tem vindo crescer, nomeadamente para controlo de qualidade dentro dos produtos para uso recreacional, indústria medicinal, ou ainda para discriminação forense entre a tipologia de substância de abuso ou cânhamo. No presente estudo foi desenvolvido um método com recurso a cromatografia líquida de alta eficiência com deteção por fotodíodos (HPLC-DAD), destinado à análise quantitativa dos canabinoides principais da planta de canábis: Δ9 -tetrahidrocanabinol (Δ9 -THC) e canabidiol (CBD), respetivas formas ácidas, canabinol (CBN) e o Δ8 - tetrahidrocanabinol Δ8 -THC, em material vegetal da canábis. A etapa de extração foi otimizada com recurso a desenhos experimentais, permitindo uma recuperação ~100% dos canabinoides. As amostras herbáceas foram extraídas com etanol:acetonitrilo (50:50), com recurso a ultrassons, e posterior deteção e quantificação dos canabinoides em HPLC-DAD, sendo apenas necessário utilizar 50 mg de amostra. Para os óleos da planta foi aplicada uma simples diluição em etanol. A separação cromatográfica foi conseguida numa coluna de fase reversa, utilizando como eluente uma mistura de acetonitrilo/água contendo 0,1% ácido fórmico. Os compostos foram quantificados a 230 nm, em 30 minutos de corrida. Os ensaios de validação do método mostraram que esta era linear (R2>0,997), sendo seletivo e sensível, com a precisão e veracidade adequados, bem como excelente estabilidade e repetibilidade entre análise de amostra real. Os principais canabinoides identificados (% p/p) em amostras reais foram o Δ9-THCA, CBD, CBDA, e o Δ9-THC. A presente metodologia foi aplicada com sucesso a várias amostras reais ricas em THC ou CBD, demonstrando a sua eficácia em análises de rotina para permitir dar resposta à atual procura de serviços de análise desta planta e seus derivados. The importance of the analysis of cannabis plants has been developing globally, namely for quality control within products for recreational use, medicinal industry, or even for forensic discrimination between the typology of substance of abuse or hemp, for industrial purposes. In the present study, a HPLC-DAD method was developed for the quantitative analysis for the main cannabinoids: Δ9-THC and CBD, their acid forms, CBN and Δ8 -THC, in cannabis plant material. Extraction was optimized using experimental design (DoE), granting ~100% recovery of the cannabinoids. Herbal samples were extracted with ethanol:acetonitrile (50:50) by ultrasonication, and subsequent detection and quantification of cannabinoids in HPLC-DAD, only requiring 50 mg of sample. For the plant oils a simple dilution in ethanol was necessary. Chromatographic separation was achieved on a reverse-phase C18 column, using an acetonitrile/water mixture containing 0.1% formic acid as eluent. The compounds were quantified at 230 nm in 30 minutes of run time. Method validation proved its linearity (R2>0.997), being selective and sensitive, with excellent results for precision and trueness, as well as excellent stability and repeatability. The main cannabinoids identified (% w/w) in actual samples were Δ9-THCA, CBD, CBDA, and Δ9-THC. The presented method was successfully applied to real samples, demonstrating its suitability in routine analyses to assist current demand for analysis services of this plant and its derivatives.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Universitário Egas Moniz Enquadramento: A alteração legislativa no Código Penal foi o grande suporte e alavanca na defensa dos direitos dos animais de companhia. Objetivo: Desenvolver, otimizar e validar um método para a identificação de fármacos e pesticidas organofosforados em amostras biológicas (sangue) de cães e gatos por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa para dar resposta a situações de envenenamento de animais de companhia com validade em tribunal. Materiais e métodos: A metodologia utilizada é constituída por dois métodos. O método de extração em fase sólida (SPE) e o método confirmatório de cromatografia acoplada à espetrometria de massa (GC/MS). Resultados: De modo a validar o método pela guideline Standard Practides for Method Validation in Forensic Toxicology foi possível identificar um limite de deteção (LOD) a 50 ng/mL para 8 compostos. Conclusão: A análise toxicológica em animais de companhia torna- Background: The legislative change in the Penal Code was the great support and leverage in the defense of the rights of companion animals. Objective: To develop, optimize, and validate a method for the identification of drugs and organophosphate pesticides in biological (blood) of dogs and cats by gas chromatography coupled with mass spectrometry to respond to situations of poisoning of pets with court validity. Materials and methods: The methodology used is obtained by two methods. The solid phase extraction method (SPE) and the confirmation method of chromatography coupled with mass spectrometry (GC/MS). Results: In order to validate the method by the guideline, standard practices for method validation in forensic toxicology it was possible to identify a limit of detection (LOD) of 50 ng/mL for 8 compounds. Conclusion: A toxicological analysis in companion animals becomes a challenging and important process in the diagnosis in cases of poisoning.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Universitário Egas Moniz O mercado de novas substâncias psicoativas tem vindo a crescer continuadamente de forma a contornar as leis que regulam a venda e o consumo de substâncias de abuso ilícitas. Os consumidores destas substâncias entendem-nas como legais e menos tóxicas em comparação com as substâncias ilegais que mimetizam. Os canabinóides sintéticos são atualmente a classe de novas substâncias mais vendidas. O presente projeto de investigação foi desenvolvido com o propósito de auxiliar na investigação destas substâncias, passando pela utilização de um modelo celular eucariota, a Saccharomyces cerevisiae, para análise da citotoxicidade de três canabinóides sintéticos, um de segunda geração (THJ-018) e dois de terceira geração (EG-018 e SGT-151), como adquiridos na internet. Tendo a sua toxicidade foi verificada através de ensaios de citotoxicidade, nomeadamente ensaios ATP, MTT e GSH. Os resultados sugerem que os canabinóides ativam a via glicolítica, diminuindo a fosforilação oxidativa para concentrações mais elevadas da substância, com um efeito no crescimento celular. The market for new psychoactive substances has been growing continuously in order to circumvent the laws that regulate the sale and consumption of drugs. Consumers of these substances understand them as legal and less toxic compared to the illegal substances they mimic. Synthetic cannabinoids are currently the major-selling class of new psychoactive substances. The present research project was developed with the purpose of supporting the investigation of these substances, through the utilization of a eukaryotic cell model with Saccharomyces cerevisiae and the analysis of the cytotoxicity of three synthetic cannabinoids, one of the second generation (THJ-018) and two of third generation (EG-018 and SGT-151), as purchased on the internet. Its toxicity was verified through cytotoxicity tests, namely ATP, MTT and GSH tests. The results suggest that cannabinoids activate the glycolytic pathway, decreasing oxidative phosphorylation to higher concentrations of the substance, with an effect on cell growth.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Universitário Egas Moniz In the last few years, the sale of new psychoactive substances (synthetic drugs) has been steadily increasing on the street markets, since they are designed to circumvent the laws ruling drug use and are perceived by consumers as legal and less toxic compared to the illegal substances that they mimic. Within these new substances that are currently sold, synthetic cannabinoids are among the top selling classes. In order to contribute to the study of these substances, the present research project was developed, which aimed to analyse the cytotoxicity of three synthetic cannabinoids, one from the second generation (THJ-018) and two from the third generation (EG-018 and SGT-151), as purchased from the supplier and after purification. The human cell line SH-SY5Y was used, since it expresses the CB1 receptor. Thus, after purchasing the packaging via Internet, GC/MS content analysis revealed the existence of impurities. Subsequently, the original pack contents were purified by HPLC/DAD and the cytotoxicity of the obtained synthetic cannabinoids was verified by cell viability assays, namely MTT assays, where the cytotoxicity of the pure synthetic cannabinoids versus the original pack contents was compared. Contrary to the original contents of the THJ-018 and EG-018 packages, cell viability assays revealed a higher cytotoxicity of the original SGT-151 package contents than this synthetic cannabinoid after purification, suggesting that other substances present in the product enhance its toxicity. Nos últimos anos, o número de novas substâncias psicoativas (drogas sintéticas) tem vindo a crescer de forma continuada no mercado, uma vez que são desenhadas com o objetivo de contornar as leis que regulam o consumo e a venda das drogas. Estas substâncias são percecionadas pelos consumidores como legais e menos tóxicas em comparação com as substâncias ilegais que mimetizam. Dentro das novas substâncias que são atualmente comercializadas, os canabinoides sintéticos encontram-se entre as classes mais vendidas. Com o propósito de contribuir para o estudo destas substâncias, desenvolveu-se o presente projeto de investigação, que visou analisar a citotoxicidade de três canabinoides sintéticos, um de segunda geração (THJ-018) e dois de terceira geração (EG-018 e SGT-151), como adquiridos no fornecedor e após purificação. Foi empregue a linha celular humana SH-SY5Y, uma vez que expressa o recetor CB1. Após aquisição das embalagens via Internet, a análise do seu conteúdo por GC/MS revelou a presença de impurezas. Subsequentemente, o conteúdo original das embalagens foi purificado através de HPLC/DAD e a citotoxicidade dos canabinóides sintéticos obtidos foi verificada através de ensaios de viabilidade celular, nomeadamente ensaios MTT, onde se comparou a citotoxicidade dos canabinoides sintéticos puros versus o conteúdo original da embalagem consumido pelos utilizadores. Ao contrário do verificado com o conteúdo original das embalagens de THJ-018 e EG-018, os ensaios de viabilidade celular revelaram uma citotoxicidade do conteúdo original da embalagem SGT-151 superior à registada para este canabinoide sintético após purificação, sugerindo por isso que outras substâncias presentes no produto comercializado potenciam a sua toxicidade.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz O comportamento agressivo tem geralmente origem em transtornos psiquiátricos e doenças neurológicas. A farmacogenética permite conhecer as principais alterações genéticas, ao nível de cada polimorfismo envolvido, que desencadeiam estes comportamentos anormais permitindo pesquisar e desenvolver fármacos que os possam contrariar/inibir. Por outro lado, também podem surgir comportamentos agressivos induzidos pela utilização de determinados fármacos, verificando-se, nesses casos, a necessidade de se suspender essa terapêutica, realizando-se a substituição da mesma por outra que não apresente estes efeitos secundários. Os genes humanos mais importantes associados a comportamentos agressivos anormais são os que se relacionam com as hormonas sexuais, as vias dopaminérgicas e as serotoninérgicas. Consequentemente, a farmacogenética permite estudar e conhecer os mecanismos que influenciam o comportamento agressivo e, deste modo, detetar quais os fármacos que podem provocar respostas agressivas, salientando-se os antiepilépticos e as benzodiazepinas como os mais críticos. Contudo, também existem fármacos que se aconselham para o tratamento agressivo e diminuição de tentativas de suicídio, destacando-se o lítio, antidepressivos, anticonvulsionantes, antipsicóticos, betabloqueadores e buspirona. Para a realização desta monografia foi necessário efetuar uma revisão da literatura existente sobre o tema proposto tendo em conta o comportamento agressivo, os genes associados, as possíveis correlações entre os fármacos prescritos e o comportamento agressivo e, por último, a sua terapêutica.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz Na Medicina Dentária Forense a identificação humana tem sido a vertente mais explorada, onde a perícia Médico Dentária, baseada em conhecimentos específicos e experiência do perito, é decisiva, nomeadamente quando a identificação não é possível por outros meios. São exemplos a desfiguração, a decomposição da matéria orgânica a carbonização ou nas grandes catástrofes que envolve um elevado número de vítimas a identificar. A natureza única da anatomia dentária e dos tratamentos dentários protéticos bem como das restaurações, garante grande precisão na identificação. Pode-se afirmar que as estruturas dentárias têm grande importância na identificação visto manterem a sua estabilidade mesmo sob condições adversas, ao contrário de outras estruturas do organismo, permitindo a sua preservação e a sua comparação com os registos ante mortem. A Medicina Dentária Forense assume importância capital no seio das Ciências Forenses, na medida em que permite a identificação in extremis desde que os Médicos Dentistas registem e preservem a informação clínica dos seus pacientes, onde se deverão encontrar os elementos fundamentais de identificação através da comparação, permitindo assim confrontar os registos ante mortem com os vestígios post mortem. Importa assim consciencializar, quer na área da Medicina Dentária quer na área do Direito, sobre as possibilidades e limitações que esta área do conhecimento.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz Objetivo - Estudar o efeito do Δ9-tetra-hidrocanabinol (THC) na quantidade de fluxo salivar estimulado e não estimulado, e também na flora bacteriana (nomeadamente no número de unidades formadoras de colónias (ufc) de Streptococcus e Staphylococcus), de indivíduos fumadores de tabaco e canábis em comparação com fumadores só de tabaco e com indivíduos não fumadores. Materiais e métodos - Neste estudo utilizou-se uma amostra de 45 indivíduos (n=45), divididos por 3 grupos de igual número de sujeitos (15), de acordo, com os seus hábitos de consumo de tabaco e canabinóides. O primeiro grupo corresponde a sujeitos não fumadores (i), o segundo grupo sujeitos fumadores só de tabaco (ii), e o terceiro grupo fumadores de tabaco e canabinóides (iii). Todos os sujeitos foram submetidos a dois questionários, o primeiro destinado a traçar o perfil de hábitos de consumo, o segundo mais específico, destinado ao diagnóstico de Xerostomia. Foi recolhida saliva não estimulada e estimulada (min/ml),sendo determinado o valor de pH de cada amostra. Foi igualmente determinado, em cada amostra recolhida o número de ufc de Streptococcus orais e de Staphylococcus sp. Os dados obtidos foram analisados, recorrendo a metodologias de análise estatística. Resultados - O consumo de canábis teve um impacto estatisticamente significativo na “sensação de boca seca”, os indivíduos consumidores tiveram o maior score de resposta ao questionário de diagnóstico de xerostomia mas o seu consumo não teve impacto estatisticamente significativo na quantidade de saliva produzida (ml/min) em comparação com os outros grupos. Esta investigação revelou diferença estatisticamente significativa no crescimento bacteriano total, sendo os indivíduos fumadores apresentar maior número de unidades formadoras de colónias (UFC) comparativamente ao grupo de controlo. Conclusão - O consumo de canábis tem elevada influência na “sensação de boca seca” (xerostomia), apesar de não ter tido resultados com diferenças estatisticamente significativas na quantidade de saliva produzida, na comparação com os restantes grupos. Fumar cria um ambiente propício para o crescimento bacteriano anaeróbio facultativo.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz A doença do Alzheimer (DA) é uma das doenças mais complexas entre as patologias do foro neurodegenerativo. Esta é caracterizada como uma doença lenta, progressiva e irreversível que se manifesta através da perda de cognição e memória. A DA é responsável por cerca de 50% a 70% dos casos de demência. A incidência e a prevalência da doença aumentam exponencialmente com a idade, principalmente em idades acima dos 65 anos. Para esta doença são conhecidas duas formas, o Alzheimer de início tardio e o Alzheimer de início precoce. Estudos recentes sugerem que alterações de natureza epigenética estão associadas à DA. Esta nova área de estudo associa a influência do ambiente sobre a expressão génica, ou seja a capacidade de fatores ambientais induzirem alterações no fenótipo sem afectarem a sequência de ADN. As principais alterações epigenéticas que afetam o fenótipo são a nível da metilação do ADN, modificação de histonas, modificação da cromatina e regulação do RNA não codificante. A terapia na DA tem como objetivos a terapêutica específica, a terapêutica profilática e o tratamento sintomático. Os fármacos disponíveis para o tratamento são a tacrina, o donepezilo, a galantamina, a rivastigmina e a memantina. Para a DA o único objetivo da utilização destes fármacos é retardar a sua progressão. Tem também vindo a ser estudada a hipótese da utilização de terapia epigenética para o seu tratamento. As classes mais desenvolvidas neste âmbito são as dos inibidores das DNMT e inibidores das HDACs. Estas classes são usadas com o objetivo de reverter as alterações epigenéticas. O tema abordado neste trabalho é relativamente recente, sendo uma área em desenvolvimento. Com isto, é essencial que a investigação desta doença continue no âmbito de se encontrar uma cura e diminuir assim a taxa de mortalidade.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz As doenças neurodegenerativas são doenças crónicas de caráter degenerativo que se caracterizam pela disfunção e perda progressiva de neurónios no sistema nervoso central (SNC). Estas patologias afetam cerca de 37 milhões de pessoas em todo o mundo e a tendência é crescente. Estima-se que o número de indivíduos com algum tipo de neurodegenerescência duplique a cada 20 anos, o que faz com que as doenças neurodegenerativas sejam consideradas uma das maiores preocupações da comunidade científica e da sociedade em geral. A doença de Alzheimer, a doença de Parkinson e a esclerose múltipla são alguns exemplos das inúmeras doenças existentes que apresentam um foro neurodegenerativo. Apesar de toda a investigação e pesquisa de que têm sido alvo, a etiologia e os mecanismos neuropatológicos subjacentes a estas doenças continuam por compreender. Recentemente, através de várias evidências epidemiológicas, experimentais e estudos emergentes surge mais uma hipótese que tenta explicar a etiologia destas patologias que aponta para um possível envolvimento de agentes infeciosos na patogénese e/ou progressão dos processos neurodegenerativos. É proposto que determinados agentes infeciosos detêm a capacidade de entrar no SNC e de estabelecer uma infeção crónica que conduz à danificação progressiva da viabilidade neuronal. Os agentes infeciosos, quando presentes no SNC, são responsáveis por desencadear uma série de eventos neurotóxicos que parecem ser cumulativos ao longo do tempo e com o avanço da idade. Concomitantemente os fatores genéticos e/ou ambientais concorrem para gerar, amplificar e/ou acelerar o processo neurodegenerativo. São cada vez mais as evidências que suportam esta hipótese. Na verdade, estudos recentes sugerem que os agentes infeciosos são capazes de produzir marcas moleculares patogénicas típicas da neurodegenerescência, nomeadamente a formação e a deposição de proteínas misfolded, disfunção mitocondrial e sináptica, stress oxidativo, processos autofágicos deficientes e neuroinflamação. Contudo, esta associação ainda é controversa e a grande parte das correlações entre os agentes infeciosos e as doenças neurodegenerativas não estão comprovadas.

Dissertação de Erasmus Mundus para obtenção do grau de mestre em Técnicas Laboratoriais Forenses Submitted by Diana Isidro (disidro@egasmoniz.edu.pt) on 2017-10-18T16:31:01Z No. of bitstreams: 1 Khosasih_Vivia.pdf: 10281958 bytes, checksum: 46951ca62b4688ff9d0aa23a89b269ef (MD5) Approved for entry into archive by Paula Saraiva (psaraiva@egasmoniz.edu.pt) on 2017-10-19T08:29:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Khosasih_Vivia.pdf: 10281958 bytes, checksum: 46951ca62b4688ff9d0aa23a89b269ef (MD5) Made available in DSpace on 2017-10-19T08:29:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Khosasih_Vivia.pdf: 10281958 bytes, checksum: 46951ca62b4688ff9d0aa23a89b269ef (MD5) Previous issue date: 2016-07

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz A Cannabis sativa caracteriza-se pela presença de canabinóides naturais como produtos do seu metabolismo secundário, os quais têm um elevado potencial psicoativo. Devido a esta característica é a planta mais consumida para fins recreativos apesar de a sua plantação ser ilegal na maior parte dos países. A sua ilegalização originou diferentes epifenómenos entre os quais a sua substituição por canabinóides sintéticos com efeitos psicoativos mais pronunciados e na sua maioria legais. Os canabinóides podem ser classificados como endocanabinóides, canabinóides sintéticos ou fitocanabinóides, podendo levar a efeitos positivos ou negativos no organismo humano. Os canabinóides sintéticos existem desde o ano 2004, no entanto, o seu consumo só ganhou relevância a partir de 2008. Estes surgiram como miméticos sintéticos do Δ9-Tetrahidrocanabinol (Δ9-THC), conhecido como princípio ativo da Cannabis, podendo levar a efeitos adversos mais graves que esta. No entanto, têm sido utilizados devido ao seu potencial farmacológico. Os canabinóides possuem propriedades terapêuticas importantes que podem contribuir para o tratamento de sintomas associados a doenças prolongadas, incuráveis e progressivas, isto porque têm demonstrado atuar segundo vários mecanismos, exercendo ações neuroprotectoras, antioxidantes e anti-inflamatórias. Estas características suscitaram interesse no uso destes compostos como potencias agentes terapêuticos nas Doenças Neurodegenerativas. Após inúmeros ensaios clínicos, foi possível verificar que vários canabinóides sintéticos têm a capacidade de providenciar neuroprotecção nestas doenças, nomeadamente na doença de Alzheimer, doença de Parkinson, Esclerose Múltipla e doença de Huntington. Contudo, visto que, a grande maioria dos estudos efetuados, foram realizados em animais, nomeadamente em ratinhos, são ainda, necessários mais estudos, principalmente em humanos, que confirmem que estes compostos são seguros, eficazes e bem tolerados pelo Homem.

Dissertação de Erasmus Mundus para obtenção do grau de mestre em Técnicas Laboratoriais Forenses The dried products of Cannabis sativa have been consumed for their psychoactive effects for thousands of years. Almost five hundred different natural cannabinoids could be identified in Cannabis sativa with Δ9-THC being the most psychoactive one. The most effective way of consumption is by smoking, because it avoids digestion and the first pass in the liver. Usually so called "joints" are rolled in a 1:1 ratio of dried cannabis and tobacco filler. The reason for this is that cannabis has a lower burning efficiency and that tobacco is cheaper. Processed Nicotina tabaccum contains about 0.6- 9 % nicotine; an oily, volatile liquid alkaloid. Pyrolysis of tobacco and cannabis leads to the formation of new products whose cytotoxicity is not yet established. This study investigates the effect of smoke of tobacco, cannabis and their mixture in similar conditions as humans uptake it. For production of smoke an in-house developed smoking device was used which trapped the water-soluble and organic-soluble molecules separately. Qualitative analysis of the smoke was performed using GC-MS and measurement of cytotoxicity on neuroblastoma tumour cells SH-SY5Y was performed using the MTT assay. SH-SY5Y cell line selectively expresses Cannabinoid 1 (CB1) receptor and Nicotinic acetylcholine receptor (nAChR). The results allow us to identify several pyrolysated products which are hydroxylated forms of nicotine and Δ9-THC. Moreover, MTT analysis strongly suggests different toxicological impact between smoke of tobacco, cannabis and their mixture. In fact our results points smoke from the mixture of tobacco and cannabis having the higher impact on cell viability followed by the smoke of tobacco which in turn is more toxic than smoke of cannabis, the least toxic compound out of these three. This study shows that at 100 μM cannabis has a cell viability of 80 % while tobacco and the mixture have around 40 %.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz Os primeiros registos da comercialização de misturas herbais contendo canabinóides sintéticos para fins recreativos datam do início da década passada. Desde então tem-se verificado um aumento quer no consumo destas substâncias quer na emergência de novas substâncias. De facto, o número de casos de hospitalização pelo consumo de canabinóides reportados indica um problema sério de saúde pública, agravado pela ausência de conhecimento sobre os efeitos tóxicos destas substâncias assim como dos seus efeitos farmacológicos. Com o objetivo de contribuir para o conhecimento do impacto toxicológico das misturas herbais e considerando que o consumo é feito pela inalação do fumo referidas misturas, foi utilizado um sistema de fumo para a obtenção dos produtos de pirólise dos canabinóides sintéticos. A identificação dos produtos de pirólise foi realizada por GC-MS, e a respetiva quantificação por HPLC-UV. Após a pirólise de 160 mg de “Spice”, contendo 24 mg de JWH-018, no sistema de queima recuperou-se 3,8mg deste composto e quantidades minoritárias de produtos de pirólise, não identificados pela base de dados de Massas. O impacto celular do JWH-018 e dos produtos de pirólise hidrófilos e hidrófobos da “Spice” foi avaliado na linha celular SH-SY5Y, recorrendo ao teste do MTT. O ensaio com MTT na presença das substâncias referidas na concentração de 0.0026 a 20μg/mL, não aponta uma correlação entre a concentração do pirolisado e a morte celular. No entanto, a repetição deste estudo para outras gamas de concentração de pirolisados é necessária para que se possa compreender o impacto dos produtos de pirólise e dos canabinóides sintéticos na viabilidade celular. O presente estudo é um contributo para o desenvolvimento de uma metodologia que permita medir o impacto de Novas Substâncias Psicoactivas na saúde.

Dissertação de Erasmus Mundus para obtenção do grau de mestre em Técnicas Laboratoriais Forenses Synthetic cannabinoids from marijuana herbal blends like ‘Spice’ and ‘K2’ are drawing the attention of drug of abuse organizations, including the UNODC1, the EMCCDA2 and emergency hospital all over the world. This concern rises from clinical episodes of psychotropic effects that go beyond the regular range of marijuana and THC – namely, panic attacks, psychosis, catatonia, addiction and withdrawal symptoms. Our study addressed two emergent synthetic cannabinoids (napthtoylindoles) denominated JWH-073 and JWH-250 that are currently detected on ‘Spice’-like products, in order to observe their cell toxicity profile on neuronal cells in vitro model (SH-SY5Y). Using 0.2% DMSO as negative control, MTT and LDH results revealed that within concentrations of 1, 5, 10, 25, 37.5 and 50 μM, JWH-250 is identified as ‘toxic’ in a statistically significant manner at higher concentrations. This work did not detect any statistically significant toxicity from JWH-073. This data suggests to extend these studies on new synthetic cannabinoids to neuronal cells with increased concentrations, as well as the application of assays assessing apoptosis (conditions and signalling), neuronal function and activity (as cell membrane potential assay) within differentiated cells as neurons and glia. At the same time, the evaluation of herbal mixtures of more than one cannabinoids and plant types is advisable in order to understand synergic effects. EACEA - European Commission

Dissertação de mestrado Erasmus Mundus para obtenção de grau de mestre em Técnicas Laboratoriais Forenses In the last few years, several samples were found to contain different combinations of multiple synthetic cannabinoids, fact which may end up in a serious health threat since these substances are not fully studied and the toxic as well as the pharmacological effects are not known. The isolation and quantification of psychoactive substances from the herbal blends, known as ‘Spice’, was performed by HPLC-UV and the identification by LC-MS/MS. The HPLC-UV method was validated for the quantification and has proven to be fit for purpose. The sample 1 has shown the coexistence of JWH-122 (29,07mg/g) and JWH-210 (175,9mg/g) while the sample 2 was found to contain one single synthetic cannabinoid, the JWH-018 (149,7mg/g). The sample 3 presented the same multiple psychoactive substances as sample 1, JWH-122 (7,3mg/g) and JWH-210 (129,9mg/g). Since these drugs are mainly smoked, a smoking machine was created* in order to characterize the chemical composition of the pyrolysis. The GC-MS analysis performed to the pyrolysis solutions has shown no degradation of the JWH-018, drug used for the assay. The toxicity impact of the characterized substances was assessed on human neuroblastoma SH-SY5Y cells, applying a combination of multiple synthetic cannabinoids (JWH-122 and JWH-210) and single one (JWH-018). The preliminary results indicate that these psychoactive substances are not toxic to the cells in the concentrations ranging from 0μM to 50μM. *Designed by Dr. Alexandre Quintas and is under a patenting process

Dissertação de Erasmus Mundus para obtenção do grau de mestre em Técnicas Laboratoriais Forenses Aspartic acid is the chemical, amongst amino acids, whose racemization process is considered to be the fastest and the most reliable way to conduct an ageing study in some living-being tissues. Racemization is a natural-occurring event in which L-stereoisomer of aspartic acid is converted into D-stereoisomer in an equilibrium dependent on factors namely pH, environmental conditions and, most critically, on temperature. The main objective of the current study is to assess the influence of temperature on kinetics of aspartic acid racemization and to implement this methodology in fingermarks. The hypothesis is that different starting points of deposition of a biological specimen will give rise to significant differences in L-/D- racemization after the sample has been heated, allowing to determine time since deposition of a fingerprint. In this way, it would be possible to find the time since build a molecular clock for fingerprints, consisting of time since deposition of fingermarks based on racemization degree of aspartic acid. Firstly, a calibration curve was built within the concentrations range expected to be quantified in actual samples both with L-aspartic acid (L-Asp) and D-aspartic acid (D-Asp) separately, Gas Chromatography - Flame Ionization Detector (GC-FID) being the chosen technique and detection mode to set up the calibration experiments. Secondly, L-aspartic acid standards were treated at different temperatures during different time periods and were analyzed by GC-FID with a chiral column, aimed for detecting D- isomer, providing with information about racemization rate of aspartic acid. Eventually a downward trend was observed for L-Asp but not for D-Asp and a pseudo-rate constant could be calculated for the former, demonstrating that temperature degrades this chemical. Fingerprints study was not successful to determine aspartic acid racemization but a simple handling of them and an adequate, sensitive response of the chromatographic system could quantify racemization degree.

Dissertação de Erasmus Mundus para obtenção do grau de mestre em Técnicas Laboratoriais Forenses The rise in use of synthetic cannabinoids as herbal smoking mixtures has been attributed to a number of reasons; primary among them being their “legality” and their promotion as being safer than the natural alternatives. As their emergence has been quite recent, their pharmacological and toxicological profiles are not known completely. One of the earliest synthetic cannabinoid to be detected in these herbal mixtures was JWH-018. In the present study, the cell toxicity of JWH-018 and its N-(3-hydroxypentyl) metabolite was investigated using human cell line HEK-293 T. The cell viability was assessed using the MTT assay after treatment with standard JWH-018 and its N-hydroxymetabolite in a concentration range between 1ng/ml to 5000ng/ml of both respectively. The results show that the highest concentration of 5000ng/ml shows statistically significant decrease in cell viability for both the parent compound and the metabolite when compared to cell controls. In addition, the metabolite also showed a statistically significant decrease in cell viability at a concentration of 2500ng/ml. There were also significant differences observed between the smaller concentrations (1ng/ml and 10ng/ml) when compared to the highest concentration (5000ng/ml) for both the parent compound and metabolite. The cytotoxic effect was seen at levels which are above the expected tissue levels after use of JWH-018 either by ingestion or smoking. The cytotoxicity of both the parent compound and the metabolite highlights the adverse effects these drugs may have with consequent need for further research and regulation.

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010 Submitted by Teresa Boa (tdboa@fc.ul.pt) on 2011-07-13T11:51:50Z No. of bitstreams: 1 ulfc055907_tm_Maria_Helena_Franco.pdf: 2607762 bytes, checksum: 774a6d7091a3114609ae62a3ba2c571f (MD5) Made available in DSpace on 2011-07-13T11:52:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc055907_tm_Maria_Helena_Franco.pdf: 2607762 bytes, checksum: 774a6d7091a3114609ae62a3ba2c571f (MD5) Previous issue date: 2010

Tese de doutoramento, Bioquímica (Regulação Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010 Nível de preservação: critical, Criado em: 2010-01-25 14:15:33, Criado por: super:MARTA, Alterado em: 2010-01-26 11:21:24, Modificado por: super:MARTA Made available in DSpace on 2010-07-27T09:00:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 20950_ulsd057706_td.pdf: 16607274 bytes, checksum: 3323b2c16128895956fc712369c0c8a4 (MD5) 20950.xml: 6755 bytes, checksum: f9e8bf18cea68866ac1d34549c3a71f3 (MD5) Previous issue date: 2009

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009 Submitted by Teresa Boa (tdboa@fc.ul.pt) on 2011-06-27T15:41:30Z No. of bitstreams: 1 ulfc055644_tm_Ana_Luisa_Lages.pdf: 2535128 bytes, checksum: 989d735c9ee11ee38d43eb4245956b20 (MD5) Made available in DSpace on 2011-06-27T15:41:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc055644_tm_Ana_Luisa_Lages.pdf: 2535128 bytes, checksum: 989d735c9ee11ee38d43eb4245956b20 (MD5) Previous issue date: 2009

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz As patologias Neurodegenerativas são doenças incuráveis e debilitantes, apresentando um caráter crónico com uma destruição celular progressiva e frequentemente irreversível. Os sintomas deste tipo de doenças caraterizam-se por alterações significativas nas capacidades cognitivas, motoras, fisiológicas e consequentemente sociais, afetando desta forma não só o doente, como todos os que com ele se relacionam. Estas alterações têm uma profunda influência na qualidade de vida quer do doente quer do meio que o envolve. As patologias neurodegenerativas com mais expressão são a doença de Alzheimer, Parkinson, e Hungtinton. Este grupo de doenças neurodegenerativas tem sido alvo de intensa investigação por serem preponderantes e pelo aumento do número de casos nos últimos anos. Muitos podem ser os fatores desencadeantes destas patologias, tais como agentes ambientais, propensão genética, e ainda mecanismos epigenéticos. Diversos estudos sugerem que a exposição a determinados químicos constitui um fator capaz de induzir este tipo de patologias. Entre estes encontram-se o consumo de substâncias psicoativas. A utilização, pelo homem destas substâncias é ancestral. Recentemente o número de diferentes substâncias de abuso tem vindo a aumentar, nomeadamente pelo aparecimento de substâncias de abuso sintéticas, traficadas nas ruas, desde o início deste século. De uma forma geral todas as substâncias psicoativas ilícitas são profundamente nocivas por serem tóxicas e gerarem dependência. As substâncias de abuso mais consumidas, presentemente nas sociedades ditas desenvolvidas, são a cannabis, a cocaína, as anfetaminas e a heroína. A heroína é uma droga semi-sintética, derivada da morfina, extraída da espécie Paper somniferum, comumente designada por papoila do ópio. O consumo de heroína tem sido relacionado com o desenvolvimento de patologias neurodegenerativas. São vários os números de casos reportados na literatura sugerindo que o consumo de heroína é indutor de síndromes Parkinsónicas, a doença de Alzheimer e de Leucoencefalopatia Espongiforme. Os mecanismos de toxicidade sugeridos incluem a formação de vacúolos na oligodendria, alterações mitocondriais e estados de hipóxia severos. Contudo, os mecanismos moleculares destes processos são ainda desconhecidos.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz O aparecimento de novas substâncias psicoativas com estatuto legal recentemente introduzidas no mercado e comercializadas pela internet ou em smart shops tem vindo a ganhar a atenção dos governos de todo o mundo. Estes produtos, designados de legal highs, incluem uma grande variedade de compostos, como sais de banho, incensos, comprimidos, fertilizantes, spices entre outras formas, todas supostamente não indicadas para consumo humano. Apesar da falta de identificação de todos os constituintes destes produtos, diversos estudos identificaram moléculas com propriedades psicoativas, como os derivados de piperazinas, catinonas sintéticas, kratom, S. Divinorum e canabinóides sintéticos. Estes últimos constituem produtos muitas vezes utilizados como alternativas à canábis e, como tal, vistos como naturais e seguros pelos consumidores, o que não corresponde à verdade, sendo responsáveis por inúmeras hospitalizações. Assim, este trabalho focar-se-á nestes compostos, que são agonistas dos recetores canabinóides CB1 e CB2, tal como o Δ9-THC, principal composto psicoativo da canábis, embora, ao contrário deste, atuem na sua maioria como agonistas totais, apresentando por isso maior ocorrência de efeitos adversos com a mesma dose do que a canábis. Embora a extensão do seu metabolismo e farmacologia não sejam totalmente conhecidas, vários estudos reportam uma panóplia de efeitos adversos que inclui psicoses, alterações de humor, cognitivas, cardiovasculares, gastrointestinais, e também, potencial de abuso e síndrome de abstinência. Pelos inúmeros perigos associados a estas substâncias, os governos de muitos países, incluindo Portugal, adotaram medidas legais para impedir a sua proliferação. No entanto, este processo continua a ser um desafio pela rapidez como surgem novas moléculas que escapam ao controlo legal, mas, também, pela falta de métodos analíticos rápidos e validades de deteção destes compostos em amostras biológicas.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Universitário Egas Moniz Com o aumento do número de crimes envolvendo armas de fogo, surgiu na investigação criminal, a necessidade de ligar um suspeito à arma do crime. Para esse efeito, recorre-se a balística, onde os vestígios deixados pela arma (resíduos de disparo da arma), que são como uma impressão digital da arma, são analisadas através de técnicas forenses, e assim obter as informações relevantes para a investigação criminal. A detecção e a identificação dos resíduos, são factores chave para a análise forense. O objectivo deste trabalho de investigação é o estudo do poder de discriminação das pólvoras através da análise discriminatória. Para isso foram utilizadas 12 tipos diferentes de pólvora (várias marcas e modelos) e 9 compostos, que geralmente são encontradas nas pólvoras, que foram utilizados como padrão. Das várias técnicas de análise existentes, para este trabalho optou-se pela Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier e pela Cromatografia Gasosa acoplada a espectrometria de massa, que são as técnicas mais utilizadas para a análise de pólvora. Para a análise discriminatória recorreu-se á Análise da Componente Principal. Além da análise química da pólvora, estas também foram sujeitas a uma análise física, onde foram analisadas as características macroscópicas de cada pólvora. A discriminação da pólvora é possível, tanto a nível das características macroscópicas como através da análise dos resíduos da pólvora. Das técnicas de análise utilizadas, verificou-se que a análise por Cromatografia Gasosa foi a melhor na obtenção de resultados e que esta técnica junto com a Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier são técnicas que se complementam. Em relação ao poder discriminatório, a análise pela Cromatografia Gasosa foi a melhor na discriminação das pólvoras, onde as melhores marcas que se conseguem discriminar são a Federal Ammunition, a Eley (Match Pistol) e RWS (Semi-auto).

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz A Cannabis sativa L., mais conhecida como marijuana, é uma planta com propriedades psicoativas. É a substância ilícita mais consumida do mundo e os compostos causadores dos efeitos psicoativos associados ao seu consumo são os canabinóides. Estes compostos são lipossolúveis e a sua ação a nível celular não está bem definida. Este trabalho experimental teve como como objetivo o estudo do impacto causado pelos produtos da pirólise de Cannabis sativa L., na viabilidade celular de neuroblastomas (células do sistema nervoso) da linha SH-SY5Y. Para mimetizar o modo como a planta é consumida, foi utilizado um sistema que reteve os compostos provenientes do fumo de Cannabis sativa L. em duas soluções distintas, uma aquosa (DMEM), e outra orgânica (metanol). Na segunda solução, identificaram-se por GC-MS (EI+), os canabinóides, e quantificou-se o THC total (THC+THCA) por HPLC-UV. A solução aquosa foi utiliza-da para perfazer as soluções finais do ensaio de viabilidade celular, que consistiu em expor as células (previamente cultivadas e tratadas) a oito concentrações diferentes de canabinóides provenientes da pirólise da Cannabis sativa L., durante 24 horas. Posteriormente foi lida a viabilidade celular para cada concentração estudada, através do méto-do colorimétrico com MTT. Na solução metanólica dos produtos de pirólise de Cannabis sativa L. identificou-se, por GC-MS (EI+), o Δ1-THC sililado, o Δ8-THC, o Δ9-THC, o Δ9-tetrahidrocanabivarin, o canabinol, o canabiciclol e o canabicromeno. Quantificaram-se, por HPLC-UV, na mesma amostra, cerca de 15,5mg de THC total. Os neuroblastomas expostos às sete soluções-amostra menos concentradas, apresentaram 80% de viabilidade celular. Quando expostas à solução-amostra mais concentrada, todas as células morreram. Concluiu-se que os 20% de morte celular verificados nas concentrações mais baixas deveram-se aos compostos do fumo de Cannabis sativa L. presentes na solução aquosa, constituinte das soluções-amostra. Os canabinóides só parecem induzir morte celular a partir de concentrações superiores a 0,1mg/mL.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz A doença de Parkinson (DP) é a patologia neurodegenerativa mais prevalente logo a seguir à doença de Alzheimer, afectando 1% dos indivíduos com idades superiores a 60 anos. A DP é caracterizada, clinicamente, por severos sintomas motores incluindo tremor, rigidez muscular, instabilidade postural e bradicinesia. Uma das principais características é a presença de Corpos de Lewy associada a uma perda substancial dos neurónios dopaminérgicos na substância nigra pars compacta. A DP é uma doença multifactorial de etiologia desconhecida, em que tanto os factores genéticos como os ambientais têm uma influência notória. Diversos mecanismos patogénicos podem estar envolvidos na patogénese da DP, incluindo um aumento excessivo dos níveis de stress oxidativo e disfunções a nível da mitocôndria, associado à presença de proteínas misfolding e alterações no sistema ubiquitina-proteassoma assim como no sistema autofagia-lisossoma. A DP permanece incurável, sendo a farmacoterapia com levodopa a mais eficaz no controlo da sintomatologia e considerada a terapêutica de primeira linha. Ainda não é possível abrandar ou parar o processo degenerativo característico da DP através da terapêutica farmacológica disponível. A alfa-Sinucleína, uma pequena proteína expressa no cérebro, é um dos principais componentes dos Corpos de Lewy. A alfa-Sinucleína encontra-se ulfolded no seu estado nativo e pode ter um papel importante a nível de transmissão sináptica e na fisiologia dos neurónios dopaminérgicos. Pensa-se que esta proteína está fortemente relacionada com a patogénese da DP e a toxicidade induzida pela alfa-Sinucleína pode envolver diversos mecanismos, como a agregação ou interacção com outras proteínas e moléculas, incluindo a Sinfilina-1. A Sinfilina-1 é uma proteína citoplasmática que se localiza perto das vesículas sinápticas e colocaliza-se com a alfa-Sinucleína dentro dos Corpos de Lewy. A Sinfilina-1 interage tanto in vitro como in vivo com a alfa-Sinucleína promovendo a sua agregação, o que pode influenciar a formação dos Corpos de Lewy nos neurónios.

Tese de doutoramento, Bioquímica (Biofísica Molecular), 2010, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências Nível de preservação: critical, Criado em: 2010-05-27 11:25:30, Criado por: creator:MARTA, Alterado em: 2010-05-27 11:28:35, Modificado por: viewer:internal Made available in DSpace on 2010-07-28T16:13:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 22588_ulsd058380_td_1.pdf: 7433688 bytes, checksum: 6e3f43c0b6cc515f33815e052f99fb4c (MD5) 22588.xml: 5634 bytes, checksum: 2f5daed04477c72fbd2ea378f8a5d31d (MD5) Previous issue date: 2009

Dissertação de Erasmus Mundus para obtenção do grau de mestre em Técnicas Laboratoriais Forenses The emergence and abuse of new synthetic cannabinoids has been on the rise because legal regulations against particular derivatives of cannabinoids tend to cause the introduction of new variants as the law is made for specific molecules and not for a group of molecules. They come with no clinical indications of use on their labels, and vaguely described intoxicating effects hence they were not banned. Consequently, they are also referred to as ‘Smart Drugs’ or more formally ‘New Psychoactive Substances’ (NPSS). Many classified synthetic cannabinoid agonists remain available to users in many countries mainly through ‘smart’ and online shops. The challenges posed to the regulation of these products are due to their ever-changing composition, adulterants and variable vehicles of distribution. Synthetic cannabinoids are famous for their recreational effects similar to that of marijuana, which has neuropsychiatric effects due to the action of its primary active ingredient, Δ9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC), binding to endogenous cannabinoid receptors. This study was conducted first to find the best microorganism model for the development of a new screening method for the analysis of synthetic cannabinoids by using the proteome expression patterns obtained from proteins of Saccharomyces cerevisiae and E. coli. The research also sought to find an efficient protein extraction and concentration method for expressed microorganism proteins for two-dimension gel electrophoresis. Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli were studied in this work. S. cerevisiae rather than E. coli proved to be a better microorganism model for to be exploited for findings in this research. Diclofenac and JWH-018 standard were used as test drugs. The Amicon® membrane filter concentration method was found to be the most efficient with protein yield greater than 20mg/mL for 500mL cell culture volume. Even though twodimension gels did not show a large number of protein spots, the application of more concentrated protein solution from S. Cerevisiae is paramount to get a better proteomic pattern for use as a sensor.

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009 Submitted by Teresa Boa (tdboa@fc.ul.pt) on 2011-06-22T14:10:51Z No. of bitstreams: 1 ulfc095738_tm_Miguel_Oliveira.pdf: 29316118 bytes, checksum: de78d23c0ed519144def29b122eae8b3 (MD5) Made available in DSpace on 2011-06-22T14:11:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc095738_tm_Miguel_Oliveira.pdf: 29316118 bytes, checksum: de78d23c0ed519144def29b122eae8b3 (MD5) Previous issue date: 2009