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Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016 A epilepsia é uma doença crônica caracterizada por ataques epilépticos recorrentes. A maioria dos pacientes com epilepsia do lobo temporal (ELT), que é o tipo mais comum de epilepsia, além de apresentarem crises convulsivas são acometidos por transtornos neuropsiquiátricos. Estes distúrbios neurocomportamentais e os episódios de crise são provenientes de alterações nos circuitos neurais e maquinaria neuroquímica/celular utilizada para eventos fisiológicos. Além disso, sistemas de sinalização inter e intracelular que são fundamentais para a atividade sináptica são passíveis de regulação e podem estar envolvidos na fisiopatologia da epilepsia. Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivos: 1) caracterizar alterações específicas da transmissão glutamatérgica e vias de sinalização intracelular no hipocampo dorsal e ventral e córtex temporal de ratos Wistar adultos submetidos ao modelo da pilocarpina de epilepsia; 2) investigar a relação temporal entre a ELT e comorbidades psiquiátricas através de testes comportamentais realizados nas fases de maturação e epilepsia crônica de ratos Wistar adultos submetidos ao modelo da pilocarpina; 3) caracterizar alterações específicas da transmissão glutamatérgica e vias de sinalização intracelular em amostras de neocortex, amígdala e hipocampo dos pacientes com ELT submetidos ao processo cirúrgico, e especificamente na amígdala, investigar os efeitos da administração de dexametasona; 4) através do uso de ferramentas de manipulação genética investigar o papel da enzima carboxipeptidase A6 (CPA6) e moléculas de sinalização celular no modelo de crises convulsivas induzidas por pentilenotetrazol (PTZ) e pilocarpina em zebrafish. Os principais resultados incluem: 1) diminuição na fosforilação de PKA/GluA1-Ser845, aumento na expressão de GFAP e diminuição na expressão do transportador GLT1 no hipocampo dorsal na fase crônica do modelo da pilocarpina. Em contraste, no hipocampo ventral ocorreu diminuição na fosforilação de PKC/GluA1-Ser831. Estes resultados sugerem um desequilíbrio região específico da transmissão glutamatérgica e de vias de sinalização em resposta a Pilo-SE; 2) déficits na discriminação olfatória e memória social de curto prazo nos períodos de maturação e epilepsia crônica de ratos submetidos ao modelo da pilocarpina; 3) diminuição na fosforilação de CaMKII/GluA1-Ser831 na amígdala de pacientes com ELT tratados cirurgicamente após uma única dose de dexametasona; 4) larvas de zebrafish geneticamente modificadas (knockdown para CPA6), apresentaram resistência a crises convulsivas induzidas por PTZ e pilocarpina. Alterações na sinalização peptidérgica e a supressão de inputs excitatórios após a perda de função da enzima CPA6 podem estar envolvidos no mecanismo de resistência. Em conjunto, as alterações neuroquímicas identificadas em regiões cerebrais específicas podem ser valiosas para a compreensão da fisiopatologia da epilepsia e podem ajudar a estabelecer alvos terapêuticos para o tratamento desta neuropatologia. Por fim, os modelos animais aplicados neste estudo reproduziram características específicas da doença, podendo assim ser utilizados como ferramenta para estudar estratégias neuroprotetoras, bem como os mecanismos neurobiológicos e psicopatológicos associados a epileptogênese. Abstract : Epilepsy is a chronic disease characterized by recurrent seizures. The majority of patients with temporal lobe epilepsy (TLE), which is the most common type of epilepsy, have to live not only with epileptic episodes but also with neuropsychiatric disorders. These neurobehavioral disorders and seizures come from changes in neural circuitry and neurochemistry/cellular machinery used in physiological events. In addition, inter- and intracellular signaling systems that are critical to synaptic activity are subject to regulation and may be involved in the pathophysiology of epilepsy. Thus, this study aimed to: 1) characterize specific changes of glutamatergic transmission and intracellular signaling pathways in the dorsal and ventral hippocampus and temporal cortex of adult Wistar rats submitted to the pilocarpine model of epilepsy; 2) investigate the temporal relationship between TLE and psychiatric comorbidities through behavioral tests performed in the maturation and chronic epilepsy phases of adult Wistar rats submitted to the pilocarpine model; 3) characterize specific changes of glutamatergic transmission and intracellular signaling pathways in the samples of neocortex, amygdala and hippocampus of TLE patients undergoing surgical process, and specifically at amygdala, investigate the effects of dexamethasone administration; 4) using tools of genetic engineering, investigate the role of enzyme carboxypeptidase A6 (CPA6) and cellular signaling molecules in the model of seizures induced by pentylenetetrazole (PTZ) and pilocarpine in zebrafish. The main results include: 1) decrease of PKA/GluA1-Ser845 phosphorylation, increase of GFAP expression and decrease in GLT1 transporter expression in the dorsal hippocampus in the chronic period of the pilocarpine model. In contrast, in the ventral hippocampus the phosphorylation of PKC/GluA1-Ser831was decreased. These results suggest an imbalance region-specific of glutamatergic transmission and signaling pathways in response to Pilo-SE; 2) deficits in olfactory discrimination and short-term social memory during maturation and chronic epilepsy periods of rats submitted to the pilocarpine model; 3) decrease in phosphorylation of CaMKII/GluA1-Ser831 in the amygdala of TLE patients surgically treated after a single dose of dexamethasone; 4) zebrafish larvae genetically modified (knockdown to CPA6) showed resistance to seizures induced by PTZ and pilocarpine. Changes in peptidergic signaling and suppression of excitatory inputs following CPA6 loss of function may be involved in mechanisms of resistance. Taken together, the neurochemical changes identified in specific brain regions may be valuable for understanding the pathophysiology of epilepsy and can help establish therapeutic targets for the treatment of neuropathology. Finally, the animal model used in this study reproduces specific characteristics of the disease, and thus can be used as a tool to study neuroprotective strategies as well as psychopathological and neurobiological mechanisms underlying to epileptogenesis.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Epilepsia é uma doença crônica caracterizada por ataques epilépticos recorrentes. Cerca de 20-30% dos pacientes com epilepsia não obtém controle satisfatório das crises mesmo com uso adequado de fármacos, sendo estes candidatos à avaliação pré-cirúrgica. Em animais a administração de pilocarpina tem sido utilizada como modelo experimental de epilepsia, reproduzindo em roedores as principais características da epilepsia do lobo temporal mesial associada à esclerose do hipocampo (ELTM-EH) em seres humanos. Nesse modelo a administração de pilocarpina (Pilo-SE) induz o status epilepticus, onde as crises podem perdurar algumas horas (período agudo). A seguir o animal passa por um período com melhora e remissão espontânea das crises (período latente/4-44 dias). Finalmente, no período crônico (após 45 dias), os animais passam a apresentar crises espontâneas recorrentes (2-4 crises/animal/semana). Os neurônios da área epileptogênica apresentam peculiaridades em sua fisiologia que os tornam propensos ao surgimento de descargas assíncronas. Sistemas de sinalização inter e intracelular são fundamentais na modulação da atividade sináptica e podem estar envolvidos na fisiopatologia da epilepsia. Entre os alvos de importância podemos destacar: a) sistema glutamatérgico, via receptores NMDA, AMPA e transportadores gliais de glutamato (EAAT1 e 2); b) proteínas cinases como MAPKs (ERK, JNK, p38MAPK) e AKT. No presente estudo foi avaliado o perfil de fosforilação de MAPKs, AKT e da subunidade GluR1 do receptor AMPA (por western blotting) e o perfil de expressão dos transportadores de glutamato EAAT1 e 2 e da subunidade NR1 do receptor NMDA (por qRT-PCR) no hipocampo (Hip) e córtex (Ctx) de ratos adultos submetidos ao modelo da pilocarpina. As estruturas foram retiradas 1h, 3h, 12h (período agudo), 5 dias (período latente) e 50 dias (período crônico) após administração de Pilo-SE. Os principais resultados incluem: 1) aumento da fosforilação da subunidade GluR1 do receptor AMPA no sítio Ser831 no Hip e Ser845 no Ctx no período agudo e diminuição de seu conteúdo total no período latente; 2) ativação de ERK1 e p38MAPK em ambas as estruturas 1 e 12h após o início do Pilo-SE. A fosforilação da isoforma JNK2/3 (54kDa) diminuiu 3h após o início Pilo-SE e na fase crônica no Hip e Ctx. A fosforilação de AKT aumentou apenas no Hip durante o período latente. Em relação ao perfil de expressão da subunidade NR1 do receptor NMDA e os transportadores gliais de glutamato, encontramos uma diminuição na expressão do mRNA da subunidade NR1 e transportadores EAAT1 e 2 no Ctx, no período latente. No Hip a expressão do transportador EAAT2 diminuiu e a expressão da subunidade NR1 aumentou no período crônico. Os resultados demonstram alterações na transdução de sinal, expressão da subunidade NR1 e transportadores EAAT1 e 2 no Ctx e Hip após Pilo-SE de forma dependente da estrutura e tempo. Estas mudanças podem estar relacionadas com modificações neuronais e gliais na fisiologia intrínseca e rede epileptogênica na ELTM-EH.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2019. Abstract : Oxidative stress is characterized by an imbalance between the production of reactive oxygen species (ROS) and the levels of antioxidant defenses in cells. It is involved in many diseases, including neurodegenerative conditions. Due to these facts, many therapeutic strategies use antioxidant compounds as pharmaceuticals for the treatment of such conditions. Probucol (PB) is an antioxidant compound with neuroprotective and hypocholesterolemic properties. Previous studies have shown that PB and its derivative succinobucol present protective properties in several models of neurodegenerative diseases. In the present study, we present two new compounds derived from PB, here named as RC363 and RC574. The glutamate (Glu)-induced oxitosis model in HT22 cells was chosen to evaluate the potential neuroprotective effects of the compounds. In this model, HT22 cells are exposed to high (5 mM) Glu concentrations, leading to GSH depletion, inhibition of glutathione peroxidase 4 (GPx4), increased production of lipid hydroperoxides, mitochondrial perturbation, and cell death. Thus, we aimed to evaluate the possible protective effect of PB and its derivatives, besides trying to elucidate their mechanisms of action. For this, the cells were preincubated with the compounds for 24 hours and then challenged with Glu for 24 hours (for death and cell viability tests) or 6 hours (to investigate the mechanisms of death). The compounds, up to the 5 µM concentration, were not toxic to cells. In the protection assays, a preincubation with RC363 and RC574, at the minimum concentration of 0.5 µM, were effective in protecting the cells from a challenge with 5 mM Glu, whereas the PB showed no protective effect. This protective effect was not associated with a recovery in GSH levels nor a direct antioxidant effect since the compounds had poor performance in the DPPH test and were not able to fully inhibit reactive species (RS) production induced by Glu. The protective effect of the compounds was not associated with an increase in PI3K or PKC activity. On the other hand, compounds RC363 and RC574 were able to inhibit the effects of Glu on the mitochondrial membrane potential (MMP) and the production of mitochondrial superoxide anion (O2 -). However, the compounds were not able to inhibit the decrease in Glu-induced mitochondrial respiratory capacity, nor the cell death induced by tBid translocation. The compounds RC363 and RC574 increased the immunocontent of GPx1 in HT22 cells, whereas PB and RC574 increased GPx activity, but this effect does not appear to be important to inhibit Glu-induced cell death. Compounds RC363 and RC574 also showed great efficiency in inhibiting cell death induced by inhibition of GPx4. Although the exact mechanism of protection may not have been evidenced in the present study, it provides valuable information on the protective effects of the new RC363 and RC574 compounds, which may be used in the future for their use in therapeutic strategies for conditions where oxidative stress is involved. O estresse oxidativo é caracterizado por um desbalanço entre a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e os níveis de defesas antioxidantes nas células. O mesmo está envolvido em muitas doenças, incluindo condições neurodegenerativas. Devido a isso, muitas estratégias terapêuticas utilizam compostos antioxidantes como fármacos para o tratamento de tais condições. O probucol (PB) é um composto antioxidante com propriedades neuroprotetoras e hipocolesterolêmicas. Estudos prévios mostram que o PB e seu derivado succinobucol apresentam propriedades protetoras em vários modelos de doenças neurodegenerativas. No presente estudo, apresentamos dois novos compostos derivados do PB, aqui denominados como RC363 e RC574. O modelo de oxitose induzido por glutamato (Glu) em células HT22 foi escolhido para avaliar os potenciais efeitos neuroprotetores dos compostos. Neste modelo, as células HT22 são expostas a uma concentração elevada (5 mM) de Glu, levando a depleção de GSH, inibição da glutationa peroxidase 4 (GPx4), aumento da produção de hidroperóxidos lipídicos, perturbação mitocondrial e morte celular. Assim, objetivamos avaliar o possível efeito protetor do PB e seus derivados, além de tentar elucidar seus mecanismos de ação. Para isso, as células foram pré-incubadas com os compostos durante 24 horas e, em seguida, eram desafiadas com Glu durante 24 horas (para os testes de morte e viabilidade celular) ou 6 horas (para investigar os mecanismos da morte). Os compostos, até a concentração de 5 µM, não foram tóxicos para as células. Nos testes de proteção, uma pré-incubação com os compostos RC363 e RC574, na concentração mínima de 0,5 µM, foi eficiente em proteger as células de um desafio com Glu 5 mM, enquanto o PB não exibiu nenhum efeito protetor. Este efeito protetor não foi associado a uma recuperação nos níveis de GSH e nem a um efeito antioxidante direto, já que os compostos tiveram um baixo desempenho no teste do DPPH e não foram capazes de inibir totalmente a produção de espécies reativas (ER) induzida por Glu. O efeito protetor dos compostos não esteve associado a um aumento da atividade da PI3K ou da PKC. Por outro lado, os compostos RC363 e RC574 foram capazes de inibir os efeitos do Glu no potencial de membrana mitocondrial (PMM) e na produção de ânion superóxido (O2 -) mitocondrial. Porém, os compostos não foram capazes de inibir a diminuição da capacidade respiratória mitocondrial induzida por Glu, nem a morte celular induzida pela translocação da tBid. Os compostos RC363 e RC574 aumentaram o imunoconteúdo de GPx1 nas células HT22, enquanto o PB e o RC574 aumentaram a atividade da GPx, porém este efeito não parece ser importante para inibir a morte celular induzida por Glu. Os compostos RC363 e RC574 também mostraram grande eficiência em inibir a morte celular induzida pela inibição da GPx4. Apesar do mecanismo de proteção exato não poder ter sido evidenciado no presente estudo, o mesmo traz valiosas informações sobre os efeitos protetores dos novos compostos RC363 e RC574, as quais poderão ser utilizadas no futuro para o uso dos mesmos em estratégias terapêuticas para condições onde o estresse oxidativo está envolvido.