Investigação das propriedades neuroprotetoras de compostos inéditos derivados do probucol em um modelo de oxitose em células HT22

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2019. Abstract : Oxidative stress is characterized by an imbalance between the production of reactive oxygen species (ROS) and the levels of antioxidant defenses in cells. It is involved in many diseases, including neurodegenerative conditions. Due to these facts, many therapeutic strategies use antioxidant compounds as pharmaceuticals for the treatment of such conditions. Probucol (PB) is an antioxidant compound with neuroprotective and hypocholesterolemic properties. Previous studies have shown that PB and its derivative succinobucol present protective properties in several models of neurodegenerative diseases. In the present study, we present two new compounds derived from PB, here named as RC363 and RC574. The glutamate (Glu)-induced oxitosis model in HT22 cells was chosen to evaluate the potential neuroprotective effects of the compounds. In this model, HT22 cells are exposed to high (5 mM) Glu concentrations, leading to GSH depletion, inhibition of glutathione peroxidase 4 (GPx4), increased production of lipid hydroperoxides, mitochondrial perturbation, and cell death. Thus, we aimed to evaluate the possible protective effect of PB and its derivatives, besides trying to elucidate their mechanisms of action. For this, the cells were preincubated with the compounds for 24 hours and then challenged with Glu for 24 hours (for death and cell viability tests) or 6 hours (to investigate the mechanisms of death). The compounds, up to the 5 µM concentration, were not toxic to cells. In the protection assays, a preincubation with RC363 and RC574, at the minimum concentration of 0.5 µM, were effective in protecting the cells from a challenge with 5 mM Glu, whereas the PB showed no protective effect. This protective effect was not associated with a recovery in GSH levels nor a direct antioxidant effect since the compounds had poor performance in the DPPH test and were not able to fully inhibit reactive species (RS) production induced by Glu. The protective effect of the compounds was not associated with an increase in PI3K or PKC activity. On the other hand, compounds RC363 and RC574 were able to inhibit the effects of Glu on the mitochondrial membrane potential (MMP) and the production of mitochondrial superoxide anion (O2 -). However, the compounds were not able to inhibit the decrease in Glu-induced mitochondrial respiratory capacity, nor the cell death induced by tBid translocation. The compounds RC363 and RC574 increased the immunocontent of GPx1 in HT22 cells, whereas PB and RC574 increased GPx activity, but this effect does not appear to be important to inhibit Glu-induced cell death. Compounds RC363 and RC574 also showed great efficiency in inhibiting cell death induced by inhibition of GPx4. Although the exact mechanism of protection may not have been evidenced in the present study, it provides valuable information on the protective effects of the new RC363 and RC574 compounds, which may be used in the future for their use in therapeutic strategies for conditions where oxidative stress is involved. O estresse oxidativo é caracterizado por um desbalanço entre a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e os níveis de defesas antioxidantes nas células. O mesmo está envolvido em muitas doenças, incluindo condições neurodegenerativas. Devido a isso, muitas estratégias terapêuticas utilizam compostos antioxidantes como fármacos para o tratamento de tais condições. O probucol (PB) é um composto antioxidante com propriedades neuroprotetoras e hipocolesterolêmicas. Estudos prévios mostram que o PB e seu derivado succinobucol apresentam propriedades protetoras em vários modelos de doenças neurodegenerativas. No presente estudo, apresentamos dois novos compostos derivados do PB, aqui denominados como RC363 e RC574. O modelo de oxitose induzido por glutamato (Glu) em células HT22 foi escolhido para avaliar os potenciais efeitos neuroprotetores dos compostos. Neste modelo, as células HT22 são expostas a uma concentração elevada (5 mM) de Glu, levando a depleção de GSH, inibição da glutationa peroxidase 4 (GPx4), aumento da produção de hidroperóxidos lipídicos, perturbação mitocondrial e morte celular. Assim, objetivamos avaliar o possível efeito protetor do PB e seus derivados, além de tentar elucidar seus mecanismos de ação. Para isso, as células foram pré-incubadas com os compostos durante 24 horas e, em seguida, eram desafiadas com Glu durante 24 horas (para os testes de morte e viabilidade celular) ou 6 horas (para investigar os mecanismos da morte). Os compostos, até a concentração de 5 µM, não foram tóxicos para as células. Nos testes de proteção, uma pré-incubação com os compostos RC363 e RC574, na concentração mínima de 0,5 µM, foi eficiente em proteger as células de um desafio com Glu 5 mM, enquanto o PB não exibiu nenhum efeito protetor. Este efeito protetor não foi associado a uma recuperação nos níveis de GSH e nem a um efeito antioxidante direto, já que os compostos tiveram um baixo desempenho no teste do DPPH e não foram capazes de inibir totalmente a produção de espécies reativas (ER) induzida por Glu. O efeito protetor dos compostos não esteve associado a um aumento da atividade da PI3K ou da PKC. Por outro lado, os compostos RC363 e RC574 foram capazes de inibir os efeitos do Glu no potencial de membrana mitocondrial (PMM) e na produção de ânion superóxido (O2 -) mitocondrial. Porém, os compostos não foram capazes de inibir a diminuição da capacidade respiratória mitocondrial induzida por Glu, nem a morte celular induzida pela translocação da tBid. Os compostos RC363 e RC574 aumentaram o imunoconteúdo de GPx1 nas células HT22, enquanto o PB e o RC574 aumentaram a atividade da GPx, porém este efeito não parece ser importante para inibir a morte celular induzida por Glu. Os compostos RC363 e RC574 também mostraram grande eficiência em inibir a morte celular induzida pela inibição da GPx4. Apesar do mecanismo de proteção exato não poder ter sido evidenciado no presente estudo, o mesmo traz valiosas informações sobre os efeitos protetores dos novos compostos RC363 e RC574, as quais poderão ser utilizadas no futuro para o uso dos mesmos em estratégias terapêuticas para condições onde o estresse oxidativo está envolvido.