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Highly active antiretroviral therapy (HAART) includes very potent drugs that are often characterized by high toxicity. Tenofovir (TFV) is a widely used drug prescribed mainly for pre-exposure prophylaxis (PreP) and the treatment of human immunodeficiency virus (HIV). The therapeutic range of TFV is narrow, and adverse effects occur with both underdose and overdose. The main factor contributing to therapeutic failure is the improper management of TFV, which may be caused by low compliance or patient variability. An important tool to prevent inappropriate administration is therapeutic drug monitoring (TDM) of compliance-relevant concentrations (ARCs) of TFV. TDM is performed routinely using time-consuming and expensive chromatographic methods coupled with mass spectrometry. Immunoassays, such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) and lateral flow immunoassays (LFIAs), are based on antibody–antigen specific recognition and represent key tools for real-time quantitative and qualitative screening for point-of-care testing (POCT). Since saliva is a non-invasive and non-infectious biological sample, it is well-suited for TDM. However, saliva is expected to have a very low ARC for TFV, so tests with high sensitivity are required. Here, we have developed and validated a highly sensitive ELISA (IC50 1.2 ng/mL, dynamic range 0.4–10 ng/mL) that allows the quantification of TFV in saliva at ARCs and an extremely sensitive LFIA (visual LOD 0.5 ng/mL) that is able to distinguish between optimal and suboptimal ARCs of TFV in untreated saliva.

The present invention relates to bioconjugates and labeled derivatives of the adducts formed by the reaction of patulin with benzene-1,2-dithiols or their salts. Said conjugates are suitable for the production of antibodies capable of recognizing the aforementioned patulin-(benzene-1,2-dithiols) adducts with high affinity and specificity. Likewise, the present invention also relates to the use of bioconjugates of patulin-(benzene-1,2-dithiols) adducts and of labeled derivatives thereof as assay antigens. Furthermore, the present invention also relates to immunochemical methods for the analysis of patulin, using the bioconjugates and labeled derivatives and antibodies of the invention, which include a previous step to quantitatively convert patulin into these adducts. This invention also provides a kit for analyzing patulin comprising a benzene-1,2-dithiol or its salts, antibodies against patulin-(benzene-1,2-dithiols) adducts, and assay antigens., Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Universitat de València, A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica

La presente invención se refiere a bioconjugados y derivados marcados de los aductos formados por la reacción de patulina con benceno-1,2-ditioles o sus sales. Dichos conjugados resultan adecuados para la producción de anticuerpos capaces de reconocer con elevada afinidad y especificidad los mencionados aductos patulina-(benceno-1,2-ditioles). Asimismo, la presente invención también se refiere al uso de bioconjugados dé los aductos patulina-(benceno-1,2-ditioles) y de derivados marcados de los mismos como antigenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a métodos inmunoquímicos de análisis de patulina, utilizando los bioconjugados y derivados marcados y anticuerpos de la invención, que incluyen un paso previo para convertir cuantitativamente la patulina en estos aductos. Esta invención también proporciona un kit para analizar patulina que comprende un benceno-1,2-ditiol o sus sales, anticuerpos frente a los aductos patulina--(benceno-1,2-ditioles), y antígenos de ensayo. [ES], The present invention relates to bioconjugates and labeled derivatives of the adducts formed by the reaction of patulin with benzene-1,2-dithiols or their salts. Said conjugates are suitable for the production of antibodies capable of recognizing the aforementioned patulin-(benzene-1,2-dithiol) adducts with high affinity and specificity. Likewise, the present invention also relates to the use of bioconjugates of patulin-(benzene-1,2- dithiol) adducts and of labeled derivatives thereof as assay antigens. Furthermore, the present invention also relates to immunochemical methods for the analysis of patulin, using the bioconjugates and labeled derivatives and antibodies of the invention, which include a previous step to convert patulin quantitatively into these adducts. This invention also provides a kit for analyzing patulin comprising a benzene-1,2-dithiol or its salts, antibodies against patulin-(benzene-1,2-dithiol) adducts, and assay antigens. [EN], Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Universitat de València, A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica

[ES] La presente invención se refiere a bioconjugados de análogos fragmentarios de aflatoxinas que tienen propiedades novedosas hacia los anticuerpos producidos frente a bioconjugados de aflatoxina M1. Asimismo, la presente invención también se refiere al uso de estos bioconjugados y derivados marcados de estos análogos fragmentarios como antígenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a métodos de análisis utilizando estos bioconjugados o derivados marcados junto a anticuerpos producidos frente a aflatoxina M1. Esta invención también proporciona un kit para analizar aflatoxina M1 que comprende conjugados o derivados marcados de estos derivados fragmentarios junto con anticuerpos producidos frente a aflatoxina M1., [EN] Bioconjugates heterologous and their use for the immunodetection of aflatoxins. The present invention relates to bioconjugates of fragmentary analogues of aflatoxins having novel properties towards antibodies produced against Aflatoxin bioconjugates M1. Likewise, the present invention also relates to the use of these bioconjugates and marked derivatives of these fragmentary analogues such as test antigens. In addition, the present invention also relates to methods of analysis using these bioconjugates or derivatives marked together with antibodies produced against aflatoxin M1. This invention also provides a kit for analyzing M1 aflatoxin comprising conjugates or marked derivatives of these fragmentary derivatives together with antibodies produced against aflatoxin M1., Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Universitat de València, B2 Patente con examen previo

Early warning systems for monitoring toxic events may benefit from the availability of monoclonal antibodies enabling the sensitive and specific detection of anatoxin‐a, a cyanotoxin involved in numerous cases of animal poisoning due to toxic algal blooms in freshwaters. Through the synthesis of three functionalized derivatives of anatoxin‐a, we have succeeded in generating the first‐ever reported immunoreagents (bioconjugates and antibodies) suitable for the development of immunoanalytical approaches aimed at rapid and onsite detection of this harmful cyanotoxin., The authors declare no conflict of interest. The immunoreagents herein reported are available upon request for evaluation and research purposes. These developments have been patented (WO2017085339A1) and an exclusive license has been granted to Abraxis, Inc (Pennsylvannia, USA) for the production and commercialization of immunoanalytical methods for anatoxin-a.

The present invention relates to bioconjugates and derivatives of ochratoxin A labelled at different positions in the molecule suitable for the production of antibodies with a high affinity for ochratoxin A. Moreover, the present invention also relates to the use of ochratoxin A bioconjugates and labelled ochratoxin A derivatives as test antigens. The present invention also relates to methods for the analysis, concentration and extraction of ochratoxin A using the antibodies obtained, together with test antigens that are bioconjugates or labelled derivatives. This invention also provides a kit for analysing ochratoxin A comprising antibodies against said mycotoxin, in certain cases together with test antigens that are bioconjugates or labelled derivatives of ochratoxin A. [EN], La presente invención se refiere a bioconjugados y derivados marcados de ocratoxina A por posiciones diferentes de la molécula, adecuados para la producción de anticuerpos de elevada afinidad para ocratoxina A. Asimismo, la presente invención también se refiere al uso de bioconjugados de ocratoxina A y de derivados marcados de ocratoxina-A como antígenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a métodos de análisis, concentración y extracción de ocratoxina A utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son bioconjugados o derivados marcados. Esta invención también proporciona un kit para analizar ocratoxina A que comprende anticuerpos frente a esta micotoxina, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son bioconjugados o derivados marcados de la ocratoxina A. [ES], Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España), Universitat de València, A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica

The present invention relates to bioconjugates and derivatives of ochratoxin A labelled at different positions in the molecule suitable for the production of antibodies with a high affinity for ochratoxin A. Moreover, the present invention also relates to the use of ochratoxin A bioconjugates and labelled ochratoxin A derivatives as test antigens. The present invention also relates to methods for the analysis, concentration and extraction of ochratoxin A using the antibodies obtained, together with test antigens that are bioconjugates or labelled derivatives. This invention also provides a kit for analysing ochratoxin A comprising antibodies against said mycotoxin, in certain cases together with test antigens that are bioconjugates or labelled derivatives of ochratoxin A. [EN] La presente invención se refiere a bioconjugados y derivados marcados de ocratoxina A por posiciones diferentes de la molécula, adecuados para la producción de anticuerpos de elevada afinidad para ocratoxina A. Asimismo, la presente invención también se refiere al uso de bioconjugados de ocratoxina A y de derivados marcados de ocratoxina-A como antígenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a métodos de análisis, concentración y extracción de ocratoxina A utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son bioconjugados o derivados marcados. Esta invención también proporciona un kit para analizar ocratoxina A que comprende anticuerpos frente a esta micotoxina, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son bioconjugados o derivados marcados de la ocratoxina A. [ES] Peer reviewed Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España), Universitat de València A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica

[EN] The present invention relates to bioconjugates and labeled derivatives of anatoxin-a, at different positions of the molecule, suitable for producing antibodies with high affinity and specificity for anatoxin-a. At the same time, the present invention also relates to the use of bioconjugates of anatoxin-a and labeled derivatives of anatoxin-a as assay antigens. Moreover, the present invention also relates to methods for analyzing, concentrating and extracting anatoxin-a using the antibodies obtained, sometimes together with assay antigens which are bioconjugates or labeled derivatives. This invention also provides a kit for analyzing anatoxin-a which comprises antibodies against this cyanotoxin sometimes together with assay antigens which are bioconjugates or labeled derivatives of anatoxin-a., [ES] Preparación de bioconjugados y anticuerpos para la inmunodetección de anatoxina-a. La presente invención se refiere a bioconjurados y derivados marcados de anatoxina-a, por posiciones diferentes de la molécula, adecuados para la producción de anticuerpos de elevada afinidad y especificidad para anatoxina-a. Asimismo, la presente invención ta,bién se refiere al uso de bioconjurados de anatoxina-a y de derivados marcados de anatoxina-a como antígenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a métodos de análisis, concentración y extracción de anatoxina-a utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son bioconjurados o derivados de marcados. Esta invención también proporciona un kit para analizar anatoxina-a que comprende anticuerpos frente a esta cianotoxina, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son bioconjugados o derivados marcados de la anatoxina-a., Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España), Universitat de València, A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica

[EN] The present invention relates to bioconjugates and labeled derivatives of anatoxin-a, at different positions of the molecule, suitable for producing antibodies with high affinity and specificity for anatoxin-a. At the same time, the present invention also relates to the use of bioconjugates of anatoxin-a and labeled derivatives of anatoxin-a as assay antigens. Moreover, the present invention also relates to methods for analyzing, concentrating and extracting anatoxin-a using the antibodies obtained, sometimes together with assay antigens which are bioconjugates or labeled derivatives. This invention also provides a kit for analyzing anatoxin-a which comprises antibodies against this cyanotoxin sometimes together with assay antigens which are bioconjugates or labeled derivatives of anatoxin-a. [ES] Preparación de bioconjugados y anticuerpos para la inmunodetección de anatoxina-a. La presente invención se refiere a bioconjurados y derivados marcados de anatoxina-a, por posiciones diferentes de la molécula, adecuados para la producción de anticuerpos de elevada afinidad y especificidad para anatoxina-a. Asimismo, la presente invención ta,bién se refiere al uso de bioconjurados de anatoxina-a y de derivados marcados de anatoxina-a como antígenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a métodos de análisis, concentración y extracción de anatoxina-a utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son bioconjurados o derivados de marcados. Esta invención también proporciona un kit para analizar anatoxina-a que comprende anticuerpos frente a esta cianotoxina, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son bioconjugados o derivados marcados de la anatoxina-a. Peer reviewed Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España), Universitat de València A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica

[ES] Preparación de bioconjugados y anticuerpos para la inmunodetección de anatoxina-a. La presente invención se refiere a bioconjurados y derivados marcados de anatoxina-a, por posiciones diferentes de la molécula, adecuados para la producción de anticuerpos de elevada afinidad y especificidad para anatoxina-a. Asimismo, la presente invención ta,bién se refiere al uso de bioconjurados de anatoxina-a y de derivados marcados de anatoxina-a como antígenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a métodos de análisis, concentración y extracción de anatoxina-a utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son bioconjurados o derivados de marcados. Esta invención también proporciona un kit para analizar anatoxina-a que comprende anticuerpos frente a esta cianotoxina, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son bioconjugados o derivados marcados de la anatoxina-a., [EN] The present invention relates to bioconjugates and labeled derivatives of anatoxin-a, at different positions of the molecule, suitable for producing antibodies with high affinity and specificity for anatoxin-a. At the same time, the present invention also relates to the use of bioconjugates of anatoxin-a and labeled derivatives of anatoxin-a as assay antigens. Moreover, the present invention also relates to methods for analyzing, concentrating and extracting anatoxin-a using the antibodies obtained, sometimes together with assay antigens which are bioconjugates or labeled derivatives. This invention also provides a kit for analyzing anatoxin-a which comprises antibodies against this cyanotoxin sometimes together with assay antigens which are bioconjugates or labeled derivatives of anatoxin-a., Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España), Universitat de València, R1 Informe sobre el estado de la técnica

[ES] Preparación de bioconjugados y anticuerpos para la inmunodetección de anatoxina-a. La presente invención se refiere a bioconjurados y derivados marcados de anatoxina-a, por posiciones diferentes de la molécula, adecuados para la producción de anticuerpos de elevada afinidad y especificidad para anatoxina-a. Asimismo, la presente invención ta,bién se refiere al uso de bioconjurados de anatoxina-a y de derivados marcados de anatoxina-a como antígenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a métodos de análisis, concentración y extracción de anatoxina-a utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son bioconjurados o derivados de marcados. Esta invención también proporciona un kit para analizar anatoxina-a que comprende anticuerpos frente a esta cianotoxina, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son bioconjugados o derivados marcados de la anatoxina-a., [EN] The present invention relates to bioconjugates and labeled derivatives of anatoxin-a, at different positions of the molecule, suitable for producing antibodies with high affinity and specificity for anatoxin-a. At the same time, the present invention also relates to the use of bioconjugates of anatoxin-a and labeled derivatives of anatoxin-a as assay antigens. Moreover, the present invention also relates to methods for analyzing, concentrating and extracting anatoxin-a using the antibodies obtained, sometimes together with assay antigens which are bioconjugates or labeled derivatives. This invention also provides a kit for analyzing anatoxin-a which comprises antibodies against this cyanotoxin sometimes together with assay antigens which are bioconjugates or labeled derivatives of anatoxin-a., Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España), Universitat de València, A2 Solicitud de patente sin informe sobre el estado de la técnica

[EN] The invention relates to haptenes, conjugates, marked derivates and antibodies for fludioxonil. The invention also relates to the use of conjugates of fludioxonil as test antigens or immunogens for producing antibodies of said fungicide; and to the use of the marked derivatives of fludioxonil as test antigens. The invention further relates to a method for analysing fludioxonil using the antibodies produced, sometimes together with test antigens that are conjugates or marked derivatives. The invention also provides a kit for analysing fludioxonil comprising antibodies of said fungicide, sometimes together with test antigens that are conjugates or marked derivatives, [ES] La presente invención se refiere a haptenos, conjugados, derivados marcados y anticuerpos para fludioxonil. Así mismo, la presente invención también se refiere al uso de conjugados de fludioxonil como antígenos de ensayo o inmunógenos para obtener anticuerpos de este fungicida; y al uso de los derivados marcados de fludioxonil como antígenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a un método de análisis de fludioxonil utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados. Esta invención también proporciona un kit para analizar fludioxonil que comprende anticuerpos de este fungicida, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Universitat de València, A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica

[EN] The invention relates to haptens, conjugates and antibodies for pyrimethanil fungicide. In addition, the invention relates to the use of pyrimethanil conjugates as assay antigens or immunogens in order to obtain antibodies of the aforementioned fungicide, and to the use of the labelled derivatives of pyrimethanil as assay antigens. The invention also relates to a pyrimethanil analysis method using the antibodies obtained, at times together with assay antigens which are conjugates or labelled derivatives. The invention also provides a kit for analysing pyrimethanil, which includes antibodies of said fungicide, at times together with assay antigens which are conjugates or labelled derivatives., [ES] La presente invención se refiere a haptenos, conjugados, derivados marcados y anticuerpos para pirimetanil. Así mismo, la presente invención también se refiere al uso de los derivados marcados de pirimetanil como antígenos de ensayo o inmunógenos para obtener anticuerpos de este fungicida; y al uso de los derivados marcados de pirimetanil como antígenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a un método de análisis de pirimetanil utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados. Esta invención también proporciona un kit para analizar pirimetanil que comprende anticuerpos de este fungicida, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados., Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España), Universitat de València (España), A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica

[EN] The invention relates to haptens, conjugates and antibodies for pyrimethanil fungicide. In addition, the invention relates to the use of pyrimethanil conjugates as assay antigens or immunogens in order to obtain antibodies of the aforementioned fungicide, and to the use of the labelled derivatives of pyrimethanil as assay antigens. The invention also relates to a pyrimethanil analysis method using the antibodies obtained, at times together with assay antigens which are conjugates or labelled derivatives. The invention also provides a kit for analysing pyrimethanil, which includes antibodies of said fungicide, at times together with assay antigens which are conjugates or labelled derivatives. [ES] La presente invención se refiere a haptenos, conjugados, derivados marcados y anticuerpos para pirimetanil. Así mismo, la presente invención también se refiere al uso de los derivados marcados de pirimetanil como antígenos de ensayo o inmunógenos para obtener anticuerpos de este fungicida; y al uso de los derivados marcados de pirimetanil como antígenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a un método de análisis de pirimetanil utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados. Esta invención también proporciona un kit para analizar pirimetanil que comprende anticuerpos de este fungicida, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados. Peer reviewed Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España), Universitat de València (España) A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica

[EN] The invention relates to haptenes, conjugates, marked derivates and antibodies for fludioxonil. The invention also relates to the use of conjugates of fludioxonil as test antigens or immunogens for producing antibodies of said fungicide; and to the use of the marked derivatives of fludioxonil as test antigens. The invention further relates to a method for analysing fludioxonil using the antibodies produced, sometimes together with test antigens that are conjugates or marked derivatives. The invention also provides a kit for analysing fludioxonil comprising antibodies of said fungicide, sometimes together with test antigens that are conjugates or marked derivatives [ES] La presente invención se refiere a haptenos, conjugados, derivados marcados y anticuerpos para fludioxonil. Así mismo, la presente invención también se refiere al uso de conjugados de fludioxonil como antígenos de ensayo o inmunógenos para obtener anticuerpos de este fungicida; y al uso de los derivados marcados de fludioxonil como antígenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a un método de análisis de fludioxonil utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados. Esta invención también proporciona un kit para analizar fludioxonil que comprende anticuerpos de este fungicida, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados Peer reviewed Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Universitat de València A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica

[EN] The invention relates to haptens, conjugates, labelled derivatives and antibodies for cyprodinil. Likewise, the present invention also relates to the use of cyprodinil conjugates as test antigens or immunogens for obtaining antibodies of said fungicide, and to the use of the labelled derivatives of cyprodinil as test antigens. Furthermore, the present invention also relates to a method for analysing cyprodinil using the thus obtained antibodies, at times together with the test antigens, which are conjugates or labelled derivatives. The invention also provides a kit for analysing cyprodinil, which includes antibodies of said fungicide, at times together with test antigens, which are conjugates or labelled derivatives., [ES] La presente invención se refiere a haptenos, conjugados, derivados marcados y anticuerpos para cipronil. Así mismo, la presente invención también se refiere al uso de conjugados de ciprodinil como antigenos de ensayo o inmunógenos para obtener anticuerpos de este fungicida; y al uso de los derivados marcados de ciprodinil como antigenos de ensayo. Además, la presente inveción también se refiere a un método de análisis de ciprodinil utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados. Esta invención también se proporciona un kit par analizar ciprodinil que comprende anticuerpos de este fungicida, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados., Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España), Universitat de Valencia (España), A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica

[EN] The invention relates to haptens, conjugates, labelled derivatives and antibodies for cyprodinil. Likewise, the present invention also relates to the use of cyprodinil conjugates as test antigens or immunogens for obtaining antibodies of said fungicide, and to the use of the labelled derivatives of cyprodinil as test antigens. Furthermore, the present invention also relates to a method for analysing cyprodinil using the thus obtained antibodies, at times together with the test antigens, which are conjugates or labelled derivatives. The invention also provides a kit for analysing cyprodinil, which includes antibodies of said fungicide, at times together with test antigens, which are conjugates or labelled derivatives. [ES] La presente invención se refiere a haptenos, conjugados, derivados marcados y anticuerpos para cipronil. Así mismo, la presente invención también se refiere al uso de conjugados de ciprodinil como antigenos de ensayo o inmunógenos para obtener anticuerpos de este fungicida; y al uso de los derivados marcados de ciprodinil como antigenos de ensayo. Además, la presente inveción también se refiere a un método de análisis de ciprodinil utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados. Esta invención también se proporciona un kit par analizar ciprodinil que comprende anticuerpos de este fungicida, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados. Peer reviewed Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España), Universitat de Valencia (España) A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica

[EN] The present invention relates to novel chemically functionalized boscalid derivatives. Furtherrnore, the present invention relates to boscalid irnmuno gens , to the conjugated or labelled derivatives and to the antibodies obtained from the irnmunogens of the present invention., [ES] La presente invención derivados se refiere a nuevos funcionalizados químicamente de boscalid. Además la presente invención se refiere a inmunogenos de boscalid, a los derivados conjugados o marcados y a los anticuerpos que se obtienen a partir de los inmunogenos de la presente invención., Consejo Superior de Investigaciones Científicas,Universitat de Valencia., A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica

La patulina es un metabolito secundario tóxico producido por diferentes hongos pertenecientes a los géneros Aspergillus, Paecilomyces, Penicillium y Xylaria. Su presencia en la cadena alimentaria se debe a la contaminación de una gran variedad de alimentos con hongos productores, entre los cuales P. expansum, que infecta fundamentalmente manzanas, es considerado el principal hongo productor de patulina. A raíz de su reactividad con compuestos nucleofílicos a nivel celular y sus efectos tóxicos agudos reportados en riñones, intestino y el sistema inmunitario de vertebrados, la patulina se encuentra en la corta lista de micotoxinas vigiladas y reguladas mundialmente. Los límites máximos para patulina establecidos por la UE son 50 µg/kg para zumos, 25 µg/kg para productos sólidos y 10 µg/kg para alimentos destinados al consumo infantil. De modo similar a otros contaminantes relevantes, son muchos los procedimientos analíticos desarrollados para la detección de patulina en alimentos. No obstante, dichas metodologías se basan principalmente en técnicas cromatográficas, no existiendo métodos inmunoanalíticos que permitan su determinación fiable. El enfoque principal de esta tesis doctoral se ha basado en la síntesis de nuevos derivados funcionalizados de patulina y su aplicación para el desarrollo de inmunoensayos que permitan detectar la micotoxina de modo cuantitativo en diferentes matrices alimentarias. En una primera aproximación, los análogos estructurales, denominados haptenos, fueron sintetizados introduciendo un brazo espaciador que permitiera su acoplamiento posterior a proteínas portadoras, manteniendo lo más intacto posible el esqueleto original de la toxina. Con este propósito, se prepararon tres haptenos convencionales, los cuales fueron finalmente empleados para la preparación de bioconjugados tras su caracterización mediante técnicas espectroscópicas. Empleando estrategias previamente descritas en la bibliografía, se sintetizaron los haptenos C4 y C7, mientras que el hapteno C6 se obtuvo mediante una aproximación novedosa. Una vez preparados y caracterizados los conjugados, se llevó a cabo evaluación de la respuesta inmunitaria generada por cada hapteno mediante la inmunización de conejos. Ante la ausencia de una adecuada respuesta inmunitaria y por tanto de anticuerpos con suficiente afinidad hacia la patulina, se decidió evaluar la viabilidad de un método de derivatización de la micotoxina que permitiera producir anticuerpos frente a un derivado estable. Para ello, se desarrollaron dos estrategias de derivatización aprovechando la reactividad de patulina con grupos nucleofílicos. El uso de diferentes compuestos aromáticos monotiolados como reactivos para la derivatización permitió obtener seis aductos, y la funcionalidad de esta aproximación se estimó mediante la inmunización con el conjugado BSA–V y su análogo, el conjugado BSA–V4. La obtención de anticuerpos anti–V impulsó el desarrollo del segundo método de derivatización, el cual estuvo basado en la formación de derivados de patulina empleando compuestos aril-1,2-ditiol. Como resultado, se produjeron y caracterizaron un total de 5 aductos, empleando finalmente derivados proteicos de los aductos VII, VIII y XI para la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales. Los haptenos VIIa, VIIIa, XIa y XIb permitieron la obtención de un grupo amplio de anticuerpos, los cuales fueron exhaustivamente caracterizados y empleados exitosamente para el desarrollo de inmunoensayos enzimáticos (ELISA) y de tiras inmunocromatográficas. Por último, la aplicación de ambas técnicas a muestras reales permitió demostrar su utilidad para el análisis de patulina a niveles legislativamente relevantes. En definitiva, esta tesis doctoral ha permitido el desarrollo de los primeros métodos rápidos basados en anticuerpos para la determinación de patulina, la única micotoxina regulada para la que no existían aproximaciones analíticas de este tipo.

Ocratoxina A (OTA) es un metabolito secundario producido por hongos del género Aspergillus y Penicillium. Esta micotoxina puede encontrarse en una gran variedad de alimentos, entre los que se encuentran cereales, café o vino. OTA es un potente carcinógeno en roedores, motivo por el que se encuentra clasificado en el grupo 2B (posible carcinógeno para humanos) por la Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer. Con el objetivo de reducir la exposición de los consumidores a esta micotoxina, la Comisión Europea ha establecido concentraciones máximas en varias matrices alimentarias, siendo este límite de 2 µg/L en el caso de vino y zumo de uva. Entre las diferentes técnicas analíticas para la detección de OTA, los métodos ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) y los ensayos de flujo lateral (LFIA, Lateral Flow ImmunoAssay) son métodos ampliamente utilizados debido a su simplicidad, bajo coste, portabilidad y alta capacidad de análisis. Se ha publicado en la literatura científica un gran número de inmunoensayos para la detección de OTA, pero en todos ellos los conjugados empleados, tanto de inmunización como de ensayo, fueron preparados mediante el acoplamiento directo de esta micotoxina a proteínas empleando el grupo carboxilo presente en su estructura. La presente Tesis Doctoral se ha centrado en la síntesis de nuevos derivados funcionalizados de ocratoxina A (haptenos) y en el uso de los mismos para el desarrollo de inmunoensayos que permitan la detección de esta micotoxina en alimentos con elevada sensibilidad y especificidad. Los nuevos haptenos fueron químicamente sintetizados manteniendo libre el grupo carboxilo de la toxina, con el objetivo de que este pudiese participar en la interacción antígeno–anticuerpo. La hipótesis de partida planteaba que la presencia de dicho grupo en los conjugados destinados a inmunización de animales de laboratorio permitiría la producción de anticuerpos con mejores prestaciones analíticas. Dos de estos haptenos fueron preparados con grupos carboxilo en posiciones distales de la estructura de OTA, manteniendo libre el carboxilo propio de la toxina. Además, se prepararon dos haptenos con un grupo azida en el extremo del brazo espaciador con el objetivo de evaluar la viabilidad de la generación de anticuerpos a partir de conjugados proteicos obtenidos a través de una reacción de cicloadición de Huisgen 1,3-dipolar catalizada por cobre (I) (CuAAC), el ejemplo clásico de reacción “click”. La importancia del grupo carboxilo nativo de OTA se confirmó mediante la evaluación de anticuerpos policlonales de conejo. Los antisueros producidos a partir de haptenos con dicho grupo carboxilo libre mostraron afinidades hacia OTA superiores a aquellos que se obtuvieron a partir de conjugados preparados a través del mismo. Además, se obtuvo una buena respuesta inmune a partir de los bioconjugados preparados mediante química “click”, demostrando que la presencia del anillo de triazol en el brazo espaciador producto del acoplamiento no impide la generación de anticuerpos de elevada afinidad. Finalmente, se llevó a cabo la producción de anticuerpos monoclonales de ratón a partir de todos los haptenos sintetizados y, tras su caracterización mediante ELISA competitivo, las mejores combinaciones de inmunorreactivos se utilizaron para el desarrollo de un ELISA y de tiras inmunorreactivas para la detección de OTA en vino y zumo de uva. Las características analíticas de los ensayos desarrollados fueron similares o superiores a los kits comerciales evaluados. Ochratoxin A (OTA) is a secondary metabolite produced by several species of Aspergillus and Penicillium. This mycotoxin can be found in a wide variety of foodstuffs, including cereals, coffee and wine. OTA is a strong carcinogen for rodents and it is classified into group 2B (possible human carcinogen) by the International Agency for Research on Cancer (IARC). In order to protect consumers from exposure, the European Commission has established regulations concerning OTA levels in several foodstuffs, being wine and grape juices the commodities with the most demanding limit (2 µg/L). Among the different analytical techniques employed nowadays for OTA detection, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or the lateral flow immunoassay (LFIA) are popular methods because they are rapid, affordable, simple, portable and high throughput. Noticeably, in all immunoassays for OTA detection developed so far, the employed immunizing and assay conjugates were obtained using the native carboxylic group of the mycotoxin for protein coupling. This PhD Thesis has focused on the synthesis of a novel set of OTA functionalised derivatives (haptens), their use for the generation of new antibodies and the development of immunoanalytical techniques for the detection of this mycotoxin in foodstuff. Those new haptens were chemically synthesised by introducing the functionalised spacer arm at positions other than the native carboxylic moiety of OTA, so this group may participate in the antibody–analyte interaction. Our hypothesis was that bioconjugates based on those novel haptens may elicit the generation of antibodies with superior binding properties. Two of these new haptens were prepared with a carboxylic group at the end of the spacer arm, thus allowing their coupling to proteins by carbodiimide chemistry. Additionally, two novel haptens were synthesised bearing an azide group in the linker in order to test the feasibility of producing antibodies using protein conjugates prepared by copper(I)-catalysed Huisgen 1,3-dipolar azide–alkyne cycloaddition (CuAAC), the prototypical example of click chemistry reactions. The relevance of the native carboxylic group in the antibody–analyte interaction was first confirmed by assessing the immune response in rabbits. Polyclonal antibodies (pAbs) obtained from haptens displaying the free native carboxylic group showed higher affinities than antisera from haptens conjugated through this group. Moreover, adequate immune responses to OTA were found from click chemistry-assisted bioconjugates, thus demonstrating for the first time that the presence of a triazole ring in the spacer arm does not handicap the generation of antibodies suitable for immunodiagnostics. Thereafter, mouse monoclonal antibodies (mAbs) with subnanomolar affinities towards OTA were produced from all haptens and, following characterization of their binding properties in different formats with homologous and heterologous conjugates, the best immunoreagent combinations were used to develop ELISAs and immunostrips for the detection of this mycotoxin in grape wine and juice samples. Remarkably, the analytical characteristics of these new immunochemical methods favourably compare with the performance of commercial kits.

La anatoxina-a es una potente neurotoxina producida por cianobacterias de agua dulce. Bajo ciertas condiciones ambientales, estos microorganismos son capaces de proliferar de forma masiva, dando lugar a floraciones o blooms, liberando concentraciones importantes de anatoxina-a. La presencia de esta biotoxina en ecosistemas de agua dulce ha causado episodios de intoxicación en humanos, así como un elevado número de incidentes mortales en ganado, animales domésticos y fauna salvaje. La posibilidad de detectar la presencia de bajas concentraciones de anatoxina-a en fuentes de abastecimiento de agua, en aguas de uso recreativo o incluso en alimentos, constituye una eficaz aproximación para reducir el riesgo de exposición a esta biotoxina. En este sentido, y ante la ausencia de métodos rápidos y sencillos para la determinación de anatoxina-a, la presente Tesis Doctoral está enfocada a la obtención de anticuerpos monoclonales de alta afinidad y especificidad que posibiliten el desarrollo de métodos inmunoanalíticos para esta cianotoxina. En esta memoria se describen varias estrategias químicas para sintetizar derivados funcionalizados (haptenos) de anatoxina-a. Así mismo, se detalla la preparación de los correspondientes bioconjugados de inmunización y ensayo, y se discuten los resultados obtenidos en la identificación y selección de hibridomas productores de anticuerpos frente a anatoxina-a. Este trabajo se desarrolló de manera conjunta en el Dpto. de Química Orgánica de la Universidad de Valencia y en el Dpto. de Biotecnología del Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA) del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) bajo la dirección del Profesor Antonio Abad Somovilla y del Dr. Antonio Abad Fuentes.

La gran variedad de plaguicidas, su amplio uso y la preocupación que genera la presencia de residuos en muestras agroalimentarias, conlleva la necesidad de disponer de metodologías analíticas fiables que permitan la determinación eficaz de estos residuos en alimentos. En este sentido, los procedimientos analíticos basados en técnicas inmunológicas y obtención de anticuerpos para el análisis de plaguicidas constituyen una alternativa en constante desarrollo. Es precisamente en esta línea en la que se enmarca el objetivo principal de este estudio, consistente en el desarrollo y aplicación de nuevos métodos basados en anticuerpos monoclonales que permitan el análisis rápido y sencillo de los fungicidas kresoxim-methyl y trifloxystrobin.

El objetivo de esta tesis fue desarrollar un ELISA multianalito, basado en anticuerpos monoclonales, para los plaguicidas N-metilcarbamatos carbaryl, carbofuran y methiocarb. Para ello se desarrollaron en primer lugar ELISAs individuales para carbofuran y methiocarb. Posteriormente estos inmunoensayos, junto con el de carbary1, previamente desarrollado en el LIB, se integraron en un ELISA multianalito. Para producir anticuerpos monoclonales frente a carbofuran y methiocarb se sintetizaron tres compuestos para cada analito, con un brazo espaciador carboxílico de diferente longitud introducido en el grupo carbamato de la estructura del analito. Posteriormente, estos compuestos fueron conjugados a proteínas y utilizados para inmunizar ratones. Los anticuerpos monoclonales producidos fueron caracterizados en los formatos de ELISA de conjugado inmovilizado (C1) y anticuerpo inmovilizado (Al), usando otros compuestos sintetizados como haptenos heterólogos de ensayo. Los anticuerpos de methiocarb LIB-MXNB31 y de carbofuran LIB-BFNB67, en combinación con los haptenos de methiocarb (DPNI-1 y MCNH) y de carbofuran (BFNH), acoplados a ovoalbúmina y a peroxidasa, respectivamente, se utilizaron para desarrollar ELISAs en los formatos Cl y Al, respectivamente. Los inmunoensayos desarrollados para carbofuran y methiocarb mostraron valores de I5o aproximadamente de 0.7 y 0.03 ng/ml, respectivamente. Los ELISAs de methiocarb fueron muy específicos, mientras que los de carbofuran reconocieron algunos compuestos estructuralmente similares. Los inmunoensayos de carbofuran y methiocarb, junto con el de carbary1, fueron validados frente a HPLC, como método de referencia, en el análisis de muestras purificadas de frutas y hortalizas, obteniéndose una buena correlación entre métodos. Asimismo, se demostró que estos ELISAs puede ser aplicados al análisis de carbary1, carbofuran y methiocarb en extractos crudos, obteniéndose incluso mejores resultados que en las muestras purificadas........., Moreno Tamarit, MJ. (2002). Desarrollo de un inmunoensayo multianalito, basado en anticuerpos monoclonales, para la determinación de plaguicidas N-metilcarbamatos en frutas y hortalizas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. doi:10.4995/Thesis/10251/2688.