Estrategias alternativas para la bioconjugación de ocratoxina A y su aplicación en inmunodiagnóstico alimentario

Ocratoxina A (OTA) es un metabolito secundario producido por hongos del género Aspergillus y Penicillium. Esta micotoxina puede encontrarse en una gran variedad de alimentos, entre los que se encuentran cereales, café o vino. OTA es un potente carcinógeno en roedores, motivo por el que se encuentra clasificado en el grupo 2B (posible carcinógeno para humanos) por la Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer. Con el objetivo de reducir la exposición de los consumidores a esta micotoxina, la Comisión Europea ha establecido concentraciones máximas en varias matrices alimentarias, siendo este límite de 2 µg/L en el caso de vino y zumo de uva. Entre las diferentes técnicas analíticas para la detección de OTA, los métodos ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) y los ensayos de flujo lateral (LFIA, Lateral Flow ImmunoAssay) son métodos ampliamente utilizados debido a su simplicidad, bajo coste, portabilidad y alta capacidad de análisis. Se ha publicado en la literatura científica un gran número de inmunoensayos para la detección de OTA, pero en todos ellos los conjugados empleados, tanto de inmunización como de ensayo, fueron preparados mediante el acoplamiento directo de esta micotoxina a proteínas empleando el grupo carboxilo presente en su estructura. La presente Tesis Doctoral se ha centrado en la síntesis de nuevos derivados funcionalizados de ocratoxina A (haptenos) y en el uso de los mismos para el desarrollo de inmunoensayos que permitan la detección de esta micotoxina en alimentos con elevada sensibilidad y especificidad. Los nuevos haptenos fueron químicamente sintetizados manteniendo libre el grupo carboxilo de la toxina, con el objetivo de que este pudiese participar en la interacción antígeno–anticuerpo. La hipótesis de partida planteaba que la presencia de dicho grupo en los conjugados destinados a inmunización de animales de laboratorio permitiría la producción de anticuerpos con mejores prestaciones analíticas. Dos de estos haptenos fueron preparados con grupos carboxilo en posiciones distales de la estructura de OTA, manteniendo libre el carboxilo propio de la toxina. Además, se prepararon dos haptenos con un grupo azida en el extremo del brazo espaciador con el objetivo de evaluar la viabilidad de la generación de anticuerpos a partir de conjugados proteicos obtenidos a través de una reacción de cicloadición de Huisgen 1,3-dipolar catalizada por cobre (I) (CuAAC), el ejemplo clásico de reacción “click”. La importancia del grupo carboxilo nativo de OTA se confirmó mediante la evaluación de anticuerpos policlonales de conejo. Los antisueros producidos a partir de haptenos con dicho grupo carboxilo libre mostraron afinidades hacia OTA superiores a aquellos que se obtuvieron a partir de conjugados preparados a través del mismo. Además, se obtuvo una buena respuesta inmune a partir de los bioconjugados preparados mediante química “click”, demostrando que la presencia del anillo de triazol en el brazo espaciador producto del acoplamiento no impide la generación de anticuerpos de elevada afinidad. Finalmente, se llevó a cabo la producción de anticuerpos monoclonales de ratón a partir de todos los haptenos sintetizados y, tras su caracterización mediante ELISA competitivo, las mejores combinaciones de inmunorreactivos se utilizaron para el desarrollo de un ELISA y de tiras inmunorreactivas para la detección de OTA en vino y zumo de uva. Las características analíticas de los ensayos desarrollados fueron similares o superiores a los kits comerciales evaluados. Ochratoxin A (OTA) is a secondary metabolite produced by several species of Aspergillus and Penicillium. This mycotoxin can be found in a wide variety of foodstuffs, including cereals, coffee and wine. OTA is a strong carcinogen for rodents and it is classified into group 2B (possible human carcinogen) by the International Agency for Research on Cancer (IARC). In order to protect consumers from exposure, the European Commission has established regulations concerning OTA levels in several foodstuffs, being wine and grape juices the commodities with the most demanding limit (2 µg/L). Among the different analytical techniques employed nowadays for OTA detection, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or the lateral flow immunoassay (LFIA) are popular methods because they are rapid, affordable, simple, portable and high throughput. Noticeably, in all immunoassays for OTA detection developed so far, the employed immunizing and assay conjugates were obtained using the native carboxylic group of the mycotoxin for protein coupling. This PhD Thesis has focused on the synthesis of a novel set of OTA functionalised derivatives (haptens), their use for the generation of new antibodies and the development of immunoanalytical techniques for the detection of this mycotoxin in foodstuff. Those new haptens were chemically synthesised by introducing the functionalised spacer arm at positions other than the native carboxylic moiety of OTA, so this group may participate in the antibody–analyte interaction. Our hypothesis was that bioconjugates based on those novel haptens may elicit the generation of antibodies with superior binding properties. Two of these new haptens were prepared with a carboxylic group at the end of the spacer arm, thus allowing their coupling to proteins by carbodiimide chemistry. Additionally, two novel haptens were synthesised bearing an azide group in the linker in order to test the feasibility of producing antibodies using protein conjugates prepared by copper(I)-catalysed Huisgen 1,3-dipolar azide–alkyne cycloaddition (CuAAC), the prototypical example of click chemistry reactions. The relevance of the native carboxylic group in the antibody–analyte interaction was first confirmed by assessing the immune response in rabbits. Polyclonal antibodies (pAbs) obtained from haptens displaying the free native carboxylic group showed higher affinities than antisera from haptens conjugated through this group. Moreover, adequate immune responses to OTA were found from click chemistry-assisted bioconjugates, thus demonstrating for the first time that the presence of a triazole ring in the spacer arm does not handicap the generation of antibodies suitable for immunodiagnostics. Thereafter, mouse monoclonal antibodies (mAbs) with subnanomolar affinities towards OTA were produced from all haptens and, following characterization of their binding properties in different formats with homologous and heterologous conjugates, the best immunoreagent combinations were used to develop ELISAs and immunostrips for the detection of this mycotoxin in grape wine and juice samples. Remarkably, the analytical characteristics of these new immunochemical methods favourably compare with the performance of commercial kits.