Search

Bu tez çalışması Pamukkale Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar ve Projeler Koordinatörlüğü tarafından 2018FEBE017 nolu proje ile desteklenmiştir. Bu çalışmanın amacı bipiridin ligandı içeren rutenyum (RuCS91) bileşiğinin antikanser ve antibiyofilm aktivitesini belirlemektir. RuCS91’in antibiyofilm aktivitesi Staphylococcus aureus ATCC 29213 karşı, Kristal viyole yöntemi ile değerlendirildi. Biyofilm inhibisyonu 2,5 ve 5,5 μg/ml’de maksimum %76 olarak belirlendi. Ru CS91’ in Minimum Bakterisidal Konsantrasyonu (MBK) 8 μg/ml’dir. Ru CS91’in antibiyofilm etkisi doza bağlıydı ve hücre hareketliliğini de inhibe etti. Antibiyofilm etki SEM, FT-IR analizi, ışık ve floresan mikroskopisiyle doğrulandı. Rutenyum ile muamale edilen hücrelerde, hücre zarı geçirgenliğinin artması, hücre zarı morfolojisinin bozulması ile ilişkilidir. Bu değişiklik, FT-IR analizi ile hücre yüzeyindeki protein ve karbonhidratlardaki bazı grupların germe ve şişme pikleri ile gösterildi. RuCS91’ in sitotoksik etkisi MTT analizi ile değerlendirildi ve EC50 değeri 1,22 μM olarak bulundu. MDA-MB-231 hücre hattında tümör baskılayıcı genlerin hücresel mRNA seviyesinde artışa neden oldu ve apoptoza yol açtı. The aim of present study was to determine anticancer and antibiofilm activity of rutenyum (RuCS91). The antibiofilm activity on Staphylococcus aureus ATCC 29213 was evaluated using the Crystal violet assay. Biofilm inhibition percentage was found maximum 76% at concentrations of 2.5 and 5.5 μg/ml. Minimum Bactericidal Concentration (MBK) was 8 μg / ml. The antibiofilm effect of RuCS91 was a dose-dependent and ruthenium inhibited bacterial motility. Antibiofilm effect of RuCS91 was verified byanalysis of SEM, FT-IR, light and flourescent microscopy. The increasing of the membrane permeability was related to the disturbing of the cell membrane morphology. This disturbing was determined via FT-IR analysis that shows vibrations some changes in the protein and carbohydrate groups in the cell surface. The cytotoxic activity of RuCS91 was also evaluated by MTT assay and EC50 value was determined 1.22 μg/ml. RuCS91 were found to have significant anticancer activity. According to the our findings, RuCS91 caused an increase in the cellular mRNA level of tumor supressor genes in MDA-MB-231 cell line. RuCS91 induced apoptosis in the MDA-MB-231 cell line.

Yüksek Lisans Tezi, Meme kanseri, dünya çapında kadınlarda en sık rastlanan malign kanser türlerinden biridir. Sürekli artmakta olan meme kanseri vakası nedeniyle, birincil ve ikincil korunmada etkili tedaviler geliştirmek hayati önem taşımaktadır. Kanser önleme yönteminin her iki türünü de birleştiren en iyi yöntemlerden biri, kimyasal müdahale gibi görünmektedir. Bu kimyasal müdahalelerde de karsinojenez sürecini engellemek, geciktirmek veya tersine çevirmek için doğal veya yapay bileşikler kullanır. Doğal kökenli kemoprevansiyon maddeler arasında, geniş spektrumlu bir anti-kanser aktivitesi gösteren polifenol türevi olan kurkumin ve naftakinon yapılı olan juglona büyük önem verilmektedir. Düşük moleküler ağırlıklı (14-15 kDa) bir protein grubu olan FABP'ler, lipit bağlayıcı protein süper ailesinin üyeleridir. FABP'ler çeşitli dokularda bulunur ve yağ asidi metabolizmasında önemli bir rol oynar ayrıca hücre büyümesinin ve çoğalmasının modülasyonundan sorumlu olabilirler. FABP'lerin kanser gelişiminde yer aldığı bildirilmektedir. Birçok kanser türünde artış veya azalış göstermektedir ve bu nedenle tümör markörü olarak kullanılabileceği belirtilmiştir. Yapılan çalışmada kurkumin ve juglonun meme kanseri hücre hatlarında antikanser ve sitotoksik etkileri sonucu hücre canlılığına etkisini ve FABP5 ve FABP9 gen ekspresyonu ve protein düzeyindeki değişiklikleri araştırmak amaçlanmaktadır. Çalışmamızda MCF-7 meme kanseri hücre hattına 0,1 – 40 μM kurkumin ve 1 – 40 μM juglon muamelesi yapılmış ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattınada 1 – 20 μM kurkumin ve 1 – 15 μM juglon muamelesi yapılmıştır. Bu farklı doz uygulamaları sonucu hücre canlılığına etkileri MTT analiz ile tespit edilmiştir. Hücrelere 24 saat boyunca IC50 değerlerine göre belirlenen farklı dozlarda kurkumin ve juglon muamelesi yapılmış ve Real-time PCR ve Western blot yöntemiyle FABP5 ve FABP9 gen ekspresyonları ve protein düzeyleri kontrol grubu ile karşılaştırılarak hesaplanmıştır. MCF-7 hücre hattında kurkumin uygulaması sonucunda, IC50 dozu 22,41 μM olarak tespit edilmiş ve FABP5 ve FABP9 gen ekspresyonlarının arttığı, juglon uygulaması sonucu IC50 dozu 16,27 μM olarak tespit edilmiş ve FABP5 ve FABP9 gen ekspresyonunun ilk dozda azaldığı yükselen dozlarda arttğı belirlenmiştir. MDA-MB-231 hücre hattında, kurkumin uygulaması sonucunda IC50 dozu 10,43 μM, juglon uygulaması sonucunda da IC50 dozu 3,38 μM olarak tespit edilmiş ve FABP5 ve FABP9 gen eksperesyonunun azaldığı belirlenmiştir. Ekspresyon analizleri yapıldıktan sonra, FABP5 ve FABP9 proteinlerine ait özgün antikorlar kullanılarak Western blot analizi yapılmıştır. MCF-7 hücre hattında kurkumin uygulamasının FABP5 ve FABP9 protein düzeylerini kontrol grubuna göre azalttığı tespit edilmiştir. Aynı şekilde MCF-7 hücre hattında juglon uygulamasının da FABP5 ve FABP9 protein düzeylerinin kontrol grubuna göre azalttığı tespit edilmiştir. MDA-MB-231 hücre hattında ise kurkumin uygulaması sonucu FABP5 ve FABP9 protein düzeylerinde kontrol grubuna göre ilk dozlarda arttığı görülürken sonraki dozlarda azaldığı tespit edilmiştir. Benzer şekilde MDA-MB-231 hücre hattında juglon uygulaması sonucu FABP5 ve FABP9 protein düzeylerinde kontrol grubuna göre ilk dozlarda arttığı görülürken sonraki dozlarda azaldığı tespit edilmiştir. Çalışma sonucunda hem MCF-7 hem MDA-MB-231 hücre hattında kurkumin ve juglon uygulamasının hücre canlılığını ve FABP5 ve FABP9 gen ekspresyonlarını ve protein düzeylerini azalttığı bulunmuştur., Breast cancer is one of the most common types of malignant cancer in women worldwide. Due to the ever-increasing case of breast cancer, it is vital to develop effective treatments for primary and secondary prevention. One of the best methods that combine both types of cancer prevention method seems to be chemical intervention. In these chemical interventions, it uses natural or artificial compounds to prevent, delay or reverse the carcinogenesis process. Among the chemoprevention substances of natural origin, great importance is given to curcumin, which is a polyphenol derivative with a broad spectrum anti-cancer activity, and a juglone with naphthaquinone. FABPs, a low molecular weight (14-15 kDa) protein group, are members of the lipid-binding protein superfamily. FABPs are found in a variety of tissues and play an important role in fatty acid metabolism and may be responsible for modulation of cell growth and proliferation. FABPs are reported to be involved in cancer development. It increases or decreases in many types of cancer and therefore it has been stated that it can be used as a tumor marker. The aim of this study is to investigate the effects of curcumin and juglone on cell viability as a result of anticancer and cytotoxic effects in breast cancer cell lines, and the changes in FABP5 and FABP9 gene expression and protein level. In our study, MCF-7 breast cancer cell line was treated with 0.1 - 40 μM curcumin and 1 - 40 μM juglone, and the MDA-MB-231 breast cancer cell line was treated with 1 - 20 μM curcumin and 1 - 15 μM juglone. The effects of these different doses on cell viability were determined by MTT analysis. Cells were treated with different doses of curcumin and juglone determined according to IC50 values for 24 hours, and FABP5 and FABP9 gene expressions and protein levels were calculated by comparing with the control group by Real-time PCR and Western blot method. As a result of curcumin application in the MCF-7 cell line, IC50 dose was determined as 22.41 μM and FABP5 and FABP9 gene expressions increased, as a result of juglone application IC50 dose was determined as 16.27 μM and FABP5 and FABP9 gene expression decreased at the initial dose and increased in increasing doses. In the MDA-MB-231 cell line, the IC50 dose was determined as 10.43 μM after curcumin application and 3.38 μM as a result of juglone application, and it was determined that FABP5 and FABP9 gene expression decreased. After the expression analysis, Western blot analysis was performed using specific antibodies of FABP5 and FABP9 proteins. It was determined that curcumin application in MCF-7 cell line decreased FABP5 and FABP9 protein levels compared to the control group. Likewise, it was found that juglone application in MCF-7 cell line decreased FABP5 and FABP9 protein levels compared to the control group. In the MDA-MB-231 cell line, it was observed that FABP5 and FABP9 protein levels increased in the initial doses compared to the control group as a result of curcumin administration, but decreased in the following doses. Similarly, as a result of the application of juglone in the MDA-MB-231 cell line, it was observed that FABP5 and FABP9 protein levels increased in the initial doses compared to the control group, but decreased in the following doses. As a result of the study, it was found that curcumin and juglone application decreased cell viability and FABP5 and FABP9 gene expressions and protein levels in both MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines.

Bitkiler gibi doğal kaynaklardan ilaç geliştirme çalışmaları oldukça hız kazanmış durumdadır. Bu anlamda bitkiler ilaç hammadde kaynağı olarak görülmektedir. Bitkilerin çeşitli analizler ile etkinliğinin değerlendirildiği çalışmalarda bu durum araştırılmaktadır. Bu tez çalışmasında, Heracleum humile bitkisinin toprak üstü kısımlarından maserasyon, infüzyon ve ultrasonikasyon yöntemleri ile elde edilen etil asetat, metanol ve su ekstraktlarının etkisi yapılan biyolojik aktivite testleri ile değerlendirilmiştir. Yapılan biyolojik aktivite testleri kapsamında DNA koruma ve antibakteriyel etkiler ile meme kanseri hücre hatları olan MCF-7 ve MDA-MB-231 hücreleri üzerindeki sitotoksik aktivite analizleri gerçekleştirilmiştir. Yapılan DNA koruma analizi sonucunda, maserasyon yöntemi ile elde edilen etil asetat ve metanol ekstraktları ile infüzyon yöntemi ile elde edilen su ekstraktının 5 ve 10 mg/mL konsantrasyonlarda zayıf DNA koruma aktivitesi gözlenmiştir. Ultrasonikasyon yöntemi etil asetat, metanol ve su ekstraktlarında DNA koruma aktivitesi görülmemiştir. Antimikrobiyal aktivite 4 Gram (+) ve 6 Gram (-) bakteri üzerinde mikrodilüsyon yöntemi ile belirlenmiştir. Buna göre Minimum İnhibisyon Konsantrasyon (MİK) değerleri ile Minimum Bakterisidal Konsantrasyonlar (MBK) belirlenmiştir. En etkili sonuç, maserasyon yöntemi ile elde edilen etil asetat ekstraktında Proteus vulgaris, Escherichia coli, Serratia marrescens, Pseudomonas aeruginosa ve Salmonella enteritidis ATCC 13076 Gram (-) suşları üzerinde gözlenmiştir. Diğer ekstraktların negatif kontrol ile aynı etkiyi gösterdiği ya da negatif kontrolden daha yüksek konsantrasyonda etki gösterdiği belirlenmiştir. Sitotoksik aktivite analizi MTT testi ile gerçekleştirilmiştir. En etkili sonuçlar; MDA-MB-231 hücre hattı üzerinde 48. saatte ultrasonikasyon yöntemi ile etil asetat ekstraktında (IC50:97,94 µg/mL), ardından MCF-7 hücre hattı üzerinde 24. saatte ultrasonikasyon yöntemi etil asetat ekstraktında (IC50:103,9 µg/mL) ve son olarak MDA-MB-231 hücre hattı üzerinde 48. saatte maserasyon yöntemi ile etil asetat ekstraktında (IC50:116,7 µg/mL) belirlenmiştir. Bulgular, düşük konsantrasyonlarda sitotoksik aktivite gösteren ekstraktlar sayesinde kanser araştırmalarına ışık tutabilir. Bu ekstraktlar için yapılacak in vivo analizler ile canlı sistemdeki etkileri araştırılabilir. Drug studies from natural sources such as plants have speed up. In this sense, plants are thought as a source of pharmaceutical raw materials. In studies where the effectiveness of plants is evaluated with various analyzes, this situation is investigated. In this thesis, the effects of ethyl acetate, methanol and water extracts obtained from the aerial parts of the Heracleum humile plant by maceration, infusion and ultrasonication methods were evaluated with biological activity tests. Within the scope of biological activity tests, DNA protection analysis, antibacterial testing and cytotoxic activity analysis in breast cancer cell lines MCF-7, MDA-MB-231 were studied. As a result of DNA protection analysis, weak DNA protection activity was observed in concentrations of 5 and 10 mg/mL of water extract obtained by infusion method with ethyl acetate and methanol extracts obtained by maceration method. DNA protection activity was not observed in ethyl acetate, methanol and water extracts by ultrasonication method. Antimicrobial activity was performed by microdilution method on 4 Gram (+) and 6 Gram (-) bacteria. Accordingly, minimum inhibition concentration (MIC) values and minimum bactericidal concentrations (MBC) were determined. The most effective result was observed on Proteus vulgaris, Escherichia coli, Serratia marrescens, Pseudomonas aeruginosa and Salmonella enteritidis ATCC 13076 Gram (-) strains in ethyl acetate extract by maceration method. Other extracts showed their effects at same concentration with negative control or in a higher concentration than negative control. Cytotoxic activity analysis was performed by MTT test. The most effective results were determined on the MDA-MB-231 cell line at 48th hour by ultrasonication ethyl acetate extract (IC50:97.94 µg/mL), followed by the MCF-7 cell line at the 24th hour by ultrasonication ethyl acetate extract (IC50:103.9 µg/mL) and finally on the MDA-MB-231 cell line at 48th hour by maceration ethyl acetate extract (IC50:116.7 µg/mL). Findings may shed light on cancer researches because of extracts that exhibit cytotoxic activity in low doses. The effects of these extracts can be investigated on the living systems by in vivo analysis. 107

Meme kanseri özellikle kadınlarda en sık görülen kanser tipidir. Bu durum tedavide yeni yaklaşımların oluşturulması gereğini doğurmuştur. Bu çalışmada Ganoderma lucidum (GL)'un MDA-MB-231 ve MCF-7 meme kanseri hücre hatları üzerindeki antiproliferatif ve apopitotik yolaklar üzerine etkisinin araştırılması amaçlandı.Çalışmada, GL'nin antiproliferatif etkisini belirlemek için MDA-MB-231 ve MCF-7 meme kanseri hücre hatları üzerine 5 µM–100 µM konsatrasyon aralığında GL uygulandı. Sitotoksik aktiviteleri 24, 48 ve 72. saatte hücre canlılık testi (MTS) ile belirlendi. Klonojenik test ile GL'nin meme kanseri hücrelerinde hücre kolonisi oluşumu üzerine etkisi belirlenirken, western blot yöntemi ile de apopitotik yolak üzerine etkileri değerlendirildi.MTS sonuçlarına göre MDA-MB-231 hücre hattında GL'nin 20 µM-100 µM konsantrasyon aralığında hücre canlılığını önemli oranda azalttığı, MCF-7 hücre hattında 20 µM ve 40 µM konsantrasyonlarda hücre canlılığını önemli oranda azalttığı, 80 µM ve 100 µM konsantrasyonlarda hücrelerin tamamen öldüğü bulundu. Klonojenik test sonuçlarına göre GL'nin MDA-MB-231 hücre hattında 12 µM, MCF-7 hücre hattında 12,5 µM konsantrasyonlarda hücre koloni oluşumunun %50'sini inhibe ettiği belirlendi. Her iki hücre hattı için de GL'nin kaspaz-8, kaspaz-9 ve PARP ekspresyon düzeyinde düşüşe, kesilmiş (aktif) kaspaz-8 ve kesilmiş (aktif) kaspaz-9 ekspresyon düzeyinde ise artışa neden olduğu ve böylece kanser hücrelerini hem intrensek hem de ekstrensik apopitotik yolakla ölüme götürdüğü belirlendi. Sonuç olarak GL'nin meme kanseri tedavisinde alternatif bir terapötik ajan olarak kullanılabileceği, ancak bu konuda ileri araştırmaların yapılması gerektiği kanaatine varıldı.Anahtar Kelimeler; MDA-MB-231, MCF-7, Ganoderma Lucidum, Hücre proliferasyonu, Apopitoz Breast cancer is the most common type of cancer, especially in women. This situation necessitated the creation of new approaches in treatment. In this study, we aimed to research the effect of Ganoderma lucidum (GL) on anti-proliferative and apoptotic pathways in MDA-MB-231 and MCF-7 breast cancer cell lines. In order to determine the antiproliferative effect of GL, GL was applied in the concentration range of 5 µM-100 µM on MDA-MB-231 and MCF-7 breast cancer cell lines. Cytotoxic activities were determined by cell viability test (MTS) at 24, 48 and 72 hours. The effect of GL on cell colony formation in breast cancer cells was determined by clonogenic test, while the effects of GL on apoptotic pathway were investigated by Western blot method. According to MTS results, it was found that GL significantly reduced cell viability in the concentration range of 20 µM-100 µM in the MDA-MB-231 cell line. GL significantly reduced cell viability in the concentrations of 20 µM ve 40 µM and completely dead concentrations of 80 µM and 100 µM in the MCF-7 cell line. According to the clonogenic test results, it was determined that GL inhibited 50% of cell colony formation at 12 µM concentrations in MDA-MB-231 cell line and 12.5 µM concentrations in MCF-7 cell line. For both cell lines, GL caused a decrease in caspase-8, caspase-9 and PARP expression levels, and an increase in cleaved (active) caspase-8 and cleaved (active) caspase-9 expression levels and thus it was leading to death by both of intrinsic and extrinsic apoptotic pathways. In conclusion, we consider that GL may be used as an alternative therapeutic agent in the treatment of breast cancer however, further research is required. Key words; MDA-MB-231, MCF-7, Ganoderma Lucidum, Cell proliferation, Apoptosis. 114

Kanser tedavisinde kısa engelleyici siRNA'ların hedefe spesifik taşınımı günümüzün önde gelen araştırma konularından birisidir. Sunulan tez çalışması kapsamında siRNA'ların hyalüronik asit (HA) reseptörü aracılığı ile etkili bir şekilde taşınımı, biyobozunur HA ve düşük molekül ağırlıklı polietilenimin (PEI) temelli taşıma sistemleri ile gerçekleştirilmiştir. Yine bu tez çalışması kapsamında literatürde ilk defa, fototermal yanıt verebilme yeteneğindeki, inorganik temelli nanotaşıyıcılardan olan altın nanoparçacıkların ve bunların PEI ve HA ile yapmış olduğu konjugatların, bunlara ilaveten yapıya kemoterapötik ajan olarak kullanılan Doksorubisinin de ilave edilmesi ile oluşturulan nihai parçacıkların (AuPEI-HA-DOX) birçok kanser türünde aşırı eksprese olduğu kanıtlanmış CXCR4 reseptörlerine özgü siRNA'lar ile kompleks oluşturması ile, sonuçta bu tezin en önemli özelliklerinden biri olan gen susturma, fototermal terapi ve kemoterapinin kombinasyonu sağlanmıştır. Kanserin etkin bir şekilde hedeflenmesi ve kombine terapisi amacıyla tez çalışmasında ilk olarak PEI ve HA temelli siRNA taşıyıcı sistemleri sentezlenmiş ve karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Sentezlenen parçacıkların boyutları, PEI-HA, PEI-SS-HA, AuNP, AuPEI NP, AuPEI-HA ve AuPEI-HA-DOX için sırasıyla, 330 nm, 203 nm, 91 nm, 25 nm, 366 nm ve 692 nm olarak tespit edilmiştir. Konjugatların oluşumu ise 1H-NMR, FT-IR ve elementel analiz yöntemleri ile doğrulanmıştır. Sentezlenen konjugatların siRNA ile elektrostatik etkileşimi ise konjugat yüzey yükü değişimi ve jelde gecikme analizi ile belirlenmiştir. Daha sonra, konjugatların hedef hücrelerin (L929 fare fibroblast hücre hattı, MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattı ve CAPAN-1 pankreas kanseri hücre hattı) canlılığına etkileri WST-1 hücre canlılık testi ile belirlenmiş; tüm parçalar için (AuPEI NP hariç), 100 µg/mL konsantrasyonunda, hücre canlılığı %50'nin üzerinde bulunmuştur. Bu konjugatların (özellikle Au içeren) siRNA ile oluşturdukları komplekslerin ardından uygulanan radyasyonun, özellikle MDA-MB-231 hücre hattı üzerindeki sitotoksik etkiyi arttırdığı sonucuna ulaşılmıştır. Konjugatların apoptotik-nekrotik etkilerine ise ikili boyama yöntemi ile bakılmış, her üç hücre hattında genel olarak apoptotik etki düşük bulunmuştur. Nekrotik etki ise, AuPEI-HA-DOX konjugatı uygulaması sonrasında (sırasıyla, %50 ve %25), hem MDA-MB-231 hem de CAPAN-1 hücre hattında en yüksek seviyede görülmüştür. Konjugat/siRNA komplekslerinin hücre proliferasyonu üzerindeki etkileri RTCA hücre proliferasyon analizi ile araştırılmış, L929 hücre hattında antiproliferatif etki görülmezken, MDA-MB-231 ve CAPAN-1 hücre hatlarında en yüksek antiproliferatif etki PEI-HA/siRNA, PEI-SS-HA/siRNA, AuPEI NP/siRNA ve AuPEI-HA-DOX/siRNA komplekslerinin uygulaması sonrasında görülmüştür. Hazırlanan komplekslerin kanser hücre hatlarında hedef gen ifadelenmesini baskılama etkileri Real Time- PCR yöntemi ile araştırılmış, MDA-MB-231 hücre hattında tüm konjugat veya komplekslerin, CAPAN-1 hücre hattında ise, AuPEI NP/siRNA kompleksinin hedef CXCR4 geni ifadelenmesini baskılayabildiği saptanmıştır. Elde edilen tüm bu veriler, sentezlenen PEI-HA ve AuPEI-HA-DOX konjugatlarının özellikle meme kanseri tedavisinde etkili siRNA taşıyıcıları olarak kullanılabileceklerini göstermektedir. Target-specific delivery of small interfering siRNAs in cancer treatment is one of today's leading research topics. Within the scope of the thesis, effective transport of siRNAs via hyaluronic acid (HA) receptor was carried out with biodegradable HA and low molecular weight polyethyleneimine (PEI) based transport systems. Within the thesis study, gold nanoparticles which are inorganic based nanoparticles capable of giving photothermal response and their conjugates with PEI and HA are added to the structure, which is first in the literature. As a consequence, a combination of gene silencing, photothermal therapy and chemotherapy, which is one of the most important features of this thesis, has been provided. In the first part of the thesis study, PEI and HA-based siRNA delivery systems were synthesized and characterized. The dimensions of the PEI-HA, PEI-SS-HA, AuNP, AuPEI NP, AuPEI-HA and AuPEI-HA-DOX particles were measured as, 330 nm, 203 nm, 91 nm, 25 nm, 366 nm and 692 nm, respectively. The formation of conjugates was confirmed by 1H-NMR, FT-IR and elemental analysis methods. The electrostatic interaction of the synthesized conjugates with siRNA was determined by the gel retardation analysis and the change in zeta potentials. In the second part of the study, effects of the conjugates on the viability of target cells (L929 mouse fibroblast cell line, MDA-MB-231 breast cancer cell line and CAPAN-1 pancreatic cancer cell line) were determined by the WST-1 cell viability test; in general (except AuPEI NP) the cell viability was above 50% when the synthesized particles (100 µg/mL) were applied. In the application of radiation following the conjugate/siRNA complex (especially those containing Au), application increased the cytotoxic effect on the MDA-MB-231 cell line. Apoptotic-necrotic effects of conjugates were investigated by double staining method, and overall apoptotic effect was low in all three cell lines. However, the necrotic effect was highest in both MDA-MB-231 and CAPAN-1 cell lines, after administration of the AuPEI-HA-DOX conjugates (50% and 25%, respectively). The effects of the complexes of the synthesized conjugates and siRNA on the cell proliferation were also investigated by RTCA real-time cell proliferation analysis. Antiproliferative effect was not observed in L929 cell line in accordance with cytotoxicity results, whereas the highest antiproliferative effects in MDA-MB-231 and CAPAN-1 cell lines were observed after administration of PEI-HA/siRNA, PEI-SS-HA/siRNA, AuPEI NP/siRNA and AuPEI-HA-DOX/siRNA complexes. The effects of suppression of target gene expression in cancer cell lines were investigated by Real Time-PCR method. All conjugates or complexes in MDA-MB-231 cell line were able to suppress target gene expression of AuPEI NP/siRNA complex in CAPAN-1 cell line. It was found that all conjugates or complexes in the MDA-MB-231 cell line, AuPEI NP/siRNA complex in the CAPAN-1 cell line could suppress the target CXCR4 gene expression. All these data show that the synthesized PEI-HA and AuPEI-HA-DOX conjugates can be used as siRNA carriers that are particularly effective, especially in the treatment of breast cancer. 154

Meme kanseri kompleks kanser türü olup, dünya üzerinde kadınlarda görülme sıklığına göre birinci, kansere bağlı ölümler arasında ikinci sıradadır. Meme kanseri klinik özelliklerine, eksprese edilen tümör markerlarına ve histolojik tipine göre alt tiplere ayrılan heterojen bir hastalıktır. Duktal ve lobular karsinomalar en yaygın histolojik tiplerini oluşturmaktadır. Her alt tipin farklı prognozu ve tedaviye yanıtı vardır. Meme kanserinin oluşumunda birçok risk faktörü tanımlanmıştır. Mutasyonlar meme kanseri oluşumunda önemli rol oynamaktadır. PI3K/Akt/mTOR yolağının mutasyonlara bağlı anormal aktivasyonu meme kanserinde sık gözlenmektedir. Bu yolağın inhibisyonunun meme kanseri gelişimini önlemeye yardımcı olduğu yapılan çalışmalarda bildirilmiştir. Meme kanserlerinin tedavisinde cerrahi müdahale, kemoterapi ve radyoterapi uygulamaları sonucu başarı elde edilmekle birlikte genellikle tedavilere karşı direnç gelişimi ya da nüks görülmektedir. Kök hücreler terapi direnci ve nüksten sorumlu olan, kanser kitlesini yeniden oluşturma potansiyeline sahip hücrelerdir. Bu nedenle güncel araştırmalar tümör kitlesini oluşturan hücrelerin yanısıra kanser kök hücrelerinin de elimine edilmesini sağlayacak mekanizmaların aydınlatılmasına odaklanmıştır. Bu doğrultuda tez kapsamında, PI3K/Akt/mTOR inhibitörü PKI-402'nin farklı meme kanseri alt tiplerindeki ve meme kanseri kök hücrelerindeki sitotoksik, apoptotik etkinliği normal hücrelerle kıyaslanarak araştırılmıştır. Bu amaçla Sitoksisite, Apoptoz, γ-H2AX deneyi, Klonojenik sağkalım deneyi ve Fosforilasyon deneyi gerçekleştirilmiştir. Çalışmalar sonucunda, 48.saatte MCF-7 hücre hattında 109 nM, MDA-MB-231 hücre hattında 2.44 µM, BCSC hücre hattı için 5.941 µM ve MCF-10A hücre hattı için 142 nM IC50 dozuyla bu hücreler için PKI-402 sitotoksik bulunmuştur. İleri deneylere bu dozlarla devam edilmiş ve bu IC50 dozunun radyasyonla kombine edildiğinde MCF-7, BCSC ve MCF-10A hücre hatlarında apoptozu indüklediği, MDA-MB-231 hücre hattında apoptotik etki göstermediği bulunmuştur. γ-H2AX deneyi sonucunda ise MCF-7, MDA-MB -231 hücre hatlarında kontrole kıyasta ve gruplar arasında (İyonize radyasyon (IR) ve PKI-402+ İyonize radyasyon (IR)) anlamlı çift kırık yüzdesi gözlemlenmiştir. MCF-10A ve BCSC hücre hatlarındaki çift kırık yüzdesi ise anlamlı olarak değerlendirilmemiştir. Uygulamalardan sonraki sağ kalım kapasitesi klonojenik analizle değerlendirilmiştir. MCF-7 ve BCSC hücre hatlarında sağkalım yüzdesinde IR ve PKI-402+IR grupları arasında ve kontrole kıyasta anlamlı bir değişim gözlemlenmiştir. Fosforilasyon deneyi sonucunda, MCF-7, MDA-MB-231 ve BCSC hücre hatlarında PI3K/Akt/mTOR yolağının baskılanmasının göstergesi olan önemli 16 proteinden bazılarının baskılandığı gözlemlenirken, normal meme epiteli hücre hattı MCF-10A'da sadece 4E-BP1 (Thr37/46) fosforillenmesinin baskılandığı gözlemlenmiştir. Tüm bu sonuçlara dayanarak, PKI-402'nin Radyasyona duyarlılığı arttırdığını düşünmekle birlikte, ileri deneylerde bunun teyit edilmesi gerektiğini düşünmekteyiz., Breast cancer is a complex type of cancer and is ranked first among women worldwide and second among cancer-related deaths worldwide. Breast cancer is a heterogeneous disease that is divided into subtypes according to clinical features, exposed tumor markers and histological type. Ductal and lobular carcinomas are the most common histological types. Each subtype has a different prognosis and treatment response. Many risk factors have been identified in the formation of breast cancer. Mutations play an important role in the development of breast cancer. The abnormal activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway due to mutations is frequently observed in breast cancer. Studies have shown that inhibition of this pathway helps prevent breast cancer development. Surgical intervention, chemotherapy and radiotherapy in breast cancer treatments are usually successful, but resistance to treatment or recurrence is usually seen. Stem cells are potentially responsible for the resistance and reccurence, cells that have potency regenerating cancer cell bulk. For this reason, current research has focused on the elucidation of the mechanisms by which cancer cells, as well as cancer stem cells, are eliminated. In this thesis, the cytotoxic, apoptotic activity of PI3K/Akt/mTOR inhibitor PKI-402 was investigated in different breast cancer subtypes and breast cancer stem cells in comparison with normal cells. For this purpose, cytoxicity, apoptosis, γ-H2AX assay, clonogenic survival assay and phosphorylation assay were performed. PKI-402 cytotoxicity was found for these cells at a dose of 109 nM in the MCF-7 cell line, 2.44 μM in the MDA-MB-231 cell line, 5.941 μM in the BCSC cell line and 142 nM in the MCF-10A cell line at 48 hours. Advanced experiments were continued with these doses and it was found that when this IC50 dose was combined with radiation, apoptosis was induced in the MCF-7, BCSC and MCF-10A cell lines and not in the MDA-MB-231 cell line. As a result of the γ-H2AX , MCF-7, MDA-MB-231 cell lines showed a significant percentage of γ-H2AX between controls and between groups (IR and PKI-402 + IR). The percentage of -H2AX in the MCF-10A and BCSC cell lines was not significantly assessed. The survival capacity after the treatments was assessed by clonogenic assay. A significant change in survival percentages difference between MCF-7 and BCSC cell lines was observed between IR and PKI-402 + IR groups and control. As a result of the phosphorylation assay, it was observed that some of the important 16 proteins repressing the PI3K/Akt/mTOR pathway inhibition in MCF-7, MDA-MB-231 and BCSC cell lines were observed to suppress the phosphorylation of only 4E-BP1(Thr37/46) in normal mammary epithelial cell line MCF-10A . Based on all these results, we think PKI-402 should be confirmed in further experiments, considering that it enhances radiation sensitivity. Key Words: Breast Cancer, PI3K/Akt/mTOR pathway, PKI-402, Radiosensitivity

Meme kanseri kadınlar arasında en sık görülen ve yüksek mortaliteye sahip bir kanser türüdür. Histopatolojik çeşitliliğinin yanı sıra karmaşık moleküler alt yapısı nedeniyle meme kanserinde tedavi hedefleri için moleküler çalışmalara ihtiyaç bulunmaktadır. RNF2, polycomb baskılayıcı kompleks içerisinde yer alan bağlandığı proteini ubikitinleyerek baskılayan bir proteindir. Embriyonik ve yetişkin evrede önemli rol oynayan RNF2' nin, bir çok metastatik kanser türünde ifadesinin artması ile beraber tümör baskılayıcı genleri susturması RNF2' ye onkojenik bir rol kazanmıştır. Bu çalışmada meme kanseri hücre hatlarında RNF2 gen ifade düzeyindeki değişimler ve bu genin miR-17-5p, miR-20a-5p ve miR-106b-5p tarafından baskılanıp baskılanmadığı analiz edilmiştir. Ayrıca bu miRNA' ların transfekte edilmesi ile metastaz ve invazyon üzerine etkisi incelenmiştir. Bunun için MCF-7, MDA-MB-231, SK-BR-3 ve ZR-75-1 meme kanseri hücre hatlarında miRNA transfeksiyonu öncesi ve sonrasında RNF2 gen ifade düzeyleri RT-PCR; protein ifade düzeyleri ise western blot ile analiz edilmiştir. Metastaz ve invazyon üzerine etkisi ise yara iyileşme ve boyden chamber yöntemleri kullanılarak saptanmıştır. RNF2' nin, MDA-MB-231 ve SK-BR-3 hücre hatlarında sırasıyla 4,1 ve 7,1 kat ifadesinin arttığı tespit edildi (sırasıyla p=0,048 ve 0,045). miR-17-5p ve miR-20a-5p miRNA transfeksiyonu sonrasında MDA-MB-231 hücre hattında RNF2 gen ifade düzeyinde anlamlı bir azalış saptandı (sırasıyla 3,5 ve 7,3 kat) (sırasıyla p= 0,045 ve 0,039). Protein düzeyinde ise MDA-MB-231 hücre hattında her üç miRNA' nın da RNF2 proteinini azalttığı saptandı. Ayrıca miR-17-5p ve miR-20a-5p metastaz ve invazyonu baskılarken miR-106b-5p' nin baskılamadığı saptandı. Sonuç olarak, metastatik yeteneği fazla olan meme kanseri hücrelerinde RNF2' nin ifadesi artmıştır. miR-17-5p ve miR-20a-5p, RNF2 aracılığı ile metastaz ve invazyonu baskılamaktadır. RNF2 meme kanseri için prognostik bir belirteç olmaya aday bir gen olarak değerlendirilebilir.Anahtar Kelimeler: Meme kanseri, metastaz, miRNA, polycomb, RNF2. Breast cancer is the most common type of cancer among women and has a high mortality rate. In addition to its histopathological diversity, new molecular and molecular investigations are needed in the treatment of breast cancer due to its complex molecular background. RNF2 is a protein that is repressed by ubiquitin binding of the protein bound in the polycomb repressor complex. RNF2, which plays an important role in a number of biological processes in embryonic development and adult stage, has acquired an oncogenic role due to overexpression in several types of metastatic cancers, as well as silencing tumor suppressor genes. In this study, changes in the level of RNF2 gene expression in breast cancer cell lines were analyzed and whether this gene was suppressed by miR-17-5p, miR-20a-5p and miR-106b-5p. Furthermore, the effect of transfection of these miRNAs on metastasis and invasion has been investigated. For this reason, RNF2 gene expression levels before and after miRNA transfection in MCF-7, MDA-MB-231, SK-BR-3 and ZR-75-1 breast cancer cell lines were analyzed by qRT-PCR and western blot analysis of protein expression levels. The effect on metastasis and invasion was observed using wound healing and dyed chamber methods. RNF2 was overexpressed 4.1 and 7.1fold in the MDA-MB-231 and SK-BR-3 cell lines, respectively (p=0,048 ve 0,045 respectively). A significant decrease in gene expression after miRNA transfection was observed in miR-17-5p and miR-20a-5p (3.5 and 7.3 fold, respectively) (p= 0,045 ve 0,039 respectively) at MDA-MB-231 cell line. At the protein level, it was observed that all three miRNAs decreased RNF2 protein at MDA-MB-231 cell line. It was also observed that miR-17-5p and miR-20a-5p suppressed metastasis and invasion and miR-106b-5p could not suppress it. As a result, RNF2 is overexpressed in breast cancer cells with more metastatic ability. miR-17-5p and miR-20a-5p suppress RNF2 targeting and suppress metastasis and invasion in this direction. RNF2 may be considered as a candidate gene to be a prognostic marker for breast cancer.Key Words: Breast cancer, metastasis, miRNA, polycomb, RNF2. 88

Genel Bilgi: Mantarların tıbbi amaçlı olarak kullanımlarının geçmişi Asya bölgesi için oldukça eskiye dayanmaktadır ve son zamanlarda Batı’da kullanımları Kabul görmektedir. Makro mantarlardan izole edilen bileşenlerin veya ekstrelerin antimikrobiyal, anti-viral, antitümör, anti-alerjik, immünomodülatör, anti- enflamatuar, anti-aterojenik, hipoglisemik ve hepatoprotektif etki gibi çeşitli biyolojik aktivitelerinin olduğu bildirilmiştir. Amaç: Bu çalışmada, Clitocybe geotropa (Bull.) Quél.’den elde edilen etanol ve metanol ekstrelerinin meme kanseri hücreleri üzerine etkinliği araştırılmıştır. Yöntem: Bu çalışmada mantar ekstrelerinin verimi, belli ağırlıktaki kuru materyalden elde edilen etanol ekstresinin (% 28,2) ve metanol ekstresinin (% 30,6) ağırlıklarına göre g/100g olarak ifade edilerek belirlenmiştir. Ekstrelerin sitotoksik etkileri Trypan Blue analiziyle belirlenmiştir. Bulgular: Etanol ve metanol ekstrelerinin total fenolik içeriği sırasıyla 217,15±0,02 ve 138,39±0,01; total flavanoit içeriği 152,28±0,03 ve 111,95±0,02 mgCE/g olarak ölçülmüştür. C. geotropa için 50–400 µg/mL konsantrasyon değerlerindeki metanol ekstrelerinin MDA-MB-231 hücre hattı üzerinde sitotoksik etkisi gözlenmezken, etanol ekstresi % 51,5; 400 μg/ml, % 17,9; 200 μg/ml, % 6,6; 100 μg/ml uygulanan konsantrasyonlarda anlamlı düzeyde sitotoksik etki göstermiştir. Sonuç: Clitocybe geotropa MDA-MB-231 hücre hattı üzerinde etkili antikanser ajan olarak kullanılma potansiyeline sahip bir mantar türüdür., Background: The medical use of mushrooms has a very long tradition in Asia and is nowadays becoming more accepted in the West. It is reported that the extracts or isolated constituents from macrofungi have biological activities such as antimicrobial, anti-viral, anti-tumour, anti-allergic, immunomodulating, anti-inflammatory, antiatherogenic, hypoglycaemic and hepatoprotective activities. Objective: In this study, cytotoxic activity of ethanol extracts (EE) and methanol (ME) of Clitocybe geotropa on MDA-MB-231 cell line were investigated. Method: The yield of mushroom extracts was calculated for EE and ME 30.6% and 28.2%, respectively. Cytotoxic effects of the extracts were determined by Trypan Blue assay. Results: The total phenolic contents of EE and ME were 217.15±0.02, 138.39±0.01; total flavonoid contents 152.28±0.03, 111.95±0.02 mgCE/g, respectively. The ME of mushroom’s 50–400 µg/mL concentrations did not show any cytotoxic effect in MDA-MB-231 cell line while the EE of C. geotropa % 51,5; 400 μg/ml, % 17,9; 200 μg/ml, % 6,6; 100 μg/ml had cytotoxicity. Conclusion: The mushroom, Clitocybe geotropa, could be used as a potential anticancer agent for MDA-MB- 231 cell line.

Kadınlarda kansere bağlı ölümlerin en önemli nedenlerinden olan meme kanserinin tedavisinde doğal bileşiklerden elde edilen çeşitli kemoterapötik ajanlar kullanılmaktadır ve yeni ilaç geliştirme çalışmalarına devam edilmektedir. Glycyrrhiza glabra (meyan kökü) bitkisinin sekonder metaboliti olan Glisiretinik asitin potansiyel bir antikanser ajan olduğu daha önce yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Bu tez çalışmasında, Rusya Bilim Akademisi, Kimyasal Biyoloji ve Temel Bilimler Enstitüsü'nde sentezlenen, Glisiretinik asitin yarı sentetik bir türevi olan Soloksolon metil bileşiğinin sitotoksik ve apoptotik etkileri insan meme kanseri hücre soylarında (MCF-7, MDA-MB-231 ve T-47D) araştırılmıştır. Soloksolon metil'in hücre canlılığı üzerine olan etkisi (24 ve 48 saat) MTT ve ATP canlılık testleriyle belirlenmiştir. Hücrelerde ölüm modunu (apoptoz ve nekroz) belirlemek amacıyla floresan boyama (Hoechst 33342 ve propidyum iyodür) ve kaspazla kırılmış sitokeratin 18 (M30) metodları kullanılmıştır. Buna ilaveten apoptozis, gen (PCR yöntemi) ve protein (Western Blot) düzeyinde araştırılmıştır. Soloksolon metil'in her üç hücrede doza ve zamana bağlı olarak hücre canlılığını azalttığı, 48 saat sonrasında IC50 değerleri MCF-7, MDA-MB-231 ve T-47D hücrelerinde sırayla 4,22 µM, 5,97 µM ve 6,18 µM olarak belirlenmiştir. Hücrelerde Soloksolon metil'in 10 µM dozunun, 24 ve 48 saat sonrasında erken apoptoza (piknotik nükeus ve propidyum iyodür negatifliği); 72 saat sonrasında geç apoptotik/sekonder nekroza (piknotik nükleus ve propidyum iyodür pozitifliği) neden olduğu gözlenmiştir. MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerinde Soloksolon metil etkisiyle apoptotik gen ekspresyonlarının arttığı tespit edilmiştir. Ayrıca MDA-MB-231 hücre soyunda apoptotik proteinlerin yanı sıra endoplazmik retikulum stresiyle ilişkili proteinlerin (IRE1-α, Bip, CHOP) artışı da belirlenmiştir.Sonuç olarak, Soloksolon metil bileşiğinin MCF-7 ve MDA-MB-231 hücre soyları üzerine olan etkisinin sitotoksik etkisini apoptozis üzerinden gerçekleştirdiği, özellikle MDA-MB-231 hücre soyunda endoplazmik retikulum aracılı apoptozis yolağından ilerlediği belirlenmiştir. Alınan sonuçlar Soloksolon metil'in meme kanseri tedavisinde etkili bir ajan olabileceğini ileri analizlerin (in vitro ve in vivo) yapılması gerektiği sonucuna varılmıştır. Being one of the leading causes of cancer death among women, various chemotherapeutic agents isolated from natural compounds are used in breast cancer treatment and studies to develop new drugs still continues. There are several studies on glycyrrhetinic acid, a secondary metabolite which is found in Glycyrrhiza glabra (Liquorice), as a potential anticancer agent. In this thesis, the cytotoxic and apoptotic effects of soloksolon methyl compound, a semi-synthetic derivative of glycyrrhtenic acid synthesized by the Russian Academy of Sciences, Chemical Biology and Basic Sciences Institute in Siberia were investigated on breast cancer cell lines (MCF-7, MDA-MBA-231 and T-47D). The antigrowth effects (24 and 48 hours) of Soloksolon methyl were determined using MTT and ATP assays. To identify the mode of cell death (apoptosis/necrosis), fluorescent staining (Hoechst 33342 and Propidium iodide) and caspase-cleaved cytokeratin 18 (M30) test were used. In addition, apoptotic genes and protein levels were investigated by PCR method and Western Blotting. Soloksolon methyl decreased cell viability in all three cell lines in a dose and time-dependent manner. The IC50 values in MCF-7, MDA-MBA-231, and T-47D cells after 48 hours of treatment are 4,22 µM, 5,97 µM and 6,18 µM respectively. Soloksolon methyl induces early apoptosis (pyknotic nuclei and negative Propidium iodide) at 10 µM after 24 and 48 hours, and late apoptosis or secondary necrosis (pyknotic nuclei and positive Propidium iodide) after 72 hours in all cell lines. An increase of apoptotic gene expressions was determined in MCF-7 and MDA-MB-231 cells treated with Soloksolon methyl. Moreover, an increase of apoptotic proteins related to endoplasmic reticulum (IRE1-α, Bip, CHOP) stress was also determined in MDA-MB-231 cell line. In conclusion, Soloksolon methyl is found to be cytotoxic on MCF-7 and MDA-MBA-231 cells by inducing apoptosis, especially in MDA-MB-231 cell line where ER stress-induced apoptosis is triggered. Advance analyses (in vitro and in vivo) should be performed to elucidate the potential of Soloksolon methyl as anticancer agent in breast cancer treatment. 127

Kansere karşı açılan savaşta terapötik amaçla potansiyel gücü ve popülaritesi artan yeni tedavi girişimlerin geliştirilmesi ve etkinliğinin incelenmesi hem dünya hem de ülkemiz için büyük önem arz etmektedir. İyon kanalları kanser hücresinde proliferasyon, apoptozis, migrasyon, anjiyogenez ve metastaz ile ilişkilendirilmektedir. Özellikle Nav1.5 kanalının in vitro yüksek metastatik potansiyel ve in vivo olarak meme kanseri gelişimiyle ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Meme kanseri gelişiminde ve metastatik yolaklar ile ilişkili hücre içi olayları etkilemede Nav1.5 kanalının özellikle neonatal izoformundaki ekspresyon ve aktivite artışının önem taşıdığı belirtilmiştir. Ancak bu konuda kanalın meme kanserine olan etkilerine ilişkin detaylı bir mekanizma ve hücre içi protein değişimlerini değerlendiren ayrıntılı bir çalışma bulunmamaktadır.Tez çalışmamızda meme kanseri gelişimi ve metastazı üzerinde Nav1.5 kanalının Adult ve Neonatal alt tiplerinin olası rolleri ve etkileri değerlendirildi. Bu amaçla kanala spesifik siRNA ile gen susturma yöntemi kullanıldı. İn vitro deneyler olarak hücre proliferasyonu testi, koloni oluşturma kapasitesi, invazyon ve migrasyon yeteneği ile ilişkili testler, flow sitometri ile apoptoz ve hücre siklusu analizi, kemoterapötik dirençliliğine olan etkiler, tüm bunlar ile ilişkili protein yolakların değerlendirilmesi için Western blot analizi ve kanal tiplerinin mRNA ekspresyonları için Real-Time ve RT-PCR deneyleri gerçekleştirildi. In vivo ksenograft ortotopik meme kanseri modeli ve ksenograft akciğer metastaz modeli gerçekleştirilerek nanolipozomal taşıyıcılar içindeki Nav1.5 siRNA tedavilerinin hem meme kanseri tümör büyümesi hem de metastaz kapasitesi üzerine olan etkileri değerlendirildi.Çalışmamızda MDA-MB-231 hücre hattında MCF7'a göre Adult ve Neonatal Nav1.5 mRNA ekspresyonunun daha yüksek düzeyde olduğu ayrıca bu iki tipe spesifik siRNA'ların kanalı etkin bir şekilde downregüle ettiği PCR ve Western blot yöntemleri ile tespit edildi. MDA-MB-231, MDA-MB-468 ve MCF7 meme kanseri hücre hatlarında Spesifik Nav1.5 siRNA tedavilerinin meme kanseri hücrelerinin proliferasyon düzeyleri ve koloni oluşturabilme yeteneklerinde önemli düzeyde azalma gerçekleştirdiği belirlendi. Ancak Nav1.5 siRNA'larının normal meme epiteli hücre hattı MCF10A üzerinde hücre proliferasyonunu azaltıcı ve sitotoksik etkilere sahip olmadıkları tespit edildi. MDA-MB-231 hücre hattında spesifik Nav1.5 siRNA tedavilerinin standart bir kemoterapötik olan paklitaksel ile kombinasyonlarının ilacın etkinliğini artırdığı ve ilaç dirençliliğini azalttığına ilişkin bulgular tespit edildi. Bu sonuçların yanısıra Nav1.5 siRNA'larının metastatik meme kanseri hücre hatları MDA-MB-231 ve MDA-MB-468'de meme kanseri hücrelerinin invazyon, migrasyon ve yara iyileşmesi migrasyonu kapasitelerini önemli ölçüde azalttığı gözlendi. MDA-MB-231 hücre hattında bu siRNA'ların hücrelerde apoptoz düzeylerinde artış şekillendirdiği ve hücre siklusunda G1 arrestine neden olduğu flow sitometri yöntemi ile belirlendi. İn vitro MDA-MB-231 ve MDA-MB-468 hücre hatlarında Nav1.5 siRNA'larının tüm bu etkilerine ilişkin hücre içi mekanizmalarda görev alan proteinlerin ekspresyon düzeylerinde önemli azalmalar gözlendi. In vivo olarak da MDA-MB-231 ve MDA-MB-468 Ksenograft ortotopik meme kanseri modellerinde spesifik Nav1.5 siRNA tedavilerini alan gruplarda tümör büyüklüğünde ve tümör ağırlığında önemli düzeyde azalma görüldü. Bunun yanısıra MDA-MB-231 Ksenograft akciğer metastaz modelinde de aynı tedavi gruplarında akciğerlerdeki tümör metastazı büyüklüğünde ve birim alan başına düşen foton sayısında önemli düzeyde azalma tespit edildi.Tüm bu sonuçlar ile Nav1.5 kanalının meme kanseri metastazında, gelişimi ve progresyonunda önemli bir role sahip olduğu ortaya konuldu. Çalışmamız birçok konuda ortaya koyduğu veriler ile literatürde ilk olması bakımından önem arz etmektedir. Böylece kansere karşı savaşta bu yeni tedavi yaklaşımının etkinliğinin ve ayrıntılarının ortaya çıkmasıyla meme kanserinin organizmadaki yayılımını ve iletişimini keserek onu kronik bir hastalık haline dönüştürebilmek, rutin tedavilerin etkinliğini artırabilmek, yapılacak yeni çalışmalar ile meme kanserini tamamen yenebilmek mümkün olabilecektir.Anahtar Kelimeler: Nav1.5, Nanolipozom, Meme kanseri, Metastaz/İnvazyon, siRNA. Development and examination of the effectiveness of new therapeutic interventions which the potential strength and popularity are growing for therapeutic purposes in the fight against cancer have great importance for both our country and the world. Ion channels are associated with proliferation, apoptosis, migration, angiogenesis and metastasis in cancer cell. It has been found that especially Nav1.5 is associated with high metastatic potential in vitro and the development of breast cancer in vivo. The importance of an increase in Nav1.5 channel especially the neonatal isoform expression and activity for influencing the intracellular events that are associated with breast cancer development and metastatic pathways was mentioned. Nevertheless, there is not a detailed study that evaluates intracellular protein changes and elaborative mechanism about the effects of the channel protein on breast cancer.Possible roles and effects of neonatal and adult subtypes of the Nav1.5 channel on breast cancer development and metastasis were evaluated in our study. In this study, gene silencing method by channel-specific siRNA was used. As in vitro experiments, cell proliferation test, colony formation capacity, tests associated with invasion and migration ability, apoptosis and cell cycle analysis by flow cytometry, the effects on chemotherapeutic resistance, western blot analysis for the evaluation of protein pathways that are associated with all these effects and Real-Time/RT-PCR experiments for mRNA expression of channel types were performed. Effects of Nav1.5 siRNA treatments in nanolipozomal carriers on both tumor growth and metastasis capacity of breast cancer were evaluated by performing xenograft orthotopic breast cancer model and xenograft lung metastasis model in vivo.In our study, expression of Adult and Neonatal Nav1.5 mRNAs are higher levels in MDA-MB-231 cell line compared to MCF7 and siRNAs that are specific to these two types downregulates the channel effectively were detected by PCR and Western blot methods. Specific Nav1.5 siRNA treatments realize a significant reduction in proliferation levels and colony formation abilities of breast cancer cells in MDA-MB-231, MDA-MB-468 ve MCF7 breast cancer cell lines were determined. However Nav1.5 siRNAs have not effects that are reducing cell proliferation and cytotoxic on normal breast epithelium cell line MCF10A were identified. Findings in relation with combinations of specific Nav1.5 siRNA treatments with a standard chemotherapeutic drug Paclitaxel increase the efficacy of the drug and reduce the drug resistance in MDA-MB-231 cell line were found. In addition to these results, it was observed that specific Nav1.5 siRNAs reduce significantly invasion, migration and wound-healing capacities of breast cancer cells in metastatic breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MDA-MB-468. In MDA-MB-231 cell line, these siRNAs increase the level of apoptosis and cause G1 arrest in cell cycle on cells were determined by flow cytometry method. İn vitro in MDA-MB-231 and MDA-MB-468 cell lines, significant reductions in the level of expression of the proteins that are involved in intracellular mechanisms regarding to all these effects of Nav1.5 siRNAs were observed. As in vivo experiments in MDA-MB-231 and MDA-MB-468 xenograft orthotopic breast cancer models, significant decrease in tumor size and tumor weight was seen in specific Nav1.5 treatment groups. On the other hand also in MDA-MB-231 xenograft lung metastasis model, significant decrease in size of tumor metastasis and photon counts per area in the lungs was found in same treatment groups. It was revealed with all these results that Nav1.5 channel has an important role in the metastasis, development and progression of breast cancer. Our study is of great importance in terms of being the first in the literature with the data that has revealed on many issues. Thus, with the appearance of effectiveness and details of this new treatment approach in the battle against cancer, it will be possible to transform it into a chronic disease by cutting off propagation and communication of breast cancer in organism, to increase the effectiveness of routine treatments and to completely defeat breast cancer by new studies to be made.Key Words: Breast cancer, Nanoliposome, Nav1.5, Metastasis/Invasion, siRNA. 214

Üçlü negatif meme kanseri diğer alt tiplere göre daha agresif seyirli olan ve tedaviye yanıt oranları daha düşük olan bir hastalıktır. Biz çalışmamızda üçlü negatif meme kanseri hücre hattında bevasizumab ve sorafenibin tek başlarına ve kombine kullanımlarında etkinliklerini değerlendirmeyi amaçladık. Bevasizumab ve sorafenibin tek başına ve kombine kullanımlarının sitotoksik etkilerini değerlendirmek amacıyla bevasizumab 50 µg/mL, 100 µg/mL ve 200 µg/mL, sorafenib 1 µM, 10 µM ve 100 µM konsantrasyonlarında üçlü negatif meme kanseri hücre hattı olan MDA-MB-231 ve östrojen reseptörü pozitif hücre hattı olan MCF-7 hücre hatlarında denendi. Sitotoksik etki microplate reader kullanılarak XTT testi ile ölçüldü ve grupların sitotoksik etkileri birbirleriyle karşılaştırıldı.Absorbans olarak elde edilen veriler ortalama ve standart hata (Mean±SEM) olarak ifade edildi. Ortalamalar arasındaki farkın önemliliği değerlendirilirken ANOVA testi, post-hoc test olarak da Tukey testi kullanıldı. Parametrik test varsayımlarının yerine getirilemediği durumlarda ise Kruskal-Wallis testi uygulandı. P değerinin 0.05?den küçük olduğu durumlar istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.Çalışmamızda bevasizumab östrojen reseptörü (ER) pozitif MCF-7 meme kanseri hücre hattında hiçbir konsantrasyonda etkin değildi, üçlü negatif meme kanseri MDA-MB-231 hücre hattında ise doz bağımlı artan sitotoksisite saptandı. Sorafenib hem MCF-7 meme kanseri hücre hattında hem de MDA-MB-231 hücre hattında etkindi. Bevasizumab ve sorafenib kombinasyonu hem MCF-7 hücre hattında hem de MDA-MB-231 hücre hattında tek başlarına gösterdikleri etkiye göre daha güçlü sitotoksik etki ortaya çıkardı.Bu bilgiler ışığında sorafenibin hem tek başına hem de bevasizumab ile beraber kullanımının özellikle meme kanserinde özellikle üçlü negatif meme kanseri alt grubunda etkin bir tedavi seçeneği olabileceği görülmüştür. Bu etkinin kanıtlanması ve mekanizmasının ortaya konması için hem preklinik hem de klinik yeni çalışmalara ihtiyaç vardır. Triple negative breast cancer is clinically aggressive and response to therapy is lesser then the other subtypes. The aim of this study is to compare the effectiveness of bevacizumab and sorafenib, alone or combined together, in the treatment of triple negative breast cancer.We evaluate the cytotoxic effects of bevacizumab ,concentrating at 50 µg / mL, 100 µg / mL and 200 µg / mL , sorafenib ,concentrating at 1 µM, 10 µM and 100 µM , alone and in combination with each of two, in triple negative breast cancer cell line MDA-MB-231 and estrogen receptor-positive cell line MCF-7. Cytotoxic effect was measured by XTT test using a microplate reader and cytotoxic effects of each groups compared.Absorbance data obtained from the mean and standard error (mean±SEM) specified. ANOVA test used for assessing the significance of the difference between the averages. Tukey's test used as post-hoc test. Kruskal-Wallis test was performed in condition that failing to fulfill the assumptions of parametric tests. P value less than 0.05 was considered statistically significant.In our study, bevacizumab isn?t effective in any concentration on estrogen receptor positive breast cancer cell line MCF-7 but it is detected that dose-dependently increased cytotoxicity seen on triple negative breast cancer cell line MDA-MB-231. Sorafenib is effective on both MCF-7 breast cancer cell line and MDA-MB-231 cell line. Combination of bevacizumab and sorafenib lead to a much stronger cytotoxic effect both on the MCF-7 cell line and MDA-MB-231 cell line than they used alone. In the light of these findings, the use of sorafenib alone and in combination with bevasisumab can be an effective treatment option for breast cancer especially in the subset of triple negative. In order to prove this effect and to understand this mechanism, both preclinical and clinical studies are needed. 79

Meme kanseri kadınlarda en çok görülen kanser olmakla birlikte birçok ülkede kanserden ölümlerin başlıca nedenidir. Bu nedenle erken tanı ve etkin tedavisi çok önemli hale gelmiştir.Epidemiyolojik çalışmalar ve hayvan deneyleri bazı besinsel bileşiklerin çeşitli kanserlerin insidans hızlarında rol oynadığını ortaya çıkarmıştır. Zeytin yaprağı ekstresinin ve fenolik bileşenlerinden biri olan oleuropeinin anti-kanser etkisi birçok çalışmada gösterilmiştir. Mevcut literatürlerde zeytin yaprağı ekstresinin diğer ilaçlarla kombinasyon çalışmasına rastlanmamıştır.Bu çalışmada MDA-MB-231 ve MCF-7 insan meme kanseri hücre soylarında, zeytin yaprağı ekstresini tedavide kullanılan ajanların değişik dozları ile kombine ederek, düşük tedavi dozlarının etkinliğinin arttırılıp arttırılamadığı araştırıldı. Böylece meme kanserinde yeni tedavi yaklaşımlarının araştırılması planlandı. Bu nedenle meme kanseri tedavisinde kullanılan epirubisin, doksorubisin ve dosetaksol ilaçları seçildi. Zeytin yaprağı ekstresi hem tek başına hem de bu ilaçlarla kombine edilerek kullanıldı.Çalışmamızda zeytin yaprağı ekstresinin, MDA-MB-231 hücre soyunda ilaçların sitotoksik etkilerini arttırdığı saptandı. MCF-7 hücre soyunda ise, MDA-MB-231 hücrelerindeki etkinin tersine, epirubisin ve doksorubisin ile kombinasyonlarında bu ilaçların sitotoksik etkisini azalttığı bulundu. Western blotting ile bakılan kırılmış PARP proteininin MCF-7 hücre soyunda dosetaksol ve epirubisinin tek başına ve zeytin yaprağı ekstresi ile kombinasyonlarında kırıldığı dolayısıyla ölümün apoptozisten kaynaklandığı, MDA-MB-231 hücre soyunda ise PARP kırılması olmadığı bulundu. RT-PCR ile gen ekspresyon düzeylerine bakıldığında MDA-MB-231 hücrelerinde zeytin yaprağı ekstresi apoptozis ile ilişkili genlerde artışa neden oldu. MCF-7 hücrelerinde epirubisin ile artan apoptozis ile ilişkili genlerin, epirubisin ile zeytin yaprağı ekstresinin kombine edilmesi halinde azaldığı görüldü. Bu azalma zeytin yaprağı ekstresinin MCF-7 hücrelerinde sitotoksisiteyi azaltıcı etkisi ile uyumlu bulunmuştur.Sonuç olarak bu bulgulara dayanarak, zeytin yaprağı ekstresinin anti-kanser ilaçlarla kombine edildiğinde hücrenin fenotipine bağlı olarak ilaçların etkisini değiştirebileceği sonucuna varıldı. Breast cancer is the most common cancer in women and the primary reason of deaths from cancer in most countries. Therefore, early diagnosis and effective therapy has become very important.Epidemiologic studies and animal experiments have shown that some nutritional compounds play a role in incidence rates of various cancers. The anti-cancer effect of olive leaf extract and oleuropein, one of the phenolic compounds in the extract, were demonstrated in many studies. There were no combination studies of olive leaf extract with other drugs in current literature.In this study, olive leaf extract is used in combination with different doses of agents that are currently used in the treatment of breast cancer in MCF-7 and MDA-MB-231 human breast cancer cell lines and it is investigated whether their combination increases the effectiveness of low treatment doses. Thus, investigation of new approaches in breast cancer treatment is planned. For this reason, the drugs that are used in breast cancer therapy, epirubicin, doxorubicin and docetaxel, are chosen.In our study, it was found that olive leaf extract increases the cytotoxic effect of the drugs in MDA-MB-231 cell line. In contrast, it was found that combinations with epirubicin and doxorubicin decreases the cytotoxic effect on MCF-7 cell line. Detection of PARP cleavage by western blotting in MCF-7 cell line treated with epirubicin and docetaxel alone and their combination with olive leaf extract shows that these cells undergo apoptosis while PARP cleavage was not detected in MDA-MB-231 cell line. Olive leaf extract caused an increase in expression levels of apoptosis related genes in MDA-MB-231 cell line by using RT-PCR. In MCF-7 cell line, it was found that the expression levels of apoptosis related genes increase in epirubicin treatment and decrease in epirubicin and olive leaf extract combination treatment. This decrease was in accordance with the cytotoxicity reducing effect of olive leaf extract in MCF-7 cell line.As a result, it was concluded that when used in combination with anti-cancer agents, olive leaf extract can change the effectiveness of these drugs depending on cell phenotype. 88

Kanser tedavilerinde en etkili yöntemlerden biri kemoterapötik tedavidir. Daha çok lösemi tedavisinde kullanılan İmatinib Mesilat, klinik olarak meme kanseri tedavisinde kullanılmasa da bu kanser üzerine etkileri halen daha araştırılmaktadır. Kemoterapötiklerin yanı sıra, antioksidanlar da kanseri tedavi edici etkilere sahiptir. Bu iki tedavi edici ajanın birlikte kullanımı, tedavi yöntemlerinin etkilerini daha da artırdığını düşündürmektedir. Pekçok kemoterapötik ilaç ve antioksidan kombinasyonlarının hücre sitoksisitesi, migrasyon, gen ekspresyon seviyeleri ve apoptotik düzeyleri üzerine etkileri halen daha bilinmemektedir. Bu çalışmada ilk kez, bir kemoterapötik olan İmatinib Mesilat (IM) ve bir antioksidan olan Tannik Asit (TA)'in MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hatlarına, tek tek ve birlikte uygulandıklarında sitotoksisite ve migrasyon üzerine olan etkileri araştırılmıştır. İmatinib Mesilat (IM), Tannik Asit (TA) ve ikisinin kombine uygulamasının, doza ve zamana bağlı hücre canlılığı üzerine etkisi MTT testi ile saptanmıştır. Bu test sonucunda, MCF-7 hücrelerinde IM ve TA için IC50 değerleri 25 µM iken, MDA-MB-231 hücre hattında ise IC50 değerlerinin IM için 20 µM ve TA için 25 µM olduğu belirlenmiştir. Her iki hücre hattında da bu ajanların 48. saatte daha etkili olduğu gözlenmiştir. Kombine tedavi uygulaması sonucunda ise IM ve TA'in sinerjik etkilerinin olmadığı, aditif, bağımsız ya da antagonist etki gösterdiği sonucuna varılmıştır. Migrasyon için her iki hücre hattına IC değerleri uygulanmış ve 0, 4, 8 ve 12 saatlerde yara iyileşmesi gözlenmiştir. IM ve/veya TA uygulanmayan kontrol hücrelerine göre tek tek ya da kombine uygulanan konsantrasyonlarda yara iyileşmesinin olmadığı gözlenmiştir. Tüm bu veriler sonucunda, kombine olmadan IM ve TA uygulamalarının, her iki hücre hattında da daha sitotoksik etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Tek tek uygulamanın daha etkili olduğu ve sitotoksik etki mekanizmalarının belirlenebilmesi için daha farklı mekanizmaların da araştırılması gerektiği sonucuna varılmıştır., One of the most effective methods in cancer treatments is chemotherapeutic treatment. Although Imatinib Mesylate, which is mostly used in the treatment of leukemia, is not clinically used in the treatment of breast cancer, its effects on this cancer are still being investigated. Besides chemotherapeutics, antioxidants also have cancer-curing effects. The combined use of these two therapeutic agents suggests that the effects of treatment methods are increased. The effects of many chemotherapeutic drugs and antioxidant combinations on cell cytotoxicity, migration, gene expression levels and apoptotic levels are still unknown. In this study, the effects of a chemotherapeutic Imatinib Mesylate (IM) and an antioxidant Tannic Acid (TA) on cytotoxicity and migration when administered individually or together to MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cell lines were investigated for the first time. The effects of Imatinib Mesylate (IM), Tannic Acid (TA) and their combined application on dose and time dependent cell viability were determined by MTT test. As a result of this test, IC50 values for IM and TA were determined as 25 µM in MCF-7 cells, while IC50 values were determined as 20 µM for IM and 25 µM for TA in MDA-MB-231 cell line. It was observed that these agents were more effective at 48th hour in both cell lines. It was concluded that IM and TA do not have synergistic effects but have additive, independent or antagonistic effects in combined treatment. IC values were applied to both cell lines for migration and wound healing was observed at 0, 4, 8 and 12 hours. No wound healing was observed at individual or combined concentrations when compared to control cells without IM and/or TA. As a result of all these data, it shows that IM and TA applications without combination have more cytotoxic effects in both cell lines. It was concluded that individual application is more effective and different mechanisms should be investigated in order to determine the cytotoxic effect mechanisms.

Kanser sağlık alanında en fazla ilaç araştırmalarının yapıldığı ve yeni ilaçların klinik kullanımda hızla yer aldığı bir alandır. Son yıllarda nanopartikül bazlı ilaçların geliştirilmesi ile hem kanser hücrelerinde hedefe yönelik toksik etki sağlanması hem de sağlıklı hücrelerde daha düşük yan etkilerin meydana gelmesi istenmektedir. Bu amaçla hücre çoğalması ve farklılaşmasındaki sinyal iletilerinde çeşitli mekanizmaları ve molekülleri hedefleyen nanopartiküller geliştirilmektedir.Seramidaz, seramidi sfingozin 1-fosfat ve yağ asitlerine dönüştüren bir enzimdir. Asit seramidaz aktivitesinin tümörlü hücrelerde normal hücrelerle kıyaslandığında artmış olduğu gösterilmiştir. Ayrıca seramidazların aşırı ekspresyonu tümör hücrelerini tümör nekrozis faktör ve radyasyona karşı dirençli hale getirmektedir. Bu nedenlerle seramidaz inhibitörleri antikanser ilaç geliştirilmesinde önemli hedeflerdir. Bu çalışmada timidilat sentetaz üzerine etkilerinin yanında, seramidaz inhibitörleri de olan, florourasil (5-FU) ve karmofur nanotaşıyıcı sistemlere yüklenerek meme kanseri hücre serilerinde (MCF-7, MDA-MB-231) ve insan kordon veni endotel hücrelerinde (HUVECs) etkileri incelenmiştir. Bu amaçla biyouyumlu nanotaşıyıcı olan rosin esteri ve Poli-Etilen Glikol (PEG) kullanılmıştır. Nanopartiküllerin karakterizasyonu Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ve Dinamik Işık Saçılımı (DLS) ile yapıldıktan sonra sitotoksik etkileri incelenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre 10-100 μM konsantrasyon aralığında çalışılan nanopartiküllerin meme kanseri hücreleri üzerinde sitotoksik etkileri tespit edilmiştir. Nano 5-FU'nun ve nano karmofurun sitotoksik aktivitesinin MCF-7 hücre hattında MDA-MB-231 hücre hattına göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Ayrıca çalışmamızda, MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerinde western blot ile yapılan protein analizinde, S1P, ASAH1 ve Bcl-2 proteinlerinin ekspresyonunda genel olarak kontrole göre azalma görülmektedir, özellikle S1P ve ASAH1 için nano karmofur'da daha yüksek oranda bir azalma söz konusudur. Çalışmamızdaki bu sonuçlara göre 5-FU ve karmofurun ASAH1 ve S1P üzerinden etki ederek hücre ölümünü gerçekleştirdiğini düşünmekteyiz. Ayrıca bu ilaçların nano taşıyıcılara yüklenmesi sonucu ASAH1ve S1P enzimlerinin sitotoksik etkilerinin de artabileceği bulgularımızda görülmektedir. Çalışmamızda sağlıklı HUVEC hücrelerinde ASAH1 ve S1P enzim seviyelerinde önemli bir değişiklik görülmemesi, nano bileşiklerimizin kanser hücreleri üzerinde kullanılabilir olduğunu desteklemektedir. Cancer is an area where the most drug researches are conducted in the field of health and new drugs are rapidly introduced into clinical use. In recent years, with the development of nanoparticle based drugs, it is aimed to provide targeted toxic effects on cancer cells and lower side effects in healthy cells. For this purpose, nanoparticles targeting various mechanisms and molecules in signaling cell proliferation and differentiation are being developed.Ceramidase is an enzyme that converts ceramide into sphingosine 1-phosphate and fatty acids. Acid ceramidase activity has been shown to be increased in tumor cells compared to normal cells. In addition, overexpression of ceramidases renders tumor cells resistant to tumor necrosis factor and radiation. For these reasons, ceramidase inhibitors are important targets in the development of anticancer drugs.In addition to its effects on thymidilate synthetase, fluorouracil and carmofur, which are also inhibitors of ceramidase were loaded into nanotransport systems and their effects on breast cancer cell lines MCF-7, MDA-MB-231 and HUVECs were investigated. For this purpose, Rosin ester, which is a biocompatible nanocarrier, and Poly-Ethylene-Glycol were used. Cytotoxic effects of nanoparticles were investigated by SEM and DLS.The cytotoxic effects of our nanoparticles in the range of 10-100 concentration μM on breast cancer cells were determined. The cytotoxic activity of nano 5-FU and nano carmofur was found to be higher in the MCF-7 cell line than in the MDA-MB-231 cell line. In our study S1P, ASAH1 enzyme levels and Bcl-2 protein expression decreased compared to control cells, especially for S1P and ASAH1. This result was lower for nano carmofur applied cells. Therefore, we think that 5-FU and carmofur effect cell death by acting on ASAH1 and S1P. ASAH1 and S1P enzymes activity may increase when loading of these drugs into the nano carriers. There were no significant changes in ASAH1 and S1P enzyme levels in healthy HUVEC cells, these results suggest that our nano compounds can be used on cancer cells. 119

MDA-MB-231 MEME KANSERİ HÜCRE HATTINDA FLAVOPİRİDOLÜN ENDOPLAZMİK RETİKULUM STRESİ BAĞLANTILI APOPİTOZA ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASIEmel ÖZTÜRKErciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Doktora TeziDoktora Tezi, Mayıs 2020 Danışmanlar: Prof. Dr. Birkan YAKAN, Doç. Dr. Zuhal HAMURCUÖZETKanser ölümlerinin ikinci önemli nedeni olan meme kanseri kadınlar arasında en yaygın görülen kanser tipidir. Son zamanlarda sayısının giderek artıyor olması alternatif tedavide yeni yaklaşımları getirmektedir. Bu yüzden sunulan tez çalışmasında antitümör etkiye sahip bir flavonoid türevi olan flavopiridolün agresif meme kanseri hücre hattı olan MDA-MB-231 hücreler üzerindeki hücre canlılığı ve endoplazmik retikulum stresi (ERS) ile bağlantılı apopitotik yolaklar üzerindeki etkisinin araştırılması amaçlandı. Bu çalışmada flavopiridolün MDA-MB-231 hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkisi içinhücre canlılık testi (MTS) ve koloni oluşumuna etkisini belirlemek için klonojenik test uygulandı. Migrasyon testi ile hücrelerin göç etme oranları, Anneksin V ve western blot yöntemleri ile flavopiridolün apopitoz, ERS [Glucose regulated protein (GRP78), Aktive edici transkripsiyon factor 4 (ATF4), Fosfo-ökaryotik başlama faktörü 2 α (p-eIF2 α)] ve ERS ile bağlantılı apopitozda rol alan CCAAT/ Enhancer Binding Protein (C/EBP) (CHOP) proteinlerin ekspresyonları belirlendi.MTS sonuçlarına göreflavopiridolün MDA-MB-231 hücre hattında, 200nM-700nM doz aralığında flavopiridolün hücre canlılığını önemli oranda azalttığı bulundu. Klonojenik test sonuçlarına göre 90nM-300nM doz aralığında flavopiridolün kloni oluşumunu azalttığı bulundu. Migrasyon deney sonuçlarına göre ise flavopiridolün 24 saatlik 400nM ve 500nM konsantrasyonlarda flavopiridolün hücrelerin migrasyonunu baskıladığı bulundu. 48 saat 400nM ve 500nM flavopiridol ile muamele edilen hücrelerin ise tamamen öldüğü bulundu. Western blot bulgularına göre 24 saat 200nM-500nM, 48 saat 200nM ve 300nM doz aralığında flavopiridol ile muamele edilen hücrelerde ERS ve ERS ile bağlantılı proteinlerin ekspresyonlarında artış olduğu tespit edildi. Anneksin V deney sonucunda da 24 saat 200nM-500nM, 48 saat 200nM ve 300nMdoz aralığında flavopiridol ile muamele edilen hücrelerde apopitoz oranın arttığı bulundu. Sonuçlarımız diğer diğer sitotoksik kemoterapötik ajanlarla kombinasyon halinde kullanıldığı takdirde flavopiridolün agresif meme kanserli hastaların tedavisi için umut verici bir potansiyele sahip olacağını, ancak bu konu ile ilgili daha ileri düzeyde çalışmaların yapılması gerektiğini gösterdi.Anahtar Kelimeler: Anneksin V, Apopitoz, Flavopiridol, MDA-MB-231, ERS. INVESTIGATION OF THE EFFECTS OF FLAVOPIRIDOL ON ENDOPLASMIC RETICULUM STRESS-CONNECTED APOPITOSIS IN THE BREAST CANCER OF MDA-MB-231 Emel ÖZTÜRK Erciyes University, Institute of Health Sciences Histology and Embryology Department PhD Thesis Ph.D. Thesis, May 2020 Consultants: Prof. Birkan YAKAN, Assoc. Dr. Zuhal HAMURCUABSTRACTBreast cancer, the second leading cause of cancer deaths, is the most common type of cancer among women. The fact that its number has been increasing recently brings new approaches in alternative therapy. Therefore, in the presented thesis, it was aimed to investigate the effect of flavopiridol, a flavonoid derivative with antitumor effect, on cell viability and endoplasmic reticulum stress (ERS) -related apopitotic pathways on aggressive breast cancer cell line MDA-MB-231 cells.In this study, cell viability test (MTS) was performed for the effect of flavopiridol on the viability of MDA-MB-231 cells, and the clonogenic test was used to determine the effect on colony formation. The migration test showed the migration rates of the cells, the expressions of proteins involved in apoptosis, ERS [Glucose regulated protein (GRP78), Activating transcription factor 4 (ATF4), Phospho-eukaryotic initiation factor 2 α (p-eIF2 α)] and ERS-related apoptosis [CCAAT/ Enhancer Binding Protein (C/EBP) (CHOP)]of flavopiridol by Anneksin V and western blot methods. According to MTS results, flavopiridol was found to significantly reduce cell viability in the MDA-MB-231 cell line, in the 200nM-700nM dose range. According to the clonogenic test results, it was found that flavopiridol reduced clone formation in the 90nM-300nM dose range. According to the results of the migration experiment, flavopiridol suppressed the migration of the cells at 24 hours at 400nM and 500nM concentrations. The cells treated with 400nM and 500nM flavopiridol for 48 hours were found to be completely dead. According to Western blot findings, there was an increase in the expression of ERS and ERS related proteins in cells treated with flavopiridol at a dose interval of 24 hours 200nM-500nM, 48 hours 200nM and 300nM. As a result of Annexin V experiment, it was found that the rate of apoptosis increased in the cells treated with flavopiridol in the range of 200nM-500nM, 48 hours 200nM and 300nMdoz for 24 hours. Our results showed that if used in combination with other cytotoxic chemotherapeutic agents, flavopiridol will have promising potential for the treatment of patients with aggressive breast cancer, but further studies on this subject should be done.Key Words: Annexin V, Apoptosis, Flavopiridol, MDA-MB-231, ERS. 109

Bu çalışmada MDA-MB-231 meme kanser hücre hattında prostaglandin endoperoksid H sentaz 2 (PTGS2), kalretikulin (CALR) ve keratin-19 (KRT19) genlerinin transkripsiyon düzeyindeki gen anlatımlarının belirlenmesi amaçlanmıştır. Materyal ve metod: Kültür ortamında çoğaltılan MDA-MB-231 meme kanser hücrelerinden RNA izolasyonu yapılmış ardından cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. PTGS2, CALR ve KRT19 genlerine spesifik primerler ile eş zamanlı PCR yapılarak, bu genlerin ifadesi transkripsiyonel seviyede belirlenmiştir. Bulgular: MDA-MB-231 hücre hattında PTGS2 gen ifadesinde 14,92 kat; CALR gen ifadesinde 1,45 kat; KRT19 geninin ifadesinde ise 6,72 kat artış olduğu saptanmıştır. Sonuç: Farklı solid kanserlerde, apoptoz direnci, metastaz, anjiyogenez gibi biyolojik süreçlerde rol aldığı bilinen KRT19, CALR, PTGS2 genlerinin meme kanseri gelişiminde de rol alabileceği ve ileride yapılacak detaylı çalışmalarla prognostik öneme sahip olacağı ön görülmektedir. In this study, we aimed to determine the gene expressions of prostaglandin endoperoxide H synthase 2 (PTGS2), calreticulin (CALR), and keratin-19 (KRT19) genes at transcriptional level in MDA-MB-231 breast cancer cell line. Materials and Methods: RNA was isolated from MDA-MB-231 breast cancer cells grown in culture medium, followed by cDNA synthesis. Real-time PCR with specific primers for PTGS2, CALR and KRT19 genes was used to determine the expression of these genes at the transcriptional level. Results: In the MDA-MB-231 cell line, a 14.92-fold increase in PTGS2 gene expression, a 1.45-fold increase in CALR gene expression and a 6.72-fold increase in expression of the KRT19 gene were found. Conclusions: It is predicted that the KRT19, CALR, PTGS2 genes, which are known to play a role in biological processes such as apoptosis resistance, metastasis, and angiogenesis in different solid cancers, may also play a role in the development of breast cancer and will have prognostic importance with further studies.

Tez Danışmanı: Prof. Dr. Engin Ulukaya Meme kanseri, kadınlar arasında en sık görülen kanser olup, her yıl 2,1 milyon kadını etkilemektedir, kadınlarda kansere bağlı ölümlerde önde gelen nedenler arasındadır. 2018'de 627.000 kadının meme kanserinden öldüğü tahmin edilmektedir ki bu kadınlarda tüm kanser ölümlerinin yaklaşık % 15'idir. Tedavisinde yeni yaklaşımlara rağmen etkin bir başarı sağlanamamaktadır. Bu tez çalışması kapsamında; dört yeni hibrid protoflavon bileşiğin MCF-7 ve MDA-MB-231 hücre hatları üzerinde anti-kanser etkileri incelenecektir. MCF-7 hücre hattı ERα -pozitif meme kanseri için temsili model olarak ve MDA-MB-231 hücre hattı üçlü negatif meme kanseri (TNBC) için model olarak kullanılacaktır Breast cancer is the most common cancer among women, affecting 2.1 million women each year and is one of the leading causes of cancer-related deaths in women. It is estimated that 627,000 women died of breast cancer in 2018, accounting for about 15% of all cancer deaths among women. Despite the new approaches in the treatment of effective success can not be achieved. Within the scope of this thesis; The anti-cancer effects of four novel hybrid protoflavone compounds on MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines will be examined. The MCF-7 cell line will be used as a representative model for ERα-positive breast cancer and as a model for the MDA-MB-231 cell line triple negative breast cancer (TNBC).

Dünyada kadınlar arasında görülme sıklığı birinci olan meme kanseri, heterojen ve karmaşık bir hastalıktır ve bu heterojenite giderek artmaktadır. Meme kanserinin pek çok alt tipleri bulunmaktadır. Meme kanserinin erken tanısı ve tedavisi hastalığın prognozunda önemli bir yer almaktadır. Hücre büyümesi, farklılaşması, apoptoz ve proliferasyonunda anahtar düzenleyici olan MYC geni, meme kanserinin gelişimi ve progresyonuyla da ilişkilidir. Yapılan çalışmalarda MYC geni aşırı ekspresyonunun baskılanmasının meme kanseri hücreleri üzerinde antiproliferatif etki oluşturduğu gösterilmiştir. Terapötik hedef olarak stauprimid embriyonik kök hücrelerde NME /NM23 nükleosit difosfat kinaz 2 (NME2) nükleer lokalizasyonunu inhibe ederek MYC geninin aşırı ekspresyonunu baskılar. DZNep (3-Deazaneplanocin-A) ise EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) yolağında H3K27me3 metillenmesini inhibe etmektedir. Tez kapsamında yapılan çalışmalarda, DZNep ve Stauprimid’in ayrı ayrı ve kombinasyon şeklinde insan meme kanseri hücre hatlarına muamelesi ile sitotoksisitesi, yara iyileşme, klonojenik analiz ve gen ekspresyon deneyleri gerçekleştirilmiştir. Stauprimid’in 72. saatte MDA-MB-231 hücre hattı için IC50 dozu 2,74 μM, DZNep’in 182,75 μM, 1:1 oranındaki kombinasyonunun ED50 0,33 μM ve CI (kombinasyon indeksi) 0,134 güçlü sinerjizm, MCF-7 hücre hattı için 72. saatte Stauprimid IC50 2,07 μM, DZNep IC50 115,0 μM, 1:1 oranındaki kombinasyonunun ED50 1,37 μM ve CI 0,671 sinerjizm, MCF-10A hücre hattı için 72. saatte Stauprimid IC50 19,90 μM, DZNep 108,6 μM, 1:1 oranındaki kombinasyonunun ED50 7,90 μM ve CI 0,47 sinerjizm göstermiştir. Yara iyileşme deneyinde, maddelerin kombinasyon uygulamasında ayrı ayrı ajan muamelesi ve kontrol grubuna göre daha az kapanma eğilimi göstermiştir. DZNep ve Stauprimid ajanlarının kombine tedavi şeklinde kullanılmasının meme kanseri hücreleri üzerinde tek bir anti-tümör özellikte kullanılmasına göre daha anti-prolifaretif etkisinin olduğu gösterilmiş ve bu bağlamda MYC geninin regülasyonu sağlanmıştır. Sonuç olarak, her iki etken maddenin MYC geni üzerine etkisinin olması ve apoptozu indüklemesi bu iki ajan arasındaki sinerjistik etki olduğunu göstermektedir. In vivo ve faz çalışmalarının ardından kullanılacak olan kombine terapötik tedavilerde fayda sağlanacağı ön görülmektedir., Breast cancer, which is the most prevalent among women in the world, is a heterogeneous and complex disease and this heterogeneity is increasing. There are many subtypes of breast cancer. Early diagnosis and treatment of breast cancer has an important role in the prognosis of the disease. The MYC gene, a key regulator of cell growth, differentiation, apoptosis and proliferation, is also associated with the development and progression of breast cancer. Studies have shown that suppression of MYC gene overexpression has an antiproliferative effect on breast cancer cells. As a therapeutic target, stauprimidine inhibits overexpression of the MYC gene by inhibiting NME / NM23 nucleoside diphosphate kinase 2 (NME2) nuclear localization in embryonic stem cells. DZNep (3-Deazaneplanocin-A) inhibits H3K27me3 methylation in the EZH2 (Enhancer of vine homologous 2) pathway. According to the data we were obtained, doses effects was detected at 72 h for MDA-MB-231 cell line the IC50 doses of Stauprimide 2.74 μM, DZNep 182.75 μM, the combination of agents 1:1 ratio ED50 0,33 μM and CI (combination index) 0.134 strong synergism, for MCF-7 cell line the IC50 doses of Stauprimide 2.07 μM, DZNep 115.0 μM, the combination of agents 1:1 raito ED50 1.37 μM and CI 0.671 synergism, for MCF-10A cell line the IC50 doses of Stauprimide 19.9 μM, DZNep 108.6 μM, the combination of agents 1:1 ratio ED50 7.9 μM and CI 0.470 synergism. In the wound healing experiment, less closing formation were observed in the combination application of the substances compared to the control group and separate agent treatment. The use of DZNep and Stauprimide agents as a combined treatment has been analyzed in flow cytometry, which has a more anti-prolifaretive effect than the use of a single anti-tumor treatment on breast cancer cells. In this context, regulation of MYC gene was achieved. In the context of all these results, the effect of both agents on MYC gene and induction of apoptosis shows that there is synergistic effect between these two agents. Combined therapeutic therapies to be used after in vivo and phase studies are predicted to be beneficial.

Yüksek Lisans Tezi., Meme kanseri, dünyada kadınlarda en sık görülen malign kanserdir. Sürekli artan sayıda meme kanseri vakası nedeniyle, birincil ve ikincil korunmada etkili aktiviteler geliştirmek hayati önem taşımaktadır. Her iki tür kanser önleme yöntemini birleştiren en iyi değer vaat eden yöntemlerden biri, kimyasal müdahale gibi görünmektedir. Karsinojenez sürecini inhibe etmek, geciktirmek veya tersine çevirmek için doğal veya sentetik bileşikler kullanır. Doğal kökenli kemoprevansiyon maddeler arasında, geniş spektrumlu bir anti-kanser polifenol türevi olan kurkumin ve juglona büyük önem verilmektedir. Çalışmamızda kurkuminin ve juglonun farklı doz gruplarında MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hatlarında proliferasyonuna etkileri MTT hücre canlılık testi ile analiz edildi. Hücrelere 24 saat boyunca kurkumin ve juglon ile farklı dozlarda muamele edildi. Real time PCR ve Western blot yöntemiyle CYP3A4 ve mt-ATP6 gen ve protein ekspresyonları kontrol grubu ile karşılaştırıldı. MCF-7 meme kanseri hücre hattında kurkumin uygulaması sonucunda, CYP3A4'ün ve mt-ATP6' nın ekspresyonunlarının arttığı, MCF-7 hücrelerine juglon uygulaması sonucu CYP3A4'ün ekspesyonunun arttğı ayrıca mt-ATP6 gen ifadelerinin azaldığı belirlenmiştir. MDA-MB-231 hücre hattında, hem kurkumin hem de juglon uygulaması sonucunda CYP3A4'ün ve mt-ATP6 gen eksperesyonunun azaldığı tespit edilmiştir. İfade analizleri yapıldıktan sonra, bu moleküllere ait özgün antikorlar kullanılarak Western blot çalışmaları yapılmıştır. MCF-7 hücrelerinde kurkumin uygulamasının CYP3A4 ve mt-ATP6 proteinlerinin kontrol grubuna göre ifadesini arttırdığı belirlenmiştir. MDA-MB-231 hücrelerinde kurkumin uygulaması sonucu CYP3A4 proteininin ifadesinde kontrol grubuna göre azaldığı tespit edilmiştir. Yapılan literatür taramasında kurkumin ve juglon un mtATP6 ve sitokrom p450 sistemini açıklayacak yayına rastlanmamıştır. Çalışmamızda mitokondiriyal enerji metabolizması ve antioksidan sistem üzerine etkileri bu moleküllerdeki değişimlerle açıklanmaya çalışılmıştır. Bunun sonucunda da tedaviye yönelik strateji geliştirilmiş olacaktır., Breast cancer is the most common malignant cancer in women in the world. Due to the ever increasing number of breast cancer cases, developing effective activities in primary and secondary prevention is vital. One of the best-value methods combining both types of cancer prevention seems to be chemical intervention. It uses natural or synthetic compounds to inhibit, delay or reverse the carcinogenesis process. Among the chemoprevention agents of natural origin, curcumin and juglone, a broad spectrum anti-cancer polyphenol derivative, are of great importance. In this study, the effects of curcumin and juglone on proliferation of MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cell lines in different dose groups were analyzed by MTT cell viability test. The cells were treated with curcumin and juglone at different doses for 24 hours. CYP3A4 and mt-ATP6 gene and protein expressions were compared with the control group by real time PCR and Western blot method. As a result of the application of curcumin in MCF-7 breast cancer cell line, it was determined that the expression of CYP3A4 and mt-ATP6 were increased and that expression of CYP3A4 was increased as a result of juglon application in MCF-7 cells and mt-ATP6 gene expression was decreased. In the MDA-MB-231 cell line, it was found that CYP3A4 and mt-ATP6 gene expression decreased as a result of both curcumin and juglone application. After expression analysis, Western blot studies were performed using specific antibodies of these molecules. It was determined that the application of curcumin in MCF-7 cells increased the expression of CYP3A4 and mt-ATP6 proteins compared to control group. It was determined that the expression of CYP3A4 protein decreased in MDA-MB-231 cells compared to the control group. In the literature review, no publication was found to explain the mtATP6 and cytochrome p450 system of curcumin and juglone. In our study, the effects of mitochondrial energy metabolism and antioxidant system on these molecules are explained. As a result, a treatment strategy will be developed.

Meme kanseri, kadınlar arasında en sık görülen kanser olup, her yıl 2,1 milyon kadını etkilemektedir, kadınlarda kansere bağlı ölümlerde önde gelen nedenler arasındadır. 2018'de 627.000 kadının meme kanserinden öldüğü tahmin edilmektedir ki bu kadınlarda tüm kanser ölümlerinin yaklaşık % 15'idir. Tedavisinde yeni yaklaşımlara rağmen etkin bir başarı sağlanamamaktadır. Bu tez çalışması kapsamında; dört yeni hibrid protoflavon bileşiğin MCF-7 ve MDA-MB-231 hücre hatları üzerinde anti-kanser etkileri incelenecektir. MCF-7 hücre hattı ERα -pozitif meme kanseri için temsili model olarak ve MDA-MB-231 hücre hattı üçlü negatif meme kanseri (TNBC) için model olarak kullanılacaktır. Breast cancer is the most common cancer among women, affecting 2.1 million women each year and is one of the leading causes of cancer-related deaths in women. It is estimated that 627,000 women died of breast cancer in 2018, accounting for about 15% of all cancer deaths among women. Despite the new approaches in the treatment of effective success can not be achieved. Within the scope of this thesis; The anti-cancer effects of four novel hybrid protoflavone compounds on MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines will be examined. The MCF-7 cell line will be used as a representative model for ERα-positive breast cancer and as a model for the MDA-MB-231 cell line triple negative breast cancer (TNBC). 67

Objective: Many methods such as pathological examinations are used to diagnose breast cancer. In addition to all these tests and methods, the use of glycobiology has also increased significantly in cancer research. Differences in sugar residues observed on the membrane surfaces of breast cancer cell lines ER (+) -creating MCF-7 and ER (-) MDA-MB-231 were specifically marked with FITC-(Maackia Amurensis-Lectin-1) Ve FITC-(Wheat Germ Aglutinin) The intensity of radiation is discussed relatively. The aim of using this method is to clearly reveal that the differences in the sialic acid units in the membranes of breast cancer cell lines can be precisely separated in as little as two hours. Material and Method: MCF-7 and MDA-MB-231 ) cells were used in our study. [FITC-(Maackia Amurensis-Lectin-1) Ve FITC(Wheat Germ Aglutin)] were purchased from the respective companies. Following this step, the FITC marked products were prepared and marked according to usage protocols. Results: FITC-labeled Maackia amurensis Lectin-1 was applied to MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cell lines. Subsequently, the MDA-MB-231 cell line showed a relatively more intense radiation than the MCF-7. The FITC marked Wheat germ agglutinin was applied to the same cancer cell lines. As a result of this marking, radiation of similar intensity was detected in both cancer lines. MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines used in the study are significant. Two different types of breast cancer cell types were rapidly separated using the two hour staining method applied to the cells. At the same time, with the help of immunofluorescent-labeled lectins, the availability of glyconoconjugates was demonstrated for rapid and specific discrimination., Amaç: Meme kanseri teşhisinde patolojik tetkikler gibi birçok yöntem kullanılmaktadır. Tüm bu tetkiklerin ve yöntemlerin yanı sıra, kanser araştırmalarında glikobiyolojinin de önemi oldukça artmıştır. ER (+) özellik gösteren MCF-7 ve ER (-) özellik gösteren MDAMB-231 meme kanseri hücre hatlarının zar yüzeylerinde görülen şeker rezidüleri miktar farklılıkları FITC-(Maackia Amurensis-Lektin-1) Ve FITC-(Wheat Germ Aglutin) ile spesifik olarak işaretlenmiş ve ışıma yoğunluğu göreceli olarak irdelenmiştir. Bu yöntem ile meme kanseri hücre soylarının membranlarında bulunan sialik asit birimlerindeki farklılıkları iki saat gibi kısa bir zamanda, hassas olarak ayrılabildiğinin açıkça ortaya çıkarılması amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda MCF-7 ve MDA-MB-231 hücre soyları kullanılmıştır. Çalışmada kullanılması planlanan floresan işaretli lektinler [FITC-(Maackia Amurensis-Lektin-1) Ve FITC-(Wheat Germ Aglutin)] ilgili firmalardan satın alınmış ve kullanım protokolüne uygun olarak hazırlanıp işaretlemeler yapılmıştır. Bulgular: MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hatlarına FITC işaretli Maackia amurensis lektini-1 uygulanmıştır. Buna göre; MDA-MB-231 hücre hattı MCF-7’a göre göreceli olarak daha yoğun bir ışıma göstermiştir. Aynı kanser hücre hatlarına FITC işaretli Wheat Germ Aglutinin uygulanmıştır. Bu işaretleme sonucunda da her iki kanser hattında da benzer yoğunlukta ışıma tespit edilmiştir. larının membranların da görülen bu farklılıklar önemli bulunmuştur. Hücrelere uygulanan iki saatlik boyama yöntemi ile iki farklı meme kanseri hücre tipi hızlı bir şekilde ayrılmıştır. Aynı zamanda immmünofloresan işaretli lektinler yardımıyla, glikokonjugatların, hızlı ve özgün ayrımda kullanılabilirliği gösterilmiştir

Bu çalışmada Triple negatif meme kanseri ve Luminal A meme kanseri hücreleri üzerine EGFR inhibitörü olan AG1478' in etkileri tespit edilmeye çalışılmıştır. Araştırmamızda Triple negatif meme kanseri modeli olarak MDA-MB-231 ve Luminal A meme kanseri modeli olarak da MCF-7 hücre hatları kullanılmıştır. Deneylerde hücre kinetiği parametreleri olarak; çoğalma hızı, mitotik indeks ve apoptotik indeks değerlendirilmiştir. Deneylerde MDA-MB-231 ve MCF-7 hücre hatları için deneylerde başlangıçta AG 1478'in farklı konsantrasyonları uygulanmıştır. IC50 dozu MDA-MB231 hücreleri için 50 µM, MCF-7 hücreleri için 20 µM olarak belirlenmiştir.Tüm çalışmalar sonucunda elde edilen veriler incelendiğinde her iki hücre hattında zamana bağlı olarak çoğalma hızı, hücre indeksi ve mitotik indeks değerlerinde anlamlı bir azalma gözlemlenmektedir In this study, it has been to determine the effects of AG1478 EGFR inhibitor on Triple negative breast cancer and Luminal A breast cancer cells. In our study, MDA-MB-231 cell line was used as a triple negative breast cancer model and MCF-7 cell line was used as a Luminal A breast cancer model. Proliferation rate, mitotic index and apoptotic index were evaluated as cell kinetics parameters in experiments. For the MDA-MB-231 and MCF-7 cell lines, different concentrations of AG 1478 were initially applied in the experiments. IC50 was determined to be 50 μM for MDA-MB231 cells and 20 μM for MCF-7 cells. When the data obtained from all studies are examined, a significant decrease is observed in the rate of proliferation, cell index and mitotic index values depending on time in both cell lines. 54

Bu çalışmada Luminal A meme kanseri ve üçlü negatif meme kanseri hücreleri üzerine Kurkumin'in antiproliferatif etkileri tespit edilmeye çalışılmıştır. Araştırmamızda Luminal A meme kanseri modeli olarak da MCF-7 ve üçlü negatif meme kanseri modeli olarak MDA-MB-231 hücre hattı kullanılmıştır. Deneylerde hücre kinetiği parametreleri olarak çoğalma hızı, xCELLigence gerçek zamanlı hücre analiz sisteminden elde edilen hücre indeksi değerleri, mitotik indeks ve apoptotik indeks değerlendirilmiştir. Deneylerde her iki hücre hattı için 75 µM, 100 µM ve 125 µM'lık Kurkumin konsantrasyonları uygulanarak 75 µM'lık Kurkumin konsantrasyonu IC50 dozu olarak belirlenmiştir. Tüm uygulamalar sonucunda elde edilen veriler incelendiğinde her iki hücre hattında zamana bağlı olarak çoğalma hızı, hücre indeksi ve mitotik indeks değerlerinde anlamlı bir azalma gözlemlenirken, apoptotik indeks değerlerinde anlamlı bir yükseliş gözlenmiştir. In this study the effects of Curcumin on Luminal A breast cancer and triple negative breast cancer cells were explored. In our investigation MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines were used as Luminal A breast cancer and triple negative breast cancer model respectively. Growth rate, cell index values obtained from xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) System, mitotic index, labelling index and apoptotic index were evaluated in experiments. In the experiments, 75 µM, 100 µM ve 125 µM of Curcumin concentrations were applied for both MDA-MB-231 cell line and MCF-7 cell line to determine IC50 dose. Concentration of 75 μM Curcumin was determined to be IC50 dose.When the data obtained from all applications were examined, a significant decrease was observed in the apoptotic index values, while a significant decrease in the rate of proliferation, cell index and mitotic index was observed in both cell lines with time. 60

Bu tezde sikloastragenol ve 34 türevinin sentezi, karakterizasyonu ve sitotoksik aktiviteleri çalışılmıştır. Çalışılan 35 molekülün, PC-3 (insan prostat kanseri), HT-29 (insan kolon kanseri), MDA-MB-231 (insan meme kanseri) ve MCF-7 (insan meme kanseri) hücre hatları üzerindeki inhibisyon etkisi MTT test yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Bu moleküllerin içinden 20(R),24(S)-epoksi-3β,6α,16β,25-tetrahidroksisikloartan-3,6-dipivalat- türevi C19, MDA-MB-231 hücre hattında gösterdiği 6.20 µM IC50 değeri ile en aktif molekül olarak belirlenmiştir. Moleküllerin lineer yapı –aktivite ilişkileri daha önceki çalışmalardan farklı olarak Yapı-Aktivite Yüzey Indeksi (YAYI) yaklaşımı ile değerlendirilmiştir. Moleküllerin YAYI grafikleri yapı ile aktivite arasındaki ilişkiyi açıklayabilmek için yapay sinir ağları (YSA) regresyonu modeli gibi non-lneer yöntemler yerine klasik çoklu lineer regresyon modeli (ÇLR), temel bileşenler regresyonu modeli (TBR), ya da kısmi en küçük kareler (KEK) yönteminin kullanılmasının anlamsız olduğunu göstermiştir. Nitekim tüm hücre hatlarında en yüksek regresyon katsayısı ve en düşük farkların karelerinin toplamı değerleri yapay sinir ağı regresyonu modelinde elde edilmiştir. Bunlara ek olarak YAYI grafikleri molekül seti içindeki aktivite tepelerini aydınlatmamızda yardımcı olmuştur. YAYI değerlerinin ve heatmap grafiklerinin yardımı ile HT-29 hücrlerinde iki, PC-3, MCF-7 ve MDA-MB-231 hücre hatlarında 1'er tane aktivite tepesi oluşturan molekül çifti belirlenmiştir. In this thesis, synthesis, characterization, cytotoxic activities of cycloastragenol (C1) and its 34 derivatives were described. The effect of derivatives on the growth of PC-3 (human prostate adenocarcinoma), HT-29 (human colon colorectal adenocarcinoma), MDA-MB-231 (human breast adenocarcinoma), MCF-7 (human breast adenocarcinoma) human cancer cell lines was determined using MTT assay. In this series, (-20(R),24(S)-epoxy-3β,6α,16β,25-tetrahydroxycycloartane-3,6-pivalate) C19 was found to be the most active compound with its 6.20 µM IC50 values on MDA-MB-231 cell line. Linear structure activity relationship of these derivatives were inspected via Structure Activity Landscape Index (SALI) approach that was distinctive compared to other studies in this thesis. SALI graphs of the molecules indicated that it was unmeaningful to build models with classical linear regression like multiple linear regression (MLR), principle component regression (PCR) and partial least square regression (PLS) in stead of non-lineer regression model artifical neural network (ANN). Best regression coefficients and lowest sum of squares of error values were obtained with artifical neural network models in all cell line. Besides, SALI graphs were useful in determining activity cliffs of the molecule set. As an outcome of the SALI calculations and heatmap graphs, we identified two activity cliffs in HT-29, one each in PC-3, MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines. 358

Kadınlarda en yaygın malignite meme kanseridir.Kanser ilaçlarının, hücresel davranışı ve kanser patogenezinin altında yatan mekanizmalar aracılığıyla etki ettiği yolakları anlamadaki yetersizlikten dolayı, kanser tedavisinde oluşan ilaç direnci hala önemli bir klinik sorun olarak kalmıştır. Bu sebeple, meme kanserindeki risk faktörü oluşumlarının tümörün morfolojik ve moleküler özelliklerine göre değişip değişmediğini belirlemek önemli bir sorgulamadır. Tamoksifen direnci, anti-östrojen tamoksifenin ERα'yı transaktive eden agonistik özellikler kazandığı meme kanseri vakalarının yarısında görülmektedir. ERα'nın PAK1 aracılıklı serin 305 (S305) fosforilasyonu tamoksifen direncine yol açar. Bizim çalışmamızda, PAK1 kaynaklı tamoksifen direnci konu alınmıştır. Bizim hipotezimize göre, PAK1 tarafından sağlanan ERα-S305 fosforilasyonu PAK1'in miR-221-3p ile transkripsiyonel engellenmesi ile tersine çevrilebilir çünkü miR-221-3p PAK1'in 3'UTR bölgesini hedeflemektedir. Bu amaçla, bölümümüzdeki laboratuvarda ER-pozitif meme kanseri hücre hatlarında (MCF7, HCC1500, ZR-75-1), ER-negatif meme kanseri hücre hatlarında (SKBR3, MDA-MB-231) ve kontrol olarak meme epitel hücre hattı hTERT-HME1'de miR-221-3p'nin ifade düzeyini ölçmek için Real-Time PCR (qRT-PCR) kullandık. PAK1'daki miR-221-3p bağımlı artış, ZR-75-1 hücre soyunun invaziv özelliğe sahip olup diğer ER+ hücre hatları MCF7 ve HCC1500'ün daha hafif bir kanser şiddetine sahip olmasına bağlanabilir. SKBR3 hücre hattındaki miR-221-3p'nin ifade düzeyinin azalıp PAK1'ın ifade düzeyinin artması, PAK1 ifade düzenlenmesinde miR-221-3p'nin rolünün de olabileceğine yorumlanabilir. miR-221-3p ve PAK1 ifadesi kontrol hücre soyuna göre yüksek olan MDA-MB-231 hücre hattında PAK1 ifadesi için farklı düzenleyici mekanizmalar olabilir. Bu sonuçlara göre, meme kanserinin histopatolojisi ve şiddetine göre, miR-221-3p hastalığın moleküler mekanizması ile ilgili PAK1 aktivitesi olsun veya farklı mekanizmalar üzerinden olsun önemli bilgiler verebilir.Anahtar Kelimeler: miR-221-3p, PAK1, meme kanseri, qRT-PCR, RT-PCR The most common malignancy in women is breast cancer. Drug resistance in the treatment of cancer still remains a major clinical concern because of an insufficiency of understanding of the pathways by which cancer drugs interact with the mechanisms underlying cellular behaviour and cancerpathogenesis. Therefore, defining whether risk factor associations for breast cancer diverge by morphological and molecular features of the tumors shows an important query. Resistance to tamoxifen is seen in half of the recurrences in breast cancer. The anti-estrogen tamoxifen gains agonistic property by transactivating ERα. PAK1- mediated phosphorylation of serine 305 (S305) of ERα leads to resistance to tamoxifen. In our study, PAK1- induced suggestive tamoxifen resistance was designed. According to our hypothesis, phosphorylation of ERα-S305 by PAK1 may be reversed by PAK1 transcriptional inhibition by miR-221-3p due to miR-221-3p targeting the 3'UTR of PAK1. For this purpose, we used Real-Time PCR (qRT-PCR) to measure the expression level of miR-221-3p in ER-positive breast cancer cell lines (CRL-1500, MCF7) and breast epithelial cell line, hTERT-HME1, as control in the laboratory in our department. Increase in the expression of PAK1 depending on miR-221-3p may be related to ZR-75-1 cell line which has invasive characteristic but other two ER+ cancer cell lines, MCF7 and HCC1500, have milder cancer severity. miR-221-3p may have a role on regulation of PAK1 expression because the miR-221-3p expression level decreases while PAK1 expression level increases in SKBR3 cell line. miR-221-3p and PAK1 expression in MDA-MB-231 cell line are higher than that of hTERT-HME1 cell line may be interpreted like that miR-221-3p has no regulatory effect on of PAK1 expression in this cell line. According to these results, miR-221-3p may give crucial information about the molecular mechanism of the disease upon PAK1 activity or different mechanisms with respect to histopathology and severity of breast cancer.Key Words: miR-221-3p, PAK1, breast cancer, qRT-PCR, RT-PCR 76

Sitotoksisteyi ölçmede kullanılan farklı yöntemler vardır. Bu farklılık çalışmaların karşılaştırılması ve değerlendirilmesinde zorluklara neden olmaktadır.Araştırmamızda sitotoksisiteyi belirlemede, gerçek zamanlı, hassas, tekrarlanabilir, yeni bir yöntem olan ?xCELLigence? sistemini kullandık. Çalışmada prostat kanseri (PC-3 ve DU-145) ve meme kanseri hücre hatlarında (MCF-7, MDA-MB-231) zoledronik asitin sitotoksisite ve apoptozis etkilerini araştırdık.Çalışmamızda xCELLigence yöntemi ile, PC-3 hücre hattı için 95.5 ?M, DU-145 hücre hattı için 47.3 ?M, MDA-MB-231 hücre hattı için 11.4 ?M, MCF-7 hücre hattı için 11.7 ?M IC50 değerleri saptanmıştır. Zoledronik asidin doza ve zamana bağlı etkisi artmıştır. There are different methods which are used to measure cytotoxiticy. This difference leads to difficulties in the evaluation and comparation of different studies. In this study we used a new `xCELLigence` system that is real-time, accurate, repeatable to determine cytotoxicity. We investigated the cytotoxicity effects and apoptosis of zoledronic acid at prostate cancer (PC-3 and DU-145) and breast cancer cell lines (MCF-7, MDA-MB-231).In this study we determined values of 95.5 ?M for PC-3 cell line, 47.3 ?M value for DU-145 cell line, 11.4 ?M value for MDA-MB-231 cell line, 11.7 ?M IC50 value for MCF-7 cell line with XCELLigence method. We found that dose-and time-dependent effect of zoledronic acid increased. 52

Tümör anjiyogenezi tümör hücreleri tarafından anjiyogenik faktörlerin salınımı, proteolitik enzimlerin aktivasyonu ve endotelyal hücrelerin proliferasyonu ve göçünü içeren çok aşamalı kompleks bir mekanizmadır. VEGF büyüme ve metastaz için kritik olan anjiyogenik bir fenotipe geçişte sınırlayıcı bir faktördür. Anjiyogenez hedefli son yaklaşımlar vasküler endotelyal hücreleri uyaran faktörlerin ve bunların reseptörlerinin baskılanmasına bağlıdır. VEGF bu alandaki araştırmalarda en önemli hedef moleküllerden biri haline gelmiştir. VEGF'ye karşı geliştirilen ilaçlardan biri monoklonal bir antikor olan Bevacizumab' dır (Avastin, Altuzan). Prostoglandinlerin COX-2 ile indüklenmiş artışı, anjiyogenez, kanser hücrelerinin çoğalması, apoptozun baskılanması ve metastatik potansiyelin artışını uyarmaktadır. Bu çalışma ile Bevacizumab'ın meme kanseri hücre hattı olan MDA-MB-231 üzerindeki antianjiyogenik ve apoptotik etkisi ile VEGF-A, VEGF-C, VEGFR2 ve COX-2 mRNA ifadeleri üzerindeki etkilerinin araştırılması amaçlandı.Çalışmamızda, MDA-MB-231 hücrelerinde, çeşitli doz ve inkübasyon sürelerinde, Bevacizumab uygulanması sonrası, ?XTT? yöntemi ve ?akridin oranj-etidyum bromür? boyamasıyla hücre canlılığı belirlendi. Aynı sinyal iletim yolağında görev alan VEGF-A, VEGF-C, VEGFR2 ve bu yolak üzerine de etki eden COX-2 genlerinin mRNA ifade düzeylerinin belirlenmesi için kantitatif Real-Time PCR yöntemi kullanıldı. Çalışmamızda, Bevacizumab' ın etkisiyle 24 ve 48. saatlerde COX-2 ifade düzeyinde artış gözlense de 72 ve 96. saatlerde bu COX-2 ifade oranı 50 ?g/ml' den sonraki dozlarda düşük düzeylerde seyretmektedir. Anjiyogenezde önemli görevi olduğu bilinen VEGF-A, VEGF-C ve VEGFR2 mRNA ifade düzeylerinin ve invazyon yeteneklerinin 24, 48 ve 72. saattlerde doza bağımlı olarak amlamlı düzeyde arttığı belirlendi. 96. saatte ise VEGF-A, VEGF-C ve VEGFR2 mRNA ifade düzeylerinin ve hücrelerin invazyon yeteneklerinin anlamlı düzeyde azaldığı gözlendi. Elde ettiğimiz veriler, MDA-MB-231 hücrelerinin anjiyogenik özelliklerinin baskılanması için uzun süreli Bevacizumab uygulaması gerektiğini düşündürmektedir. Tumor angiogenesis is a complex mechanism consisting of multi-step events including secretion or activation of angiogenic factors by tumor cells, activation of proteolytic enzymes, proliferation and migration of endothelial cells. VEGF may be the rate limiting factor in the tumor-related switch to an angiogenic phenotype that is critical for growth and metastasis. Current approaches to target angiogenesis rely on inhibiting growth factors that stimulate vascular endothelial cells or blocking their receptors. VEGF has become a major target of investigation in this area. Bevacizumab is a monoclonal antibody developed against VEGF. Enhanced COX2-induced synthesis of prostaglandins stimulates cancer cell proliferation, promotes angiogenesis, inhibits apoptosis, and increases metastatic potential. In the present study, we aimed to investigate the antiangiogenic and apoptotic effect of Bevacizumab on MDA-MB-231 cell line and changes of VEGF-A, VEGF-C, VEGFR2 and COX-2 mRNA expressions. In our study, cell viability was detected in the MDA-MB-231 cells by XTT assay method and acridin-orange/ethidium bromide staining, for different dosages and incubation time, following Bevacizumab treatment. Quantitative Real-Time PCR method was used for analysis of mRNA expression levels of VEGF-A, VEGF-C, VEGFR2 genes which take part in same signal pathway and COX-2 acting on this pathway. In this study, although COX-2 mRNA expression was higher in breast cancer cells at 24 and 48h, its expression level was low in MDA-MB-231 at 72 and 96h after the 50 ?g/ml dose. VEGF-A, VEGF-C and VEGFR2 mRNA expression level and invasion ability of MDA-MB-231 cells significantly increased at 24, 48 and 72h in a dose dependent manner. VEGF-A, VEGF-C and VEGFR2 mRNA expression and invasion ability of MDA-MB-231 significantly decreased at 96h in a dose dependent manner. Our data suggest that the long-term application of bevacizumab is required for the suppression of angiogenic properties. 134

Tümör anjiyogenezi tümör hücreleri tarafından anjiyogenik faktörlerin salınımı, proteolitik enzimlerin aktivasyonu ve endotelyal hücrelerin proliferasyonu ve göçünü içeren çok aşamalı kompleks bir mekanizmadır. VEGF büyüme ve metastaz için kritik olan anjiyogenik bir fenotipe geçişte sınırlayıcı bir faktördür. Anjiyogenez hedefli son yaklaşımlar vasküler endotelyal hücreleri uyaran faktörlerin ve bunların reseptörlerinin baskılanmasına bağlıdır. VEGF bu alandaki araştırmalarda en önemli hedef moleküllerden biri haline gelmiştir. VEGF ye karşı geliştirilen ilaçlardan biri monoklonal bir antikor olan Bevacizumab dır (Avastin, Altuzan). Prostoglandinlerin COX-2 ile indüklenmiş artışı, anjiyogenez, kanser hücrelerinin çoğalması, apoptozun baskılanması ve metastatik potansiyelin artışını uyarmaktadır. Bu çalışma ile Bevacizumab ın meme kanseri hücre hattı olan MDA-MB-231 üzerindeki antianjiyogenik ve apoptotik etkisi ile VEGF-A, VEGF-C, VEGFR2 ve COX-2 mRNA ifadeleri üzerindeki etkilerinin araştırılması amaçlandı.Çalışmamızda, MDA-MB-231 hücrelerinde, çeşitli doz ve inkübasyon sürelerinde, Bevacizumab uygulanması sonrası, XTT yöntemi ve akridin oranj-etidyum bromür boyamasıyla hücre canlılığı belirlendi. Aynı sinyal iletim yolağında görev alan VEGF-A, VEGF-C, VEGFR2 ve bu yolak üzerine de etki eden COX-2 genlerinin mRNA ifade düzeylerinin belirlenmesi için kantitatif Real-Time PCR yöntemi kullanıldı. Çalışmamızda, Bevacizumab ın etkisiyle 24 ve 48. saatlerde COX-2 ifade düzeyinde artış gözlense de 72 ve 96. saatlerde bu COX-2 ifade oranı 50 μg/ml den sonraki dozlarda düşük düzeylerde seyretmektedir. Anjiyogenezde önemli görevi olduğu bilinen VEGF-A, VEGF-C ve VEGFR2 mRNA ifade düzeylerinin ve invazyon yeteneklerinin 24, 48 ve 72. saattlerde doza bağımlı olarak amlamlı düzeyde arttığı belirlendi. 96. saatte ise VEGF-A, VEGF-C ve VEGFR2 mRNA ifade düzeylerinin ve hücrelerin invazyon yeteneklerinin anlamlı düzeyde azaldığı gözlendi. Elde ettiğimiz veriler, MDA-MB-231 hücrelerinin anjiyogenik özelliklerinin baskılanması için uzun süreli Bevacizumab uygulaması gerektiğini düşündürmektedir. Tumor angiogenesis is a complex mechanism consisting of multi-step events including secretion or activation of angiogenic factors by tumor cells, activation of proteolytic enzymes, proliferation and migration of endothelial cells. VEGF may be the rate limiting factor in the tumor-related switch to an angiogenic phenotype that is critical for growth and metastasis. Current approaches to target angiogenesis rely on inhibiting growth factors that stimulate vascular endothelial cells or blocking their receptors. VEGF has become a major target of investigation in this area. Bevacizumab is a monoclonal antibody developed against VEGF. Enhanced COX2-induced synthesis of prostaglandins stimulates cancer cell proliferation, promotes angiogenesis, inhibits apoptosis, and increases metastatic potential. In the present study, we aimed to investigate the antiangiogenic and apoptotic effect of Bevacizumab on MDA-MB-231 cell line and changes of VEGF-A, VEGF-C, VEGFR2 and COX-2 mRNA expressions. In our study, cell viability was detected in the MDA-MB-231 cells by XTT assay method and acridin-orange/ethidium bromide staining, for different dosages and incubation time, following Bevacizumab treatment. Quantitative Real-Time PCR method was used for analysis of mRNA expression levels of VEGF-A, VEGF-C, VEGFR2 genes which take part in same signal pathway and COX-2 acting on this pathway. In this study, although COX-2 mRNA expression was higher in breast cancer cells at 24 and 48h, its expression level was low in MDA-MB-231 at 72 and 96h after the 50 μg/ml dose. VEGF-A, VEGF-C and VEGFR2 mRNA expression level and invasion ability of MDA-MB-231 cells significantly increased at 24, 48 and 72h in a dose dependent manner. VEGF-A, VEGF-C and VEGFR2 mRNA expression and invasion ability of MDA-MB-231 significantly decreased at 96h in a dose dependent manner. Our data suggest that the long-term application of bevacizumab is required for the suppression of angiogenic properties.