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[SPA] Las plantas han desarrollado una organización compleja para hacer frente a los cambios ambientales, sincronizando sus procesos fisiológicos y metabolismo con la rotación del eje de la Tierra. Este ritmo está regulado por el reloj circadiano, un intrincado sistema basado en un conjunto de genes llamado oscilador, que forma varias respuestas cíclicas de transcripción y traducción. GIGANTEA (GI), una proteína nuclear específica de la planta, es un gen que pertenece al ciclo de la tarde del sistema génico, que regula el ritmo circadiano. Este gen se caracteriza por sus acciones pleiotrópicas, que incluyen el tiempo de floración, el crecimiento y la defensa contra patógenos. Aquí mostramos cómo el silenciamiento específico del gen GI, a través de la técnica de interferencia de ARN, afecta el desarrollo vegetativo en Petunia. [ENG] Plants have developed a complex organization to cope with environmental changes, synchronizing their physiological processes and metabolism with the rotation of the Earth’s axis. This rhythm is regulated by the circadian clock, an intricate system based on a set of genes called the oscillator, forming several feedback loops of transcription and translation. GIGANTEA (GI), a plant-specific nuclear protein, is a gene belonging to the evening loop of the circadian gene regulatory system. This gene is characterized by its pleiotropic actions, including flowering time, growth and defense against pathogens. Here we show how the specific silencing of the GI gene, through the RNA-interference technique, affects the vegetative development in Petunia.

Influenza virus is a globally significant infectious agent with the potential to cause catastrophic pandemic outbreaks. Present treatment of influenza infections is restricted to only four anti-viral drugs, but there are increasing global reports of anti-viral resistance in several seasonal strains and also the 2009 pandemic swine-origin influenza virus H1N1. Possible future pandemic outbreaks, emerging new strains and drug resistance underscore the need to understand this complex virus and its pathogenicity with the goal that novel targets can be uncovered for future therapeutic development. Extensive lung tissue damage during influenza virus infection is proposed to contribute to the development of aberrant host immune responses. Strong evidence now demonstrates the significance of the cellular death pathway in promoting efficient influenza virus replication and disease progression. Viruses rely heavily on the machinery of their host for productive replication, which is also an Achilles’ heel that could be targeted for treatment. In pursuit of unraveling the complex nature of influenza virus replication, I carried out a global shRNA screen to identify specific host factors and signaling pathways that are involved in influenza-induced cell death and replication. In this study I identified 138 genes required for influenza viruses to induce infected host cell death. These genes were found to be involved in Protein Kinase A, NF-kB and PI3K signaling cascades. These signaling pathways are well known regulators of cell death and survival, which suggests influenza viruses may carefully regulate these pathways to reach a balance that suit their requirements for efficient proliferation, eventually at the cost of the host cell. I chose five candidate genes—BAD, MxB, TNFSF12-13,TNFSF13, and USP47—that were associated with apoptosis and the major signaling pathways determined in my network analysis to further verify the genome-wide screen as well as elucidate the role of thes

Influenza virus is a globally significant infectious agent with the potential to cause catastrophic pandemic outbreaks. Present treatment of influenza infections is restricted to only four anti-viral drugs, but there are increasing global reports of anti-viral resistance in several seasonal strains and also the 2009 pandemic swine-origin influenza virus H1N1. Possible future pandemic outbreaks, emerging new strains and drug resistance underscore the need to understand this complex virus and its pathogenicity with the goal that novel targets can be uncovered for future therapeutic development. Extensive lung tissue damage during influenza virus infection is proposed to contribute to the development of aberrant host immune responses. Strong evidence now demonstrates the significance of the cellular death pathway in promoting efficient influenza virus replication and disease progression. Viruses rely heavily on the machinery of their host for productive replication, which is also an Achilles’ heel that could be targeted for treatment. In pursuit of unraveling the complex nature of influenza virus replication, I carried out a global shRNA screen to identify specific host factors and signaling pathways that are involved in influenza-induced cell death and replication. In this study I identified 138 genes required for influenza viruses to induce infected host cell death. These genes were found to be involved in Protein Kinase A, NF-kB and PI3K signaling cascades. These signaling pathways are well known regulators of cell death and survival, which suggests influenza viruses may carefully regulate these pathways to reach a balance that suit their requirements for efficient proliferation, eventually at the cost of the host cell. I chose five candidate genes—BAD, MxB, TNFSF12-13,TNFSF13, and USP47—that were associated with apoptosis and the major signaling pathways determined in my network analysis to further verify the genome-wide screen as well as elucidate the role of thes

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Die Variabilität der Expression und Funktion der P450 Enzyme (CYPs) ist eine der Ursachen dafür, dass bei gleicher Dosierung eines Medikaments Intensität und Dauer von Wirkungen und Nebenwirkungen von Patient zu Patient unterschiedlich sein können. Diese interindividuelle Variabilität der Enzyme lässt sich heute noch nicht lückenlos erklären. Prinzipiell können biologische Faktoren (z.B. Alter, Geschlecht, Hormonstatus), Umweltfaktoren (Ernährung, Rauchen, Arzneimittelinteraktionen) sowie genetische Faktoren, z.B. Polymorphismen, Enzymfunktionen beeinflussen. Um dieser Problematik nachgehen zu können und auf Aktivitätsebene relativ schnell und einfach Unterschiede nachzuweisen, wurde ein LC-MS/MS basierter P450 Cocktail-Assay zur Quantifizierung der sieben wichtigsten Enzymaktivitäten für den Arzneistoffwechsel entwickelt und in humanen Hepatozyten etabliert. Am Beispiel der Arzneistoffgruppe der HMG-CoA Reduktasehemmer (Statine) wurden Untersuchungen der Cytochrom P450 Enzyme durch zeitabhängige Enzyminduktionsprofile mittels Cocktail-Assay und mRNA-Expression gemessen. Das CYP2C8 wurde als neues, von Statinen stark induziertes P450 Enzym identifiziert. Es wurde eine bis zu 20-fache Zunahme der Aktivität durch Atorvastatin und eine ~10-fache Zunahme durch Simvastatin- und Lovastatinbehandlung nachgewiesen. Die Enzyme CYP3A4, CYP2B6 und CYP2C9 zeigten geringere, aber auch deutliche Aktivitätssteigerungen durch die Behandlung mit Atorvastatin und Simvastatin (4 bis 11-fach). Lovastatin und Rosuvastatin hatten geringere Effekte. Die Expression der mRNA entsprach weitestgehend den Beobachtungen der Aktivitäten, wobei jedoch die Auswirkungen dynamischer und drastischer mit wesentlich höheren Induktionsleveln ausfielen. Die Ergebnisse deuten auf einen stärkeren Einfluss der Behandlung mit Statinen auf P450 Expression und Aktivität hin, als bisher angenommen. Dies könnte besonders für die Co-Medikation mit anderen über CYP2C8 metabolisierten Arzneistoffen von entscheidend, The variability of the expression and function of the P450 enzymes (CYPs) is a cause for having different intensities and lengths of effects as well as side effects when patients are given the same dosage of medication. Up to this day, one cannot allover explain this inter individual variability of expression and activity of the enzymes. In general, there are several factors that may affect the variability, including biological factors (such us age, gender, hormonal status), environmental factors (such as nutrition, smoking, medication) as well as genetic factors like polymorphisms In order to solve this problem and to analyze relatively easy and fast activity differences, we developed an LC-MS/MS based P450 activity cocktail assay to quantify and detect simultaneously the seven most important CYPs as judged by their roles in the metabolism of clinically used drugs. The assay was established for use in in human hepatocytes as well as in recombinant and microsomal enzymes. We used the newly developed model-substrate cocktail assay to analyze the time-dependent induction of seven drug metabolizing cytochrome P450 activities as response to treatment of primary human hepatocytes with different statins. The strongest induction was observed for amodiaquine N-desalkylation of CYP2C8, which was induced up to 20-fold by atorvastatin and approximately 10-fold by simvastatin and lovastatin. Enzymes CYP3A4, CYP2B6 and 2C9 showed lower, but also significant induction after treatment with atorvastatin and simvastatin (4-11-fold). lovastatin and rosuvastatin demonstrated minor effects. Quantitative RT-PCR confirmed corresponding changes on the mRNA level with even more dramatic induction up to almost 100-fold. These data suggest a broader inducing effect of statins on cytochrome P450 expression and activity than previously known, thus further emphasizing their drug-drug interaction potential, especially for CYP2C8. Based on correlation analysis with P450 enzyme activity to their s

Hintergrund: Der Transkriptionsfaktor GATA-4 ist für die normale Entwicklung des Endoderms essentiell. Mausmutanten mit einer homozygoten Deletion des gata-4 Gens versterben zwischen den embryonalen Tagen 8.5 - 10.5 aufgrund einer Störung der ventralen Morphogenese und der Ausbildung des Herzschlauches. Zielsetzung und experimentelle Strategie: Um die Bedeutung von GATA-4 auch nach der embryonalen Entwicklung untersuchen zu können, wurden doppelt-transgene Mäuse generiert. Diese Mausmutanten exprimieren einen Tetrazyklin-Repressor und eine gegen GATA-4 gerichtete short hairpin RNA (shGATA-4). Die Expression der shGATA-4 steht dabei unter der Kontrolle eines H1-Promotors, welcher durch ein Tetrazyklin-Operator Element modifiziert wurde. Dadurch ist das System durch Doxyzyklin induzierbar. Ergebnisse: Die Integration der Transgene in dem Genom der Maus wurde durch Southern-Blot Analyse nachgewiesen. Die Expression der shGATA-4 wurde durch die Applikation von Doxyzyklin über das Trinkwasser (20 mg/ml) induziert. Langzeitstudien am Herzen haben dabei eine signifikante Suppression von GATA-4 nach 38 Tagen ergeben (80 %). Diese Reduktion konnte durch Western-Blot Analyse bestätigt werden. Obwohl die Expression verschiedener Zielgene von GATA-4 (ANF, BMP-4) ebenfalls herunterreguliert war, fiel bei den transgenen Mäusen kein kardialer Phänotyp auf. Jedoch wurde die GATA-4 Expression in den Hoden und Ovarien transgener Mäuse supprimiert, nachdem shGATA-4 durch die Applikation von Doxyzyklin induziert wurde. Weiterführende Untersuchungen an adulten Mäusen zeigten eine GATA-4 Reduktion von 20 % auch in nicht mit Doxyzyklin-induzierten Mausmutanten. Diese Reduktion könnte durch einen sog. leaky-Effekt des shGATA-4 Transgens hervorgerufen worden sein, wodurch die stark eingeschränkte Fertilität dieser Mauslinie erklärt werden könnte. Interessanterweise haben ca. 10 % der mit Doxyzyklin behandelten transgenen Weibchen Ovarial-Teratome ausgebildet. Histologisch wiesen diese Terat, Background: The transcription factor GATA-4 is crucial for the normal endodermal development. In mice, homozygous deficiency of GATA-4 causes defects in ventral morphogenesis and heart tube formation, resulting in embryonic death between day e8.5 and e10.5. Aim and experimental strategy: To analyze the implication of GATA-4 beyond embryonic development a double transgenic mouse expressing the tetracycline repressor (TetR) and an inducible small interfering RNA directed against GATA-4 was generated. This expression construct contains a H1 promoter modified with a tetracycline operator upstream of the coding region for the GATA-4 short hairpin RNA (shGATA-4). Results: The integration of the transgenes in FvB mice (H1:G4/TetR) was confirmed by Southern blot. To induce the expression of the shGATA-4 construct, transgenic mice were treated with doxycycline (20 mg/ml drinking water). In longitudinal analysis, most efficient GATA-4 suppression was detected after 38 days. Quantitative PCR revealed a GATA-4 reduction of about 80 % in the heart, if normalized against the wildtype. Reduction of GATA-4 was confirmed by Western Blot. Although GATA-4 target genes (ANP, BMP-4) were down regulated, the animals showed no clinical phenotype. In opposite to wildtype mice, GATA-4 expression was undetectable in the ovaries and testis of transgenic mice with induced shGATA-4. Additional analysis in adult transgenic mice, which were not treated with doxycycline, also showed a reduction of GATA-4 expression of about 20 %, probably caused by a leaky-effect of the transgene. This may explain the significantly reduced fertility of the colony. Importantly, 10 % of transgenic females treated with doxycycline developed ovarian teratomas. Histological examination of teratomas showed predominantly (neuro-) ectodermal and to a lower degree mesodermal, but almost no endodermal compounds. Conclusions: GATA-4 reduction in the adult murine heart is – at least to a certain degree – clinically redundant.

Hintergrund: Der Transkriptionsfaktor GATA-4 ist für die normale Entwicklung des Endoderms essentiell. Mausmutanten mit einer homozygoten Deletion des gata-4 Gens versterben zwischen den embryonalen Tagen 8.5 - 10.5 aufgrund einer Störung der ventralen Morphogenese und der Ausbildung des Herzschlauches. Zielsetzung und experimentelle Strategie: Um die Bedeutung von GATA-4 auch nach der embryonalen Entwicklung untersuchen zu können, wurden doppelt-transgene Mäuse generiert. Diese Mausmutanten exprimieren einen Tetrazyklin-Repressor und eine gegen GATA-4 gerichtete short hairpin RNA (shGATA-4). Die Expression der shGATA-4 steht dabei unter der Kontrolle eines H1-Promotors, welcher durch ein Tetrazyklin-Operator Element modifiziert wurde. Dadurch ist das System durch Doxyzyklin induzierbar. Ergebnisse: Die Integration der Transgene in dem Genom der Maus wurde durch Southern-Blot Analyse nachgewiesen. Die Expression der shGATA-4 wurde durch die Applikation von Doxyzyklin über das Trinkwasser (20 mg/ml) induziert. Langzeitstudien am Herzen haben dabei eine signifikante Suppression von GATA-4 nach 38 Tagen ergeben (80 %). Diese Reduktion konnte durch Western-Blot Analyse bestätigt werden. Obwohl die Expression verschiedener Zielgene von GATA-4 (ANF, BMP-4) ebenfalls herunterreguliert war, fiel bei den transgenen Mäusen kein kardialer Phänotyp auf. Jedoch wurde die GATA-4 Expression in den Hoden und Ovarien transgener Mäuse supprimiert, nachdem shGATA-4 durch die Applikation von Doxyzyklin induziert wurde. Weiterführende Untersuchungen an adulten Mäusen zeigten eine GATA-4 Reduktion von 20 % auch in nicht mit Doxyzyklin-induzierten Mausmutanten. Diese Reduktion könnte durch einen sog. leaky-Effekt des shGATA-4 Transgens hervorgerufen worden sein, wodurch die stark eingeschränkte Fertilität dieser Mauslinie erklärt werden könnte. Interessanterweise haben ca. 10 % der mit Doxyzyklin behandelten transgenen Weibchen Ovarial-Teratome ausgebildet. Histologisch wiesen diese Terat, Background: The transcription factor GATA-4 is crucial for the normal endodermal development. In mice, homozygous deficiency of GATA-4 causes defects in ventral morphogenesis and heart tube formation, resulting in embryonic death between day e8.5 and e10.5. Aim and experimental strategy: To analyze the implication of GATA-4 beyond embryonic development a double transgenic mouse expressing the tetracycline repressor (TetR) and an inducible small interfering RNA directed against GATA-4 was generated. This expression construct contains a H1 promoter modified with a tetracycline operator upstream of the coding region for the GATA-4 short hairpin RNA (shGATA-4). Results: The integration of the transgenes in FvB mice (H1:G4/TetR) was confirmed by Southern blot. To induce the expression of the shGATA-4 construct, transgenic mice were treated with doxycycline (20 mg/ml drinking water). In longitudinal analysis, most efficient GATA-4 suppression was detected after 38 days. Quantitative PCR revealed a GATA-4 reduction of about 80 % in the heart, if normalized against the wildtype. Reduction of GATA-4 was confirmed by Western Blot. Although GATA-4 target genes (ANP, BMP-4) were down regulated, the animals showed no clinical phenotype. In opposite to wildtype mice, GATA-4 expression was undetectable in the ovaries and testis of transgenic mice with induced shGATA-4. Additional analysis in adult transgenic mice, which were not treated with doxycycline, also showed a reduction of GATA-4 expression of about 20 %, probably caused by a leaky-effect of the transgene. This may explain the significantly reduced fertility of the colony. Importantly, 10 % of transgenic females treated with doxycycline developed ovarian teratomas. Histological examination of teratomas showed predominantly (neuro-) ectodermal and to a lower degree mesodermal, but almost no endodermal compounds. Conclusions: GATA-4 reduction in the adult murine heart is – at least to a certain degree – clinically redundant.

Mehrere Studien haben gezeigt, daß die Cyclooxygenase-2 (COX-2) eine bedeutende Rolle sowohl bei Entstehung als auch Progression maligner Tumoren spielt. COX-2-Inhibitoren werden bereits in klinischen Studien zur Krebstherapie getestet. COX-2 ist die induzierbare Isoform der Cyclooxygenase - dem Schlüsselenzym der Synthese von Prostaglandinen und anderen Eicosanoiden. Im Tier- und Zellkulturmodell konnten COX-Hemmer anti-Tumor-Effekte hervorrufen. Es ist jedoch unklar, ob diese Effekte durch Hemmung des COX-Enzyms oder durch COX-unabhängige Mechanismen vermittelt werden. Wir untersuchten daher die Auswirkung der COX-Inhibition zum einen durch den selektiven COX-2-Hemmer NS-398 sowie zum anderen durch COX-Isoform-spezifische RNA-Interferenz (RNAi) in zwei humanen Ovarialkarzinomzellinien (OVCAR-3 und SKOV-3). OVCAR-3 zeigte eine konstitutive COX-1-Expression und eine durch IL-1beta induzierbare COX-2-Expression. SKOV-3 war COX-1- und COX-2-negativ. IL-1beta führte bei OVCAR-3 zu einer vermehrten Produktion von Prostaglandin E2 (PGE2), die durch eine gegen die COX-2 gerichtete siRNA gehemmt werden konnte, wohingegen COX-1-siRNA keinen Effekt hatte. Das deutet darauf hin, daß die COX-2 die Hauptquelle von PGE2 in OVCAR-3 ist. 1mikroM NS-398 waren ausreichend, um die PGE2-Produktion und somit auch die COX-2 in OVCAR-3 zu inhibieren. Höhere Konzentrationen NS-398 (>10mikroM) hatten einen antiproliferativen Effekt. Auch in der COX-2-negativen Zellinie SKOV-3 trat diese Wachstumshemmung auf; sie war nicht durch exogene Zufuhr von PGE2 (10mikroM) reversibel. Durchflußzytometrische Zellzyklusanalyse ergab, daß der Wachstumshemmung in beiden Zellinien ein G0/G1-Zellzyklusarrest zugrunde liegt. Dagegen führten weder COX-1- noch COX-2-Ausschaltung durch RNAi zu ähnlichen Auswirkungen auf Proliferation bzw. Zellzyklus. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein COX-2-unabhängiger Mechanismus für den durch NS-398 induzierten G0/G1-Arrest verantwortlich ist., Several studies have provided evidence that the enzyme Cyclooxygenase-2 (COX-2) plays an important role in tumor development and progression. COX-2-inhibitors are already evaluated in clinical trials as cancer therapeutics. COX-2 is the inducible isoform of cyclooxygenase - the rate-limiting enzyme in the synthesis of prostaglandins and other eicosanoids. COX-inhibitors cause antitumor effects in animal models and in cell culture experiments. However, it is not clear, whether these effects are due to inhibition of the COX-enzyme or mediated via a COX-independent mechanism. We therefore investigated the effects of COX inhibition by the selective COX-2-inhibitor NS-398, as well as by COX-isoform specific RNA interference (RNAi) in the human ovarian carcinoma cell lines OVCAR-3 and SKOV-3. OVCAR-3 cells showed a constitutive expression of COX-1, and an inducible COX-2 expression. COX-2 was induced through stimulation with Interleukin-1beta, leading to production of high levels of Prostaglandin E2 (PGE2). SKOV-3 cells were negative for both COX isoforms. Selective COX-2-suppression by RNAi reduced PGE2 production in OVCAR-3, whereas COX-1-siRNA had no effect on PGE2 synthesis. Thus, COX-2 is the main source of PGE2 in OVCAR-3 cells. In these cells, 1microM NS-398 was sufficient to completely inhibit PGE2-synthesis - and thus the activity of the COX-2 enzyme. Increasing amounts of NS-398 (>10microM) had an antiproliferative effect. This growth inhibition was also observed in the COX-negative cell line SKOV-3, it could not be reverted by exogenous addition of PGE2 (10microM). Flowcytometric analysis of the cell cycle revealed that this growth inhibition was based on a G0/G1-cell-cycle-arrest. In contrast, suppression of COX-1 or COX-2 by RNAi had no effect on proliferation or cell cycle progression. These results suggest that a COX-independent mechanism is responsible for the G0/G1-arrest induced by NS-398.

Mehrere Studien haben gezeigt, daß die Cyclooxygenase-2 (COX-2) eine bedeutende Rolle sowohl bei Entstehung als auch Progression maligner Tumoren spielt. COX-2-Inhibitoren werden bereits in klinischen Studien zur Krebstherapie getestet. COX-2 ist die induzierbare Isoform der Cyclooxygenase - dem Schlüsselenzym der Synthese von Prostaglandinen und anderen Eicosanoiden. Im Tier- und Zellkulturmodell konnten COX-Hemmer anti-Tumor-Effekte hervorrufen. Es ist jedoch unklar, ob diese Effekte durch Hemmung des COX-Enzyms oder durch COX-unabhängige Mechanismen vermittelt werden. Wir untersuchten daher die Auswirkung der COX-Inhibition zum einen durch den selektiven COX-2-Hemmer NS-398 sowie zum anderen durch COX-Isoform-spezifische RNA-Interferenz (RNAi) in zwei humanen Ovarialkarzinomzellinien (OVCAR-3 und SKOV-3). OVCAR-3 zeigte eine konstitutive COX-1-Expression und eine durch IL-1beta induzierbare COX-2-Expression. SKOV-3 war COX-1- und COX-2-negativ. IL-1beta führte bei OVCAR-3 zu einer vermehrten Produktion von Prostaglandin E2 (PGE2), die durch eine gegen die COX-2 gerichtete siRNA gehemmt werden konnte, wohingegen COX-1-siRNA keinen Effekt hatte. Das deutet darauf hin, daß die COX-2 die Hauptquelle von PGE2 in OVCAR-3 ist. 1mikroM NS-398 waren ausreichend, um die PGE2-Produktion und somit auch die COX-2 in OVCAR-3 zu inhibieren. Höhere Konzentrationen NS-398 (>10mikroM) hatten einen antiproliferativen Effekt. Auch in der COX-2-negativen Zellinie SKOV-3 trat diese Wachstumshemmung auf; sie war nicht durch exogene Zufuhr von PGE2 (10mikroM) reversibel. Durchflußzytometrische Zellzyklusanalyse ergab, daß der Wachstumshemmung in beiden Zellinien ein G0/G1-Zellzyklusarrest zugrunde liegt. Dagegen führten weder COX-1- noch COX-2-Ausschaltung durch RNAi zu ähnlichen Auswirkungen auf Proliferation bzw. Zellzyklus. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein COX-2-unabhängiger Mechanismus für den durch NS-398 induzierten G0/G1-Arrest verantwortlich ist., Several studies have provided evidence that the enzyme Cyclooxygenase-2 (COX-2) plays an important role in tumor development and progression. COX-2-inhibitors are already evaluated in clinical trials as cancer therapeutics. COX-2 is the inducible isoform of cyclooxygenase - the rate-limiting enzyme in the synthesis of prostaglandins and other eicosanoids. COX-inhibitors cause antitumor effects in animal models and in cell culture experiments. However, it is not clear, whether these effects are due to inhibition of the COX-enzyme or mediated via a COX-independent mechanism. We therefore investigated the effects of COX inhibition by the selective COX-2-inhibitor NS-398, as well as by COX-isoform specific RNA interference (RNAi) in the human ovarian carcinoma cell lines OVCAR-3 and SKOV-3. OVCAR-3 cells showed a constitutive expression of COX-1, and an inducible COX-2 expression. COX-2 was induced through stimulation with Interleukin-1beta, leading to production of high levels of Prostaglandin E2 (PGE2). SKOV-3 cells were negative for both COX isoforms. Selective COX-2-suppression by RNAi reduced PGE2 production in OVCAR-3, whereas COX-1-siRNA had no effect on PGE2 synthesis. Thus, COX-2 is the main source of PGE2 in OVCAR-3 cells. In these cells, 1microM NS-398 was sufficient to completely inhibit PGE2-synthesis - and thus the activity of the COX-2 enzyme. Increasing amounts of NS-398 (>10microM) had an antiproliferative effect. This growth inhibition was also observed in the COX-negative cell line SKOV-3, it could not be reverted by exogenous addition of PGE2 (10microM). Flowcytometric analysis of the cell cycle revealed that this growth inhibition was based on a G0/G1-cell-cycle-arrest. In contrast, suppression of COX-1 or COX-2 by RNAi had no effect on proliferation or cell cycle progression. These results suggest that a COX-independent mechanism is responsible for the G0/G1-arrest induced by NS-398.

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Der "klassische" Importweg von Proteinen wie Transkriptionsfaktoren, Kernrezeptoren oder viralen Proteinen in den Zellkern erfolgt in Abhängigkeit der Importine alpha und beta. Während nur ein Importin beta existiert, waren zu Beginn der Arbeiten zwei humane alpha-Importine bekannt. In der vorliegenden Arbeit wird die Identifikation, Klonierung und funktionelle Charakterisierung von vier neuen humanen alpha-Importinen beschrieben. Anhand ihrer Primärstruktur wurden die sechs alpha-Importine in drei Subfamilien unterteilt. Um die Hypothese zu testen, dass die verschiedenen Importin alpha Isoformen spezifische Funktionen ausüben und sich nicht vollständig gegenseitig ersetzen können, wurde zunächst ihre Expression auf RNA- und Proteinebene analysiert. Hier ließen sich differentielle Expressionsmuster in verschiedenen humanen Zellen und Geweben nachweisen. In vitro Analysen mit rekombinant exprimierten und aufgereinigten Proteinen deuteten daraufhin, dass die neu identifizierten Isoformen tatsächliche Importfunktion besitzen, dass sich jedoch die verschiedenen alpha-Importine in ihren Substratspezifitäten unterscheiden. Verschiedene neue Substrate der alpha-Importine wurden identifiziert und deren Importwege im Detail analysiert. Unterschiede in der Regulation der Expression der alpha-Importine in Abhängigkeit von Zellproliferation, Zelldifferenzierung bzw. in unterschiedlichen Diabetesmodellen der Ratte deuteten ebenfalls auf spezifische Funktionen der verschiedenen Isoformen hin. Die spezifische Inhibition der Importin alpha Expression in kultivierten HeLa-Zellen mittels RNA-Interferenz führte bei den meisten Isoformen zu einer ausgeprägten Inhibition der Zellproliferation, wodurch erstmals der Nachweis essentieller Funktionen verschiedener alpha-Importine in lebenden humanen Zellen erbracht wurde. In weiterführenden Experimenten sollen die Ursachen für die Inhibition der Zellproliferation bei Importin alpha-Mangel geklärt und die Bedeutung der unterschiedlichen alph, The "classical" import of proteins like transcription factors, nuclear receptors or viral proteins into the nucleus depends on importins alpha and beta. While only one importin beta is known, two human alpha-importins had been described. In this study the identification, cloning and functional characterisation of four novel human alpha-importins is reported. Based on their primary structures the human alpha-importins can be grouped into three distinct subfamilies. To test the hypothesis that the various alpha-Importins differ in their specific functions and cannot substitute for each other first their expression at the RNA- and protein levels were analyzed. Differential expression patterns in various human cells and tissues could be demonstrated. In vitro analyses using recombinantly expressed and purified proteins indicated, that the newly identified isoforms posses import functions in deed. However, there was evidence for differences in their substrate specific import efficacies. New substrates of the alpha-importins were identified and their import pathways analyzed in detail. Differences in the expression regulation of the alpha-importins depending on cellular proliferation and differentiation as well as in different rat models of diabetes further pointed towards specific functions of the various alpha-importins. Specific expression inhibition of several isoforms of the importin alpha protein family in cultured HeLa-cells using RNA-interference technology caused a strong inhibition of cellular proliferation. This is the first proof for essential functions of different alpha-importins in living human cells. Future experiments shall identify the mechanisms involved in the cellular proliferation inhibition due to importin a deficiency and further analyze the role of the different alpha-importins in vivo.

Der "klassische" Importweg von Proteinen wie Transkriptionsfaktoren, Kernrezeptoren oder viralen Proteinen in den Zellkern erfolgt in Abhängigkeit der Importine alpha und beta. Während nur ein Importin beta existiert, waren zu Beginn der Arbeiten zwei humane alpha-Importine bekannt. In der vorliegenden Arbeit wird die Identifikation, Klonierung und funktionelle Charakterisierung von vier neuen humanen alpha-Importinen beschrieben. Anhand ihrer Primärstruktur wurden die sechs alpha-Importine in drei Subfamilien unterteilt. Um die Hypothese zu testen, dass die verschiedenen Importin alpha Isoformen spezifische Funktionen ausüben und sich nicht vollständig gegenseitig ersetzen können, wurde zunächst ihre Expression auf RNA- und Proteinebene analysiert. Hier ließen sich differentielle Expressionsmuster in verschiedenen humanen Zellen und Geweben nachweisen. In vitro Analysen mit rekombinant exprimierten und aufgereinigten Proteinen deuteten daraufhin, dass die neu identifizierten Isoformen tatsächliche Importfunktion besitzen, dass sich jedoch die verschiedenen alpha-Importine in ihren Substratspezifitäten unterscheiden. Verschiedene neue Substrate der alpha-Importine wurden identifiziert und deren Importwege im Detail analysiert. Unterschiede in der Regulation der Expression der alpha-Importine in Abhängigkeit von Zellproliferation, Zelldifferenzierung bzw. in unterschiedlichen Diabetesmodellen der Ratte deuteten ebenfalls auf spezifische Funktionen der verschiedenen Isoformen hin. Die spezifische Inhibition der Importin alpha Expression in kultivierten HeLa-Zellen mittels RNA-Interferenz führte bei den meisten Isoformen zu einer ausgeprägten Inhibition der Zellproliferation, wodurch erstmals der Nachweis essentieller Funktionen verschiedener alpha-Importine in lebenden humanen Zellen erbracht wurde. In weiterführenden Experimenten sollen die Ursachen für die Inhibition der Zellproliferation bei Importin alpha-Mangel geklärt und die Bedeutung der unterschiedlichen alph, The "classical" import of proteins like transcription factors, nuclear receptors or viral proteins into the nucleus depends on importins alpha and beta. While only one importin beta is known, two human alpha-importins had been described. In this study the identification, cloning and functional characterisation of four novel human alpha-importins is reported. Based on their primary structures the human alpha-importins can be grouped into three distinct subfamilies. To test the hypothesis that the various alpha-Importins differ in their specific functions and cannot substitute for each other first their expression at the RNA- and protein levels were analyzed. Differential expression patterns in various human cells and tissues could be demonstrated. In vitro analyses using recombinantly expressed and purified proteins indicated, that the newly identified isoforms posses import functions in deed. However, there was evidence for differences in their substrate specific import efficacies. New substrates of the alpha-importins were identified and their import pathways analyzed in detail. Differences in the expression regulation of the alpha-importins depending on cellular proliferation and differentiation as well as in different rat models of diabetes further pointed towards specific functions of the various alpha-importins. Specific expression inhibition of several isoforms of the importin alpha protein family in cultured HeLa-cells using RNA-interference technology caused a strong inhibition of cellular proliferation. This is the first proof for essential functions of different alpha-importins in living human cells. Future experiments shall identify the mechanisms involved in the cellular proliferation inhibition due to importin a deficiency and further analyze the role of the different alpha-importins in vivo.