Search

One of the fastest developing fields of biotechnology in the past three decades is that of genetically modified (GM) plants for industrial applications, as well as food and feed. The European Union (EU) has probably the most rigorous regulations for GMOs in the world and as such, the decisions made by the EU political institutions on regulatory and marketing actions heavily depend on scientific evidence. This doctoral dissertation deals with the molecular biology laboratory methods based on the most popular to date method polymerase chain reaction (PCR) used in the molecular characterization of the genetically modified organisms (GMOs). When studying the molecular structure of the GMO, two main interests of the nucleotide sequence are: (1) the actual sequence of the transgenic insert, and (2) the plant genomic DNA surrounding the synthetic DNA. Two distinct techniques of the Long Template PCR and Genome Walking were analyzed on the GMO DNA matrices. The LT-PCR was applied to obtain single uninterrupted fragment containing full transgenic insert of the selected GM events. The analysis of LT-PCR was continued with the application of a novel PCR additive called carbon nanotubes (CNTs) to investigate the impact of this nanomaterial on the specificity, efficiency and the product yield. The Genome Walking is a technique to obtain unknown DNA fragments adjacent to the known DNA. This doctoral dissertation seeks to explain in detail the development and optimization of a method Long... [to full text], Viena iš greičiausiai besivystančių biotechnologijos mokslo sričių pastaruosius tris dešimtmečius yra genetiškai modifikuotų (GM) augalų kūrimas ir jų naudojimas pramonėje, maistui ir pašarams. Europos Sąjunga turi bene griežčiausią GMO reglamentavimą visame pasaulyje, t.y. visi politiniai sprendimai dėl transgeninių augalų patekimo į rinką yra pagrįsti mokslinių tyrimų rezultatais. Šioje disertacijoje apžvelgiami populiariausiu molekulinės biologijos metodu, polimerazine grandinine reakcija (PGR), grįstos technologijos genetiškai modifikuotų organizmų (GMO) tyrimams. Tiriant molekulinę GMO struktūrą, didžiausias dėmesys yra kreipiamas į šių nukleotidinių sekų aptikimą: (1) transgeninio intarpo, bei (2) augalo genomo sekų aplink transgeninio intarpo įsiterpimo vietą. Naudojant GMO DNR matricas, buvo tirtos dvi skirtingos technologijos: ilgagrandė PGR (I-PGR) ir „pasivaikščiojimas genomu“ (PG). I-PGR metodu buvo siekiama nukopijuoti ir pagausinti vienalytį DNR fragmentą, kuriame būtų nukopijuotas visas transgeninis intarpas. Šio metodo taikymo tyrimas buvo tęsiamas ištiriant naujovišką PGR priedą, anglies nanovamzdelius (ANV). Šis reakcijos mišinio priedas, manoma, yra potencialus reakcijos specifiškumo ir efektyvumo stipriklis. PG yra technologija, įgalinanti nežinomų DNR sekų, prisijungusių prie žinomų sekų, aptikimą. Šioje daktaro disertacijoje smulkiai aprašomas PG metodo, kurį pavadinome LT-RADE, kūrimas ir optimalių reakcijų sąlygų parinkimas. Taip pat, sėkmingas metodo... [toliau žr. visą tekstą]

Viena iš greičiausiai besivystančių biotechnologijos mokslo sričių pastaruosius tris dešimtmečius yra genetiškai modifikuotų (GM) augalų kūrimas ir jų naudojimas pramonėje, maistui ir pašarams. Europos Sąjunga turi bene griežčiausią GMO reglamentavimą visame pasaulyje, t.y. visi politiniai sprendimai dėl transgeninių augalų patekimo į rinką yra pagrįsti mokslinių tyrimų rezultatais. Šioje disertacijoje apžvelgiami populiariausiu molekulinės biologijos metodu, polimerazine grandinine reakcija (PGR), grįstos technologijos genetiškai modifikuotų organizmų (GMO) tyrimams. Tiriant molekulinę GMO struktūrą, didžiausias dėmesys yra kreipiamas į šių nukleotidinių sekų aptikimą: (1) transgeninio intarpo, bei (2) augalo genomo sekų aplink transgeninio intarpo įsiterpimo vietą. Naudojant GMO DNR matricas, buvo tirtos dvi skirtingos technologijos: ilgagrandė PGR (I-PGR) ir „pasivaikščiojimas genomu“ (PG). I-PGR metodu buvo siekiama nukopijuoti ir pagausinti vienalytį DNR fragmentą, kuriame būtų nukopijuotas visas transgeninis intarpas. Šio metodo taikymo tyrimas buvo tęsiamas ištiriant naujovišką PGR priedą, anglies nanovamzdelius (ANV). Šis reakcijos mišinio priedas, manoma, yra potencialus reakcijos specifiškumo ir efektyvumo stipriklis. PG yra technologija, įgalinanti nežinomų DNR sekų, prisijungusių prie žinomų sekų, aptikimą. Šioje daktaro disertacijoje smulkiai aprašomas PG metodo, kurį pavadinome LT-RADE, kūrimas ir optimalių reakcijų sąlygų parinkimas. Taip pat, sėkmingas metodo... [toliau žr. visą tekstą], One of the fastest developing fields of biotechnology in the past three decades is that of genetically modified (GM) plants for industrial applications, as well as food and feed. The European Union (EU) has probably the most rigorous regulations for GMOs in the world and as such, the decisions made by the EU political institutions on regulatory and marketing actions heavily depend on scientific evidence. This doctoral dissertation deals with the molecular biology laboratory methods based on the most popular to date method polymerase chain reaction (PCR) used in the molecular characterization of the genetically modified organisms (GMOs). When studying the molecular structure of the GMO, two main interests of the nucleotide sequence are: (1) the actual sequence of the transgenic insert, and (2) the plant genomic DNA surrounding the synthetic DNA. Two distinct techniques of the Long Template PCR and Genome Walking were analyzed on the GMO DNA matrices. The LT-PCR was applied to obtain single uninterrupted fragment containing full transgenic insert of the selected GM events. The analysis of LT-PCR was continued with the application of a novel PCR additive called carbon nanotubes (CNTs) to investigate the impact of this nanomaterial on the specificity, efficiency and the product yield. The Genome Walking is a technique to obtain unknown DNA fragments adjacent to the known DNA. This doctoral dissertation seeks to explain in detail the development and optimization of a method Long... [to full text]

Restrikcijos endonukleazės (REazės) – tai fermentai, kurie dėl savo ypatingo specifiškumo DNR taikiniui sulaukė plataus pritaikymo kaip DNR manipuliacijų in vitro ir genų inžinerijos įrankis. Kristalografiniais metodais nustatomos trimatės REazių atomų koordinačių struktūros (toliau – struktūros) padeda atskleisti, kaip skirtingos struktūrinės sanklodos yra pritaikytos restrikcijos endonukleazių funkcijai atlikti. Disertacijoje pristatomo darbo tikslas – kristalografiniais bei biocheminiais metodais ištirti specifiškumo-struktūros sąryšį PD-(D/E)XK ir fosfolipazių D (PLD) superšeimoms priklausantiems restrikcijos fermentams. Savo darbo objektais pasirinkome PD-(D/E)XK superšeimos Cfr10I/NgoMIV/Bse634I pogrupiui priklausančias REazes Bse634I ir EcoRII, bei PLD superšeimos fermentą BfiI. Disertacijoje pristatomos REazės Bse634I mutanto R226A komplekso su alternatyviais taikiniais 5'-ACCGGT ir 5'-GCCGGC struktūros atskleidė, kad Bse634I specifiškumą RCCGGY taikiniui lemia tiesioginio bei netiesioginio atpažinimo mechanizmai. REazės EcoRII N- ir C-galinių domenų kompleksų su specifine DNR struktūros iliustruoja du skirtingus taikinio 5'-CCWGG atpažinimo mechanizmus. EcoRII C-galinis domenas (EcoRII-C) išsuka centrinius A/T nukleotidus iš DNR duplekso. Ši deformacija leidžia fermentui panaudoti Cfr10I/NgoMIV/Bse634I REazių pogrupiui būdingus simetrinius konservatyvius struktūrinius elementus 5'-CCGG sekos atpažinimui. EcoRII N-galinio domeno (EcoRII-N) struktūra yra pirmas B3... [toliau žr. visą tekstą], Due to their unique specificity, restriction endonucleases (REases) have gained widespread application as indispensable tools for in vitro manipulation and cloning of DNA. Delineation of the repertoire of the protein folds, providing three-dimensional portraits of the REases by crystallographic methods, should reveal how different folds are tailored to function as restriction enzymes. The major goal of this work was to explore the specificity‑structure relationships within PD‑(D/E)XK and phospholipase D superfamily enzymes using a combination of the crystallographic and biochemical methods. More specifically, we have focused on the Bse634I and EcoRII restriction enzymes belonging to the Cfr10I/NgoMIV/Bse634I branch of PD‑(D/E)XK superfamily, and BfiI REase of PLD superfamily. Dissertation presents the crystal structure of the Bse634I REase mutant (R226A) complexed with two alternative target sites 5'‑ACCGGT and 5'‑GCCGGC, respectively. The analysis of the crystal structures revealed for the first time that the degenerate base pairs recognition by Bse634I is achieved through the combination of direct and indirect readout mechanisms. The crystal structures of the N‑ and C‑terminal domains of EcoRII solved in the DNA bound form revealed different structural mechanisms used for the recognition of the same target sequence 5'‑CCWGG. The first structural evidence has been provided that the C‑terminal domain of EcoRII (EcoRII-C) flips out the central nucleotides A/T while interacting... [to full text]

Due to their unique specificity, restriction endonucleases (REases) have gained widespread application as indispensable tools for in vitro manipulation and cloning of DNA. Delineation of the repertoire of the protein folds, providing three-dimensional portraits of the REases by crystallographic methods, should reveal how different folds are tailored to function as restriction enzymes. The major goal of this work was to explore the specificity-structure relationships within PD-(D/E)XK and phospholipase D superfamily enzymes using a combination of the crystallographic and biochemical methods. More specifically, we have focused on the Bse634I and EcoRII restriction enzymes belonging to the Cfr10I/NgoMIV/Bse634I branch of PD-(D/E)XK superfamily, and BfiI REase of PLD superfamily. Dissertation presents the crystal structure of the Bse634I REase mutant (R226A) complexed with two alternative target sites 5'-ACCGGT and 5'-GCCGGC, respectively. The analysis of the crystal structures revealed for the first time that the degenerate base pairs recognition by Bse634I is achieved through the combination of direct and indirect readout mechanisms. The crystal structures of the N- and C-terminal domains of EcoRII solved in the DNA bound form revealed different structural mechanisms used for the recognition of the same target sequence 5'-CCWGG. The first structural evidence has been provided that the C-terminal domain of EcoRII (EcoRII-C) flips out the central nucleotides A/T while interacting... [to full text], Restrikcijos endonukleazės (REazės) – tai fermentai, kurie dėl savo ypatingo specifiškumo DNR taikiniui sulaukė plataus pritaikymo kaip DNR manipuliacijų in vitro ir genų inžinerijos įrankis. Kristalografiniais metodais nustatomos trimatės REazių atomų koordinačių struktūros (toliau – struktūros) padeda atskleisti, kaip skirtingos struktūrinės sanklodos yra pritaikytos restrikcijos endonukleazių funkcijai atlikti. Disertacijoje pristatomo darbo tikslas – kristalografiniais bei biocheminiais metodais ištirti specifiškumo-struktūros sąryšį PD-(D/E)XK ir fosfolipazių D (PLD) superšeimoms priklausantiems restrikcijos fermentams. Savo darbo objektais pasirinkome PD-(D/E)XK superšeimos Cfr10I/NgoMIV/Bse634I pogrupiui priklausančias REazes Bse634I ir EcoRII, bei PLD superšeimos fermentą BfiI. Disertacijoje pristatomos REazės Bse634I mutanto R226A komplekso su alternatyviais taikiniais 5'-ACCGGT ir 5'-GCCGGC struktūros atskleidė, kad Bse634I specifiškumą RCCGGY taikiniui lemia tiesioginio bei netiesioginio atpažinimo mechanizmai. REazės EcoRII N- ir C-galinių domenų kompleksų su specifine DNR struktūros iliustruoja du skirtingus taikinio 5'-CCWGG atpažinimo mechanizmus. EcoRII C-galinis domenas (EcoRII-C) išsuka centrinius A/T nukleotidus iš DNR duplekso. Ši deformacija leidžia fermentui panaudoti Cfr10I/NgoMIV/Bse634I REazių pogrupiui būdingus simetrinius konservatyvius struktūrinius elementus 5'-CCGG sekos atpažinimui. EcoRII N-galinio domeno (EcoRII-N) struktūra yra pirmas B3... [toliau žr. visą tekstą]