Development, optimization and application of PCR-based methods for molecular characterization of transgenic inserts in genetically modified plants

One of the fastest developing fields of biotechnology in the past three decades is that of genetically modified (GM) plants for industrial applications, as well as food and feed. The European Union (EU) has probably the most rigorous regulations for GMOs in the world and as such, the decisions made by the EU political institutions on regulatory and marketing actions heavily depend on scientific evidence. This doctoral dissertation deals with the molecular biology laboratory methods based on the most popular to date method polymerase chain reaction (PCR) used in the molecular characterization of the genetically modified organisms (GMOs). When studying the molecular structure of the GMO, two main interests of the nucleotide sequence are: (1) the actual sequence of the transgenic insert, and (2) the plant genomic DNA surrounding the synthetic DNA. Two distinct techniques of the Long Template PCR and Genome Walking were analyzed on the GMO DNA matrices. The LT-PCR was applied to obtain single uninterrupted fragment containing full transgenic insert of the selected GM events. The analysis of LT-PCR was continued with the application of a novel PCR additive called carbon nanotubes (CNTs) to investigate the impact of this nanomaterial on the specificity, efficiency and the product yield. The Genome Walking is a technique to obtain unknown DNA fragments adjacent to the known DNA. This doctoral dissertation seeks to explain in detail the development and optimization of a method Long... [to full text]
Viena iš greičiausiai besivystančių biotechnologijos mokslo sričių pastaruosius tris dešimtmečius yra genetiškai modifikuotų (GM) augalų kūrimas ir jų naudojimas pramonėje, maistui ir pašarams. Europos Sąjunga turi bene griežčiausią GMO reglamentavimą visame pasaulyje, t.y. visi politiniai sprendimai dėl transgeninių augalų patekimo į rinką yra pagrįsti mokslinių tyrimų rezultatais. Šioje disertacijoje apžvelgiami populiariausiu molekulinės biologijos metodu, polimerazine grandinine reakcija (PGR), grįstos technologijos genetiškai modifikuotų organizmų (GMO) tyrimams. Tiriant molekulinę GMO struktūrą, didžiausias dėmesys yra kreipiamas į šių nukleotidinių sekų aptikimą: (1) transgeninio intarpo, bei (2) augalo genomo sekų aplink transgeninio intarpo įsiterpimo vietą. Naudojant GMO DNR matricas, buvo tirtos dvi skirtingos technologijos: ilgagrandė PGR (I-PGR) ir „pasivaikščiojimas genomu“ (PG). I-PGR metodu buvo siekiama nukopijuoti ir pagausinti vienalytį DNR fragmentą, kuriame būtų nukopijuotas visas transgeninis intarpas. Šio metodo taikymo tyrimas buvo tęsiamas ištiriant naujovišką PGR priedą, anglies nanovamzdelius (ANV). Šis reakcijos mišinio priedas, manoma, yra potencialus reakcijos specifiškumo ir efektyvumo stipriklis. PG yra technologija, įgalinanti nežinomų DNR sekų, prisijungusių prie žinomų sekų, aptikimą. Šioje daktaro disertacijoje smulkiai aprašomas PG metodo, kurį pavadinome LT-RADE, kūrimas ir optimalių reakcijų sąlygų parinkimas. Taip pat, sėkmingas metodo... [toliau žr. visą tekstą]