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National audience; Le clonage positionnel consiste à identifier un gène d’intérêt à partir de la seule connaissance de sa localisation chromosomique. Cette stratégie est utilisée lorsqu’il n’existe aucun gène candidat évident ou aucun défaut biochimique spécifique. Elle comprend une localisation primaire, faite généralement par une analyse de liaison classique, puis une cartographie fine de la région d’intérêt permettant de réduire progressivement l’intervalle critique contenant le gène, d’identifier un ensemble de clones chevauchant et couvrant la région, de mettre en évidence les séquences codantes contenues dans cette région et enfin d’identifier le gène responsable du caractère étudié. Etant donné qu’une approche de clonage positionnel pure est lourde et longue à mettre en oeuvre, elle est souvent associée à une approche de cartographie comparée et de gènes candidats.

Le clonage positionnel consiste à identifier un gène d’intérêt à partir de la seule connaissance de sa localisation chromosomique. Cette stratégie est utilisée lorsqu’il n’existe aucun gène candidat évident ou aucun défaut biochimique spécifique. Elle comprend une localisation primaire, faite généralement par une analyse de liaison classique, puis une cartographie fine de la région d’intérêt permettant de réduire progressivement l’intervalle critique contenant le gène, d’identifier un ensemble de clones chevauchant et couvrant la région, de mettre en évidence les séquences codantes contenues dans cette région et enfin d’identifier le gène responsable du caractère étudié. Etant donné qu’une approche de clonage positionnel pure est lourde et longue à mettre en oeuvre, elle est souvent associée à une approche de cartographie comparée et de gènes candidats.

National audience; La rouille foliaire causée par Melampsora larici-populina Kleb. (Mlp) est une des principales maladies affectant les peupleraies européennes. Nous avons identifié un facteur de résistance quantitative à Mlp hérité du génotype Populus trichocarpa 101-74, Rus, qui peut réduire de 60% le niveau de sporulation après inoculation contrôlée et qui a un effet significatif en conditions naturelles d'infection. Ce facteur est localisé sur une carte génétique basée sur l'analyse d'une famille Fi Populus deltoïdes x P.trichocarpa. Un travail de clonage positionnel du facteur Rus est en cours de réalisation. Pour identifier des marqueurs plus proches de Rus, nous avons utilisé la technique de Bulk Segregant Analysis (BSA). Une puissance de tri importante (15 bulks de génotypes contrastés Rus et rus, et 114 couples d'amorces AFLP testés) a permis d'amplifier 7 marqueurs discriminants les génotypes Rus et rus. Ces 7 marqueurs et 2 marqueurs AFLP déjà cartographiés ont été clonés, séquencés pour permettre le développement de marqueurs STS et le génotypage à moindre coût de la famille étendue à 1300 génotypes Fi. Le marqueur le plus proche est situé à 2.9 cM. La cartographie de ces bandes et de 5 marqueurs microsate1lites additionnels ainsi que les résultats des alignements avec la séquence de P. trichocarpa Nisqually-1 permet de cibler la région d'intérêt. Nous avons défini une zone exploratoire d'environ 400 kb sur laquelle nous avons déjà détecté des analogues de gènes de résistance de type NBS-LRR. Une banque BAC du clone d'intérêt 101-74 comptant environ 52 000 clones a été construite et organisée en pool ligne puis en pool plaque pour optimiser la recherche de BAC portant Rus. Un ensemble de 70 locus micro satellite répartis sur l'ensemble du génome, choisis d'après les données de cartographie génétique ont été utilisés pour confirmer la couverture de la banque préalablement estimée à 14X. Les marqueurs génétiques, les plus proches du gène sont utilisés pour cribler la banque par PCR sur pool plaque puis la recherche de la coordonnée dans la plaque est menée. La carte physique locale sera initiée après la réalisation des empreintes de chaque clone BAC sélectionné. Parallèlement, une annotation expertisée de la région de 500 000 bases du chromosome XIX de Nisqually-1 entre les bases 800 000 et 1 300 000 est en cours pour identifier les gènes dans cette zone. L'objectif ici étant de développer de nouveaux marqueurs dans les gènes pour faire le lien entre locus d'intérêt et gène.

Les cultivars modernes de canne à sucre (Saccharum spp) sont de hauts polyploïdes, aneuploïdes (2n = ça 115) issus de croisements interspécifiques entre deux espèces polyploïdes, une espèce sucrée domestiquée Saccharum officinarum (2n = 8x = 80) et une espèce sauvage Saccharum spontaneum (2n = 5x à 12x = 40 à 128). Un gène majeur de résistance à la rouille brune de la canne à sucre (Brui), a été identifié chez le cultivar R570. Ce gène est la cible d'une approche de clonage positionnel, ce qui représente un véritable challenge compte tenu de la complexité du génome des cultivars modernes. La syntenie entre le sorgho, le riz et la canne à sucre a été exploité pour construire une carte génétique fine de la région cible. Pour cela, un contig de BAC couvrant la région orthologue du sorgho a été construit, et les extrémités de ces BAC ont été utilisées comme sondes sur la descendance de R570. D'autre part, la région physique du riz orthologue à la région cible a été identifiée et sa séquence a été comparée à la base de données SUCEST comprenant 250 000 EST de canne à sucre. Les ADNc ainsi obtenus ont été utilisés comme sondes sur la descendance de R570. Ceci a permis de réduire la taille de la région cible à une fenêtre de 0,56 cM autour du gène Brui. Les marqueurs cartographiés à proximité du gène Brul ont été utilisés pour cribler deux banques BAC de R570 et initier une marche chromosomique. La nature polyploïde et hétérozygote du génome des cultivars implique que parmi les BAC identifiés seuls quelques uns correspondent à l'haplotype cible. Trois des BAC identifiés couvrent totalement la région cible sur certains des haplotypes hom(é)ologues, alors que les 8 BAC correspondant à l'haplotype cible identifiés ne la couvre que partiellement. Cette différence entre haplotypes hom(é)ologues est lié à la présence d'une insertion sur l'haplotype cible. Des extrémités et des sous-clones de BAC canne à sucre ont été exploités pour affiner la carte génétique qui comprend désormais seize marqueurs, un cartographié à 0,14 cM en position distale par rapport à Bru), un cartographié à 0,28 cM en position proximale par rapport à Brui et quatorze marqueurs coségrégeant avec le gène Brui. Parallèlement, une approche exploitant le déséquilibre de liaison local a été entreprise pour tenter de réduire la taille de la région contenant Brui.

National audience; Le clonage positionnel consiste à identifier un gène d’intérêt à partir de la seule connaissance de sa localisation chromosomique. Cette stratégie est utilisée lorsqu’il n’existe aucun gène candidat évident ou aucun défaut biochimique spécifique. Elle comprend une localisation primaire, faite généralement par une analyse de liaison classique, puis une cartographie fine de la région d’intérêt permettant de réduire progressivement l’intervalle critique contenant le gène, d’identifier un ensemble de clones chevauchant et couvrant la région, de mettre en évidence les séquences codantes contenues dans cette région et enfin d’identifier le gène responsable du caractère étudié. Etant donné qu’une approche de clonage positionnel pure est lourde et longue à mettre en oeuvre, elle est souvent associée à une approche de cartographie comparée et de gènes candidats.

DUT Génie biologique; DEUG

La reconnaissance entre le produit d'un gène d'avirulence et le produit du gène de résistance correspondant est une étape clé du déclenchement des mécanismes de défense chez les plantes. A ce jour seulement deux couples gène d'avirulence/gène de résistance correspondant ont été clonés: avrPto/Pto dans le couple Pseudomonas syringae pv tomato/tomate et avr-Pita/Pi-ta dans le couple Magnaporthe grisea/riz. Dans ces deux cas l'interaction entre les produits des deux gènes a été démontrée. La compréhension des premières étapes de l'interaction demeure donc très limitée. Récemment le gène d'avirulence Ace1 de Magnaporthe grisea a été cloné. Ce gène a été transféré par transformation à différentes souches, créant ainsi des couples de souches isogéniques au gène d'avirulence près. Ces couples permettent de détecter le gène de résistance correspondant à Ace1. En effet, si une souche sauvage est virulente sur une variété donnée et que la souche transformée est avirulente sur cette même variété, cela signifie que la variété porte le gène de résistance correspondant à Ace1. Ce gène de résistance a ainsi été détecté dans plusieurs variétés de riz dont IR64 et Bala. Ces deux variétés ont été utilisées en croisement par d'autres équipes. Des descendants et des cartes génétiques sont donc disponibles. En utilisant les couples de souches isogéniques décrits précédemment, nous avons étudié la ségrégation de la résistance correspondant à Ace1 dans la descendance des croisements IR64 x Azucena et Azucena x Bala. Dans les deux croisements une ségrégation pour un gène, localisé sur le chromosome 8 du riz, a été mise en évidence. Le clonage positionnel de ce gène de résistance a donc été entrepris. A partir de différentes cartes génétiques du riz, des marqueurs potentiellement proches du gènes de résistance ont été recherchés puis cartographiés dans le croisement IR64 x Azucena. Le gène a été placé entre deux marqueurs distants de 3 cM. Une banque BAC de la variété Nipponbare, ordonnée par fingerprinting, a été hybridée avec les marqueurs flanquant le gène de résistance. Deux contigs (série de clones BACs chevauchants) ont été identifiés. A partir des bacs extrêmes de ces deux contigs de nouveaux marqueurs ont été définis, placés sur la carte génétique et utilisés comme sonde sur la banque BAC. Un nouveau contig a été identifié, permettant un pas de marche supplémentaire. La recherche de marqueurs liés et la cartographie physique se poursuivent. Une fois la carte physique du locus établie, la recherche du gène de résistance sera réalisée par complémentation fonctionnelle.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

National audience; Le pathosystème riz-Magnaporthe grisea est utilisé comme modèle des interactions céréale-champignon phytopathogène mais c'est aussi un pathosystème d'importance économique mondiale. Dans ce pathosystème des interactions gène-pour-gène ont été décrites. Le nombre d'interactions spécifiques caractérisées au niveau moléculaire est encore restreint. Après avoir cloné le gène d'avirulence Ace1 de Magnaporthe grisea (Böhnert et al 2004, Plant Cell), nous avons entrepris le clonage positionnel du gène de résistance correspondant Pi33. Pi33 a été localisé sur le chromosome 8 du riz dans deux croisements indépendants (Berruyer et al 2003, TAG). Une cartographie fine a permis de placer le gène entre deux marqueurs distants de 230 kb. Dans cette zone, un cluster de 8 gènes candidats a été mise en évidence par analyse de la séquence du génome d'une variété de riz dépourvue de Pi33. La définition de nouveaux marqueurs est en cours pour essayer de restreindre le nombre de candidats potentiels. L'étude du cluster a été in tiée. Le séquençage des différents gènes candidats chez différentes variétés avec ou sans Pi33 est en cours. Leur expression est également étudiée.

Affections héréditaires et congénitales des carnivores domestiques; National audience

* INRA Documentation, Domaine St Paul, Site Agroparc, 84914 Avignon cedex 9 Diffusion du document : INRA Documentation, Domaine St Paul, Site Agroparc, 84914 Avignon cedex 9; National audience

Positional cloning of Ph2, a gene impacting homoeologous pairing in polyploid bread wheat Triticum aestivum L.. 5. annual AgreenSkills+ meeting

Depuis déjà plusieurs décennies, nous sommes en mesure d'identifier les mutations responsable de diverses maladies mendéliennes. La découverte des gènes responsables de ces maladies permet non seulement un meilleur diagnostic clinique pour ces familles, mais aussi de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces maladies ainsi que mieux définir la fonction normale des gènes causales. Ultimement, ces découvertes mènent à l'identification de cibles thérapeutiques pour le traitement de ces maladies. Les progrès technologiques sont depuis toujours un facteur très important dans la découverte de ces gènes mutés. De l'approche traditionnelle de clonage positionnel en passant par la première séquence du génome humain et maintenant les technologies de séquençage à grande échelle, de plus en plus de maladies ont maintenant une entité génétique. Dans le cadre de ce projet de doctorat, nous avons utilisé tant les approches traditionnelles (leucodystrophies) que les nouvelles technologies de séquençage (polyneuropathie douloureuse) qui ont mené à l'identification du gène causal pour plusieurs de nos familles. L'efficacité de ces deux approches n'est plus à démontrer, chacune d'entre elles possèdent des avantages et des inconvénients. Dans le cadre de ces projets, nous avons utilisé la population canadienne-française connue pour ces effets fondateurs et la présence, encore aujourd'hui, de grandes familles. Les différents projets ont permis d'établir certains avantages et inconvénients quant à l'utilisation de ces techniques et de la population canadienne-française. Dans le cadre d'un phénotype assez homogène et bien défini comme celui du projet leucodystrophie, l'approche traditionnel par gène candidat nous a permis d'identifier le gène causal, POLR3B, sans trop de difficulté. Par contre, pour les autres projets où nous sommes en présence d'une hétérogénéité clinique et génétique une approche non-biaisée utilisant le séquençage exomique a obtenu un plus grand succès. La présence de grandes familles est un grand avantage dans les deux approches. Dans le projet polyneuropathie douloureuse, une grande famille originaire du Saguenay-Lac-St-Jean nous a permis d'identifier le gène NAGLU comme responsable suite à l'exclusion des autres variants candidats par analyse de ségrégation. Comme NAGLU était déjà associé à un phénotype qui diffère sur plusieurs points à celui de notre famille, une approche traditionnelle n'aurait pas été en mesure d'identifier NAGLU comme le gène causal. Dans l'analyse de nos données de séquençage exomique, nous avons observé que plusieurs variants rares, absents des bases de données, étaient partagés entre les différents individus Canadiens français. Ceci est probablement dû à la démographie génétique particulière observée chez les Canadiens français. En conclusion, les technologies de séquençage à grande échelle sont avantageuses dans l'étude de maladies hétérogènes au niveau clinique et génétique. Ces technologies sont en voie de modifier l'approche d'identification de gènes en permettant une analyse de génétique inversée, c'est-à-dire de la génétique vers la clinique., Since many decades we are able to identify mutations responsible for Mendelian diseases. The identification of the causative gene not only allows a better diagnostic to these families, but also allows a better understanding of the pathophysiological mechanisms of these disorders and of the normal function of a gene. Ultimately, those discoveries lead to the identification of therapeutic targets that will enable clinicians to treat these diseases. Technological progress has forever driven gene identification. Starting with traditional approaches like positional cloning passing through the first sequence of the human genome and finally the recent high-throughput sequencing technologies, more and more diseases are now linked to a genetic cause. During my PhD, I had the opportunity to use traditional approaches (leukodystrophy) as well as new sequencing technologies (painful sensory polyneuropathy) which both led to gene identification for some of our families. The efficiency of these approaches is well known, each of them has advantages and disadvantages. In these projects, we used the french-canadian population well known for its founder effect and the presence, still today, of large families. Working on these projects allowed us to establish advantages and disadvantages concerning the use of those technologies and the french-canadian population. In the presence of a homogenous and well defined phenotype, like the leukodystrophy project, the traditional approach enables us to rapidly identify the causative gene (POLR3B). On the other hand, the unbiased exome sequencing approach has had more success for diseases characterized with clinical and genetic heterogeneity. Large families are a great advantage for both methods. In the painful sensory polyneuropathy project, a large family originated from the Saguenay-Lac-St-Jean region allowed us to identify the NAGLU gene as responsible for the disease after exclusion of the candidate variants by segregation analysis. NAGLU has already been associated with a phenotype that differs in many points with the clinical features observed in our family. In this case a traditional approach would have failed to identify NAGLU as the causative gene. In the analysis of our exome sequencing results, we observed many rare variants absent from databases but shared between french-canadian individuals. This enrichment in rare variants is probably due to the particular genetic demography of Quebec. In conclusion, high-throughput sequencing technologies are advantageous in the study of clinically and genetically heterogeneous diseases. These technologies are changing the gene identification approach towards reverse genetics, meaning genetics towards clinic.

Positional candidate gene approach and molecular characterization of chromosomal abnormalities can elucidate the genetic basis of many human developmental diseases. Mapping of such rearrangements allows the identification of disease candidate genes by using cytogenetic and molecular biology approaches. Array-CGH serves the critical need for identification of causal genes related to disease by detection of unknown chromosomal imbalances.We report here the results of mapping and molecular characterization of two unbalanced chromosomal rearrangements related to mental retardation : 20q13.33 and 21q21 deletions. This study led to candidate genes identification and contributed to improve clinical monitoring and genetic counseling.Moreover, the breakpoints characterization of a balanced de novo translocation t(3;18)(p12.3;q23) associated with an early-onset generalized dystonia and developmental delay revealed the disruption of ROBO1, a gene mediating axone guidance. Additional analysis including array-CGH, RNA and protein analysis, leukocyte chemotaxis and search for ROBO1 mutations in 20 independent patients with syndromic dystonia were performed in order to evaluate the correlation beetween ROBO1 disruption and dystonia. The results presented here underline the difficulties in elucidating the role of such rearrangements, and the need to provide further evidences in defining their involvment in the development of a genetic disease., L'identification de gènes responsables d'anomalies du développement passe par des approches de clonage positionnel parmi lesquelles la caractérisation moléculaire d'anomalies chromosomiques. La cartographie précise de réarrangements chromosomiques permet de mieux cerner des gènes candidats impliqués dans les maladies génétiques, grâce à l'utilisation d'outils de cytogénétique et de biologie moléculaire. L'array-CGH a ainsi conduit à identifier des microremaniements chromosomiques jusqu'alors inconnus et à préciser les gènes candidats dans les affections étudiées.Nous présentons dans une première partie, les résultats de la cartographie et de la caractérisation moléculaire de deux anomalies microcytogénétiques associées à un retard mental, une délétion 20q13.33 et une délétion 21q22. Ces données ont contribué à la sélection de gènes candidats et à améliorer la prise en charge clinique et le conseil génétique.Par ailleurs, la caractérisation moléculaire d'une translocation réciproque t(3;18)(p12.3;q23) de novo associée à une dystonie précoce généralisée avec retard de développement a été réalisée. Le gène ROBO1 impliqué dans le guidage axonal s'est révélé interrompu. Des explorations complémentaires ont été conduites (array-CGH, étude de l'ARN, étude protéique, migration cellulaire et séquençage du gène ROBO1 chez d'autres patients avec une dystonie syndromique) afin de mieux cerner les conséquences de cette anomalie sur la survenue de cette dystonie syndromique. Les résultats de ces études soulignent les difficultés d'interprétation liées à la découverte de tels réarrangements et la nécessité d'apporter la preuve de leur implication dans le phénotype observé par des moyens appropriés.

Drought and heat can occur during the growth cycle of crops and severely reduce yield. A QTL associated with yield and yield-related component was found in four wheat populations (Triticum aestivum L.) on the long arm of chromosome 3B “qYDH.3BL”. The four populations were grown under various climatic conditions including drought, heat and combinations of both in a number of different areas (Australia and Mexico). Linear mixed models that partition and account for genetic and non-genetic or extraneous variation were used to detect loci in single-environment and/or multi-environment QTL analysis using ASReml-R. The alleles carried by RAC875, Excalibur or Drysdale improved grain yield by between 5% and 12.5%. Two doubled haploid populations (RAC875/Kukri and Excalibur/Kukri) and two recombinant inbred line populations (RAC875/Kukri and Gladius/Drysdale) were used to fine map qYDH.3BL and identify candidate gene(s). A total of thirty-seven molecular markers were mapped on one or both genetic maps of chromosome 3B enabling development of a consensus genetic map of the qYDH.3BL region. The markers were selected based on comparisons with a published “neighbour map” of chromosome 3B or designed using either BAC-end, contig or gene sequences from the chromosome 3B sequencing project; 3BSEQ http://urgi.versailles.inra.fr/ (cv. Chinese Spring). A positional cloning approach was used to identify candidate genes for qYDH.3BL. Molecular markers from the targeted region were assigned to physical contigs by screening the chromosome 3B BAC library experimentally using PCR or in silico by sequence comparison. A total of eight physical contigs containing 85 genes, were anchored to the qYDH.3BL region. Public and in-house resources of wheat transcript sequences were used to restrict the gene list to 65 expressed genes. Based on comparison of the 65 gene sequences to gene probes in a drought transcriptomic database, three genes were found to be differentially expressed between RAC875 and Kukri under drought conditions. Short genomic sequence reads (10× coverage) from each of the five parental lines (RAC875, Kukri, Excalibur, Gladius and Drysdale) were mapped against the 65 genes for polymorphism discovery. One gene exhibited sequence polymorphism between the drought tolerant parents (RAC875, Excalibur and Drysdale) and the drought-sensitive parents (Gladius and Kukri). In addition, presence/absence polymorphisms were consistently detected throughout a region containing 12 genes, indicating that the drought tolerant parents may have a deletion (or alien introgression) in this region. Thus, in this work, we confirmed the genetic effect of qYDH.3BL in multiple environments and multiple populations, saturated the target region with new molecular markers and defined a preliminary list of genes located in the qYDH.3BL region and selected candidate genes for further investigations., Des épisodes climatiques de sècheresse et/ou de hautes températures peuvent engendrer de fortes pertes de rendement pour les cultures de céréales au champ. Un QTL associé au rendement et à ses composantes a été détecté dans quatre populations de blé (Triticum aestivum L.) sur le bras long du chromosome 3B « qYDH.3BL ». Deux populations d’haploïdes doublés (RAC875/Kukri et Excalibur/Kukri) et deux populations de lignées recombinantes (RAC875/Kukri et Gladius/Drysdale) ont été utilisées pour cartographier finement le QTL, au même titre que l’identification de gènes candidats. Ces quatre populations ont été testées sous des conditions environnementales variées, incluant des périodes de sécheresse et/ou hautes températures en Australie et au Mexique. Des modèles statistiques mixtes et linéaires décomposant les variations génétiques et non-génétiques ont été utilisés pour la détection de QTL en considérant dans un premier temps chaque environnement unique, puis en considérant les environnements multiples dans une analyse commune. Les allèles de RAC875, Drysdale et Excalibur à ce locus ont montré une hausse du rendement de 5 à 12.5 % comparées à celles de Gladius ou Kukri. Un total de trente-sept marqueurs moléculaires a été cartographié dans la région du QTL. Les marqueurs moléculaires ont été sélectionnés (i) par comparaison avec une carte génétique publiée du chromosome 3B, ou (ii) en désignant de nouveaux marqueurs moléculaires sur les séquences de BAC-end, de contig ou de gènes provenant du projet de séquençage du chromosome 3B (3BSEQ, http://urgi.versailles.inra.fr/, cv. Chinese Spring). Ceci a permis la construction d’une carte génétique consensus du locus qYDH.3BL . A ce jour, aucun QTL associé au rendement ou ses composantes en condition de sécheresse et/ou de hautes températures n’a encore été cloné positionellement chez le blé tendre. Les marqueurs moléculaires de la région d’intérêt ont été utilisés pour cartographier physiquement des contigs, soit par PCR, soit par comparaison de séquences in silico. La région du QTL inclus un total de huit contigs physiques comprenant 85 gènes annotés. L’utilisation de base de données de transcris biologiques publiques ou internes ont été utilisées pour détecter la présence de ces gènes, réduisant la liste à soixante-cinq gènes. Sur les contigs ayant une confiance élevée, aucun des vingt gènes n’a été exprimé différentiellement entre RAC875 et Kukri. Cependant, un gène présentant du polymorphisme dans sa séquence ainsi qu’une délétion/insertion d’un segment portant 12 gènes ont été découvert permettant ainsi de continuer à affiner la liste de gènes candidats. Les trois lignées parentales (RAC875, Drysdale et Excalibur) qui ont l’allèle liée au haut rendement ont le même haplotype pour ce gène, et la même délétion/insertion en opposition au deux autres lignées parentales Gladius et Kukri. Ainsi, dans ce travail de thèse nous avons pu confirmer la présence d’un QTL répondant aux stresses environnementaux sur le chromosome 3BL dans différentes populations et différents environnements, identifier des gènes candidats sous le QTL, et proposer une liste restreinte pour de futures analyses sur la base de données d’expression et de polymorphismes entre les parents des populations de cartographie.

Stone fruit crops Prunus spp. grown under Mediterranean climates are severely damaged by root-knot nematodes (RKN) Me/oidogyne spp. and breeding for RKN-resistant rootstocks is a promising control alternative to nematicide ban. Resistance (R) genes that confer different spectra have been identified and mapped in plums (Ma and Rjap), peach (RMia) and almond (RMja). Thus sustainable resistance in Prunus is based on pyramiding of R genes in interspecific rootstock mate rial to take into account the risk of resistance breaking in the durable plant-nematode interaction for perennials. The Ma gene from Myrabalan plum has been shown to confer a complete-spectrum, high-Ievel and heat-stable resistance to both mitotic (M. arenaria, M. incognito, M. javanico and M. entera/obii) and meiotic (M. f/oridensis) RKN. Ma triggers a hypersensitive-like reaction (HLR) in raot apices and severe nematode attacks induce _ the development of subterminal lateral rootlets replacing primary terminal apices and providing an acive, resist,ance response to HLR damage (1). Sustainability of resistance conferred by Ma has been challenged in multi-year experiments applying a high and continuous nematode inoculum pressure by co-cultivation of RKN-infested susceptible tomato plants together with Prunus plants carrying Ma or, for comparison, with R tomato plants carrying the Mi-l reference gene. Galling and virulent nematode individuals have been observed in Mi-l resistant tomatoes but not in Ma-carrying Prunus plants. The positional cloning of the Ma locus in accession P.2175 has been performed using high resolution mapping developed in two successive steps totalling over 3000 segregants. The Ma locus interval has been reduced to a 32-kb cluster of three TIR-NB-LRR genes (TNLl to TNL3) including a pseudogene (TNL2) and a truncated gene (TNL3). Using A. rhizogenes transformed hairy raots and composite plants (2), the best candidate gene, TNLl, comprising the genomic sequence and the native promoter region (15.3 kb), has been validated as Ma as it conferred the same complete-spectrum and high-Ievel resistance as in the donor accession P.2175. The full-Iength cDNA (2048 aa) of Ma is the longest of ail R genes cloned tc-date. Its TNL structure is extended by a huge Cvterminal post-LRR (PL) region (1088 aa) comprising five repeated PL exons (3).

National audience; Les technologies mises en place dans le cadre des projets sur les génomes humain et murin ont stimulé le développement de la cartographie des espèces d’intérêt agronomique. Des cartes ont été construites pour les ruminants, le porc, le cheval et le poulet, permettant de localiser des gènes d’intérêt agronomique ou des QTL (quantitative trait loci) chez ces espèces. Ces travaux de cartographie génétique, cytogénétique et physique devraient se révéler être des outils indispensables pour le clonage positionnel de ces gènes ou QTL.

• R(US) is a major dominant gene controlling quantitative resistance, inherited from Populus trichocarpa, whereas R(1) is a gene governing qualitative resistance, inherited from P. deltoides. • Here, we report a reiterative process of concomitant fine-scale genetic and physical mapping guided by the P. trichocarpa genome sequence. The high-resolution linkage maps were developed using a P. deltoides × P. trichocarpa progeny of 1415 individuals. R(US) and R(1) were mapped in a peritelomeric region of chromosome 19. Markers closely linked to R(US) were used to screen a bacterial artificial chromosome (BAC) library constructed from the P. trichocarpa parent, heterozygous at the locus R(US) . • Two local physical maps were developed, one encompassing the R(US) allele and the other spanning r(US) . The alignment of the two haplophysical maps showed structural differences between haplotypes. The genetic and physical maps were anchored to the genome sequence, revealing genome sequence misassembly. Finally, the R(US) locus was localized within a 0.8-cM interval, whereas R(1) was localized upstream of R(US) within a 1.1-cM interval. • The alignment of the genetic and physical maps with the local reorder of the chromosome 19 sequence indicated that R(US) and R(1) belonged to a genomic region rich in nucleotide-binding site leucine-rich repeat (NBS-LRR) and serine threonine kinase (STK) genes.

National audience; Lorsque l’analyse de performances permet de montrer qu’un gène gouverne une part importante de la variabilité d’un caractère, diverses approches sont possibles pour l’identifier : l’étude de candidats physiologiques afin d’identifier le gène recherché parmi les gènes connus intervenant dans ce caractère ; la cartographie fine de la région pour déterminer très précisément la position du gène recherché, jusqu’à ne plus trouver qu’un seul gène à cet endroit (démarche de clonage positionnel). Le plus souvent, le gène responsable est identifié par une combinaison de ces deux approches, en trouvant un candidat positionnel situé dans l’intervalle restreint où il est attendu. Dans certains cas cependant, l’étude de gènes connus ayant un effet similaire dans une autre espèce, permettra d’identifier rapidement le gène responsable.

Oral Session 4: Interactions Moleculaires; National audience

Deux document disponibles:- HDR elle-même- Document annexe sur l'amélioration génétique du riz auquel il est fait référence dans l'HDR; L'objectif scientifique de mon travail de recherche et d'encadrement d'étudiants a principalement concerné la détermination des bases génétiques de la résistance à la sécheresse du riz. Une partie de ces travaux ont été menés à l'Institut International de Recherche sur le Riz aux Philippines, dans le cadre d'un programme de sélection du riz pluvial pour l'Asie du Sud et du Sud-Est. Le riz pluvial ne dépend que la pluviométrie pour son alimentation hydrique et souffre donc de déficits hydriques fréquents. La nature des sécheresses rencontrées dans les environnements cibles m'ont conduite à travailler plus particulièrement sur la morphologie du système racinaire et sur l'ajustement osmotique. L'approche choisie a été celle de la génétique moléculaire. Les travaux conduits ont permis des progrès dans la compréhension du déterminisme génétique de ces caractères et la localisation de QTL d'intérêt dans des populations de cartographie classique, puis des populations de back-cross avancés, plus adaptées à un programme de sélection. Des lignées quasi isogéniques introgressées avec des QTLs de profondeur racinaire ont été produites par sélection assistée par marqueurs et utilisées pour valider l'existence et l'effet des QTLs. Mon projet de recherche actuel conduit à Montpellier dans l'UMR "Développement et Amélioration des Plantes" se situe dans la continuité des travaux précédents. Il consiste à relier les nombreux QTL de morphologie racinaire identifiés à ce jour chez le riz aux gènes sous jacents, puis à analyser la variabilité allélique de ces gènes dans différents fonds génétiques. Plusieurs approches complémentaires seront utilisées pour réaliser la cartographie fine des QTLs. La large gamme de données disponibles va d'abord être utilisée pour affiner la position des QTLs par une approche statistique de méta-analyse. L'approche d'étude d'association a également été retenue ce qui suppose, en préalable, de clarifier l'étendue du déséquilibre de liaison chez le riz. Des approches au niveau du génome entier seront suivies d'approches ciblées sur des gènes candidats, en ayant largement recours aux données de séquençage total du génome de 2 variétés de riz et de séquençage partiel de 20 autres. Enfin, en utilisant les lignées quasi-isogéniques produites à l'IRRI, le clonage d'un QTL de profondeur racinaire a été entrepris. L'intégration de ces approches de génétique directe avec les approches complémentaires de génétique inverse utilisées par d'autres personne de l'équipe "Développement et adaptation du riz" se fera autour des gènes dont la fonction aura été validée. La combinaison des allèles les plus adaptés aux environnements cibles dans des variétés d'élite constituera le but ultime de mon travail.

Deux document disponibles:- HDR elle-même- Document annexe sur l'amélioration génétique du riz auquel il est fait référence dans l'HDR; L'objectif scientifique de mon travail de recherche et d'encadrement d'étudiants a principalement concerné la détermination des bases génétiques de la résistance à la sécheresse du riz. Une partie de ces travaux ont été menés à l'Institut International de Recherche sur le Riz aux Philippines, dans le cadre d'un programme de sélection du riz pluvial pour l'Asie du Sud et du Sud-Est. Le riz pluvial ne dépend que la pluviométrie pour son alimentation hydrique et souffre donc de déficits hydriques fréquents. La nature des sécheresses rencontrées dans les environnements cibles m'ont conduite à travailler plus particulièrement sur la morphologie du système racinaire et sur l'ajustement osmotique. L'approche choisie a été celle de la génétique moléculaire. Les travaux conduits ont permis des progrès dans la compréhension du déterminisme génétique de ces caractères et la localisation de QTL d'intérêt dans des populations de cartographie classique, puis des populations de back-cross avancés, plus adaptées à un programme de sélection. Des lignées quasi isogéniques introgressées avec des QTLs de profondeur racinaire ont été produites par sélection assistée par marqueurs et utilisées pour valider l'existence et l'effet des QTLs. Mon projet de recherche actuel conduit à Montpellier dans l'UMR "Développement et Amélioration des Plantes" se situe dans la continuité des travaux précédents. Il consiste à relier les nombreux QTL de morphologie racinaire identifiés à ce jour chez le riz aux gènes sous jacents, puis à analyser la variabilité allélique de ces gènes dans différents fonds génétiques. Plusieurs approches complémentaires seront utilisées pour réaliser la cartographie fine des QTLs. La large gamme de données disponibles va d'abord être utilisée pour affiner la position des QTLs par une approche statistique de méta-analyse. L'approche d'étude d'association a également été retenue ce qui suppose, en préalable, de clarifier l'étendue du déséquilibre de liaison chez le riz. Des approches au niveau du génome entier seront suivies d'approches ciblées sur des gènes candidats, en ayant largement recours aux données de séquençage total du génome de 2 variétés de riz et de séquençage partiel de 20 autres. Enfin, en utilisant les lignées quasi-isogéniques produites à l'IRRI, le clonage d'un QTL de profondeur racinaire a été entrepris. L'intégration de ces approches de génétique directe avec les approches complémentaires de génétique inverse utilisées par d'autres personne de l'équipe "Développement et adaptation du riz" se fera autour des gènes dont la fonction aura été validée. La combinaison des allèles les plus adaptés aux environnements cibles dans des variétés d'élite constituera le but ultime de mon travail.

Acidity is an essential component of the organoleptic quality of fleshy fruits. However, the physiological and molecular mechanisms that control fruit acidity remain unclear. In peach low-acidity is determined at the D locus by the dominant allele. A peach progeny of 208 F2 individuals obtained from a cross between ‘Ferjalou Jalousia®’ (a low-acid peach) and ‘Fantasia’ (a normally acid nectarine) varieties (JxF) was analyzed for several agronomical traits. This peach F2 progeny segregating for several mendelian traits, was analyzed for fruit quality traits including fruit acidity and used for the construction of a genetic linkage map. The D locus was mapped to the proximal end of linkage group 5 (LG5) and co-localized with major QTLs involved in the control of fruit pH, titratable acidity and organic acid concentration and minor QTLs for sugar concentration. Several candidate genes involved in organic acids synthesis, degradation or vacuolar storage have previously been studied. However, none of these candidate genes were located on in the region of the D locus, excluding their direct role in the control of fruit acidity by the D locus. The complexity of organic acids metabolic pathways as well as the involvement of transporters and channels and related proton pumps has hampered, so far, the identification of the gene(s) associated to the D locus using a candidate gene approach. Thus, in order to investigate the molecular and physiological bases of fruit acidity in peach, a positional cloning strategy of the D locus was undertaken for the isolation of the gene(s) underlying this trait. Using a BSA-AFLP method, 34 AFLP markers were mapped to the LG5, and the six nearest markers were transformed into codominant SCAR markers. These SCAR markers and three previously mapped SSR markers were used to genotype an F2 segregating progeny extended to 1,718 F2 individuals. A high-resolution map of the D locus was realized after genotyping and phenotyping recombinant individuals. Using these recombinant plants we delimited the D locus to a genetic interval of 0.4 cM. We also constructed a peach BAC library with a covering estimated at 15 x the peach haploid genome. The screening of the BAC library with tightly linked markers indicated that 1 cM corresponds to 250 kb at the vicinity of the D locus and allowed the construction of the physical map in two walks integrating 16 markers obtained from the BACends sequences. Two BAC clones harbouring the D locus were identified and sequenced; one BAC clone of 98 kb containing the D dominant allele and another one of 78 kb containing the d recessive allele. Eleven predicted genes were found in the sequenced region. A new set of markers was developed which allowed the localization of the D locus in a 16 kb interval. In this region, two genes were identified: a resistance gene and a gene encoding for a transporter. A transcriptional approach was initiated in addition to the positional cloning strategy to provide a first element which could confirm the involvement of one or more identified positional candidate gene(s) in the control of peach fruit acidity., La qualité du fruit est un critère incontournable de sélection chez les Rosacées fruitières, et l’acidité constitue une composante majeure de la qualité organoleptique. Toutefois, les mécanismes physiologiques et moléculaires contrôlant l'acidité des fruits restent mal connus. Chez le pêcher, le caractère non acide du fruit est contrôlé par le locus D. Une descendance F2 de 208 individus issus d'un croisement entre une variété de pêche non acide ‘Ferjalou Jalousia®’ et une variété de nectarine normalement acide, ‘Fantasia’ (JxF) a été analysée pour différents caractères agronomiques dont l’acidité du fruit. Cette descendance a servi à la réalisation d’une carte génétique et ainsi à la localisation du locus D sur le groupe de liaison 5 (GL5). Ce locus co-localise avec des QTL à effet majeur impliqués dans l’acidité titrable, le pH, la teneur en acides organiques ainsi que des QTL à effet plus faible pour la teneur en sucres solubles. De nombreux gènes candidats impliqués dans la synthèse des acides organiques, la dégradation et le stockage vacuolaire avaient été précédemment étudiés. Cependant, aucun gène candidat n’a encore été cartographié dans la région du locus D, excluant ainsi leur rôle direct dans le contrôle de l’acidité du fruit. Ceci s’explique par la complexité des voies métaboliques des acides organiques et par l’implication de transporteurs, de canaux et de pompes à protons qui rendent l'identification du ou des gène(s) associés au locus D plus complexe par une approche gène candidat. Par conséquent, une approche de clonage positionnel a été menée dans la présente étude afin d’identifier le ou les gène(s) intervenant dans le contrôle de l’acidité du fruit chez le pêcher dans le but de comprendre les mécanismes moléculaires et physiologiques sous-jacents. La recherche de marqueurs liés au locus D a été réalisée par BSA-AFLP. Trente quatre marqueurs AFLP ont été cartographiés sur le GL5 et les six marqueurs les plus proches ont été convertis en marqueurs SCAR codominants. Une carte génétique fine de la région contenant le locus D a ensuite été réalisée à partir d’une descendance F2 élargie à 1 718 individus et à l’aide des six marqueurs SCAR et de trois marqueurs microsatellites précédemment cartographiés dans cette région. L’ensemble des données de génotypage et de phénotypage des individus ayant subi un événement de recombinaison dans la région du locus d’intérêt, a permis la localisation précise du locus D dans un intervalle de 0,4 cM. En parallèle, une banque BAC d’une couverture estimée à 15 fois la taille du génome haploïde du pêcher a été réalisée et son criblage a permis d’évaluer le rapport distance physique/distance génétique dans cette région à 250 kb/cM. Après deux étapes de marche sur le chromosome, une carte physique de la région a été construite en intégrant 16 marqueurs issus du séquençage d’extrémités de BAC. Un clone BAC de 98 kb contenant l’allèle D et un autre de 78 kb contenant l’allèle d ont été séquencés. L’annotation des séquences des deux allèles a mis en évidence onze gènes candidats. De nouveaux marqueurs développés à partir des séquences de ces deux BAC ont ensuite permis de préciser la localisation du locus d’intérêt dans un intervalle de 16 kb. Dans cette région deux gènes ont été identifiés : un gène de résistance et un gène codant pour un transporteur. Une approche transcriptionnelle a été initiée en complément du clonage positionnel afin de fournir un premier élément pouvant confirmer l’implication d’un ou plusieurs gène(s) candidat(s) positionnel(s) dans l’acidité du fruit chez le pêcher.