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La maladie d’Alzheimer est majoritairement sporadique et peu est connu sur les mécanismes déclenchant le développement de cette forme de la maladie. Les études sur la forme familiale ont attribué une importance particulière à la bêta-amyloïde (Aβ), un produit de clivage du précurseur de la protéine amyloïde (APP). Plusieurs facteurs de risques ont été identifiés comme déclencheurs potentiels du développement de la maladie d’Alzheimer dont le diabète de type II (T2D). En effet, la déficience de la signalisation de l’insuline par la désensibilisation des récepteurs de l’insuline (IR) dans le cerveau semble être une caractéristique commune aux deux maladies. Les effets à long terme de la résistance à l’insuline sur l’accumulation d’Aβ et sur la phosphorylation de Tau ont été étudiés, mais les effets de la perturbation aiguë des IR sont moins bien caractérisés. Aussi, les désordres métaboliques sont également des caractéristiques communes aux deux maladies. Le but de notre étude est de déterminer si la perturbation aiguë des IR peut affecter le clivage de l’APP et si la privation énergétique par le jeûne peut sensibiliser ce clivage à la perturbation aiguë des IR. Pour évaluer ceci, nous avons utilisé la Tyrphostin AG1024 à faible dose pour simuler une perturbation des IR plutôt qu’un blocage complet des récepteurs. Pour quantifié le clivage de l’APP, nous avons mesuré les changements de la quantité d’APP taille pleine totale par immunobuvardage de type Western. Pour s’assurer que les changements de la quantité d’APP taille pleine traduisait bien un clivage, nous avons développé un système de lecture par luciférase. Ce système nous permet de suivre le clivage de l’APP via l’expression de la luciférase Firefly puisque le facteur de transcription GAL4 est lié à la portion C-terminale de l’APP . Tout d’abord, nous avons observé que la perturbation aiguë des IR par la Tyrphostin mène au clivage de l’APP et que le jeûne augmente la vulnérabilité au clivage de l’APP suite à une plus petite dose de Tyrphostin. Ce clivage serait imputable à la voie amyloïdogénique puisque l’inhibition de la β-secrétase et de la γ-secrétase empêche le clivage de l’APP. Nous avons aussi montré que la perturbation des IR est nécessaire alors que la perturbation spécifique des IGF-1R n’est pas suffisante. De plus, ni l’autophagie, ni les caspases et ni le protéasomes ne semblent impliqués dans le clivage de l’APP suivant la combinaison du jeûne et de la petite perturbation des IR. L’activité de mTOR n’est également pas requise. Cependant, l’activité de la GSK3 est nécessaire au clivage et semble affecter le clivage par la γ-secrétase. Nous avons ensuite confirmé dans des cultures primaires neuronales que la combinaison du jeûne et de la perturbation aiguë des IR cause le clivage de l’APP et que la GSK3 est encore une fois fortement active. Ainsi, nos résultats suggèrent que la perturbation de la signalisation de l’insuline tel qu’observé dans le T2D augmente le clivage de l’APP via la voie amyloïdogénique et, donc, contribue à la pathologie de la maladie d’Alzheimer., Little is known about the mechanisms that trigger the onset of Alzheimer’s disease (AD), a primarily sporadic disease. Studies on the familial form of AD attributed a particular importance to Amyloid beta (Aβ), a cleavage product of the Amyloid precursor protein (APP). Many risk factors have been identified as potential triggers of the development of AD including Type 2 diabetes (T2D). Indeed, the impairment of insulin signaling by the desensitization of insulin receptors (IR) in the brain seems to be a common hallmark of both diseases. The long term effects of IR resistance on the accumulation of Aβ and Tau hyperphosphorylation have been studied, but the acute effects of IR perturbation is less characterized. Also, both diseases show metabolic defects. Our research aimed to determine whether acute perturbation of IR signaling affects APP processing and if starving (energy deprivation) could sensitize this processing to acute perturbation of IR. To assess this, we used small doses of Tyrphostin AG1024 to simulate IR perturbations rather than a complete blocakade of the receptors. To quantify APP processing, we measured the change of total full- lenght APP by Western blot. To ensure that this change reflected APP processing we developed a luciferase based readout system. This system allowed us to monitor the occurrence of APP cleavage via GAL4-UAS Firefly luciferase driven expression because we linked GAL4 transcription factor to the C-terminal region of APP. First, we showed that IR perturbation with Tyrphostin leads to APP processing and that starving increased IR susceptibility to a smaller doses of Tyrphostin. This APP processing occurs via the amyloidogenic pathway because inhibition of β- and γ-secretase inhibited APP processing. We showed that this processing absolutely requires IR perturbation, while IGF-1R perturbation alone is insufficient. Furthermore, neither autophagy, caspases nor proteasome seemed to be implicated in APP processing following starvation and small IR perturbation. The activity of mTOR is also not required. On the contrary, GSK3 activation is necessary for the processing and seems to affect γ-secretase cleavage. We then confirmed in primary cultured neurons that the combination of acute starvation and small IR perturbation causes APP cleavage and GSK3 is again strongly activated. Taken together, our results suggest that the impairment of IR signalling seen in T2D increases the processing of APP via the amyloidogenic pathway and thereby contributes to the pathology of AD.

Alzheimer's disease is the most common type of dementia in the elderly; it is characterized by early deficits in learning and memory formation and ultimately leads to a generalised loss of higher cognitive functions. While amyloid beta (Aβ) and tau are traditionally associated with the development of Alzheimer disease, recent studies suggest that other factors, like the intracellular domain (APP-ICD) of the amyloid precursor protein (APP), could play a role. In this study, we investigated whether APP-ICD could affect synaptic transmission and synaptic plasticity in the hippocampus, which is involved in learning and memory processes. Our results indicated that overexpression of APP-ICD in hippocampal CA1 neurons leads to a decrease in evoked AMPA-receptor and NMDA-receptor dependent synaptic transmission. Our study demonstrated that this effect is specific for APP-ICD since its closest homologue APLP2-ICD did not reproduce this effect. In addition, APP-ICD blocks the induction of long term potentiation (LTP) and leads to increased of expression and facilitated induction of long term depression (LTD), while APLP2-ICD shows neither of these effects. Our study showed that this difference observed in synaptic transmission and plasticity between the two intracellular domains resides in the difference of one alanine in the APP-ICD versus a proline in the APLP2-ICD. Exchanging this critical amino-acid through point-mutation, we observed that APP(PAV)-ICD had no longer an effect on synaptic plasticity. We also demonstrated that APLP2(AAV)-ICD mimic the effect of APP-ICD in regards of facilitated LTD. Next we showed that the full length APP-APLP2-APP (APP with a substitution of the Aβ component for its homologous APLP2 part) had no effect on synaptic transmission or synaptic plasticity when compared to the APP-ICD. However, by activating caspase cleavage prior to induction of LTD or LTP, we observed an LTD facilitation and a block of LTP with APP-APLP2-APP, effects that were not seen with the full length APLP2 protein. APP is phosphorylated at threonine 668 (Thr668), which is localized directly after the aforementioned critical alanine and the caspase cleavage site in APP-APLP2-APP. Mutating this Thr668 for an alanine abolishes the effects on LTD and restores LTP induction. Finally, we showed that the facilitation of LTD with APP-APLP2-APP involves ryanodine receptor dependent calcium release from intracellular stores. Taken together, we propose the emergence of a new APP intracellular domain, which plays a critical role in the regulation of synaptic plasticity and by extension, could play a role in the development of memory loss in Alzheimer’s disease., La maladie d’Alzheimer est la forme la plus commune de démence liée au vieillissement ; elle est caractérisée par des déficits précoces d’apprentissage et de mémorisation et entraîne à terme une perte généralisée des fonctions cognitives supérieures. Alors que l’amyloïde-bêta (Aβ) et la protéine tau sont traditionnellement associées au développement de la maladie d’Alzheimer, des études récentes suggèrent que d’autres facteurs, tels que le domaine intracellulaire (APP-ICD) du précurseur de la protéine amyloïde (APP), pourraient jouer un rôle. Dans notre étude, nous avons testé si l’APP-ICD pourrait affecter les mécanismes de transmission ou de plasticité synaptique dans l’hippocampe, qui sous-tendent les processus d’apprentissage et de mémorisation. Nos résultats ont indiqué que la surexpression de l’APP-ICD dans des neurones du CA1 de l’hippocampe entraînait une diminution de la transmission synaptique dépendante des récepteurs AMPA et NMDA. Notre étude a montré que cet effet était spécifique de l’APP-ICD puisque son plus proche homologue l’APLP2-ICD n’a pas eu cet effet. De plus, l’APP-ICD entraînait un blocage de la potentialisation à long terme (LTP), une augmentation de l’expression et une facilitation de l’induction de la dépression à long terme (LTD), mais l’APLP2-ICD n’a eu aucun de ces effets. Notre étude a montré que cette différence observée en transmission et en plasticité synaptique entre les deux peptides réside dans le changement d’une seule alanine dans l’APP-ICD pour une proline dans l’APLP2-ICD, et que l’APP(PAV)-ICD n’avait pas d’effet sur la plasticité synaptique. Nous avons aussi démontré que l’APLP2(AAV)-ICD mimait l’effet de l’APP-ICD pour la facilitation de la LTD. Ensuite nous avons montré que la longue forme APP-APLP2-APP (APP avec un changement de la séquence de l’Aβ pour celle homologue de l’APLP2) ne montrait pas d’effet en comparaison avec l’APP-ICD, ni sur la transmission synaptique ni sur la plasticité synaptique. Cependant, en activant le clivage par les caspases préalablement à l’induction de la LTD ou la LTP, nous avons observé une facilitation de la LTD et un iii blocage de la LTP avec l’APP-APLP2-APP, des effets que nous n’avons pas reproduit avec la longue forme APLP2. La thréonine 668 phosphorylable se trouve immédiatement après l’alanine et le site de clivage par les caspases dans l’APP-APLP2-APP. La mutation de la Thr668 pour une alanine a aboli son effet sur la LTD et restauré la LTP. Finalement, nous avons montré que la facilitation de la LTD par l’APP-APLP2-APP dépendait de la libération de calcium intracellulaire par les récepteurs ryanodines. En conséquence, nous proposons l’émergence d’un nouveau domaine de l’APP jouant un rôle critique, en plus de l’Aβ, dans les processus à la base de l’apprentissage et qui en conséquence pourrait jouer un rôle dans le développement de la maladie d’Alzheimer.

Subclinical psychoaffective symptoms of anxiety and depression are common in the elderly and are associated with an increased risk of developing dementia and progressing from a pre-dementia stage to a dementia stage. However, they could also be symptoms associated with dementia and could be a clinical manifestation of the underlying pathology. The aim of this thesis was to contribute towards a better understanding of the links between anxiety and depressive symptoms and Alzheimer's disease (AD) hallmarks, including cognitive, structural, functional and molecular modifications, both in normal aging and during the course of this pathology. Our results show that higher anxiety symptoms are associated with lower grey matter volume in cognitively healthy elderly subjects, but only in women. This same association is present in all Subjective Cognitive Decline (SCD) participants recruited from the general population, and shows an increased vulnerability to age-related neurodegenerative diseases such as dementia. In Subjective Cognitive Decline (SCD) subjects, high depressive symptoms are associated with greater amyloid load in the brain, and thus an increased risk of developing AD, while in amyloid-positive Mild Cognitive Impairment (MCI) and AD subjects, they are related to better cognition and awareness of their cognitive deficits. Psychoaffective symptoms thus seem to have an evolving role during the transition from normal aging to pathological aging; they first manifest a brain vulnerability, then an underlying pathology and a risk of developing AD, and then are a marker of preservation in patients with cognitive decline (MCI and AD).; Les symptômes psychoaffectifs anxieux et dépressifs infra-cliniques sont fréquents chez les personnes âgées et sont associés à un risque accru de développer une démence et de progresser d’un stade prédémentiel à un stade démentiel. Cependant, ils pourraient également être des symptômes associés à une démence, et pourraient constituer une manifestation clinique de la pathologie sous-jacente. L’objectif de cette thèse était de contribuer à une meilleure compréhension des liens entre symptômes anxieux et dépressifs et les modifications cognitives et cérébrales structurales, fonctionnelles et moléculaires typiques de la maladie d’Alzheimer (MA), à la fois dans le vieillissement normal et au cours de cette pathologie. Nos résultats montrent que des symptômes anxieux élevés sont associés à un volume de substance grise plus bas chez les sujets âgés cognitivement sains, et ce uniquement chez les femmes. Cette même association est présente chez les sujets Subjective Cognitive Decline (SCD) recrutés dans la population générale, et montre une vulnérabilité accrue aux maladies neurodégénératives liées à l’âge, telles que les démences. Chez les SCD ayant consulté pour leur déclin cognitif subjectif, des symptômes dépressifs élevés sont associés à une charge amyloïde plus importante dans le cerveau, et donc à un risque accru de développer une MA, tandis que chez les sujets Mild Cognitive Impairment (MCI) et MA amyloïde positifs, ils sont liés à une meilleure cognition et conscience de ses propres troubles. Les symptômes psychoaffectifs semblent donc avoir un rôle évolutif au cours du passage du vieillissement normal au vieillissement pathologique, d’abord manifestation d’une vulnérabilité cérébrale, puis manifestation d’une pathologie sous-jacente et d’un risque de développement de MA, ils sont au contraire un marqueur de préservation chez les patients présentant un déclin cognitif (MCI et MA).

Subclinical psychoaffective symptoms of anxiety and depression are common in the elderly and are associated with an increased risk of developing dementia and progressing from a pre-dementia stage to a dementia stage. However, they could also be symptoms associated with dementia and could be a clinical manifestation of the underlying pathology. The aim of this thesis was to contribute towards a better understanding of the links between anxiety and depressive symptoms and Alzheimer's disease (AD) hallmarks, including cognitive, structural, functional and molecular modifications, both in normal aging and during the course of this pathology. Our results show that higher anxiety symptoms are associated with lower grey matter volume in cognitively healthy elderly subjects, but only in women. This same association is present in all Subjective Cognitive Decline (SCD) participants recruited from the general population, and shows an increased vulnerability to age-related neurodegenerative diseases such as dementia. In Subjective Cognitive Decline (SCD) subjects, high depressive symptoms are associated with greater amyloid load in the brain, and thus an increased risk of developing AD, while in amyloid-positive Mild Cognitive Impairment (MCI) and AD subjects, they are related to better cognition and awareness of their cognitive deficits. Psychoaffective symptoms thus seem to have an evolving role during the transition from normal aging to pathological aging; they first manifest a brain vulnerability, then an underlying pathology and a risk of developing AD, and then are a marker of preservation in patients with cognitive decline (MCI and AD)., Les symptômes psychoaffectifs anxieux et dépressifs infra-cliniques sont fréquents chez les personnes âgées et sont associés à un risque accru de développer une démence et de progresser d’un stade prédémentiel à un stade démentiel. Cependant, ils pourraient également être des symptômes associés à une démence, et pourraient constituer une manifestation clinique de la pathologie sous-jacente. L’objectif de cette thèse était de contribuer à une meilleure compréhension des liens entre symptômes anxieux et dépressifs et les modifications cognitives et cérébrales structurales, fonctionnelles et moléculaires typiques de la maladie d’Alzheimer (MA), à la fois dans le vieillissement normal et au cours de cette pathologie. Nos résultats montrent que des symptômes anxieux élevés sont associés à un volume de substance grise plus bas chez les sujets âgés cognitivement sains, et ce uniquement chez les femmes. Cette même association est présente chez les sujets Subjective Cognitive Decline (SCD) recrutés dans la population générale, et montre une vulnérabilité accrue aux maladies neurodégénératives liées à l’âge, telles que les démences. Chez les SCD ayant consulté pour leur déclin cognitif subjectif, des symptômes dépressifs élevés sont associés à une charge amyloïde plus importante dans le cerveau, et donc à un risque accru de développer une MA, tandis que chez les sujets Mild Cognitive Impairment (MCI) et MA amyloïde positifs, ils sont liés à une meilleure cognition et conscience de ses propres troubles. Les symptômes psychoaffectifs semblent donc avoir un rôle évolutif au cours du passage du vieillissement normal au vieillissement pathologique, d’abord manifestation d’une vulnérabilité cérébrale, puis manifestation d’une pathologie sous-jacente et d’un risque de développement de MA, ils sont au contraire un marqueur de préservation chez les patients présentant un déclin cognitif (MCI et MA).

Aux fondements de la vie, on retrouve les protéines qui agissent telles des nanomachines à l’échelle de la cellule. En effet, elles effectuent une immense diversité de tâches vitales à tout organisme vivant, allant de la transcription/traduction de l’ADN, au transport membranaire en passant par le métabolisme énergétique, etc. Les protéines sont des macromolécules composées de combinaisons des 20 acides aminés classiques. Sous l’effet des lois fondamentales de la physique, cette chaîne va se replier localement (structure secondaire) puis globalement (structure tertiaire). C’est cette dernière qui donne la fonction aux protéines et son étude se révèle donc primordiale. Les méthodes numériques offrent un complément indispensable à l’expérience pour la réalisation de cet immense défi. Ce mémoire s’articule autour de deux axes principaux. Le premier est l’étude du N-terminal de la protéine Huntingtine à l’aide de simulations numériques. Le second est l’optimisation et le développement de la famille de potentiel gros-grain OPEP. La protéine Huntingtine est à l’origine du développement de la maladie d’Huntington et son N-terminal est crucial pour son agrégation et son interaction avec la membrane. Suite à la proposition d’un premier modèle expérimental du N-terminal de Huntingtine, nous avons déterminé son ensemble structurel, en solution et en membrane, à l’aide de simulations tout-atome et de techniques d’échantillonnage avancées. Les motifs structurels et interactions dominantes observés sont mis en relation avec les modèles détaillés de son agrégation et de son ancrage dans la membrane. Finalement, les potentiels OPEP sont des potentiels gros-grain dont l’application s’est révélée un succès pour l’étude des protéines amyloïdes et pour la prédiction de structure tertiaire avec PEPFOLD. Le potentiel sOPEP fut optimisé sur de vastes ensembles de protéines avec comme résultat une amélioration de 25% au niveau des inégalités. La paramétrisation de sOPEP fut aussi testée à l’aide de simulation sur neuf protéines. En parallèle, nous développons le potentiel aaOPEP, qui portera la philosophie des potentiels OPEP en régime tout-atome. Ces potentiels sont intégrés à un code de dynamique moléculaire flexible qui permettra leur distribution., Proteins are the vital machinery of the cell and therefore are fundamental to life. They play a wide variety of roles from the transcription/translation of DNA to membrane transport to energy metabolism and many more. In terms of structure, proteins are macromolecules composed by the combination of 20 basic amino acids. Under the fundamental laws of physic, this chain will fold itself locally (secondary structure) and then globally (tertiary). This three dimensional structure gives rise to the protein’s function thus making the prediction of three dimensional structure a crucial aspect of protein study. Numerical techniques provide an essential tool to complement experiments in the study of proteins. The following thesis is divided into two main research axes. The first one is the study, via numerical techniques, of the N-terminal of the Huntingtin protein. The second one is the optimization and the development of the coarse grained forcefield family OPEP. First, we present our study of Huntingtin’s N-terminal. The Huntingtin protein is associated with the Huntington disease and its N-terminal is crucial for the protein aggregation and anchoring inside the membrane. Following the proposition of a first experimental model of the N-terminal, we determined its structural ensemble in aqueous solution and membrane environment. To do so, we used powerful sampling techniques in the all-atom regime. Our discoveries are linked to Huntingtin’s aggregation and membrane association models. Finally, the last chapter discusses the optimization of the sOPEP and aaOPEP forcefield. The coarse grained OPEP forcefields were successfully applied to multiple studies, most notably for the simulation of amyloid peptides and the tertiary structure prediction using the PEPFOLD methodology. Vast protein ensemble were generated and used in the optimization of sOPEP resulting in 25% of improvement compared to the previous version on our decoys set. The parametrization is also validated by short molecular dynamic simulations on nine proteins. In parallel, we develop the new aaOPEP, a forcefield that will use the OPEP philosophy but in the all-atom regime. Those potential are included in a flexible molecular dynamic code that will be available to everyone when completed.

Resume L’amyloidose hepatique est une maladie tres rare et fatale, touchant le Sharpei dans l’espece canine et principalement les races Siamois, Abyssin et Orientaux dans l’espece feline. Un phenomene inflammatoire chronique est le plus souvent a l’origine d’un depot de substance amyloide au sein des organes, en particulier les reins et le foie ; l’infiltration d’amyloide peut etre majeure et conduire a des signes cliniques d’insuffisance renale et/ou hepatique. Ces symptomes sont peu specifiques, le diagnostic est souvent tardif et le pronostic sombre. Les traitements sont peu efficaces a ce jour.

Structural properties and noncovalent interactions within biologically relevant molecular systems are crucial for their activity. They are especially important for the specific binding of drugs on receptors in living organisms. Besides, studying molecules in the gas phase allows measuring their intrinsic properties because of the absence of solvent effects. Precise information can then be extracted from the comparison between experimental data and state-of-the-art quantum chemistry calculations. Our research group aims to describe the structural changes occurring within peptides, oligonucleotides and pharmaceutically relevant complexes: we compare results from simulations and two complementary experimental techniques, IRMPD spectroscopy and ion mobility spectrometry. In this PhD thesis, I have tested for the first time the performances of a QM/MM method for the simulation of the IR spectra of isolated biomolecular systems. It allowed me to simulate the IR spectrum of amyloid β-protein strands containing more than 250 atoms. We found that the solvent in which these strands are diluted has a big influence on their gas-phase secondary structure: in the case of polar solvents, globular ones dominate, whereas a weak dielectric constant tends to favor helical structures. The structural changes upon receptor binding on vancomycin, a glycopeptide antibiotic, have also been studied. The receptor binding site in the protonated complexes is not the pocket which can be seen in X-ray scattering data, but the specific interactions responsible for the high binding constant of the complex in solution remains intact in the deprotonated species.; Les caractéristiques structurales et les interactions intra et/ou intermoléculaires non-covalentes jouent un rôle primordial dans l'activité des molécules d'intérêt biologique, notamment lors de la reconnaissance moléculaire entre un médicament et son récepteur. Par ailleurs, on peut connaître par les études en phase gazeuse (sans les effets du solvant) les propriétés intrinsèques des systèmes moléculaires. Des calculs de chimie quantique élaborés peuvent ainsi être comparés aux résultats des expériences pour en tirer des informations précises. L'équipe AMIBES tente ainsi de décrire les structures de peptides, d'oligonucléotides ou de complexes d'intérêt pharmaceutiques. Pour cela, nous prenons appui sur deux techniques expérimentales complémentaires, la spectroscopie IRMPD et la spectrométrie de mobilité ionique, dont les résultats sont comparés avec des simulations. Dans ce travail de thèse, j'ai d'abord testé les prédictions d'une méthode QM/MM en ce qui concerne le calcul des spectres IR d'espèces d'intérêt biologique isolées. J'ai ensuite utilisé cette méthode pour simuler les spectres IR de brins de la protéine amyloïde β en phase gazeuse. Il ressort de ces études que leur structure secondaire varie selon l'état de protonation et le solvant dans lequel ils sont dissous: un solvant polaire favorise les structures globulaires, alors qu'une constante diélectrique plus basse permet de conserver une structure en hélice α. Je me suis également intéressé aux changements de structure induits par la complexation d'un antibiotique, la vancomycine, avec un modèle de son récepteur. En mode positif, le site de fixation de celui-ci est différent de celui révélé par la cristallographie, mais les interactions spécifiques responsables de la grande constante d'affinité en solution sont conservées dans le complexe déprotoné.

Structural properties and noncovalent interactions within biologically relevant molecular systems are crucial for their activity. They are especially important for the specific binding of drugs on receptors in living organisms. Besides, studying molecules in the gas phase allows measuring their intrinsic properties because of the absence of solvent effects. Precise information can then be extracted from the comparison between experimental data and state-of-the-art quantum chemistry calculations. Our research group aims to describe the structural changes occurring within peptides, oligonucleotides and pharmaceutically relevant complexes: we compare results from simulations and two complementary experimental techniques, IRMPD spectroscopy and ion mobility spectrometry. In this PhD thesis, I have tested for the first time the performances of a QM/MM method for the simulation of the IR spectra of isolated biomolecular systems. It allowed me to simulate the IR spectrum of amyloid β-protein strands containing more than 250 atoms. We found that the solvent in which these strands are diluted has a big influence on their gas-phase secondary structure: in the case of polar solvents, globular ones dominate, whereas a weak dielectric constant tends to favor helical structures. The structural changes upon receptor binding on vancomycin, a glycopeptide antibiotic, have also been studied. The receptor binding site in the protonated complexes is not the pocket which can be seen in X-ray scattering data, but the specific interactions responsible for the high binding constant of the complex in solution remains intact in the deprotonated species., Les caractéristiques structurales et les interactions intra et/ou intermoléculaires non-covalentes jouent un rôle primordial dans l'activité des molécules d'intérêt biologique, notamment lors de la reconnaissance moléculaire entre un médicament et son récepteur. Par ailleurs, on peut connaître par les études en phase gazeuse (sans les effets du solvant) les propriétés intrinsèques des systèmes moléculaires. Des calculs de chimie quantique élaborés peuvent ainsi être comparés aux résultats des expériences pour en tirer des informations précises. L'équipe AMIBES tente ainsi de décrire les structures de peptides, d'oligonucléotides ou de complexes d'intérêt pharmaceutiques. Pour cela, nous prenons appui sur deux techniques expérimentales complémentaires, la spectroscopie IRMPD et la spectrométrie de mobilité ionique, dont les résultats sont comparés avec des simulations. Dans ce travail de thèse, j'ai d'abord testé les prédictions d'une méthode QM/MM en ce qui concerne le calcul des spectres IR d'espèces d'intérêt biologique isolées. J'ai ensuite utilisé cette méthode pour simuler les spectres IR de brins de la protéine amyloïde β en phase gazeuse. Il ressort de ces études que leur structure secondaire varie selon l'état de protonation et le solvant dans lequel ils sont dissous: un solvant polaire favorise les structures globulaires, alors qu'une constante diélectrique plus basse permet de conserver une structure en hélice α. Je me suis également intéressé aux changements de structure induits par la complexation d'un antibiotique, la vancomycine, avec un modèle de son récepteur. En mode positif, le site de fixation de celui-ci est différent de celui révélé par la cristallographie, mais les interactions spécifiques responsables de la grande constante d'affinité en solution sont conservées dans le complexe déprotoné.

Soluble beta-amyloid (A-beta) oligomers putatively play a critical role in the early synapse loss and cognitive impairment observed in Alzheimer's disease. We previously demonstrated that A-beta oligomers activate cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) which specifically releases arachidonic acid from membrane phospholipids. By using a single A-beta oligomers intra cerebro ventricular injection, we observed that cPLA2 gene suppression prevents both the alterations of cognitive abilities and the reduction of hippocampal synaptic markers levels which are observed in wild type mice. We further demonstrated that the A-beta oligomers-induced sphingomyelinase activation is suppressed and that the phosphorylation of Akt/PKB is preserved in neuronal cells isolated from KO mice. Interestingly, expression of the A-beta precursor protein (APP) is reduced in hippocampus homogenates and neuronal cells from KO mice, but the relationship with the resistance of these mice to the A-beta oligomers toxicity requires further investigation. These results therefore show that cPLA2 plays a key role in the A-beta oligomers-associated neurodegenerative effects, and as such represents a potential therapeutic target for the treatment of Alzheimer's disease, Les oligomères solubles de peptide Bêta-amyloïde (A-bêta) apparaissent comme les acteurs majeurs de la perte synaptique précoce observée au cours de la maladie d'Alzheimer. Notre équipe a précédemment montré que ces oligomères de peptide A-bêta activent la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2), qui entraîne la libération d'acide arachidonique à partir des phospholipides membranaires. En utilisant un modèle d'injection intra cérébro ventriculaire unique d'une faible quantité de peptide A-bêta, nous avons pu observer que l'inactivation constitutive du gène de la cPLA2 protége les souris KO contre les perturbations mnésiques et empêche la réduction de l'expression de protéines synaptiques au sein de l'hippocampe, ces deux effets délétères étant constatés chez les animaux wild-type. Par la suite, nous avons montré que l'activation des sphingomyélinases, consécutive à l'exposition aux oligomères A-bêta, est indétectable dans des neurones en culture issus de souris KO. Dans ces mêmes neurones KO, nous avons constaté que la phosphorylation de Akt/PKB n'est pas altérée suite à l'exposition des cellules aux oligomères A-bêta. Enfin, nous avons pu mettre en évidence une diminution de l'expression de la protéine précurseur du peptide A-bêta (protéine APP), tant au niveau d'homogénats hippocampiques que de neurones en cultures, issus de souris KO. Néanmoins, des travaux supplémentaires sont requis pour établir le lien exact entre cette réduction de l'expression d'APP et la résistance aux oligomères A-bêta, tant in vitro qu'in vivo. Toutefois, ces résultats soulignent l'implication de la cPLA2 dans la neuro dégénérescence entrainée par les oligomères A-bêta, et font apparaitre cette enzyme comme une cible thérapeutique potentielle pour le traitement de la maladie d'Alzheimer

The peptidic bond in a peptide or a protein is usually flat and in trans conformation for the majority of amino acids. The situation is a little bit different upstream the proline: the thermodynamic barrier which opposes the rotation of the amide bond is weaker and the tendency of the bond to remain flat is lesser. So, this AA-Pro bond can adopt a cis conformation, leading to the formation of a turn in the peptidic chain. This work describes the synthesis and the chemical reactivity of new bis-nitrogen analogous of proline in solution to facilitate the cis conformation of a AA-PPro bond. The conformational impact that these residues may generate in pseudopeptides is also exposed.Initially, a new access road to the orthogonally protected and enantiomerically pure azaproline has been developed by exploiting previous work on the synthesis of hydrazinoesters and N-aminodipeptides. The study of the reactivity of this pseudoproline helped define the best conditions for forming pseudotripeptides of formula P1-AA1--azaPro-AA3-P3. It also guided the work, in a second step, towards the synthesis of pseudopeptide incorporating a pyrazole acid motif. Finally, the structure of the prepared compounds was analyzed by NMR, IR and molecular modeling. Examination of the P1-AA1-azaPro(Boc)-AA3-P3 revealed the formation of a pseudocycle C7 by a Hydrogen bond, favoring the trans conformation of the AA1-azaPro bond, while the absence of Boc function seems to favor the cis conformation of this bond., La liaison peptidique au sein d'un peptide ou d'une protéine est d'ordinaire plane et en conformation trans pour la majorité des acides aminés. La situation est un peu différente en amont d'une proline : la barrière thermodynamique qui s'oppose à la rotation de la liaison amide est plus faible et la tendance de la liaison à rester plane est un peu moins grande. Cette liaison AA-Pro peut donc adopter une conformation cis, entraînant la formation d'un coude prononcé dans une chaîne peptidique à son niveau. Ce travail décrit la synthèse et la réactivité chimique de nouveaux analogues bis-azotés de la proline en solution permettant de favoriser la conformation cis d'une liaison AA-Pro. L'impact conformationnel que peut engendrer ces résidus au sein de pseudopeptides est également exposé. Dans un premier temps, une nouvelle voie d'accès à la azaproline énantiomériquement pure et orthogonalement protégée a été mise au point en exploitant des travaux antérieurs concernant la synthèse d'hydrazinoesters et de N-aminodipeptides. L'étude de la réactivité de cette pseudoproline a permis de définir les meilleures conditions de formations de pseudotripeptides de formule P1-AA1-azaPro-AA3-P3. Elle a également orienté les travaux, dans un second temps, vers la synthèse de pseudopeptides incorporant un motif acide pyrazolique. Enfin, la structure des composés préparés a été analysée par RMN, IR et par modélisation moléculaire. L'examen des P1-AA1-azaPro(Boc)-AA3-P3 a révélé la formation par liaison hydrogène d'un pseudocycle en C7, favorisant la conformation trans de la liaison AA1-azaPro, alors que l'absence de la fonction Boc favorise la conformation cis de cette liaison.

The peptidic bond in a peptide or a protein is usually flat and in trans conformation for the majority of amino acids. The situation is a little bit different upstream the proline: the thermodynamic barrier which opposes the rotation of the amide bond is weaker and the tendency of the bond to remain flat is lesser. So, this AA-Pro bond can adopt a cis conformation, leading to the formation of a turn in the peptidic chain. This work describes the synthesis and the chemical reactivity of new bis-nitrogen analogous of proline in solution to facilitate the cis conformation of a AA-PPro bond. The conformational impact that these residues may generate in pseudopeptides is also exposed.Initially, a new access road to the orthogonally protected and enantiomerically pure azaproline has been developed by exploiting previous work on the synthesis of hydrazinoesters and N-aminodipeptides. The study of the reactivity of this pseudoproline helped define the best conditions for forming pseudotripeptides of formula P1-AA1--azaPro-AA3-P3. It also guided the work, in a second step, towards the synthesis of pseudopeptide incorporating a pyrazole acid motif. Finally, the structure of the prepared compounds was analyzed by NMR, IR and molecular modeling. Examination of the P1-AA1-azaPro(Boc)-AA3-P3 revealed the formation of a pseudocycle C7 by a Hydrogen bond, favoring the trans conformation of the AA1-azaPro bond, while the absence of Boc function seems to favor the cis conformation of this bond.; La liaison peptidique au sein d'un peptide ou d'une protéine est d'ordinaire plane et en conformation trans pour la majorité des acides aminés. La situation est un peu différente en amont d'une proline : la barrière thermodynamique qui s'oppose à la rotation de la liaison amide est plus faible et la tendance de la liaison à rester plane est un peu moins grande. Cette liaison AA-Pro peut donc adopter une conformation cis, entraînant la formation d'un coude prononcé dans une chaîne peptidique à son niveau. Ce travail décrit la synthèse et la réactivité chimique de nouveaux analogues bis-azotés de la proline en solution permettant de favoriser la conformation cis d'une liaison AA-Pro. L'impact conformationnel que peut engendrer ces résidus au sein de pseudopeptides est également exposé. Dans un premier temps, une nouvelle voie d'accès à la azaproline énantiomériquement pure et orthogonalement protégée a été mise au point en exploitant des travaux antérieurs concernant la synthèse d'hydrazinoesters et de N-aminodipeptides. L'étude de la réactivité de cette pseudoproline a permis de définir les meilleures conditions de formations de pseudotripeptides de formule P1-AA1-azaPro-AA3-P3. Elle a également orienté les travaux, dans un second temps, vers la synthèse de pseudopeptides incorporant un motif acide pyrazolique. Enfin, la structure des composés préparés a été analysée par RMN, IR et par modélisation moléculaire. L'examen des P1-AA1-azaPro(Boc)-AA3-P3 a révélé la formation par liaison hydrogène d'un pseudocycle en C7, favorisant la conformation trans de la liaison AA1-azaPro, alors que l'absence de la fonction Boc favorise la conformation cis de cette liaison.

No cure against Alzheimer's Disease (AD) exists yet, justifying the development of therapeutic strategies. Toxicity of soluble amyloid peptide is a key-player in early synaptic and cellular loss in AD. According to this hypothesis, we propose that preventing A peptide effects could prevent cogninitive decline in AD. Neurotrophic factors are good candidates to prevent cell death but require a targeted and continuous delivery. We used the cell encapsulation technology to produce graftable bioreactors that contain C2C12 cells secreting the Ciliary Neurotrophic factor (CNTF). Our goal was to realize the proof-of-concept that CNTF long term in situ delivery could prevent A-induced cognitive decline.Our studies prove that bioreactor-produced CNTF prevents A-induced cytotoxicity and apoptosis in vitro. Neuroprotection relies on PI3K and STAT3 activation. In vivo, bioreactor implantation in brain prevents cognitive impairment induced by A icv injection or delays their appearance in Tg2576 mice. In both of our preclinical model of AD, behavioral protection was associated with synapse maintenance in hippocampus.Therefore, in situ long term CNTF delivery is an efficient preventive therapeutic strategy against toxicity and A-linked cognitive disturbances. These results also suggest that encapsulated cells graft is a good way to deliver therapeutic molecules to the brain., Aucun traitement de la maladie d'Alzheimer (MA) n'existe, justifiant le développement de stratégies thérapeutiques. La toxicité des oligomères solubles du peptide amyloïde (A) est centrale dans les pertes synaptiques et cellulaires précoces dans la maladie. Dans le cadre de cette hypothèse, nous proposons qu?empêcher ces effets puisse prévenir le déclin cognitif dans la MA. Les facteurs neurotrophiques sont de bons candidats pour prévenir la mort cellulaire mais nécessitent une application ciblée et continue. Nous avons utilisé la technologie d'encapsulation cellulaire pour produire des bioréacteurs implantables contenant des cellules C2C12 sécrétant le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF). Notre objectif était d'établir la preuve du concept que la production à long terme de CNTF in situ dans le cerveau puisse prévenir les déficits cognitifs liés à l'A. Nos études prouvent que le CNTF produit par les bioréacteurs prévient la cytotoxicité et l'apoptose induites par le peptide A in vitro. La neuroprotection dépend de l'activation de la PI3-Kinase et du facteur STAT3. In vivo, l'implantation des bioréacteurs dans le cerveau prévient les troubles cognitifs induits par l'injection icv d'A ou retarde leur apparition chez la souris Tg2576. Dans nos deux modèles précliniques de la MA, la protection comportementale est associée au maintien des protéines synaptiques dans l'hippocampe. Aussi, la production in situ de CNTF est une approche thérapeutique préventive efficace contre la toxicité et les déficits cognitifs liés à l'A. Ces résultats suggèrent également que l'implantation de cellules encapsulées est un bon procédé pour délivrer des molécules thérapeutiques au cerveau.

Alzheimer's disease (AD) is a progressive dementia characterised in the early stages by synaptic loss and neurodegeneration. Currently, no effective treatments are available and the molecular mechanisms implicated are still unknown. Recent studies, including ours, indicate that the direct interaction between soluble amyloid-ß (Aß) oligomers and the plasma membrane initiates a cellular stress involving apoptotic cascades. The present work focuses on the impact of lipid status on neuronal susceptibility to the toxicity of soluble Aß peptide and on the pro-apoptotic signalling pathways. We showed that this peptide induces membrane remodelling, thereby activating pro-apoptotic pathways and inhibiting survival signalling, which leads to neuronal cell death. This was however prevented in neurons cultured in a medium supplemented with docosahexaenoic acid (DHA), an ?3 polyunsaturated fatty acid. This protective effect seems to rely on subtle local membrane remodelling due to DHA incorporation, which maintains active survival and growth pathways. DHA did not prevent either cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) or oxidative stress upon soluble Aß peptide exposure. These two events have already been reported by our team to be implicated in a pro-apoptotic cascade leading to ceramide production due to the activation of sphingomyelinases. These enzymes very likely play a central role in Aß peptide toxicity, as pretreatments with DHA or sphingosine-1-phosphate, a well-known anti-apoptotic compound, lead to neuronal protection through the inhibition of acid sphingomyelinase. This PhD thesis demonstrates that lipids, as structural molecules as well as signalling mediators, are essential players that could be used to develop strategies for the prevention or treatment of AD, La maladie d'Alzheimer (MA) est une démence progressive caractérisée dans ses stades précoces par une perte synaptique et une dégénérescence neuronale. Aucun traitement efficace n'est disponible à ce jour et les mécanismes moléculaires impliqués sont encore mal connus. Des études récentes, menées notamment par notre équipe, indiquent que les oligomères de peptide amyloïde-ß (Aß) interagissent avec la membrane plasmique et y induisent un stress cellulaire impliquant des cascades apoptotiques. Ce travail a été consacré à l'étude de l'influence du statut lipidique sur la sensibilité des neurones au peptide Aß soluble et sur la signalisation pro-apoptotique. Nous avons montré que ce peptide induit un remodelage membranaire conduisant à la mort neuronale en activant des voies pro-apoptotiques et en inhibant des voies de survie. Par contre, la supplémentation du milieu en acide docosahexaénoïque (DHA), acide gras polyinsaturé de type ?3, protège les neurones de la mort induite par le peptide Aß. Cet effet préventif semble dépendre d'une incorporation du DHA pouvant localement induire un remodelage membranaire discret capable de préserver des voies de croissance et de survie cellulaire. Le DHA n'agit toutefois pas en inhibant l'activation de la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2) et le stress oxydant induits par le peptide Aß, mécanismes que nous avons observés être impliqués dans la voie pro-apoptotique menant à la production de céramides suite à l'activation des sphingomyélinases. Ces enzymes occupent une position essentielle dans la toxicité du peptide Aß, puisqu'un prétraitement par le DHA ou par la sphingosine-1-phosphate, connue pour son potentiel antiapoptotique, protège les neurones en inhibant la sphingomyélinase acide. Les travaux de cette thèse ont donc montré que les lipides, molécules structurales mais aussi médiateurs de signalisation, sont des acteurs essentiels à considérer pour le développement de stratégies préventives ou thérapeutiques contre la MA