Studium vlivu faradaických procesů na účinnost elektroporace kvasinek

Elektroporace je metoda široce využívaná v biotechnologii a ve zdravotnictví. Spočívá v aplikaci krátkých intenzivních elektrických pulzů, díky kterým dochází k tvorbě pórů v buněčné membráně. Skrze tyto póry následně dochází k výměně molekul mezi elektrolytem a intracelulárním prostředím. Ačkoli je elektroporace standardně využívanou technikou, její přesný mechanismus je stále neznámý a předmětem současného výzkumu. Předpokládá se, že hlavním mechanismem elektroporace je samotné působení elektrického pole. Nedávné studie však naznačují, že jedním z doprovodných mechanismů může být také působení reaktivních forem kyslíku (ROS) a obecně produktů faradaických procesů. Tyto silně oxidující molekuly mohou mít vliv jak na účinnost elektroporace, tak na viabilitu buněk. Hypotézou bylo, že anodizací elektroporačních elektrod, tj. vytvořením tenké vrstvy dielektrika na jejich povrchu je možné zabránit produkci ROS. Následným srovnáním účinnosti elektroporace za použití připravených kapacitních elektrod a klasických faradaických elektrod lze odhalit efekt ROS na elektroporaci. Byla zmapována produkce H2O2 jakožto zástupce ROS při použití standardních elektroporačních pufrů, protokolů a různých elektrodových materiálů. Koncentrace H2O2 byla stanovena spektrofotometricky jeho reakcí s 3,3',5,5'-tetramethylbenzidinem (TMB) za katalýzy enzymem křenová peroxidáza (HRP). Byly vybrány takové elektrody, aby bylo dosaženo nízké, střední a vysoké produkce H2O2. Vybrané elektrody byly použity k in vitro elektroporaci kvasinek Saccharomyces cerevisiae, přičemž účinnost permeabilizace byla stanovována elektrochemickou impedanční spektroskopií (EIS) a měřením fluorescence dopraveného propidium jodidu (PI). Bylo zjištěno, že působení ROS není hlavním mechanismem tvorby pórů v buněčné membráně během elektroporace a nemá významný vliv na účinnost této metody. Výsledky však nevylučují jejich roli v sekundárních procesech, které ovlivňují kinetiku uzavírání pórů a viabilitu buněk po elektropor
Electroporation is a widely used method in biotechnology and healthcare. It involves the application of short, intense electric pulses, which create pores in the cell membrane. These pores allow the exchange of molecules between the electrolyte and the intracellular environment. Although electroporation is a standard technique, its exact mechanism remains unknown and is the subject of current research. It is assumed that the primary mechanism of electroporation is the effect of the electric field itself. Recent studies, however, suggest that one of the accompanying mechanisms may also be the effect of reactive oxygen species (ROS) and generally the products of faradaic processes. These highly oxidizing molecules can influence both the efficiency of electroporation and cell viability. The hypothesis was that by anodizing electroporation electrodes, i.e., creating a thin dielectric layer on their surface, the production of ROS can be prevented. By subsequently comparing the efficiency of electroporation using prepared capacitive electrodes and classic faradaic electrodes, it would be possible to reveal the effect of ROS on electroporation. The production of H2O2, as a representative of ROS, was mapped using standard electroporation buffers, protocols, and various electrode materials. The concentration of H2O2 was determined spectrophotometrically by its reaction with 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) catalyzed by horseradish peroxidase (HRP). Electrodes were selected to achieve low, medium, and high production of H2O2. These selected electrodes were used for in vitro electroporation of Saccharomyces cerevisiae yeast, with the efficiency of permeabilization determined by electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and fluorescence measurement of propidium iodide (PI) intake. It was found that the action of ROS is not the primary mechanism of pore formation in the cell membrane during electroporation and does not significantly affect the efficiency of this method. H