Methods to study device induced aggregation of proteins

This work developed a method for the investigation of how medical devices, such as syringes and needles, affect the formation of subvisible particles in a protein drug without excipients. Protein-based pharmaceuticals are well known to be sensitive to different kinds of stress, and exposure to stress during the use of this device is unavoidable. To study this phenomenon, an in-house built probe for the operation of syringes with a texture analyser was created. Mechanical stress was modulated by varying the expulsion speed, and related forces were captured by the texture analyser. The formation of particles was evaluated by dynamic light scattering(DLS), size exclusion chromatography(SEC) and flow imaging microscopy by FlowCAM. The insulin was found to be primarily present in its hexamer form, with a hydrodynamic diameter of 5.6 nm. FlowCAM showed increased concentration of particles in both siliconized and non-siliconized syringes after mechanical stress. The increase was associated with protein aggregates in the non-siliconized syringe, while increase in the the siliconized was mainly associated to silicone oil droplet formation. The particles were categorized by sphericity using circle fit and aspect ratio, with spherical cutoff at 0.85. The siliconized syringe had no increase in protein aggregates after stress and displayed a substantial loss of native protein (2.5 %) according to SEC. This concedes with findings from other studies and might be due to oil interface adsorption. Although, the size distribution from FlowCAM yielded particle counts, which were theoretically too low to account for this loss alone.
Läkemedel som består av skräddarsydda proteiner används idag för att behandla bland annat diabetes. De ges traditionellt som injektioner och detta misstänks vara kopplat till skapandet av skadliga partiklar. Sprutan och nålen är ofta silikoniserade för att underlätta hantering och deras användning utsätter det känsliga proteinet för mekaniska krafter. Detta tros leda till bildandet av partiklar i form av silikon droppar och protein klumpar (aggregat). Detta arbete utvecklade därför en metod för att undersöka effekten av sprutor med nål på ostabiliserat insulin. En 3D printad spruthållare till en maskin som kan trycka och dra samtidigt som den mäter kraften (texturometer) designades för att kunna manövrera sprutan. Effekten av mekanisk påverkan undersöktes genom att variera tömningshastighastighen av sprutan. Endast hastigheter som var associerade med laminärt flöde underöktes. Osilikoniserade sprutor jämfördes mot silikoniserade. Tre vanligt förekommande analysmetoder (dynamisk ljusspridning, storlekskromatografi (SEC) och FlowCam) användes för att mäta partikelkoncentration och storlek. Spruthållaren i vit nylonplast presterade bra, tog tre dagar att skapa och kostade en tiondel av färdiga alternativ på marknaden. FlowCam mätningarna visade att partikelkoncentrationerna höll sig under tillåtna nivåer och steg med ökad tömningshastighet. FlowCam tog bilder av de individuella partiklarna i proven. Dessa kunde sedan användas för att se vilka slags partiklar proven innehöll. Silikondropparna var helt sfäriska med slät kant och hade ibland en reflektiv mitt. Det visade sig att koncentrationsökningen i den silikoniserade sprutan berodde på ökat antal silikonoljedroppar. I den osilikoniserade sprutan berodde ökningen istället på ett ökat antal partiklar som var ojämna, mörkare och med skrovlig kant. Dessa antogs vara proteinaggregat. Metoden som utvecklades kan i framtiden användas för att undersöka andra proteiner eller effekten av andra faktorer såsom övergångsflöde, up