Intermolecular paramagnetic relaxation to study Protein-RNA Binding

Kernspinresonanzspektroskopie ist eine etablierte Methode zur Untersuchung von Proteinstrukturen und deren dynamischen Eigenschaften. Diese Masterarbeit zielt darauf ab die strukturellen Eigenschaften von L7Ae involvier im H/ACA box Ribonucleoprotein (RNP) zu untersuchen. L7Ae ist ein RNA bindendes Protein, welches in zwei großen Gruppen von RNPs vorkommt. Diese RNPs sind involviert in verschiedenen RNA Modifikationsprozessen, die eine große Rolle in der Feineinstellung einiger Zellfunktionen spielen und daher einen großen evolutionären Vorteil für die Zelle darstellen. Daher ist die Untersuchung der Struktur des H/ACA box RNPs von großem Interesse. Ein RNP, das unteranderem L7Ae enthält, ist das H/ACA box RNP, welches für die sequenzspezifische Pseudouridylierung von RNA zuständig ist und aus einer Leitsequenz-RNA und vier Proteinen besteht, welche den Psedouridylierungsprozess katalysieren. In dieser Arbeit wird die Bindung von L7Ae an der H/ACA RNA untersucht. L7Ae bindet dabei an ein Kink-Turn Element der RNA und stabilisiert diese Kink-Turn Struktur durch diese Bindung. L7Ae wird mittels rekombinanter Proteinsynthese in isotopenreiner Form hergestellt und gereinigt. Paramagnetische Relaxationseffekte verschiedener paramagnetischer Markierungen sowohl intramolekular als auch intermolekular, zwischen RNA und Protein werden mittels NMR Methoden untersucht. In einem Fall ist die paramagnetische Markierung auf der Proteinseite angebracht und der Effekt auf die RNA wird beobachtet und im zweiten Fall ist die RNA Probe mit einer paramagnetischen Markierung versehen und der Effekt auf der Proteinseite wird untersucht. Des Weiteren werden Strukturvorhersagen, unterstützt durch die bestimmten chemischen Verschiebungen, berechnet, um einen Strukturvorschlag in Lösung zu erhalten. Außerdem werden die dynamischen Eigenschaften von L7Ae mittels Relaxationsdispersions-experimenten untersucht.
Nuclear magnetic resonance spectroscopy is a versatile and well-established tool to determine protein structure and dynamics. In this master thesis the structural properties of L7Ae involved in the H/ACA Box ribonucleoprotein (RNP) is investigated. L7Ae is an RNA binding protein involved in two groups of RNPs. These RNPs are involved in RNA modification processes, responsible for the fine tuning of cell functions and the translation process. Therefore, RNPs comprise a great evolutionary advantage for the cell, which in turn makes them and the RNA modification process a subject of great interest. One of the RNPs involving L7Ae is the H/ACA box RNP, which is comprised of a guide RNA that marks RNA for site specific pseudouridylation and four proteins, which are responsible for the catalysis of the pseudouridylation process. In the context of the H/ACA box RNP, L7Ae binds a kink-turn motive present in the RNA and stabilizes the kink-turn structure. This thesis aims to examine this protein RNA binding using paramagnetic relaxation enhancement (PRE). L7Ae is produced using recombinant protein synthesis, which allows for the synthesis of isotopically labeled protein suitable for NMR studies. After purification different PRE effects are studied both on an intramolecular and an intermolecular level with the purpose to examine the L7Ae-H/ACA RNA binding. Both an experiment containing a paramagnetic tag on the protein and one experiment having the paramagnetic tag located at the RNA are conducted to observe the effect of the tag on the binding partner. Furthermore, a structure prediction, using the chemical shift data obtained from recorded assignment spectra, is conducted to obtain leads as to the protein structure in solution. The dynamic properties of L7Ae are also determined by employing a chemical shift dispersion experiment.
eingereicht von Matthias Huber, BSc.
Zusammenfassung in deutscher Sprache
Masterarbeit Universität Innsbruck 2021