Prediction of protein-protein complexes by combining size exclusion chromatography and mass spectrometric analysis

Two major objectives were pursued and met in this study. First, the goal was to add to the scientific toolbox a diligent method for uncovering PPi dynamics on a proteomic scale, with a focus on plant membranes. There are large-scale or high-throughput approaches, but they rely on genetically modified proteins or heterologous expression systems to describe PPi outside of their natural context. Similarly, those methods are incapable of describing the dynamics of protein interactions. In course of this study, a co-elution based approach was combined with modern mass spectrometric label free quantification in order to investigate PPi and interaction dynamics on a proteomic scale. A rigorous data processing pipeline was developed to not only address known fallacies of using co-elution based methods (such as for example random co elution), but also to access and utilize meta-information in form of protein abundance and protein network connectivity to draw conclusions not only on proteomic scale, but also for individual proteins. In total, 6.928 individual proteins extracted from Arabidopsis thaliana root membranes were detected under different nutritional conditions (full nutrition, nitrogen starvation and nitrogen resupply). The data processing pipeline described in this study was used to predict and discover connectivity information for at least 2.058 of these proteins. Each step in data processing was validated by comparison to database confirmed interactions to improve filtering criteria. Protein abundance was evaluated through a unique ranking system, allowing a seamless integration as network attributes for each condition. From the suggested interaction data, an interactome network of the various nutritional conditions was reconstructed. Using different network parameters from graph theory, protein significance and dynamic conditional changes were described. Second, this study applied the aforementioned approach to identify relevant proteins involved in nitrogen sig
In dieser Studie wurden zwei Hauptziele verfolgt und erreicht. Zunächst war es dezidiertes Ziel dieser Arbeit das wissenschaftliche Methodenspektrum um eine sorgfältige Methode zur Aufdeckung von Protein-Protein Interaktionsdynamiken auf proteomischer Ebene unter besonderer Berücksichtigung der pflanzlichen Membranumgebung zu ergänzen. Zwar gibt es Ansätze für large-scale oder high-throuput Methoden, jedoch sind diese auf genetisch veränderte Proteine oder heterologe Expressionssysteme angewiesen und beschreiben PPi damit außerhalb des natürlichen Kontextes. Ebenso sind diese Methoden ungeeignet, um Dynamiken von Proteininteraktionen zu beschreiben. Zu diesen Zweck wurde in dieser Studie eine Methode entwickelt, die Vorteile eines Co-Elutions-basierten Ansatzes mit modernen label-freien massenspektrometrischen Quantifizierungsmethoden kombiniert. Dazu musste eine belastbare Datenverarbeitungspipeline entwickelt werden, um nicht nur bekannte Fallstricke von Co-Elutionsmethoden (wie z.B. zufällige Co-Elution) zu vermeiden, sondern auch um Metainformationen wie Proteinhäufigkeit oder Netzwerkkonnektivität zu erschließen und nutzbar zu machen. So können Schlussfolgerungen nicht nur auf proteomischer Ebene, sondern auch für individuelle Proteine gezogen werden. Im Rahmen dieser Studie wurden Arabidopsis thaliana Wurzelmembranproteine untersucht. Insgesamt konnten 6.928 individuelle Proteine extrahiert, identifiziert und unter verschiedenen Nährstoffverfügbarkeiten (Normalbedingung, Stickstoffmangel und Stickstoffzufuhr nach Mangel) untersucht werden. Die in dieser Studie beschriebene Datenverarbeitungspipeline wurde verwendet, um PPi für mindestens 2058 dieser Proteine vorherzusagen und zu beschreiben. Jeder Schritt der Datenverarbeitung wurde durch den Vergleich mit datenbankbestätigten Interaktionen kontrolliert, um die Filterkriterien zu verbessern. Aus den vorhergesagten Interaktionen wurde ein Interaktom-Netzwerk der verschiedenen Ernährungszustände rekonstruiert, a