The role of posttranslational modifications of the centromeric histone variant CENP-A in Drosophila melanogaster

Zusammenfassung Zentromere sind spezifische Abschnitte auf den Chromosomen, welche für den Zusammenbau der Kinetochore während der Mitose unerlässlich sind und die gleichmäßige Aufteilung der Schwesterchromatiden auf die Tochterzellen ermöglichen. Die Überexpression der zentromerspezifischen Histon-H3-Variante CENP-A führt zu einer Fehllokalisierung entlang der Chromosomenarme, was zu einer Fehlregulation der Transkription, zu Segregationsdefekten und folglich zu genomischer Instabilität führt und so zur Tumorentstehung beiträgt. Daher sind Mechanismen notwenig, welche den Einbau von CENP-A auf die Zentromer-Region beschränken. Während einige Aspekte der CENP-A Integration ausführlich untersucht wurden, gibt es noch viele offene Fragen. In dieser Arbeit wurde der Einbau von CENP-A und dessen Verbleib im zentromeren Chromatin des Modellorganismus Drosophila melanogaster untersucht. Im ersten Teil dieser Studie wurden verschiedene Komplexe von CENP-A mit anderen Proteinen identifiziert und charakterisiert. Insbesondere haben wir mit der Histon-Acetyltransferase HAT1 einen bisher unbekannten CENP-A-Komplex identifiziert. Neben der subzellulären Verteilung dieses Komplexes konnten wir zeigen, dass HAT1 für eine effiziente CENP-A Integration in das Chromatin erforderlich ist. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde im zweiten Teil der Arbeit der Beitrag verschiedener posttranslationaler Modifikationen zur Funktion von CENP-A untersucht. Dabei ergab sich, dass die Phosphorylierung von CENP-A an S20 sowohl am neusynthetisierten als auch am Chromatin-gebundenen Protein stattfindet, und dass sie von der Protein Kinase CKII katalysiert wird. Unter Verwendung einer Kombination von biochemischen und in vivo-Markierungsansätzen haben wir gezeigt, dass S20-Phosphorylierung den Abbau von CENP-A in einer von der E3-Ligase SCFPpa und dem Proteasom abhängigen Weise reguliert. Zusätzlich konnten wir beweisen, dass S20-Phosphorylierung die schnelle Entfernung von CENP-A von extra-zent
Centromeres are specialized regions on chromosomes which are required for kinetochore assembly during mitosis to facilitate the faithful segregation of sister chromatids. Overexpression of the centromere-specific histone H3 variant CENP-A results in its mislocalization along chromosome arms leading to transcriptional misregulation, segregation defects and consequently to genomic instability promoting tumorigenesis. Thus, mechanisms must exist to restrict assembly of CENP-A into centromeric chromatin. While some aspects of CENP-A loading have been studied in considerable detail, there are still many open questions. In this work, we have investigated the processes that govern CENP-A loading into and maintenance at centromeric chromatin in the model organism Drosophila melanogaster. In the first part of this study, we have characterized different CENP-A preloading complexes. In particular, we have identified a so far unknown complex of CENP-A with the histone acetyltransferase HAT1. We determined the subcellular distribution of this complex and showed that HAT1 is required for efficient CENP-A assembly into chromatin. Based on these findings, we characterized the posttranslational modification pattern of CENP-A in different cellular fractions and within the different pre-loading complexes. We found that phosphorylation at S20 of CENP-A occurs in soluble as well as chromatin-bound fractions of CENP-A, and we identified CKII as the kinase responsible for this modification. Using a combination of biochemical and in vivo labeling approaches we demonstrate that S20 phosphorylation regulates the degradation of CENP-A in a manner that is dependent on the E3 ligase SCFPpa and the proteasome. We show that S20 phosphorylation promotes the fast clearance of CENP-A from extracentromeric sites, while it does not affect stability of centromeric CENP-A suggesting additional roles for this modification at the centromere. Next we addressed the role of phosphorylation of S77 in
Anming Huang, MAg
Kumulative Dissertation aus drei Artikeln
Zusammenfassung in deutscher Sprache
Dissertation Medical University of Innsbruck 2020