Funktionale und molekulare Charakterisierung des Pad-Proteins von Legionella pneumophila

In der vorliegenden Arbeit wurde das Pad-Protein von Legionella pneumophila mit zell- bzw. molekularbiologischen sowie immunochemischen Methoden charakterisiert. Mittels Einbau des mutierten Pad-Locus, kodiert auf dem Plasmid pCS-25, in das Genom der L. pneumophila Stämme WH88 (Serogruppen 6) bzw. WH89 (Serogruppe 10) wurden je drei Pad-negative Mutanten gewonnen. Mit Hilfe der PCR, des Southernblot bzw. ELISA wurde der korrekte Austausch der Wildtypsequenz gegen den mutierten Bereich des Proteins nachgewiesen. Die Infektionsversuche mit den Mutanten bestätigten die Vermutung, dass das Protein eine Rolle an der initialen Kontaktaufnahme von L. pneumophila in den natürlichen Wirt, A. castellanii, hat. Dabei wurden signifikant niedrigere Aufnahmeraten der Mutanten im Vergleich zu den beiden Wildtypen beobachtet. Durch Kultivierung und Infektion des Ursprungstammes L. pneumophila Corby, der pad-negativen Mutante CP7 und der Pad-komplementierten Mutante bei 25°C, 30°C bzw. 37°C wurde der Einfluss der Temperatur auf die Funktion des Proteins untersucht. Die Ergebnisse zeigten dabei einen signifikanten Anstieg der Aufnahmeraten bei Vergleich von 25°C und 30°C bzw. 25°C und 37°C. Keine Signifikanz trat zwischen 30°C und 37°C auf. Ein zweiter Aspekt dieses Versuchs war die Prüfung der Infektionsrate in Abhängigkeit von der Proteinexpression unter dem Einfluss der Wachstumsphase. Dabei wurden durch vergleichende Infektion von A. castellanii mit exponentiellen (EP) bzw. stationäre Phase-Kulturen (SP) in diesem Versuch signifikante Unterschiede zwischen dem Wildtyp Corby und der Mutante CP7 bzw. zwischen der Mutante CP7 und der Pad+-Komplementante bei den jeweils untersuchten Temperaturen beobachtet. Keine signifikanten Unterschiede waren zwischen Wildtyp und Pad-Komplementante feststellbar. Zur Speziesübergreifenden Charakterisierung des Proteins Pad wurde das Wildtyplocus-kodierende Plasmid (pCS31) in die fünf non-pneumophila Stämme L. parisiensis (H962); L. bozemanii (L99-3