Estudi de la via d'agregació de tres proteïnes implicades en diferents malalties conformacionals humanes scFv‐h3D6 com agent terapèutic per a la malaltia d'Alzheimer, AL‐12 com a causa d'amiloïdosi de cadena lleugera, i PDZ3 com a organitzador del proteoma

Aquesta Tesi Doctoral es centra en l'estudi molecular de tres proteïnes relacionades amb malalties conformacionals humanes, o Amiloïdosis. Mitjançant tècniques espectroscòpiques, s'han descrit els mecanismes de plegament natiu i d'agregació en fulla-β ordenada, dues vies que es troben en competència a través de la presència de diferents estats intermediaris a l'espai conformacional. Els intermediaris d'agregació, precursors de les fibres amiloides, són considerats els principals causants de la citotoxicitat cel·lular en moltes de les malalties amiloidogèniques, per tant, el seu estudi és crucial per aprofundir en l'etiologia d'aquestes patologies humanes, moltes d'elles sense tractament curatiu. Per una banda, s'ha obtingut un fragment d'anticòs recombinant específic per a β-oligòmers del pèptid Aβ1-42 causant de l'Alzheimer, l'scFv-h3D6. El seu estudi ha estat el primer en descriure el mecanisme pel qual un scFv retira el pèptid Aβ1-42 de la via amiloide i evita la seva toxicitat neuronal, tal i com s'ha demostrat en assajos de viabilitat en cultius cel·lulars. A més, l'obtenció d'un model tridimensional de l'scFv-h3D6, per homologia de seqüències, ha permès fer un redisseny racional de la molècula per tal de millorar-ne la seva estabilitat, augmentar la seva producció, i disminuir la dosi efectiva ja demostrada en ratolins model d'Alzheimer. Per altra banda, s'ha treballat amb un domini variable (VL) d'immunoglobulina, extret d'una pacient amb Amiloïdosi de cadena lleugera, l'AL-12. Aquest domini amiloidogènic presenta 7 mutacions respecte la seva línia germinal κI O18/O8. L'obtenció de les propietats termodinàmiques de l'AL-12, així com de quatre mutants restauratius, ha servit per estudiar l'efecte de les mutacions somàtiques sobre l'estabilitat dels dominis VL. Així, la restauració de residus puntuals de l'AL-12 cap a la seqüència germinal, implica la desestabilització del domini i un augment de la tendència a l'agregació i, per tant, s'ha demostrat que una úni
The thesis here presented is focused on the molecular study of three human proteins related to conformational diseases, or Amyloidoses. The mechanisms of native folding and aggregation in a cross-β sheet structure have been described using several spectroscopic techniques. These two pathways are competing by the presence of intermediate states of the reaction. An oligomeric intermediate is the precursor of the β-aggregates and is considered the main responsible of the cellular toxicity in many amyloid diseases. Therefore, is necessary to perform a deeper study of the oligomeric state to delve into the etiology of these human diseases. On one hand, the expression and extraction of a single-chain variable fragment (scFv-h3D6), a derivative of an antibody specific for Aβ-oligomers, was performed. Here is the first description of a conformational mechanism by which a scFv-h3D6 withdraws Aβ1–42 oligomers from the amyloid pathway and, consistently, it prevents Aβ-oligomer toxicity in the SH-SY5Y human neuroblastoma cell line. Moreover, we modeled the 3D-structure of scFv-h3D6, obtained by sequence homology. This model has allowed to a rational redesign of the molecule in order to improve its stability, increase its recombinant production, and decrease the effective dose already demonstrated in a mice model of Alzheimer's disease. For another hand, we studied the AL-12 protein, an Ig variable domain (VL) obtained from a patient diagnosed with light chain Amyloidoses. This amyloidogenic domain shows seven non-conservative mutations from his germinal protein κI O18/O8. The thermodynamic study of AL-12 and four restoratives mutants, allowed us to determine the effect of somatic mutations on the VL stability. Thereby, the restoration of a residue toward the germinal sequence implies a destabilization of the domain and increases the aggregation tendency. Here we demonstrate that a single somatic mutation couldn't be the cause of the amyloidogenic potential of AL-12, rather it i