Noves aportacions a l'estudi de la capacitat coordinant de les metal·lotioneïnes el catió Ag(I) com a substitut de Cu(I) en les Cu(I)-MT i l'espectrometria de masses (ESI-MS) com a tècnica essencial i complementària a l'espectroscòpia òptica

Consultable des del TDX
Títol obtingut de la portada digitalitzada
Les metalotioneïnes (MT) són unes proteïnes de baix pes molecular i elevat contingut en residus de cisteïna que es caracteritzen per la seva extremada habilitat para enllaçar tant cations de metalls essencials, com Zn(II) i Cu(I), com de metalls tòxics (Cd(II), Hg(II)). En una primera part d'aquest treball s'analitza la utilització del catió Ag(I) com a sonda del catió Cu(I) en l'estudi de les Cu-MT, i en conseqüència es compara detalladament el comportament d'ambdós metalls enfront la isoforma 1 de MT de mamífer. Aquesta proteïna, així com els seus fragments constitutius a i b, s'ha obtingut per enginyeria genètica amb la finalitat d'assegurar al màxim el seu grau de puresa. L'estudi de la capacitat coordinant de MT 1, aMT 1 i bMT 1 enfront Ag(I) s'ha dut a terme mitjançant tècniques d'espectroscòpia electrònica (CD i UV-Vis) i de masses (ESI-MS). Aquesta darrera tècnica ha requerit la incorporació d'un mètode de separació previ a la determinació de la massa, per tal d'eliminar la presència de tampó a la mostra. L'electroforesi capil·lar (CZE) acoblada a l'ESI-MS ha demostrat ser una bona opció. Amb la finalitat de validar l'acoblament CZE-ESI-MS, en primer lloc s'ha aplicat l'esmentat acoblament a l'estudi del desplaçament del Zn(II) en Zn7-MT 1 per Cd(II) a pH 7, procés ja conegut en les MT de mamífer que procedeix de manera seqüencial i isomorfa. Aquest estudi demostra que la tècnica CZE permet una bona separació del tampó de la solució que conté la proteïna, a la vegada que ofereix una detecció precisa de l'estequiometria de les espècies que coexisteixen en solució. En base a aquests resultats, s'ha seguit en paral·lel -mitjançant CD, UV-Vis i CZE-ESI-MS- la valoració de Zn7-MT 1, Zn4-aMT 1 i Zn3-bMT 1 amb AgClO4 a pH 7.5 i 2.5. Els resultats mostren que al llarg de les valoracions es forma un elevat nombre d'espècies, tant heterometàl·liques AgxZny-MT com homometàl·liques Agx-MT, i que en la majoria dels punts de valoració coexisteixen diverses espècies. També
Metallothioneins (MT) are ubiquitous low molecular weight cysteine-rich metalloproteins, which characterize by their extremely high binding abilities towards essential metal cations, such as Zn(II) and Cu(I), as well as toxic cations like Cd(II) and Hg(II). In the first stage of this work the use of Ag(I) as a probe for Cu(I) in Cu-MT studies is analysed, and thus, the behaviour of both metal ions when binding to the mammalian MT 1 isoform has been compared. This protein, as well as their constitutive a and b fragments, was obtained by genetic engineering in order to assure the highest purity degree. The binding abilities of Ag(I) to MT 1, aMT 1 and bMT 1 have been studied by using optical spectroscopy (CD, UV-vis) and mass spectrometry (ESI-MS) techniques. The latter required the use of a separation method previous to the mass determination in order to remove the buffer present in the sample. With the aim of validating the CZE-ESI-MS coupling, we first studied the Zn(II)/Cd(II) replacement in Zn7-MT 1 at pH 7, a well known system in mammalian MT that proceeds by means of a sequential and isomorphous Zn/Cd replacement. This study proves that the previous coupling allow a good separation of the protein from the buffer, while achieving a precise detection of the stoichiometries of the coexisting species in solution. Based on these results, the titrations of Zn7-MT 1, Zn4-aMT 1 and Zn3-bMT 1 with AgClO4 at pH 7.5 and 2.5 were monitored in parallel by CD, UV-vis and CZE-ESI-MS techniques. The results obtained throughout the titration show formation of a high number of heterometallic AgxZny-MT as well as homometallic Agx-MT species. Also, at each titration point, there is coexistence of several species. It has also been shown the Zn template effect in the 3 proteins studied as revealed by the different folding found for the Ag-MT species of the same stoichiometry formed either from Zn-MT or from apo-MT. Comparison of the behaviour of Ag(I) and Cu(I) toward mammalian MT 1