The role of riboflavin and niacin in vitamin B12 biosynthesis by Propionibacterium freudenreichii

The literature review of this thesis concentrated on vitamin B12 (Clb), its forms, vitamin B12 anologues, and the biosynthetic route of Clb. In addition, the roles of ribolfavin (RF) and niacin (NAM) in this biosynthetic route were discussed. Cereals were also evaluated as a matrix for vitamin B12 synthesis based on their RF and NAM concentrations. The aims of the experimental part were to prepare a malt extract medium, to study the effects of RF and NAM, and to compare three Propionibacterium freudenreichii strains. The medium (pH 6.40) consisted of 10% of malt extract (ME) and 0.1 M potassium phos-phate buffer. Sterile filtered precursor solutions (e.g. CoCl2) were added to the autoclaved broth. The final composition of the broth was decided based on a preliminary test, where lactate (L; 8 g/L) and/or tryptone (T; 5 g/L) supplements were compared. Thus, the impact of RF and NAM to Clb yield was studied in ME+L+T medium. In these tests five conditions were used: ME+L+T, ME+L+T with DMBI (5,6-dimethylbenzimidazole), and either 1) RF levels of 1, 3, and 38 ?M (27 mM of NAM) or 2) NAM levels of 0.1, 0.6, and 27 mM (3 ?M of RF). The RF concentrations were also tested with strain 3 in ME+T broth. Strains were incubated anaerobically at 30 °C for 3 days and microaerobically for 4 days. Optical densities, cell masses, and pH values were measured. Intracellular Clb was extracted as cy-ano-Clb and quantified using an UHPLC/UV method. From medium RF and niacin were analyzed with an UHPLC/FL method, and sugars and acids with an HPLC/RI/UV method. In ME+L+T strain 1 produced 1.0 ± 0.2 ?g/mL of vitamin B12, strain 2 synthesized 1.2 ± 0.2 ?g/mL, and strain 3 yielded 0.82 ± 0.2 ?g/mL of Clb. DMBI increased Clb synthesis most in strains 1 and 3, while with strain 2 the 27 mM NAM level together with RF resulted in the highest yields. Alone low NAM concentrations did not affect Clb yields, but RF increased Clb production by strains 2 and 3 (p < 0.05). On the other hand, high RF conc
Tämän maisterin tutkielman kirjallisuuskatsaus keskittyi B12-vitamineereihin ja -analogeihin sekä kobalamiinin (Clb) biosynteesiin. Lisäksi käsiteltiin riboflaviinin (RF) ja nikotiiniamidin (NAM) osallistumista Clb:n synteesireittiin. Viljoja puolestaan arvioitiin B12-vitamiinin tuotantoalustana niiden RF- ja NAM- pitoisuuksien perusteella. Kokeellisen osan tavoitteina oli valmistaa mallaspohjainen kasvatusliemi, tutkia siinä RF:n ja NAM:n vaikutusta Clb:n synteesiin sekä verrata kolmea Propionibacterium freudenreichii -kantaa. Mallasliemi (pH 6,40) koostui 10 %:sta mallasuutetta (ME) ja kaliumfosfaatti pus-kurista (0,1 M). Myös steriilisuodatettuja lähtöaineliuoksia (esim. CoCl2) lisättiin autoklavoi-tuun liemeen. Liemen lopullinen koostumus päätettiin esikokeessa, laktaatti- (L; 8 g/l) ja/tai tryptoni- (T; 5 g/l) lisäyksiä vertaamalla. RF:n ja NAM:n osallisuutta Clb:n tuottoon päätet-tiin tutkia ME+L+T-liemessä. RF:a testattiin kannalla 3 myös ME+T-liemessä. Kokeissa oli viisi olosuhdetta: ME+L+T, ME+L+T ja DMBI (5,6-dimetyylibentsimidatsoli) sekä joko 1) RF-tasot 1, 3 ja 38 ?M (27 mM NAM) tai 2) NAM-tasot 0,1, 0,6 ja 27 mM (RF 3 ?M). Kan-toja kasvatettiin anaerobisesti 30 °C:ssa kolme ja mikroaerobisesti neljä päivää. Optiset ti-heydet, solumassat ja pH-arvot mitattiin. Clb eristettiin soluista syano-Clb:na ja kvantitoitiin UHPLC/UV-menetelmällä. RF ja niasiini analysoitiin UHPLC/FL-menetelmällä kasvatus-liemestä, kun taas sokerit ja hapot määritettiin HPLC/IR/UV-menetelmällä. ME+L+T-liemessä kanta 1 tuotti 1,0 ± 0,2 ?g/ml, kanta 2 tuotti 1,2 ± 0,2 ?g/ml ja kanta 3 tuotti 0,82 ± 0,2 ?g/ml B12-vitamiinia. Kannoilla 1 ja 3 Clb:n synteesi tehostui merkittävim-min DMBI:n avulla, mutta kannalla 2 NAM (27 mM) yhdessä RF:n kanssa edisti Clb:n tuot-toa DMBI:tä enemmän. Pienet NAM-pitoisuudet eivät yksin edistäneet Clb:n biosynteesiä, mutta RF nosti sen tuottoa kannoilla 2 ja 3 (p < 0.05). Toisaalta, koska suuret RF-tasot saat-toivat inhiboida RF:n soluunottoa ja Clb:n sy