Functional microdomains in the specialized membranes of skeletal myofibres

The function of skeletal muscle is to generate force and produce movement. These tasks are carried out by long multinucleated cells, the skeletal myofibres. The membrane system and the cytoskeleton of these cells are uniquely organized to respond rapidly to neuronal stimuli and to achieve efficient contraction. In the present study the organization and distribution of selected protein/lipid based microdomains that reside in the plasma membrane and sarcoplasmic reticulum of isolated rat skeletal myofibres, were investigated. Aquaporin 4 (AQP4) water channels are arranged as higher order oligomers of several sizes in the sarcolemma and in the T tubules. These oligomers, however, were absent from many specialized micro- and- macrodomains. The distribution of AQP4 coincided with that of a highly organized protein assembly, the dystrophin glycoprotein complex (DGC), in the sarcolemma. A chimaeric venus-AQP4 was equally mobile in the T tubules and sarcolemma, but the anchoring mechanisms of the protein appeared to be different. In contrast to AQP4, the proteins resident in cholesterol and sphingolipid-based microdomains, known as rafts, also occupied DGC deficient areas, which surround the T tubule openings. Indeed, flotillin-1 rafts were located in the neck portions of the T tubules. The rafts defined by the influenza haemagglutinin (HA) also resided in DGC deficient areas, but at the borders of the DGC area. Importantly, of the raft proteins, only the localization of caveolin 3 (CAV3) was dependent on the cholesterol enriched lipid environment, as evidenced by cholesterol depletion experiments and localization studies on a non-raft associated variant of HA. The organization and distribution of membrane associated rough ER (RER) proteins were also analysed. Biochemical detergent extraction analyses and immunofluorescence staining indicated that the ER proteins were assembled as microdomains within the sarcoplasmic reticulum (SR). The microdomains were distribute
Tiivistelmä Luustolihaksen toimintojen perustana ovat supistumiskykyiset lihassolut, joiden kalvorakenne on järjestynyt erityisellä tavalla ohjaamaan supistusta. Tässä tutkimuksessa analysoitiin proteiini- ja lipidiperustaisten mikroalueiden järjestäytymistä ja tähän vaikuttavia tekijöitä luustolihassolun solukalvolla sekä lihassolun sisäisessä kalvojärjestelmässä, sarkoplasmisessa verkossa (SR). Ensin analysoitiin vesikanavatyyppiä 4 (AQP4), joka oligomerisoituessaan muodostaa erikokoisia mikroalueita. Havaittiin, että AQP4-mikroalueita esiintyy kaikkialla solukalvolla lukuun ottamatta eräitä erilaistuneita mikro- ja makroalueita. AQP4-oligomeerien jakauma solukalvon lateraalisessa osassa, sarkolemmalla, noudatti dystrofiini-glykoproteiinikompleksin jakaumaa. Fluoresoivan venus-AQP4-proteiinin avulla osoitettiin, että proteiinin liikkuvuus oli samanlainen solun sisään ulottuvissa poikkiputkistoissa ja sarkolemmalla, mutta liikkuvuutta rajoittavat tekijät olivat erilaisia näissä solukalvon osissa. Toiseksi analysoitiin kolesteroli- ja sfingolipidipitoisia mikroalueita, kalvolauttoja. Flotilliini-1- ja influenssaviruksen hemagglutiniini (HA) -proteiinia sisältäviä lauttoja esiintyi vain poikkiputkien suuaukkojen alueella, mutta lauttojen jakauma oli erilainen. Lauttojen lipidiympäristöllä ei ollut vaikutusta proteiinien sijaintiin. Tämä osoitettiin kolesterolin poistokokeilla sekä kokeilla, joissa käytettiin mutatoitua HA-proteiinia, joka ei hakeudu kolesteroliympäristöön. Kaveoliini-3-proteiinin sijainti poikkeaa edellä mainituista, ja kolesterolin poisto vaikutti merkittävästi sijainnin määräytymiseen. Kolmanneksi analysoitiin, miten karkean endoplasmakalvoston proteiinit ovat järjestäytyneet SR:ssä. Havaittiin, että endoplasmiset kalvoproteiinit eivät ole homogeenisesti levittäytyneet SR-kalvostoon vaan muodostavat pieniä mikroalueita. Detergenttiuuttoanalyysit osoittivat lisäksi, että näissä mikroalueissa on erilainen lipidikoostumus kuin SR:ssä yleensä. Huomatta