Staurosporine-induced cleavage of apoptosis-inducing factor in human fibrosarcoma cells is independent of matrix metalloproteinase-2

Apoptosis-inducing factor (AIF) is a mitochondrial flavoprotein which mediates staurosporine (STS)--induced cell death. AIF cleavage and translocation to the cytosol is thought to be calpain-1- dependent as calpain inhibitors reduce AIF proteolysis; however, many calpain inhibitors also inhibit matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) activity, an intracellular and extracellular protease implicated in apoptosis. Here we investigated whether MMP-2 activity is affected in response to STS and if it contributes to AIF cleavage. Human fibrosarcoma HT1080 cells were treated with STS (0.1 [micro]M, 0.25-24 h). A significant increase in cellular MMP-2 activity was seen by gelatin zymography after a 6 h STS treatment, prior to induction of cell necrosis. Western blot showed the time-dependent appearance of two forms of AIF (~60 and 45 kDa) in the cytosol which were significantly increased at 6 h. Surprisingly, knocking down MMP-2 or inhibiting its activity with MMP-2 preferring inhibitors ARP-100 or ONO-4817, or inhibiting calpain activity with ALLM or PD150606, did not prevent the STS-induced increase in cytosolic AIF. These results show that although STS rapidly increases MMP-2 activity, the cytosolic release of AIF may be independent of the proteolytic activities of MMP-2 or calpain. Key words: matrix metalloproteinase-2, apoptosis-inducing factor, calpain, cytotoxicity, staurosporine, apoptosis. Le facteur induisant l'apoptose (FIA) est une flavoproteine mitochondriale, qui participe a la modulation de la mort cellulaire provoquee par la staurosporine (STS). On pense que le clivage du FIA et sa translocation vers le cytosol sont dependants de la calpaine 1, puisque les inhibiteurs de la calpaine entrainaient une diminution de la proteolyse du FIA. Cependant, beaucoup d'inhibiteurs de la calpaine entrainent aussi une inhibition de l'activite de la metalloproteinase matricielle 2 (MMP-2), une protease intracellulaire et extracellulaire jouant un role dans l'apoptose. Dans les presents travaux, nous avons etudie la possibilite que l'activite de la MMP-2 soit modifiee en reaction a la STS, et aussi qu'elle participe au clivage du FIA. Nous avons expose des cellules de fibrosarcome humain (HT1080) a de la STS (a 0,1 [micro]M, sur 0,25 a 24 heures). Nous avons observe une augmentation marquee de l'activite de la MMP-2 cellulaire a l'aide de la zymographie sur gelatine apres une exposition au STS de 6 heures, avant la production de necrose cellulaire. L'immunobuvardage de Western a revele une apparente proportionnalite entre la duree et deux formes de FIA (environ 60 et 45 kDa) dans le cytosol, avec leur accroissement marque apres 6 heures. Etonnamment, ni la repression (<< knockdown >>) de la MMP-2, ni l'inhibition de son activite a l'aide d'inhibiteurs preferentiels de son activite ARP-100 ou ONO-4817, ni l'inhibition de l'activite de la calpaine a l'aide d'ALLM ou de PD150606, ne parvenaient a prevenir la hausse de FIA cytosolique entrainee par la STS. Ces resultats montrent que meme si la STS entraine une augmentation rapide de l'activite de la MMP-2, la liberation de FIA dans le cytosol pourrait etre independante des activites proteolytiques de la MMP-2 ou de la calpaine. [Traduit par la Redaction] Mots-cles: metalloproteinase matricielle 2, facteur induisant l'apoptose, calpaine, cytotoxicite, staurosporine, apoptose.
1. Introduction Apoptosis-inducing factor (AIF) is a flavoprotein anchored to the mitochondrial inner membrane (Susin et al. 1996). It binds to flavin adenine dinucleotide to exert a NADH oxidase activity [...]