Involvement of NF-κB activation in the apoptosis induced by extracellular adenosine in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells

Adenosine can exhibit cytotoxic activity in vivo and in vitro, though its mechanisms are still uncertain. In this study, we investigated the adenosine-mediated apoptotic signaling pathway and the role of NF-κB in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells. HepG2 cells were treated with different concentrations of adenosine for 12-48 h, and the effect of adenosine on cell proliferation was evaluated by MTT assay. The cytotoxicity of adenosine alone or in combination with an NF-κB inhibitor, pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), was also evaluated by MTT assay and the mode of cell death was detected by Hoechst 33342 staining. Cell cycle progress was performed by flow cytometry with PI staining. The protein expressions of Bcl-2, p53, NF-κB subunit p65, and caspase-3 were assayed by Western blot. Caspase-3 activity was measured by spectrophotomteric assay. The results showed that adenosine significantly reduced the viability of HepG2 cells in a dose- and time-dependent manner, with [IC.sub.50] (24 and 48 h) of 2.52 and 1.89 mmol x [L.sup.-1], respectively. The apoptotic index (percentage of sub-[G.sub.1] phase) of HepG2 cells in adenosine treatment alone for 12 and 24 h or in combination with PDTC were 8.30%, 22.32% and 20.18%, 30.89%, respectively. All of them were higher than that in the control group (0.81%, p < 0.01). The characteristic changes of cell apoptosis (chromatin condensation and sub-G1 peak) were observed under fluorescent microscopy and flow cytometry. We also found that the apoptotic process triggered by adenosine was involved in [G.sub.0]-[G.sub.1] cell-cycle arrest, enhanced the activity of caspase-3, upregulated p53 and NF-κB p65 expression, and downregulated Bcl-2 expression. Inhibition of NF-κB by PDTC decreased NF-κB p65 expression, enhanced cell apoptosis ratio, and increased caspase-3 activity. NF-κB may play an anti-apoptosis role in adenosine-induced HepG2 cytotoxicity. Key words: adenosine, apoptosis, HepG2 cells, NF-κB. L'adenosine peut exercer une activite cytotoxique in vivo et in vitro mais son mecanisme d'action demeure incertain. Dans cette etude, nous avons examine la voie de signalisation de l'apoptose causee par l'adenosine ainsi que le role du facteur NF-κB dans les cellules de carcinome hepatocellulaire HepG2. Les cellules HepG2 ont ete traitees avec differentes concentrations d'adenosine pendant 12-18 h, et l'effet de l'adenosine sur la proliferation cellulaire a ete; evalue par un dosage au MTT. La cytotoxicite de l'adenosine seule ou combinee a un inhibiteur du NF-κB, le pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) a aussi ete evaluee par un dosage MTT, et le mode de mort cellulaire a ete detecte par coloration au Hoechst 33342. La progression du cycle cellulaire a etee suivie par cytometrie de flux apres coloration a l'iodure de propidium. L'expression de Bcl-2, p53, de la sous-unite p65 du NF-κB et de la caspase-3 a ete detectee par buvardage Western. L'activite de la caspase-3 a ete mesuree a l'aide d'une mesure spectrophotometrique. Les resultats ont montre que l'adenosine reduisait de facjon significative la viabilite des cellules HepG2 de maniere dependante de la concentration et du temps, avec des [CI.sub.50] (24 et 48 h) de 2.52 et 1.89 mmol x [L.sup.-1], respectivement. Les indices d'apoptose (pourcentage de cellules en phase sub-G1) des cellules HepG2 traitees a l'adenosine seule pendant 12 ou 24 h, ou combinee au PDTC etaient de 8.30% et 22.32%, et 20.18% et 30.89%, respectivement. Ils etaient tous superieurs a l'indice du groupe controle (0.81%, p < 0.01). Les changements caracteristiques de l'apoptose (condensation de la chromatine et pic en sub- [G.sub.1]) ont ete observees par microscopie en fluorescence et par cytometrie de flux. Nous avons aussi trouve que le processus d'apoptose enclenche par l'adenosine etait implique; dans l'arret du cycle cellulaire en [G.sub.0]-[G.sub.1], augmentait l'activite; de la caspase-3, augmentait l'expression de p53 et de la sous-unite p65 du NF-κB, et diminuait l'expression de Bcl-2. L'inhibition du NF-κB par le PDTC augmentait la cytotoxicite;, l'indice d'apoptose et l'activite; de la caspase-3, et diminuait l'expression de p65. L'inhibition du NF-κB pourrait augmenter l'apoptose a travers la voie de la caspase-3 et de Bcl-2. NF-κB peut jouer un role anti-apoptose dans la cytotoxicite; induite par l'adenosine dans les cellules HepG2. Mots-cles: adenosine, apoptose, HepG2, NF-κB. [Traduit par la Redaction]
Introduction Apoptosis (programmed cell death), which plays a critical role during normal development, homeostasis, and pathology of a wide variety of diseases including cancer, occurs in response to various intracellular [...]