Mutational investigation of protein folding transition states by Φ-value analysis and beyond: lessons from SH3 domain folding

Understanding how proteins adopt their unique native structures requires a complete structural characterization of the rate-limiting transition state(s) along the folding pathway. By definition, transition states are not significantly populated and are only accessible via folding kinetics studies. In this respect, interpreting the kinetic effects of amino acid substitutions (especially to Ala) via Φ-value analysis is the most common method to probe the structure of these transient, yet important states. A critical review of the key assumptions required for rigorous interpretation of Φ values reveals that a multiple substitution strategy in which a position of interest is mutated to a variety of amino acids, and not exclusively to Ala, provides the best means to characterize folding transition states. This approach has proven useful in revealing nonnative interactions and (or) conformations in folding transition states. Moreover, by simultaneously examining the folding kinetics of multiple substitutions made at a single surface-exposed position using the Bronsted analysis the backbone conformation in a folding transition state can be investigated. For folding equilibria with exchange rates on the order of milliseconds, the kinetic parameters for Φ-value analysis can be obtained from NMR relaxation dispersion experiments, under fully native conditions, along with a wealth of high-resolution structural information about the states in exchange (native, denatured, and intermediate states that populate the pathway). This additional structural information, which is not readily obtained through stopped-flow based methods, can significantly facilitate the interpretation of Φ values because it often reports on the validity of the assumptions required for a rigorous interpretation of Φ values. Key words: protein folding, Φ-value analysis, SH3 domains, mutagenesis, folding transition states. La comprehension du mecanisme par lequel les proteines adoptent leurs structures natives uniques requiert une caracterisation structurale complete de l'etat ou des etats de transitions limitants durant le processus de repliement. Par definition, les etats de transition ne sont pas significativement abondants et ne sont accessibles que par l'intermediaire d'etudes cinetiques de repliement. A cet effet, l'interpretation des effets cinetiques de la substitution d'acides amines (specialement par une Ala) a l'aide d'une analyse des valeurs de Φ est la methode la plus utilisee pour sonder ces etats transitoires mais importants. Une revue critique des postulats de base requis pour interpreter rigoureusement les valeurs de Φ revele qu'une strategie utilisant de multiples substitutions, par laquelle un acide amine situe dans une position d'interet est mute en une variete d'acides amines et non seulement en Ala, fournit le meilleur moyen de caracteriser les etats de transition de repliement. Cette approche a demontre son utilite en revelant les interactions/conformations non-natives dans les etats de transition de repliement. De plus, en examinant simultanement des cinetiques de repliement de multiples substitutions realisees sur un site unique expose a la surface par une analyse de Bronsted, la conformation d'une chaine dans un etat de transition de repliement donne peut etre etudiee. Dans le contexte d'un repliement a l'equilibre avec des taux d'echange de l'ordre de la milliseconde, les parametres cinetiques de l'analyse des valeurs de Φ peuvent etre obtenus par des experiences en RMN de relaxation/dispersion, sous des conditions pleinement natives, avec une abondance d'informations structurales a haute resolution des etats en echange (natif, denature et etats intermediaires qui jalonnent ce sentier). Cette information structurale additionnelle, qui n'est pas facilement obtenue par des methodes en stop-flow, peut faciliter de facon significative l'interpretation des valeurs de Φ car elle temoigne de la validite des postulats requis pour interpreter rigoureusement les valeurs de Φ. Mots-cles: repliement des proteines, analyse des valeurs de Φ, domaines SH3, mutagenese, etats de transition de repliement. [Traduit par la Redaction]
Introduction to Φ-value analysis In the quest to understand the biophysical principles underlying the relationship between the amino acid sequence of a protein and its three-dimensional structure, many studies have [...]