Recent developments in nucleic acid based techniques for use in rumen manipulation

Nucleic acid-based techniques which can be used to characterise complex microbial communities without incubation are now being employed regularly in ruminant nutrition studies. Conventional culture-based methods for enumerating rumen microorganisms (bacteria, archaea, protozoa, and fungi) have been superseded and are now used mainly to obtain pure isolates of novel organisms and reference strains that are required for the development and validation of the nucleic acid approaches. These reference strains are also essential for physiological studies of the lifestyle of the organisms as well as sources of genomic DNA and RNA that can be analysed for functional gene activity. The foundation of the molecular ecology techniques is 16S/18S rDNA sequence analysis which has provided a phylogenetically based classification scheme for enumeration and identification of microbial community members. The use of this marker gene in assays involving the use of single nucleic acid probes or primer sets is rapidly evolving to high throughput approaches such as microarray analysis and new generation sequencing technologies. While these analyses are very informative for determining the composition of the microbial community and monitoring changes in population size, they can only infer function based on these observations. The focus of nucleic acid research is now shifting to the functional analysis of the ecosystem which involves the measurement of functional genes and their expression in the predominant or specific members of the rumen microbial community. Functional gene studies are less developed than 16S rDNA-based analysis of community structure. Also for gene expression studies there are inherent problems involved in extracting high quality RNA from digesta, and priming cDNA synthesis from bacterial mRNA. This paper reviews nucleic acid based molecular methods which have recently been developed for studying the structure and function of rumen microbial communities.Metodologias baseadas na análise de ácidos nucléicos, que possam ser utilizadas para caracterizar comunidades microbianas complexas, sem a necessidade da incubação de amostras, têm sido empregadas atualmente, de forma rotineira, em estudos de nutrição de ruminantes. Os métodos convencionais, dependentes do cultivo microrganismos ruminais (bactérias, archaea, protozoarios e fungos) para sua enumeração foram superados e atualmente passaram a ser utilizados especialmente para o isolamento de cepas puras de organismos ainda desconhecidos e para o cultivo de cepas de referência, necessários para o desenvolvimento e a validação das metodologias de análise de ácidos nucléicos. Tais cepas de referência são também essenciais para estudos fisiológicos e ainda, funcionam como fontes de DNA e RNA para avaliação da expressão gênica. O fundamento das metodologias de ecologia molecular é a análise de sequências de 16S / 18S rDNA, que fornece um esquema de classificação de base filogenética, utilizado para a enumeração e identificação de membros de uma comunidade microbiana. O uso de marcadores de genes e estudos envolvendo o uso de sondas individuais de ácidos nucléicos ou de conjuntos de primers tem evoluído rapidamente para abordagens de alto desempenho ("high throughput"), como por exemplo analises de microsatélites e novas metodologias para sequenciamento. Entretanto, se por um lado tais métodos são muito úteis para a determinação da composição da microbiota e para o monitoramento de variações nos tamanhos das populações componentes, por outro lado, os mesmos apenas auxiliam na inferência das funções em relação à composição ou ao tamanho de determinada população. Portanto, o foco de pesquisas baseadas em metodologia de ácidos nucléicos esta mudando para a analise funcional de um ecossistema, o quê envolve a mensuração de genes funcionais e sua expressão nos membros predominantes ou, membros específicos da microbiota ruminal. Estudos da expressão gênica ainda são menos desenvolvidos do que aqueles de analise da microbiota baseada no rDNA. Além disso, existem problemas intrínsecos aos estudos de expressão gênica relacionados à extração de RNA de alta qualidade a partir da digesta, e também em relação ao processo da iniciação da síntese de cDNA a partir de mRNA bacteriano. Este artigo oferece uma revisão dos métodos moleculares baseados em ácidos nucléicos que foram desenvolvidos recentemente para estudos de estrutura e função da microbiota ruminal.