Laboratory diagnosis of the lysosomal storage disease α-mannosidosis using blood samples dried on filter paper

Die angeborene lysosomale Stoffwechselerkrankung α-Mannosidose wird autosomal rezessiv vererbt und durch einen Mangel des Enzyms α-Mannosidase verursacht. Dieses Enzym sorgt dafür, dass mannosehältige Oligosaccharide abgebaut werden. Durch den Enzymdefekt sammeln sich unverdaute Oligosaccharide in den Lysosomen an, was zu Funktionseinschränkungen führt. Typische Symptome betroffener Personen äußern sich durch skelettale Veränderungen, Immundefizienz, kognitive Einschränkungen und typische Gesichtsmerkmale wie eine prominente Stirn, ein abgeflachter Nasenrücken und Kieferfehlstellungen. Die Behandlung von PatientInnen erfolgt zurzeit mittels Stammzelltransplantation oder Enzymersatztherapie. Bisher wurde die Erkrankung durch Aktivitätsbestimmung der α-Mannosidase in Leukozyten oder Fibroblasten diagnostiziert. Um auch eine Methode zur Bestimmung der Enzymaktivität mit Trockenblutproben an der Universitätsklinik für Kinder- und Jugendheilkunde am LKH Graz anbieten zu können, war das Ziel dieser These optimale Reaktionsbedingungen zu finden, damit diese Methode in der Routine einsetzbar ist. Dies war notwendig da Trockenblutproben Vorteile wie bessere Lagerungs- und Versandmöglichkeiten und ein geringes Blutvolumen bieten. Die Enzymaktivität wurde mit einem künstlichen Substrat, welches bei Anwesenheit von α-Mannosidase fluoresziert, gemessen. Um die Methode zu etablieren, wurden die Reaktionsparameter Substratkonzentration, Blutvolumen, Inkubationsdauer, pH-Wert und Inkubationstemperatur herangezogen. Die optimalen Parameter, die anhand der Untersuchungen festgelegt wurden, lauten folgendermaßen: eine Substratkonzentration von 3mM, ein Blutvolumen von 3,6µl, eine Inkubationsdauer von zwei Stunden, ein pH-Wert von 4,4 und eine Inkubationstemperatur von 37°C. Weiters konnte festgestellt werden, dass es keinen Unterschied macht, ob die Trockenblutproben mit EDTA oder Lithium-Heparin-Vollblut aus der Vene hergestellt werden oder mit Kapillarblut, das direkt auf das Filterpapier aufgetropft wird. Die These ergab, dass die Aktivitätsbestimmung von α-Mannosidase mit Trockenblutproben in gesunden PatientInnen möglich ist. Mit diesen Werten konnte ein Referenzbereich erstellt werden. Aufgrund der Seltenheit der Erkrankung konnte die Methode nicht mit einer α-Mannosidose-positiven Probe validiert werden, sodass die Aktivitätsbestimmung erst sicher durchgeführt werden kann, wenn feststeht, dass sie auch diese detektieren kann. The lysosomal storage disease α-mannosidosis is inherited in an autosomal recessive manner and is caused by a deficiency of the enzyme α-mannosidase. This enzyme ensures that mannose containing oligosaccharides are broken down. Due to the enzyme defect, undigested oligosaccharides accumulate in the lysosomes, leading to functional impairment. Symptoms of affected individuals are manifested by skeletal abnormalities, immunodeficiency, cognitive impairment and typical facial features such as a prominent forehead, a flattened bridge of the nose and jaw malposition. Therapeutic options for the disorder include stem cell transplantation and enzyme replacement therapy. So far, this disease was diagnosed by determining the activity levels of α-mannosidase in leukocytes or fibroblasts. To be able to offer a method for activity determination with driedblood spots (DBS) at the University Hospital for Paediatric and Adolescent Medicine at the LKH Graz, the aim of the thesis was to identify optimal reaction conditions in order to use the method in routine operation. This was necessary because DBS offer advantages such as better storage and shipping options and less needed blood volume. The enzyme activity was measured with an artificial substrate, which fluorescents in the presence of α-mannosidase. To establish the method, the reaction parameters substrate concentration, blood volume, incubation time, pH-level and incubation temperature were tested. The ideal parameters, which were determined on the basis of the examinations, are: a substrate concentration of 3mM, a blood volume of 3,6µl, an incubation time of two hours, a pH level of 4,4 and an incubation temperature of 37°C. Furthermore, it was found that it makes no difference whether the dried blood samples are prepared with EDTA or lithium heparin blood from the vein or whether capillary blood is used directly. The thesis showed that the activity determination of α-mannosidase with DBS in healthy patients is possible. With these values, a reference range could be created. Due to the rarity of the disease, the method could not be validated with an α-mannosidase-positive sample. Therefore, the method can only be used safely if it is known that it can also detect positive patients. Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers Bachelorarbeit FH JOANNEUM 2022