'Genetic Engineering' von Lactobacillus diolivorans mit Fokus auf Promotorselektion

Lactobacillus diolivorans ist ein vielversprechendes Milchsäurebakterium, da es Glycerin als Kohlenstoffquelle für eine fermentative Herstellung von Polymerrohstoffen, wie zum Beispiel Thermoplasten, genutzt werden kann. Die Hauptvorteile von Glycerin sind niedrige Kosten, die breite Verfügbarkeit des Rohstoffes und die Tatsache, dass es ein Abfallprodukt aus der Biodieselproduktion ist. Da L. diolivorans ein heterofermentatives Milchsäurebakterium ist, ist es je nach Stoffwechselweg möglich, aus Glycerin 3-Hydroxypropionsäure oder 1,3-Propandiol zu verstoffwechseln. Diese Rohstoffe sind in der Polymerindustrie universell einsetzbar und daher von großem Interesse. Die Umwandlung von Glycerin zu 1,3-Propandiol und 3-Hydroxypropionsäure ist während des anaeroben Wachstums von L. diolivorans Elektronen reduzierend. Um Biomasse für diese Umwandlung zu produzieren, muss L. diolivorans auf Glukose oder Xylose wachsen, da ihm die Fähigkeit fehlt, Glycerin in seinen zentralen Kohlenstoffstoffwechsel zu einzuschleusen. Daher wird versucht den Stoffwechsel mit genetischen Werkzeugen so zu verändern, dass Glycerin zur überwiegenden Kohlenstoffquelle für die Synthese von 3-Hydroxypropionsäure oder 1,3-Propandiol werden kann. In der Polymerindustrie sind derzeit zwei Herstellungsverfahren von 1,3-Propandiol etabliert, die petrochemische Produktion nach dem „Degussa Prozess“ von DuPont und ein biotechnologisches Fermentationsverfahren von DuPont und Genencor. Obwohl der Einsatz von 3-Hydroxypropionsäure in der Industrie vielversprechend ist, bereitet diese Schwierigkeiten in der zellinternen Produktion, da sie zytotoxisch ist. Um eine Akkumulation von 3-Hydroxypropionsäure zu vermeiden, ist es von großer Bedeutung, diese Säure so schnell wie möglich aus L. diolivorans Zellen auszuschleusen. Dazu ist es notwendig einen geeigneten Transporter oder einen adäquaten Promotor für den Metabolismus von L. diolivorans zu finden, die einen Rückstau von 3-Hydroxypropionsäure verhindern und auch das Zellwachstum unterstützen. Der bisher einzig verfügbare konstitutive Promotor für L. diolivorans ist der GAP-Promotor der für L. diolivorans zu stark ist und weniger Transformanten nach der Elektroporation zeigt. Daher wurden fünf verschiedene konstitutive Promotorstärken verwendet, die nachweislich in Lactobacillus plantarum funktionieren. Auch ein induzierbarer Promotor (orfXP) wurde eingesetzt. Induzierbare Promotoren bestehen aus einer induzierbaren regulatorischen Sequenz wodurch die Promotorstärke durch spezifische Chemikalien stimuliert werden kann. Beispielsweise steuern beim orfXP-Promotor unterschiedliche Konzentrationen von Nisin die Stärke der Promotoren. Alle verwendeten Promotoren wurden mit zwei separaten kodierenden Sequenzen (GFP oder mCherry) und einer Terminatorsequenz in Expressionskassetten fusioniert. Die Zusammenführung der einzelnen Sequenzen in die Expressionskassetten wurde mittels Golden Gate Assembly durchgeführt. Abgeschlossene Expressionskassetten, gebunden in Level 3-Plasmide, wurden durch Elektroporation in L. diolivorans transformiert. Neben der Elektroporation wurden auch andere Transformationsmethoden, wie chemische Transformation oder Konjugation untersucht. Das letztendliche Ziel besteht darin, einen konstitutiven Promotor zu finden, der stark genug ist, um Transporter zu exprimieren, aber nicht zu stark, um Transformanten zu erhalten. Diese Arbeit zeigte, dass die Elektroporation eine praktikable Transformationsmethode für L. diolivorans ist. Die Elektroporation in L. diolivorans zeigt eine signifikante Verbesserung des Wachstums von Klonen durch unterschiedliche Promotorstärken. Die Anzahl der L. diolivorans-Transformanten entspricht jedoch nicht der Anzahl der KBE des natürlichen Wachstums des L. diolivorans Wildtyps. Vorläufige Konjugationsexperimente zeigen, dass ein geeignetes Protokoll noch entwickelt werden muss. Beispielsweise ist eine Änderung des Verhältnisses von Escherichia coli zu L. diolivorans erforderlich, da das Wachstum von E. coli durch die Anzahl seiner Plasmide stark beeinflusst wird. Die Verwendung von GFP und mCherry als kodierende Sequenzen erleichtern den Nachweis erfolgreicher L. diolivorans-Transformanten durch die Anwendung von Fluoreszenzmethoden. Da ein bereits etabliertes PCR-Verfahren teuer ist, erweisen sich Fluoreszenzverfahren als kostengünstiger und zeiteffizienter. Lactobacillus diolivorans is a promising lactic acid bacterium because it can use glycerol as a carbon source for a fermentative production of polymer raw materials, in example to produce thermoplastics. The main benefits of glycerol are low costs and the wide availability of the raw material, since it is a waste product from biodiesel production. Due to the fact that L. diolivorans is a heterofermentative lactic acid bacteria, it is possible to metabolize 3-hydroxypropionic acid or 1,3-propanediol from glycerol, depending on the metabolic pathway of the lactic acid bacteria. 3-hydroxypropionic acid has a universal use in the polymer industry and is therefore a raw material of great interest. The conversion of glycerol to 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid serves as an electron sink during the anaerobic growth of L. diolivorans. To produce the biomass for this bioconversion L. diolivorans needs to grow on glucose or xylose, because it lacks the ability to channel glycerol into its central carbon metabolism. Therefore, attempts are being made to change the metabolism using genetic engineering tools, so glycerol becomes the predominant carbon source for synthesis of 3-hydroxypropionic acid or 1,3-propanediol. In the polymer industry, currently two manufacturing processes of 1,3-propanediol are established, the petrochemically production by DuPont's “Degussa Process” and a biotechnological fermentation process by DuPont and Genencor. Although the use of 3-hydroxypropionic acid is promising in industry, it poses difficulties for production in the cell because it is cytotoxic. To avoid accumulation of 3-hydroxypropionic acid, it is of great importance to expel this acid out of L. diolivorans cell as quickly as possible. For this purpose, it is necessary to find a qualified transporter and an adequate promoter for the metabolism of L. diolivorans to avoid accumulation of 3-hydroxypropionic acid and also supports the growth of the cells. The only constitutive promoter available so far for L. diolivorans is the GAP promoter, which is too strong for L. diolivorans and shows fewer transformants after electroporation. Therefore, five different constitutive promoter strengths that previously worked in Lactobacillus plantarum and as well an inducible promoter (orfXP) were tested. The strength of inducible promoters, which consists of an inducible regulatory sequence, could be stimulated by specific chemicals. In example, for the orfXP promoter, different concentrations of nisin control the strength of the promoter. These promoters (constitutive and inducible) were fused with two separate coding sequences (GFP or mCherry) and terminator sequence to various expression cassettes. The assembly is performed by using 3 levels of Golden Gate reactions. Finalized expression cassettes, bounded in level 3 plasmids, were transformed into L. diolivorans by electroporation. In addition to electroporation, other transformation methods such as chemical transformation or conjugation were under investigation. The ultimate goal is to find a constitutive promoter strong enough to express transporters, but not too strong to obtain transformants. This work demonstrated that electroporation is a viable transformation method for L. diolivorans. Electroporation in L. diolivorans shows a significant improvement in the growth of clones with different promoter strengths. However, the final number of L. diolivorans transformants does not correspond to the natural growing number of CFU of the L. diolivorans wild-type. Preliminary conjugation experiments show that a suitable protocol still needs to be developed. For example, an alteration in the ratio of Escherichia coli donor cells to L. diolivorans recipient cells is required, since the growth of E. coli is impacted by the number of its plasmids. Using GFP and mCherry as coding sequences for analyses, also facilitate the detection of successful L. diolivorans transformants. Since the already established PCR method is expensive, fluorescence methods indicate to be more cost-effective and time-efficient. Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers Masterarbeit Wien, FH Campus Wien 2023