Funktionelle Charakterisierung von CTNND1-Varianten durch Sphäroid-Modellierung

Mit mehr als eine Million neuer Fälle im Jahr 2020 ist Magenkrebs weltweit die fünfthäufigste Krebsart mit einer hohen Mortalitätsrate. Während die meisten Krankheitsfälle sporadisch auftreten, unterliegen 10 % der betroffenen Patienten einer familiären Häufung, von denen nur bis zu 3 % der Fälle mit einer bereits bekannten genetischen Ursache in Verbindung gebracht werden. Das hereditäre diffuse Magenkarzinom ist ein häufig vererbtes Magenkrebssyndrom, das durch Keimbahnmutationen in CDH1 ausgelöst wird. Es wurden jedoch bisher keine weiteren Gene mit dieser Krankheit in Verbindung gebracht. Daten der Whole-exome Sequenzierung aus einer Kohorte von Magenkrebspatienten ergaben, dass CTNND1 einen interessanten Beitrag zum hereditären Magenkrebs leistet. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die identifizierten CTNND1-Mutationen funktionell zu charakterisieren. Aus diesem Grund wurden zwei verschiedene Techniken, die Hanging-Drop-Methode und Ultra-Low-Attachment-Platten, für die Sphäroid-Modellierung an NCI-N87-Zellen getestet, um drei genetische CTNND1-Varianten zu bewerten: c.28_29delinsCT (p.Ala10Leu), c.1105C>T (p.Pro369Ser) und c.1537A>G (p.Asn513Asp). Mit Hilfe statistischer Methoden konnte bestätigt werden, dass die Ultra-Low-Attachment-Platten die effektivste Technik für die Sphäroid-Modellierung sind, da sie skalierbare und reproduzierbare Sphäroide liefern. Anschließend wurde die Pathogenität von drei CTNND1-Varianten, die bei Magenkrebspatienten gefunden wurden, durch Sphäroid-Modellierung getestet. Die CTNND1-Varianten wirkten sich negativ auf die Funktion des Proteinprodukts (p120) aus, indem sie vor allem die Zell-Zell-Bindung störten. Da p120 zur Struktur der Zelle beiträgt, führte es dazu, dass die produzierten Sphäroide anders aggregierten als die mit dem CTNND1-Wildtyp. Außerdem konnte beobachtet werden, dass die c.1105C>T-Mutation die Bindung von E-Cadherin und p120 beeinträchtigte, was zu einer Internalisierung von E-Cadherin führte. Daraus lässt sich schließen, dass die CTNND1-Varianten die Funktion des Proteins beeinträchtigen, indem sie die Zell-Zell-Adhäsionseigenschaften verändern und die Position von E-Cadherin beeinflussen With more than one million cases in 2020, gastric cancer is the 5th most common cancer worldwide linked to a high mortality rate. Whilst most of the disease cases occur sporadically, 10% of the affected patients show familial aggregation, from which only up to 3% of the cases are associated with an already known genetic cause. Hereditary diffuse gastric cancer is a frequent inherited gastric cancer syndrome triggered by germline mutations in CDH1, but no additional genes have been linked with this disease. Whole exome sequencing data from a cohort of gastric cancer patients revealed CTNND1 as an interesting contributor to hereditary gastric cancer. The present work aimed to functionally characterize the identified CTNND1 mutations. To do so, two different techniques, the Hanging Drop method, and Ultra-Low Attachment plates, were tested for spheroid modeling on NCI-N87 cells to evaluate three CTNND1 genetic variants: c.28_29delinsCT (p.Ala10Leu), c.1105C>T (p.Pro369Ser) and c.1537A>G (p.Asn513Asp). With the help of statistical methods, it could be confirmed that the Ultra- Low Attachment plates were the most effective technique for spheroid modeling, as it provided scalable and reproducible spheroids. Afterwards, the pathogenicity of three CTNND1 variants found in gastric cancer patients was tested by spheroid modeling. CTNND1 variants negatively impacted its protein product (p120) function by mainly disturbing cell-to-cell attachment. As p120 contributes to the cell's structure, it caused the produced spheroids to aggregate differently than those with the CTNND1 wild type. Moreover, it could also be observed that the c.1105C>T mutation impaired the E-cadherin and p120 binding, resulting in E-cadherin internalization. It could be concluded that CTNND1 variants are impairing its protein function by altering cell-cell adhesion properties and by influencing the location of E-cadherin.